HU208041B - Monoclonal antibodies for treating human hon microcellular carcinoma pulmonum - Google Patents

Description

A találmány emberi, nem-kissejtes tüdőkarcinómák esetében alkalmazható monoklonális antitestek előállítására vonatkozik.

A rákbetegségek közül a férfiak körében a tüdőkarcinóma okozza a legtöbb halálesetet; mostanában azonban a nők között is előtérben van, s megelőzi az emlőrákot, amely eddig a leggyakoribb halálok volt (Cancer Facts and Figures, 1983). Ez a betegség 4 főbb szövettani típusba sorolható, éspedig epidermális (30%), adenokarcinómás (35%), óriássejtes diferenciálatlan (15%) és kissejtes korformákba. A tüdőkarcinómás esetek többsége kemoterápiával és besugárzással nem gyógyítható. A kissejtes tüdőkarcinóma az, amelynél kemoterápiás-, illetve sugárkezeléssel a daganat mértékének csökkenése ugyan elérhető, a teljes gyógyulás azonban nem. A tumor teljes sebészeti eltávolítása látszik az egyetlen hatásos gyógymódnak. Sajnos azonban az összes tüdőrákos betegeknek kevesebb, mint 30%-ánál van diagnosztizáláskor a daganat olyan stádiumban, hogy a daganat teljesen eltávolítható, és ezeknek az eseteknek is csak kevesebb, mint egyharmadánál van 5 éves túlélés a tumorok teljes eltávolítását követően. Nagy szükség van tehát olyan módszerekre, amelyek a tüdőrák az eddiginél korábbi diagnosztizálását, a rák szétterjedésének jobb megállapítását és a betegség hathatósabb gyógyítását lehetővé teszik.

A monoklonális antitestek alkalmasak ezekre a célokra. Alkalmazásuk előfeltétele azonban, hogy olyan antigénekre specifikus antitestek álljanak rendelkezésre, amely antigének tüdőrákos szöveteken jobban kifejeződnek, mint normális érett szöveteken. Minthogy a daganatsejtpopulációk közismerten heterogének, és mert ugyanazon az antigénen számos determináns-csoport lehet jelen, továbbá, mert a gyógyítani kívánt célsejtek vonatkozásában - az antigének között meglévő, már említett különbségek miatt - kérdéses lehet az egyes antigének diagnosztikai markerként való alkalmazhatósága, s végül, mert a különböző antitestek különböző sajátságokat mutatnak egy adott antigénnel szemben, számos különböző antitestre lehet szükség.

Tüdőrák-antigénekre érzékeny humán monoklonális antitesteket Sikora és munkatársai ismertettek [Br. J. Cancer, 43, 696-700. (1981).]. Többféle emberi tüdőrákra specifikus monoklonális antitesteket Cuttitta és munkatársai írtak le [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4591-95. (1981)]. Humán tüdő-adenokarcinómához kötődő antigéneket felismerő monoklonális antitesteket Varki és munkatársai ismertettek [Cancer Research,

44., 681-687, (1984)].

Glikolipid-típusú Le* antigénekre specifikus egér monoklonális antitesteket a következő cikkek ismertetnek: Hakomori és munkatársai: Biochemical and Biophysical Research Communications, 700., 1578-86. (1981); Bockhouse és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys., 277., 647. (1982); Fukushi és munkatársai: J. Bioi. Chem., 259., 506. (1984); Fukushi és munkatársai: J. Exp. Med., 759., 506. (1984); Chia és munkatársai: Cancer Rés., 45., 435. (1985). Le^y antigénekre specifikus antitestekre a következő cikkek vonatkoznak: Abe és munkatársai: J. Bioi. Chem. 258., 8934. (1983); Lloyd és munkatársai: Immunogenetics, 77., 537. (1983); Brown és munkatársai: Biosci. Rep., 3., 163. (1983).

Előre meghatározott specifitású antitesteket termelő, fúzióval létrehozott sejtek folytonos tenyészeteit Köhler és munkatársai ismertették [Natúré, 265., 495497. (1975)].

A találmány emberi, nem-kissejtes tüdőkarcinóma (non-small cell lung carcinoma, a továbbiakban (NSCLC) sejtekhez kötődő glikolipid típusú antigén determináns helyeit felismerő új monoklonális antitestek előállítására vonatkozik. Az NSCLC sejtekbe beleértjük az epidermális karcinóma-sejteket, az adenokarcinómás sejteket és az óriássejtes differenciálatlan karcinóma sejteket. Az antigénen fellelhető determináns helyek néhány más rákfajtához, így például néhány emlőrák-fajtához is kötődhetnek, s következésképpen a találmány szerinti antitestek ezekhez a karcinóma-sejtekhez is kapcsolódhatnak. A jelen találmány szerinti monoklonális antitestek sokkal kisebb mértékben kötődnek normális érett sejtekhez, mint daganatsejtekhez. A „sokkal kisebb mértékben való kötődés” azt jelenti, hogy a kötés immunhisztológiai módszerekkel nem mutatható ki. A monoklonális antitesteket egér-hibridómák termelik.

A találmány tárgya továbbá eljárás emberi tüdőszövet és humán szövetek malignus állapotának oly módon való felismerésére, hogy a tüdőszövetet vagy más humán szövetet Le* vagy Le^y antigénekre jellemző sajátságokat mutató antigének jelenlétére vizsgáljuk. A Le* antigént Hakomori és munkatársai, Brockhans és munkatársai, Fukushi és munkatársai, valamint Chia és munkatársai írták le fent idézett cikkeikben. Az Le^y antigént Abe és munkatársai, Lloyd és munkatársai, valamint Brown és munkatársai ismertették a fent már ugyancsak megadott cikkekben.

így például egy adott beteg szöveteit olyan antitesttel, vagy annak funkcionális ekvivalensével vagy fragmensével érintkeztetjük, amely a sejthez kötött szénhidrát-(glikolipid)-típusú Le^y vagy Le* antigén, vagy a Le^y vagy Le* antigének sajátságaival rendelkező antigén determináns-csoportjait felismeri.

A találmány szerinti monoklonális antitesteket diagnosztikai célra alkalmazzuk. Egy ilyen alkalmazási mód például az NSCLC sejtek jelenlétének kimutatása olyan mintákban, amely mintákról gyanítható, hogy ilyen sejteket tartalmaznak. A kérdéses mintát olyan antitestekkel hozzuk érintkezésbe, amelyek képesek arra, hogy az NSCLC sejteket a mintában lévő egyéb sejttípusoktól megkülönböztessék. Az érintkeztetést olyan körülmények közöt végezzük, hogy az antitest megkötődhessen az NSCLC sejteken. Az érintkeztetés után meghatározzuk, hogy a mintában lévő sejtekhez kötődött-e antitest, vagy sem. Ha kötés jött létre, ez a körülmény NSCLC sejtek jelenlétére, illetve ha nem jött létre, az NSCLC sejtek hiányára utal. A mintát általában a monoklonális antitesthez specifikusan kötődő, jelzett anyaggal hozzák érintkezésbe, amely jelzett anyag valamilyen kimutatható jelet képes adni. A diag2

HU 208 041 Β nosztikai alkalmazás egy másik megoldási módja az, hogy a betegeknek megfelelően, így például radioaktív izotóppal jelzett antitestet vagy antitest-fragmenst adunk be injekcióban, majd ezeknek a tumorhoz való kötődési helyeit meghatározzuk. Ez a megoldás az előbbinél jobb lehetőséget ad a betegség stádiumának, illetve a terápiát követő változásoknak a meghatározására.

Az antitestek gyógyászati alkalmazása is a találmány tárgyához tartozik. Az antitestek a fenti antigének bármelyikével, vagy mindkettővel reagálni képesek; ezek az antigének a tumorsejt felületén nagy koncentrációban vannak jelen. Az antitest különböző daganatellenes szerek vivőanyagként is használható, amely szerekbe például a kemoterápiás szereket és radioizotópokat értjük bele.

A találmány tehát humán NSCLC-sejteken fellelhető antigénekhez kötődő új antitestek előállítására, valamint antitesteket alkalmazó diagnosztikai és terápiás eljárásokra vonatkozik. A találmány szerinti monoklonális antitesteket önmagában ismert módon Köhler és Milstein az előzőekben már megadott közleménye szerint állíthatjuk elő. így például antigénként normális embrió tüdősejteket, vagy emberi nem-kissejtes tüdőkarcinóma szövettenyészetet, vagy mellhártya izzadmányból nyert emberi tüdőkarcinómás sejteket alkalmazhatunk. Ezeket a sejteket egérbe injekciózzuk, majd kellő idő elteltével az egeret megöljük és lépsejtjeit kinyerjük. A kívánt immunglobulinokat kódoló lépsejt-kromoszómákat hibridóma formájában őrizzük meg, úgy, hogy a kérdéses lépsejteket mielóma- vagy limfóma-sejtekkel - általában polietilén-glikol jelenlétében - fúzióba hozzuk. A kapott, a fúzióval létrehozott hibridómákat is tartalmazó sejteket szelektív hatású tápközegen, így például HAT-tápközegen tenyésztjük, és a túlélő sejteket limitáló körülmények között ugyanezen a tápközegen növesztjük tovább. A sejttenyésztést megfelelő tartályban, például mikrotiter tenyésztőedényben végezzük, és a felülúszót a kívánt specifikus tulajdonságokat mutató antigénekre vizsgáljuk.

A monoklonális antitestek keletkezésének elősegítésére számos módszer ismeretes. Egy ilyen mód például, hogy a hibridóma sejteket injekcióval valamely emlős gazdaállat hasüregébe juttatjuk, majd a hasüregi folyadékot kinyerjük. Ha a hasüregi folyadékból nem sikerül megfelelő mennyiségű monoklonális antitestet összegyűjteni, akkor a gazdaszervezet véréből nyerjük ki a monoklonális antitesteket. A monoklonális antitestek izolálására és egyéb proteinektől és szennyezésektől való megtisztítására több módszer is ismeretes (lásd: Köhler és Milstein az előzőekben már megadott publikációja).

A jelen találmány szerinti egyik monoklonális antitestet L15-nek nevezzük. Ez egy szénhidrát-típusú sejtfelületi antigént ismer fel, amely az Le^y antigén, illetve egy annak sajátságaival rendelkező antigén. A kérdéses antigén jellemzően emberi NSCLC sejteken és bizonyos más emberi karcinóma sejteken azonosítható. Az antitest IgM izotípusnak felel meg, és normális sejtekhez, így például fibroblasztokhoz, endotheliális sejtekhez, vagy a nagyobb szervek epitheliális sejtjeihez kimutathatóan nem kötődik. Az L15 antitestet L15 egér hibridómák termelik.

A jelen találmány szerinti, egy további monoklonális antitestet L 17-nek nevezzük. Ez egy sejtfelületi szénhidrát-determinánst ismer fel, amely az Le* antigén, illetve egy annak sajátságaival rendelkező antigén. Ez az antigén szintén jellemzően emberi NSCLCsejteken és bizonyos más emberi karcinóma sejteken azonosítható. Ez az antitest is az IgM izotípusnak felel meg, és normális sejtekhez, így például fibroblasztokhoz, endotheliális sejtekhez, vagy a nagyobb szervek epitheliális sejtjeihez kevésbé kötődik, mint a daganatsejtekhez. Az L17 antitestet L17 egér hibridómák termelik.

Az L15 antitest az Le^y antigént ismeri fel, amely az alábbi szerkezetnek felel meg:

Gaipi->4GlcNAcpl->3Galpl->R

3

I I

Fucal Fucal

Ezzel az antitesttel egy sor különböző lánchosszúságú glikolipid mutatható ki.

Az L17 antitest egy sor olyan glikoipid-típusú antigénnel reagál, amelyek mindegyike Le* végcsoportot, azaz

Gaipi—>4GlcNAc—

I

Fucal csoportot hordoz, ahol R különböző hosszúságú, 2. vércsoportra jellemző lánc lehet (Gaipi->4GlcNAc[3l—> 3Gaipi->4GlcNAcpi->3). Az antitest az alábbi trifukozil Y struktúrával is reagál:

Galpl->4GlcNAcpl->3[Fucal]->3Galpl->4GlcNacpl-> 3-[Fucal]-»3Gal(3l—>4GlcNacpl->3[Fucal]->3Gal(3l-> 4Glc.

A fenti monoklonális antitest hasznosítható, kötődni képes fragmensei, így például a Fab, F(ab’)₂ és Fv fragmensek is a találmány tárgyához tartoznak. Ezek az antitest-fragmensek ismert módon, például az antitest peptidázos lebontásával, így papain vagy pepszin alkalmazásával állíthatók elő.

A találmány szerinti egyik diagnosztikai módszer lényege, hogy a betegtől származó tüdőszövet vagy más szövet malignus állapotát annak alapján konstatáljuk, hogy a kérdéses szövetben van-e Le^y vagy Le*, illetve a Le^y vagy Le* antigén tulajdonságaival rendelkező szénhidrát-típusú antigén. A „szövet” lehet sebészeti úton nyert szöveti metszet, exfoliatív sejtminta, különböző testnedvek, mint például vér, plazma, szérum, vizelet stb. és hasonlók. A „malignus állapot” jelenthet bármely, a normálistól eltérő sejtnövekedést, így in situ karcinómás, neoplazmás állapotú, malignus vagy tumorsejteket, vagy hasonlókat. így például a szövetmintát egy olyan monoklonális antitesttel érint3

HU 208 041 Β keztetjük, illetve reagáltatjuk, amely felismeri az Le^y vagy Le^x antigén determináns-csoportjait. Ilyen antitestek például az L15 vagy L17 antitest vagy más, ezekhez hasonló sajátságú antitest, mint amilyeneket például Hakomori és munkatársai, Fukushi és munkatársai, Chia és munkatársai, Abe és munkatársai, Lloyd és munkatársai, valamint Brown és munkatársai írtak le fent már idézett cikkeikben. Az érintkeztetést olyan körülmények között végezzük, hogy az antitest a kérdéses szövetminta malignus sejtjeihez kötődjék, majd a mintát az antitest és az antigén determináns-csoport között létrejött immunkomplexek jelenlétére vizsgáljuk. Immunkomplex jelenléte arra utal, hogy a szövetmintában malignus sejtek vannak jelen.

A találmány szerinti diagnosztikai módszert tumorsejteknek szöveti metszetben való detektálásával az alábbiakban szemléltetjük, anélkül, hogy igényünket ere a megoldásra korlátoznánk. E módszer sebészeti úton eltávolított daganatból nyert szöveti metszeten alkalmazható. A sebészeti úton eltávolított daganatból metszeteket készítünk, majd azokat - rendszerint a tumor kioperálását követően azonnal - lefagyasztjuk. A fagyasztott daganat-rétegből a metszeteket például kriosztát segítségével vágjuk ki.

A fenti módon nyert daganatmetszetet ezután először a találmány szerinti antitesttel, majd egy második olyan monoklonális antitesttel érintkeztetjük, amely egyrészt detektálható jelzés leadására képes, másrészt az első antitestet megkötni képes.

A kimetszett mintát, így például a daganatmetszetet az első monoklonális antitesttel olyan körülmények között érintkeztetjük, hogy az antitest a malignus sejtekhez kötődjék. Az inkubálást általában vizes közegben, mint például kis mennyiségű nátrium-azidot és foszfát puffért tartalmazó sóoldatban, a célnak megfelelő edényben, így például petri-csészében 15-30 percen át, 20 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Az alkalmazott antitest mennyisége általában elegendő ahhoz, hogy a kötődés mértéke kimutatható legyen, azaz hogy az antitest és a determináns, illetve a kérdéses antigénen lévő kötőhely között kimutatható számú immunkomplex képződjék.

Az inkubáció lejátszódása után a nem specifikusan kötődött antitestek eltávolítása, illetve mennyiségének csökkentése érdekében a metszetet lemossuk, majd az antigén-kötőhellyel rendelkező minta sejtjei és a monoklonális antitest közötti kötődés folytán létrejött már említett komplexet valamely módszerrel megvizsgáljuk, illetve észleljük. A kötődést például oly módon határozhatjuk meg, hogy a mintát egy jelzett, a monoklonális antitestre nézve specifikus kötődő partnerrel hozzuk érintkezésbe. A jelzés módja lehet radioaktív jelzés, valamely kromofór, például immunfluoreszcens anyag, enzim vagy hasonló; mindenképpen detektálható jel leadására képes jelzőanyagot kell azonban használni.

Az előbbi módszer egyik megvalósítási módja esetén immunfluoreszcens festést alkalmazunk. Ha ezt a technikát alkalmazzuk, a fagyasztott daganatmetszetet üveglemezen acetonnal fixáljuk, majd egy antitesttel például petri-csészében inkubáljuk. A metszetet ezután egy megfelelően megválasztott pufferrel, így például foszfáttal pufferolt sóoldattal lemossuk, majd petri-csészébe tesszük és egy jelzett, a monoklonális antiteste specifikus kötő-partnerrel, így például az alkalmazott monoklonális antitestet specifikusan megkötni képes, jelzett antitesttel érintkeztetjük. Minthogy a monoklonális antitestek nagy része egér-eredetű, az erre a monoklonális antitestre specifikus anti-egér immunglobulin jelzett formáját alkalmazhatjuk. Ilyen immunglobulin fokozott mértékben, ismert módon például úgy termelhető, hogy egy alkalmas gazdaszervezetbe injekcióval egér-antitestet juttatunk, majd megfelelő idő elteltével a gazdaállat véréből az anti-egér immunglobulint kinyerjük.

Ezután az üveglemezt például valamely vizes pufferrel másodszor is lemossuk, a szövetmetszetre az antitest beágyazására alkalmas fluoreszcens tárgylemez-folyadékot, majd fedőlemezt juttatunk és a monoklonális antitest szövetmetszethez való kötődését fluoreszcens mikroszkópban meghatározzuk. A „meghatározás” a kötőhely elhelyezkedésének azonosítására is kiterjedhet.

A monoklonális antitest mintához való kötődését úgy is meghatározhatjuk, hogy a monoklonális antitestet kovalens kötéssel valamely olyan jelzőanyaghoz kapcsoljuk, amely jelzőanyag detektálható jel produkálására képes. A jelzőanyag lehet valamely kromofórcsoportot tartalmazó molekula (festék, fluoreszcens anyag), enzim, vagy radioaktív tulajdonságú anyag. Az antitestenként alkalmazott jelzések száma egyrészt attól függ, hogy a jelzett antitestet milyen diagnosztikai módszerhez használják, másrészt attól, hogy a jelzőanyag és az antitest között hány helyen jöhet létre kötés.

Jelzőanyagok és antitestek közötti kötés létrehozására több módszer is ismeretes; ilyen módszereket például a 4220450,4235 869,3 935 074 és 3 996 345 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetnek.

A találmány szerinti monoklonális antitest az úgynevezett immunperoxidáz jelzésmóddal is jelölhető [Stemberger, Immunocytochemistry, John Wiley and Sons, New York, (1979), 104-169. oldalak, illetve ennek Garrigues és munkatársai által módosított változata: Cancer 29., 511-515. (1982)].

E módszer alkalmazásakor a vizsgálni kívánt szöveteket valamely hordozón, például egy üveglemezen, alkalmas oldószerrel, így például acetonnal rögzítjük. Ezután a szövetet a monoklonális antitesttel együtt inkubáljuk, majd a meg nem kötött antitestet mosással eltávolítjuk. Ezt követően a szövetet nyúl anti-egér IgG-vel inkubáljuk, a meg nem kötött antitestet mosással eltávolítjuk, majd egér peroxidáz-antiperoxidáz komplexszel összekeverjük, a meg nem kötött jelzőanyagot mosással eltávolítjuk, s végül az enzim szubsztrátjával kezeljük. A kezelést követően az üveglemezen lévő preparátumot kimutatható jelzés jelenlétére vizsgáljuk.

A találmány szerinti antitestek alkalmazhatók to4

HU 208 041 Β vábbá tüdő-eredetű exfoliatív sejtminták, így például köpet és a cervikális kenet malignus állapotának megállapítására is. Az „exfoliatív” minta olyan vizsgálati anyag, amely a szövetfelület lemosásával vagy lekaparásával nyert különálló vagy összetapadt, például pikkelyszerű vagy lamelláit sejtekből áll. Ez az exfoliatív minta nem tévesztendő össze a biopsiával nyert szöveti metszettel. A mintát olyan körülmények között hozzuk érintkezésbe az antitesttel, hogy az antitest az antigénkötőhelyekhez kapcsolódjék. Az érintkeztetés után a mintában az antitest és az antigén-kötőhely között létrejött kötés a tüdő malignus állapotára utal, illetve ilyen kötés hiányában nincs malignus állapot.

Tüdő malignus állapotának megállapításához a találmány szerinti eljárásban exfoliatív sejtmintaként például köpet-mintát használhatunk. A módszer azonban a bronchusból, az emésztőcsatornából, a garatból, szájból, stb. származó exfoliatív minták malignus állapotainak felismerésére is használható.

Az exfoliatív sejtmintát a fenti antitesttel olyan körülmények között érintkeztetjük, hogy az antitest a mintában lévő specifikus antigén-kötőhelyekhez kötődjék, miközben antigén-antitest komplexek képződnek. Az antigén-kötőhelyek a mintában lévő sejteken vagy sejt-fragmenseken lehetnek jelen. A mintát általában valamely alkalmas hordozóra, így például lemezre, főként üveglemezre vagy egyéb alkalmas anyagra helyezzük. Az exfoliatív sejtmintát általában rákenjük a lemezre, hogy egy vékony minta-réteg legyen a lemez felületén. Az antitest és a minta érintkeztetését általában pufferolt vizes közegben végezzük. Az alkalmazható pufferek például a foszfát, a trisz és a bikarbónát, stb. pufferoldatok. A pH az antitest és a minta típusától függően változhat és általában 5 és 8 között van. A vizes közeg ezenkívül poláros szerves oldószert is tartalmazhat 0 és 40% közötti mennyiségben. A poláros szerves oldószerek vízoldhatóak és általában közelítőleg 1-10 szénatomot és 1-4 oxigénatomot tartalmaznak. Az antitest a vizes közegben 1-100 pg/ml, előnyösen 10-20 pg/ml koncentrációban van jelen. Az antitest és a minta érintkeztetését rendszerint 4-40 °C, előnyösen 10-30 °C hőmérsékleten végezzük. Az érintkeztetés időtartama általában 15-120 perc, előnyösen 30-60 perc.

Az antitest és a minta érintkeztetési idejének elteltével a hordozón lévő mintából a reagálatlan antitestet eltávolítjuk. Ezt általában úgy végezzük, hogy a hordozó lemezt vizes, általában pufferolt, vizes oldattal lemossuk. A mosófolyadék mennyiségét úgy választjuk meg, hogy az az összes reagálatlan antitest eltávolításához elegendő legyen.

Ezután a minta malignus állapotára utaló kötések, azaz a mintában lévő antigén-kötőhelyek és az antitest között létrejött kötések jelenlétét állapítjuk meg. Ez lényegében úgy történik, hogy megvizsgáljuk, hogy a mintában milyen számú antigén-antitest (immun) komplex képződött. Meg kívánjuk jegyezni, hogy bizonyos esetekben az exfoliatív sejtmintában csak igen kis számú ilyen antigén-kötőhely található. Ugyanakkor, malignus állapot esetén nagy számú ilyen antigénkötőhely van, jelen, s így a rosszindulatú daganatos állapot ezzel a módszerrel a nem-malignus állapotoktól jól megkülönböztethető azáltal, hogy malignus állapotban nagy számú antigén-antitest komplex jelenléte mérhető. A jelenlévő kötések meghatározását a mintához adott, valamely detektálható jelet adó anyag teszi lehetővé. így például a módszernél az egyik lehetőség, hogy az alkalmazott antitestet egy olyan jelzőanyaghoz kötjük, amely detektálható jelzést képes adni. A jelzőanyag lehet radioaktív tulajdonságú, vagy kromofór jellegű (például festék vagy fluoreszcens anyag), enzim vagy hasonló. Az antitesten alkalmazandó jelzések számát általában a módszer követelményei és az antitesten lévő, a jelzőanyag megkötésére alkalmas kötőhelyek száma szabják meg.

Alternatív megoldásként a kimosott lemezt egy jelzett, az antitestre specifikus kötőpartnerrel, így például az alkalmazott antitestre specifikus, jelzett más antitesttel hozhatjuk érintkezésbe. Ha egér-eredetű monoklonális antitestet alkalmazunk, akkor jelzett anti-egér immunglobulin - amely az antitestre specifikus - használható kötőpartnerként. Ilyen immunglobulinok keletkezését ismert módon például úgy segíthetjük elő, hogy megfelelő gazdaállatnak injekcióban beadjuk a monoklonális antitestet, megfelelő ideig várunk, majd a gazdaállat véréből az anti-egér immunglobulinokat kinyerjük. Ha az antitestre specifikus, jelzett kötőpartnert alkalmazunk, a lemezen levő preparátumot újra ki kell mosni vizes közeggel, mielőtt a preparátum immunfluoreszcens vizsgálatát elvégezzük.

Fluoreszcens jelzés használatakor a sejtminta és az antitest közötti kötődés meghatározását úgy végezzük, hogy a lemezen lévő preparátumot fluoreszcens festődésre, rendszerint egy fluoreszcens mikroszkóp segítségével megvizsgáljuk. Ha nem fluoreszcens jelzést alkalmaztunk, akkor csapadékképződést, színreakciót, vagy mást vizsgálunk.

A fenti módszerleírás főként arra az esetre vonatkozik, ha a találmány szerinti antitesteket immunfluoreszcens módszerrel mutatjuk ki. A találmány szerinti antitestek azonban a legtöbb egyéb antigén-antitest reakción alapuló elemzés esetén is használhatók. Ezek az elemzési meghatározások lehetnek homogén vagy heterogén fázisúak. A homogén elemzés esetén a minta egy biológiai folyadék, mint például szérum, vizelet vagy hasonlók, vagy olyan minták, amelyekből sejtlízissel és derítéssel az idegen anyagokat előzetesen eltávolították. Az immunreakcióban részt vevő partnerek: a specifikus antitest, az analízist lehetővé tevő jelzett anyag, és a kérdéses minta. A jelzőanyag által produkált jel általában módosul, ha az antitest a jelzett anyaghoz kötődik. Mind az immunreakció, mind az immunreakció mértékének kimutatása homogén oldatban megy végbe. Immunkémiai jelzőanyagként szabad gyökök, fluoreszcens festékek, enzimek, bakteriofágok, koenzimek stb. használhatók.

Heterogén elemzési mód esetén a résztvevő reakciópartnerek általában a minta, a specifikus antitest és a detektálható jelzést szolgáltató anyag. A mintát általában egy hordozóra, például tálkára vagy üvegle5

HU 208 041 Β mezre tesszük és az antitesttel folyékony fázisban érintkeztetjük. Ezután a hordozót és folyékony fázist elválasztjuk és akár a hordozót tartalmazó szilárd fázist, akár a folyékony fázist detektálható jelre megvizsgáljuk. Kimutatható jel észlelése esetén a minta analizálni kívánt kötést tartalmaz. Kimutatható jel produkálására képes jelzőanyagok a radioaktív jelzett vagy fluoreszkáló anyagok, az enzimek stb. A heterogén immunológiai meghatározások fajtái például a radioimmunológiai, az immunfluoreszcens és az enzimhez kötött immunológiai meghatározások (enzyme-linked immunoassays; például ELISA).

A fenti immunológiai módszereket részletesen a következő források tárgyalják: Edward T. Maggio: Rnzyme-Immunoassay, CRC Press., Inc., Boca Raton, Florida (1980), a 3690834, 3791932, 3817837, 3850578, 3853987, 3867517, 3901654, 3935074, 3984533, 3996345 és 4098876 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások (a felsorolás a teljesség igénye nélkül készült).

A találmány szerinti antitestek NSCLC-betegek metasztázisainak feltérképezésére is felhasználhatók a malignus melanóma esetére leírtakkal [J. Nucl. Med.,

24., 123-129. (1983) és J. Clin. Invest., 72., 21012114. (1983)] analóg módon. Az antitestet vagy fragmenseit radioaktív jelzéssel ellátva intravénásán adjuk be a betegeknek, majd például gamma kamerával felvételt készítünk.

Bár a fenti, a találmány szerinti módszert szemléltető példákban olyan antitestek alkalmazását ismertettük, melyek egér eredetűek és IgM alosztályba tartoznak, és a megfelelő antigének specifikus determinánscsoportjaihoz kötődnek, ez semmiképp sem jelent korlátozást. A találmány tárgyába beleértjük ezeknek az antitesteknek a funkcionális ekvivalenseit is, akár egértől, akár más emlőstől vagy éppenséggel az embertől származnak, beleértjük továbbá ezeknek olyan kombinációit és egyéb izotípusait is, amelyek a találmány szerinti módszernél alkalmazhatóak. „Funkcionális ekvivalens” alatt olyan más antitesteket értünk, amelyek a fent leírt antitesttel azonos determináns helyekhez kötődnek, illetve ezekért a determináns helyekért a fenti antitesttel versenyezni képesek. Más szóval, ha ilyen antitesteket egy, a fenti determináns helyet tartalmazó sejtet vagy sejtfragmenst hordozó mintához keverünk, meggátolja a találmány szerinti antitesteket abban, hogy a kérdéses determinánsokhoz kötődjenek. S minthogy az Le^y és Le* antigéneknek nemcsak egy determinánsuk van, a találmány szerinti eljárás olyan monoklonális antitestek alkalmazására is kiterjed, amelyek a fenti monoklonális antitestek által felismert determinánsoktól eltérő determináns-csoportokat ismerik fel.

A találmány szerinti diagnosztikai módszerekhez szükséges kellékek egy lehetséges sorozatának részei:

a) a fent részletesen definiált monoklonális antitest és

b) a fenti antitestre specifikus kötőpartnerből és a detektálható jel leadására képes jelzőanyagból álló konjugátum. A reagens-jellegű kellékek mellett segédanyagok, így pufferek és protein stabilizálószerek, például poliszacharidok és hasonlók is alkalmazhatók. Szükség esetén további diagnosztikai kellékként jelen lehet a jelzőanyagot tartalmazó rendszerben például olyan anyag, amely csökkenti a tesztnél a háttér-interferenciát, ezenkívül alkalmazható kontroll reagens, jelen van maga a teszt lefolytatásához szükséges készülék és hasonlók. Egy másik lehetséges kelléksorozatban a találmány szerinti antitestből és a detektálható jel leadására képes jelzőanyagból álló konjugátum az egyik kellék, s emellett a fent már felsorolt járulékos segédanyagok is jelen lehetnek.

A találmány szerinti antitestek terápiás célra is alkalmazhatók. Megfelelő biológiai tulajdonságokkal rendelkező antitestek közvetlenül is alkalmazhatók terápiás szerként. [Sears és munkatársai: Contrl. Oncol. Karger, Basel (1984), 19, 180-192). Az antitestek ezenkívül toxinnal immuntoxinná, illetve radioaktív anyaggal vagy gyógyszerrel radiofarmakonná, illetve gyógyhatású anyaggá alakíthatók. Az antitestek immuntoxinná, illetve radiofarmakonná alakíthatósága, illetve a megfelelő módszerek ismertek [például: Cancer Treatment Reports, 68., 317-328. (1984)].

A találmány szerinti monoklonális antitest egy másik terápiás felhasználási területe a beteg immunizálása egy olyan anti-idiotípusos antitesttel, amely a jelen találmány szerinti monoklonális antitestnek mint immunogén anyagnak való alkalmazásakor képződik. Ez az immunizáció aktív daganatellenes hatást idézhet elő [például Nepom és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84., 2864-2867. (1984)]. Hasonló meggondolás alapján a beteg a megfelelő tisztított antigénnel, vagy annak valamely módosított formájával is immunizálható.

A jelen találmány egy figyelemre méltó vonatkozása, hogy a találmány szerinti antitestek más NSCLCantitestekkel, így a 667 521 alapszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (bejelentés napja: 1984. november 2.) leírt antitestekkel kombinációban is alkalmazhatók. A kombináció főként a fent említett tüdőkarcinóma-típusok, azaz óriássejtes differenciálatlan tüdőkarcinóma, kissejtes tüdókarcinóma, adenokarcinóma és epidermális karcinóma kimutatására használhatók.

A találmány szerinti antitestek más karcinomás, így például emlőkarcinómához kapcsolódó antigének determinánsait is felismerik, s következésképpen ezeknek a karcinómáknak a diagnosztizálására és gyógyítására is felhasználhatók.

A találmányt közelebbről példákkal szemléltetjük, előbb azonban megadjuk a példákban említett módszerek leírását.

Immunhisztológiai módszerek

Az immunhisztológiai vizsgálatokat fagyasztott metszeteken a Garrigues és munkatársai által [Int. J. Cancer, 29., 511-515. (1982)] módosított Stemberger módszerrel [Immunochemisry, John Wiley and Sons, New York (1979) 104-169. oldal] jelzetlen antitest alkalmazásával végeztük. A tesztekhez a célsejteket sebészeti úton nyertük, és a sebészeti beavatkozást követő 4 órán belül folyékony nitrogénnel előhűtött izopentánban megfagyasztottuk. A szöveteket ezután a felhasználásig -70 °C-on tároltuk folyékony nitro6

HU 208 041 Β génben. A felhasznált anyagok a következők: nyúl anti-egér IgG (Sternberger-Mayer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) 1:50 arányú hígításban: egér peroxidáz-antiperoxidáz (PAP) komplex (Stemberger-Mayer Immunochemicals, Inc.) 2 mg/ml specifikusan tisztított PAP tartalommal, 1:80 arányú hígításban. A fagyasztott metszetek előállítása, szárítása, acetonos kezelése és újabb szárítása Garrigues és munkatársai fenti módszerével történt. A szövettani vizsgálathoz használt metszeteket hematoxilinnel festettük meg, és a nem specifikus kötődésből adódó zavaró hátteret Garrigues és munkatársai fenti módszerével úgy szorítottuk vissza, hogy a metszeteket 1:5 arányban hígított humán szérummal előzetesen inkubáltuk. Az egér antitesteket, a kecske anti-egér IgG preparátumot, valamint az egér PAP-oldatot egy 10%-os normális humán szérumot és 3%-os nyúl szérumot tartalmazó oldattal hígítottuk.

A festési eljárás során a metszetsorozatot 2,5 órán át a specfikus-, vagy a kontroli-antitesttel kezeltük, 1:50 hígítású nyúl anti-egér IgG-vel 30 percig inkubáltuk, majd 30 percig 1:80 hígítású egér PAP-komplexszel festettük. Az egyes kezelések után a lemezeket foszfáttal pufferolt sóoldattal (phosphate buffered saline; PBS) kétszer lemostuk. Az immunhisztokémiai reakció eredményezte színt 8 percig 0,05%-os 3,3’-diamino-benzidin-tetrahidroklorid-oldattal (Sigma, St. Louis, MO) és 0,05 mólos trisz puffer-oldattal (pH 7,6) készült 0,01%-os hidrogén-peroxid-oldattal előhívjuk, majd a színt 20 percig 1%-os desztillált vizes ozmiumtetraoxid-(OsO₄)-oldattal inenzifikáljuk. Ezután a metszeteket vízzel leöblítjük, alkohollal dehidratáljuk, xilollal tisztítjuk és mikroszkóp tárgylemezére tesszük.

A lemezeken lévő mintákat kódoltuk, s ezután értékeltük ki, majd még egy, a kísérletben nem érdekelt kutató ellenőrizte le az eredményeket. A jellegzetes mintákat Zeiss-Nomarski-féle differenciál interferenciamikroszkópban kontrasztos optikával lefényképeztük. Az antitest festődését a következő tapasztalati skála alapján értékeltük: 0, ha nincs reakció; +, ha néhány pozitívan reagáló sejt van; ++, ha a sejteknek legalább az egyharmada pozitívan reagál; +++, ha a sejtek többsége pozitívan reagál; és ++++, ha szinte minden sejt erősen pozitív reakciót mutat. Minthogy a 0 és a + fokozat közötti különbség kevésbé jól határolható el, mint a ++ és + fokozat közötti, úgy döntöttünk, hogy csak a ++, vagy az annál erősebben festődő mintákat tekintjük „pozitív”-nak. A mintákban mind a daganatsejteket, mind a sztróma-sejteket megfigyeltük; a festődést csak a daganatsejtekre vonatkozóan adjuk meg, mert a sztróma-sejtek vagy egyáltalán nem, vagy csak a tumorsejteknél sokkal gyengébben festődnek meg.

Az antigének sejten belüli elhelyezkedésének meghatározása

Az antigének sejten belüli elhelyezkedését az antitest sejtekhez való kötődésének mérése útján, nem-ionos felületaktív anyaggal történő permeabilizálást megelőzően, vagy azt követően határoztuk meg. Intakt sejttenyészetben a sejtfelülethez kötődő antitesteket vagy közvetlen kötődési elemzéssel, ¹²⁵I-vel jelzett antitest segítségével [Brown és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78., 539-543. (1981)], vagy közvetett módon, fluoreszcens elemzéssel, úgynevezett (FACS) II sejt-osztályozó segítségével határoztuk meg. A sejten belüli kötőhelyekhez kapcsolódó antitesteket úgy határozzuk meg, hogy a sejteket paraformaldehiddel fixáljuk, NP-40 nemionos felületaktív anyaggal permeabilizáljuk, majd a ¹²⁵I-jelzett antitestek sejtekhez való közvetlen kötődését határozzuk meg.

Kötődési vizsgálatok

a) Izotóppal jelzett antitestek alkalmazásán alapuló meghatározás (Brown és munkatársai módszere) esetén a vizsgálandó sejtek (10⁶) tenyészetét 10⁶ cpm ¹²⁵I-jelzett antitesttel 30 percig, 4 °C-on 100 pl, hővel aktivált (30 perc, 56 °C) borjúembrió-szérum táptalajon inkubáljuk. Ezután a tenyészethez 5 ml PBS-oldatot adunk, és a sejteket - 250xg-vel 10 percig centrifugálva - pelletekké alakítjuk. A felülúszót leszívatjuk és a pelletekben a ¹²⁵I-izotóp tartalmat megmérjük. 10 pg, a kötőhelyekért versengő jelzetlen antitest felhasználásával parallel inkubációkat végeztünk és a nem-specifikus kötődést Brown már idézett módszerével meghatároztuk. Bizonyos esetekben a kötődési vizsgálatokat műanyag inkubációs edényekre felvitt egyrétegű sejtkultúrában, s egyébként a fentiekkel analóg módon végeztük.

b) FACS II módszernél sejtosztályozó segítségével végeztünk kötődési vizsgálatokat. A sejteket 5 mM etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) tartalmazó PBS oldattal leválasztjuk a szubsztrátról, majd az lxlO⁵ sejtet tartalmazó mintákat először 2 pg/ml koncentrációjú antitesttel, utána pedig 1:200 hígítású és fluoreszceinhez kapcsolt kecske anti-egér antitesttel inkubáljuk. A sejteket mosás után a táptalajban újra szuszpendáljuk. Közvetlenül a FACS elemzés előtt a nem életképes sejteket 1 pg/ml koncentrációjú propídium-jodiddal megfestjük és az ezekből származó piros fluoreszcenciát a FACS elemzés során elektronikusan kizárjuk, hogy csak az életképes sejtek vizsgálata történjék meg. Ezután az egyes antitestek átlagos fluoreszcein eredetű fluoreszcencia intenzitását meghatározzuk. A vizsgálatoknál antitestet nem tartalmazó, úgynevezett „negatív kontrolF’-mintát és HLA-1 típusú histokompatíbilis antigénhez kapcsolható antitestet tartalmazó, úgynevezett „pozitív kontroll”-t is alkalmaztunk. A festődést akkor tekintettük pozitívnak, ha a csatornán mért átlagos fluoreszcein intenzitás legalább a háttér-érték háromszorosa volt.

Glikolipidekhez kapcsolható antitestek reaktivitásának meghatározása

Az antitestek glikolipid-antigénekkel szembeni reakciókészségét mikroteszt edényekben (koleszterollal és lecitinnel együtt) adszorbeáltatott tisztított glikolipidekkel végzett inkubáció, továbbá a glikolipideket frakcionáló vékonyrétegkromatográfiás lemezek segítségével vizsgáltuk. A megkötött antitestek mennyiségét egér-immunglobulin anti szérummal történő inkubálás és radioaktív jóddal jelzett protein-A segítségével határoztuk meg.

HU 208 041 Β

Izotípus meghatározás

a) Ouchterlony immundiffúziós módszerével

2%-os agar-lemez középső mélyedésébe az adott hibridómasejtek felülúszójából egy aliquot részt teszünk, a külső mélyedésbe pedig monospecifikus nyúl anti-egér lg izotípusoknak megfelelő antitesteket (Meloy) teszünk, majd a lemezt 2 órán át szobahőmérsékleten, azután egy éjszakán át 4 ’C-on inkubáljuk.

b) ELISA-módszerrel edényes flexibilis PVC lemezen (Costar) 37 ’Con 2 órán át 0,1 mg/ml kecske anti-egér lg antitest bevonatot, majd 2 órán át 37 ’C-on 3%-os BSA-oldat ellenbevonatot képzünk. A hibridóma felülúszóját ezután 2 órán át 37 ’C-on inkubáljuk. A borjú szérumalbuminos (BSA) tálkákat PBS-oldattal mossuk és peroxidázhoz (Zymed) kötött monospecifikus nyúl antiegér lg izotípusnak megfelelő antitesttel 2 órán át 37 ’C-on inkubáljuk. A tálkákat mossuk, majd 1 mg/ml koncentrációjú o-fenilin-diamin-oldattal, valamint 0,1 mólos citrát-pufferrel (pH=4,5) készült 0,03%-os hidrogén-peroxid-oldattal inkubáljuk. Az optikai sűrűséget 630 nm-nél Dynatec ELISA készülék segítségével határozzuk meg.

Staphylococcus-eredetű protein-A kötődési vizsgálatok

5% FCS+0,02% nátrium-azid tartalmú BPS-oldatot mikrotiterű edényekben inkubálunk, majd a felülúszót leszívatjuk. Az egyes edényekben 25 μΐ epidermális sejtszuszpenziót (2xl0⁷ sejt/ml) a kérdéses antitest 25 μΐ-ével együtt 1 órán át szobahőmérsékleten inkubálunk. Az egyes preparátumokat 7 percen át 1200 fordulat/perc sebességű centrifugán centrifugáljuk, 50%os NCS/PBS/NaN3-oldattal kétszer mossuk, majd 25 μΐ ¹²⁵I-jelzett Staphylococcus eredetű protein-A-val (körülbelül 50000 cpm/25 liter) 1 órán át 25 ’C-on inkubáljuk. A preparátumokat 5%-os NCS/PBS/NaN3-oldattal kétszer mossuk és megszárítjuk. Az edények fenekét ezután levágjuk és a radioaktivitást gamma számlálóval meghatározzuk.

1. példa

A monoklonális antitestek előállítása

Különböző eredetű emberi szövetek, éspedig (1) metasztázisos stádiumú nem-kissejtes tüdőkarcinómás betegek mellhártya izzadmánya (2) nem-kissejtes tüdőkarcinóma sejttenyészet és (3) 3-4 hónapos humán embriók tüdőszövete - valamelyikével 3 hónapos BALB/c egereket immunizálnak monoklonális antitestek termeltetése céljából. Az immunizáció úgy történt, hogy az egerek hasüregébe 3-4 alkalommal körülbelül 10⁷ sejtet injektáltunk. Az utolsó immunizáció után 3 nappal az állatok lépét eltávolítöttuk, táptalajban szuszpendáltuk és NSL egér mielóma sejtekkel fúzióba hoztuk (Köhler és Milstein már idézett módszere). A keveréket inkubáljuk, hogy a keletkező tenyészet kis sűrűségű legyen és egyes fuzionált sejtekből (kiónok) álljon; az alkalmazott hibridizációs módszert Yeh és munkatársai [Int. J. Cancer, 29., 269-275. (1979)] ismertetik.

A hibrid sejtek felülúszóit az immunizációs célra használt tumorok többek között sejtmembránt is tartalmazó extraktumaival szemben mind ELISA-módszerrel, mind a ¹²⁵I-jelzett protein-A alkalmazásán alapuló autoradiográfos indirekt módszerrel szkrineltük. [Brown és munkatársai: J. Immunoi. Meth. 31, 201— 209. (1979)]. A kérdéses extraktumokat a Colcher és munkatársai által [Cancer Rés., 42., 1451-1459. (1981)] módosított Yeh-féle, már említett módszerrel a következőképpen állítottuk elő. Az intakt tumorokat rozsdamentes acélszűrőkön átpréseltük, PBS-oldattal mostuk, majd szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluoridot (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA) tartalmazó 1 mmólos nátriumhidrogén-karbonátot adtunk és az anyagot jégen Dounce homogenizátor B-törője segítségével 50 ütéssel homogenizáltuk. A homogén anyagot 15 percen át 27 OOOxg-vel centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítöttuk és a pelletet PBS-oldattal újra szuszpendáltuk, 1 percig nagy frekvenciájú hangrezgéssel kezeltük, majd -70 ’C-on tároltuk.

A sejtmembrán extraktumokhoz kötődő antitesteket termelő hibridómákat klónoztuk, in vitro kiterjesztettük és antitest-specifitás tekintetében tovább vizsgáltuk. A vizsgálat a fentiekben ismertetett immunhisztológiai módszerekkel lényegében úgy történt, hogy a keletkezett antitestek kötődési képességét fagyasztott tüdőkarcinómás szövetekkel, egyéb daganatokkal és normális emberi szövetekkel szemben teszteltük. Azokat a hibridómákat, amelyek emberi tüdőrákra specifikus antitesteket termeltek, újra klónoztuk, tovább tenyésztettük és prisztánnal (2,6,10,14-tetrametil-pentadekánnal) itatott 3 hónapos BALB/c egereknek injekcióban beadtuk, amelynek hatására az egerekben ascites tumorok fejlődtek ki.

Az állatok hasüregéből elkülönített antitesteket protein-A Sepharose [Ey és munkatársai: Immunchemistry,

75., 429. (1978)] segítségével vagy Sephacryl S-300 gélen történő gélszűréssel tisztítjuk. A tisztított antitesteket további, a sajátságaik megállapítását célzó tesztekkel, így immunhisztológiai jellegű kiegészítő specifitási teszttel, intakt sejteken végzett kötődési vizsgálatokkal (azt tisztázandó, hogy mely antitestek kötődnek a sejtfelülethez), és radioimmunprecipitációs tesztekkel a fentiekben már ismertetett módon vizsgáltuk.

Az L15 és L17 monoklonális antitesteket a megfelelő, fent leírt hibridómák termelik, és a kapott antitestek a leírásban részletezett tulajdonságokkal rendelkeznek.

A fent leírt immunhisztológiai módszerekkel vizsgálva az L15 és L17 antitestre a következő eredményeket kaptuk:

Az L15 antitest NSCLC-sejtekhez erősen kötődik: a következő sejttípusokhoz viszont nem kötődik: vastagbélrák, emlőrák, normális szív-, agy-, vastagbél-, vese-, lép-, bőr- és májszövet, valamint leukociták.

Az L17 antitest erősen kötődik az NSCLC-sejtekhez, vastagbél-karcinóma- és emlőkarcinóma-sejtekhez. Leukocitákhoz gyengén, normális szív-, agy-, vastagbél-, vese-, lép-, bőr- és májsejtekhez egyáltalán nem kötődik.

Mind az L15, mind az L17 jelzésű sejtvonalat az A.T.C.C.-nél deponáltuk 1985. március 1-jén, ahol HB 8738 és HB 8739 deponálási számot kaptak.

HU 208 041 Β

Bár a találmányt közelebbről a fenti példa szemlélteti, ennek különböző variációit és módozatait is a találmány tárgyához tartozónak tekintjük.

Claims (12)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás L15 monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az ATCC HB8738 sejtvonalat tenyésztjük, majd a keletkezett antitestet elválasztjuk a tenyészettől.
2. 2. Eljárás L17 monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az ATCC HB8739 sejtvonalat tenyésztjük, majd a keletkezett antitestet elválasztjuk a tenyészettől.
3. 3. Eljárás malignus állapot meghatározására vizsgálati alany tüdejében, azzal jellemezve, hogy

   i) a vizsgálati alany tüdőszövetéből vett mintát az emberi nem-kissejtes tüdőkarcinómára jellemző Le^Y felületi szénhidrát antigént felismerni képes L15 antitesttel hozzuk érintkezésbe, és ii) meghatározzuk a tüdőben jelen lévő malignus állapotra jellemző, az antitest és sejtek közötti kötődés létrejöttét.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kötődés mértékét egy detektálható jelet adó jelzőanyagból és az L15 monoklonális antitesttel specifikusan kötődni képes anyagból álló konjugátumot alkalmazva határozzuk meg.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az L15 monoklonális antitesttel specifikusan kötődni képes jelzett anyagként egy, a humán IgM-re specifikus antitestet alkalmazunk.
6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jelzőanyagként egy kromofórt alkalmazunk.
7. 7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kötődés létrejöttét az L15 antitestet egy detektálható jel adására képes jelzőanyaggal konjugálva határozzuk meg.
8. 8. Eljárás malignus állapot meghatározására vizsgálati alany tüdejében, azzal jellemezve, hogy

   i) a vizsgálati alany tüdőszövetéből vett mintát az emberi nem-kissejtes tüdőkarcinómára jellemző Le* felületi szénhidrát antigént felismerni képes L17 antitesttel hozzuk érintkezésbe, és ii) meghatározzuk a tüdőben jelenlevő malignus állapotra jellemző, az antitest és sejtek közötti kötődés létrejöttét.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kötődés mértékét egy detektálható jelet adó jelzőanyagból és az L17 monoklonális antitesttel specifikusan kötődni képes anyagból álló konjugátumot alkalmazva határozzuk meg.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az L17 monoklonális antitesttel specifikusan kötődni képes jelzett anyagként egy, a humán IgM-re specifikus antitestet alkalmazunk.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelzőanyagként egy kromofórt alkalmazunk.
12. 12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kötődés létrejöttét az L17 antitestet egy detektálható jel adására képes jelzőanyaggal konjugálva határozzuk meg.