NO168311B - Monoklonale antistoffer for humane ikke-smaacelle lungekarsinomer, cellelinjer som produserer disse samt diagnostisksett - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører monoklonale antistoffer

for humane ikke-småcelle lungekarsinomer, cellelinjer som produserer disse samt diagnostisk sett.

Humane lungekar si norner er ansvarlige for de fleste dødsfallene forårsaket av kreft blant menn og er i ferd med å overta for brystkarsinom; som den vanligste dødsårsaken forårsaket av kreft blant kvinner (Cancer Facts and Figures, 1983). Denne sykdommen kan inndeles i fire hovedhistologiske typer, dvs. epidermoid (30%), adenokarsinom (35%), storcelle udifferensiert (15%) og småcelle (20%). De fleste tilfeller av lungekarsinom kan ikke helbredes ved kjemoterapi eller bestrålingsterapi. Småcelle-lungekarsinom kan vise respons på kjemoterapi og strålingsterapi ved en reduksjon i størrel-se, men viser ikke en fullstendig helbredelse. Fullstendig kirurgisk fjernelse av tumoren synes å være den eneste effek-tive behandlingen. Uheldigvis har imidlertid færre enn 30%

av lungekreftpasientene tumorer som fullstendig kan skjæres bort ved diagnosen og av disse overlever mindre enn 1/3 5 år etter tilsynelatende fullstendig kirurgisk fjernelse av hele tumoren. Det foreligger følgelig et stort behov for fremgangsmåter som kan muliggjøre en tidligere diagnose av lungekreft, en bedre definisjon av graden av kreftspredning, og en mer effektiv behandling.

Monoklonale antistoffer kan benyttes for alle disse formålene. En forutsetning er imidlertid å finne antistoffer til antigener som utvikles sterkere i lungekreft enn i normalt voksent vev. På bakgrunn av den kjente heterogeniteten for tumorcellepopulasjoner, nærværet av flere determinanter på

det samme antigenmolekylet, de forventede forskjellene mellom antigener med hensyn til deres egnethet som diagnostiske markø-rer med hensyn til det terapeutiske formål, og de forskjellige biologiske egenskapene for forskjellige antistoffer til det samme antigenet, kan et antall forskjellige antistoffer være påkrevet.

Humane monoklonale antistoffer til lungekreftantigener er beskrevet av Sikora et al. , Br. J. Cancer (1981) 4_3; 696-700. Monoklonale antistoffer som viser spesifisitet for flere typer av human lungekreft er beskrevet av Cuttitta et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. (1981) 78: 4591-4595. Antigener forbundet med et humant lungeadenokarsinom definert ved monoklonale antistoffer er beskrevet av Varki et al., Cancer Research (1984) 44: 681-687.

Muse-monoklonale antistoffer til glykolipid Le antigener er beskrevet av Hakomori et al., i Biochemical and Biophysical Research Communications (1981) 100: 1578-1586; Brockhaus et al., Arch. Biochem. Biophys. (1982) 217: 647; Fukushi et al. , J. Biol. Chem. (1984) 259: 506; Fukushi et al. J. Exp. Med. (1984) 159:506; Chia et al., Cancer Res. (1985) 45:435. Antistoffer til LeJ y antigener er beskrevet av Abe et al., J. Biol. Chem.(1983) 258:8934; Lloyd et al., Immuno-genetics (1983) V7:537; Brown et al., Biosci. Rep. (1983) 3:163.

Kontinuerlige kulturer av sammensmeltede celler som utskiller antistoff av på forhånd definert spesifisitet er beskrevet av Køhler et al., Nature (1975) 265:495-497.

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye monoklonale antistoffer som definerer determinantseter på karbohydrat (glykolipid) antigener forbundet med humane ikke-småcelle kar sinomceller (NSCLC) (human non^small cell lung carcinoma)-celler. Betegnelsen "NSCLC-celler" innbefatter epidermoide karsinornceller , adenokarsinomceller, og storcelle-udif fe-rensierte karsinornceller. Determinantsetet kan også finnes på antigener av andre karsi norner, f.eks. enkelte karsinomer i brystet, og følgelig vil antistoffene ifølge oppfinnelsen også bindes til disse andre karsinomcellene. Foreliggende monoklonale antistoffer bindes i mye mindre grad til normale voksne celler enn til tumorceller. Betegnelsen "bindes i en mye mindre grad" betyr at bindingen ikke vil være detekterbar ved immunohistologiske teknikker og at det vil være en mye svakere binding til normale celler enn til tumorceller. De monoklonale antistoffene utskilles ved hjelp av murine hybr i domer .

Foreliggende oppfinnelse vedrører monoklonalt antistoff av IgM isotypen eller en Fab, F(ab')2 eller Fv fragment derav, for in vitro anvendelse som er kjennetegnet ved at det er produsert av hybridomcellei injen ATCC HB 8738, hvis antigen-kombinerende sete definerer Le<y>, et overflatekarbohydrat-antigen karakteristisk for humane, ikke-småcelle lungekarsinomer og som kan konjugeres til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre monoklonalt antistoff av IgM isotypen betegnet L17, eller Fab, F(ab')2

eller Fv fragment derav, for in vitro anvendelse som er kjennetegnet ved at det er produsert av hybridom cellelinjen ATCC HB 8739, hvis ant igen-kombinerende sete definerer Le ,

et overflate-karbohydratantigen som er karakteristisk for humane ikke-småcelle lungekarsinomer og som kan konjugeres til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal.

Oppfinnelsen vedrører videre en cellelinje, kjennetegnet ved at den er deponert ved ATCC HB 8738 og produserer monoklonalt antistoff L15, i henhold til ovenstående.

Oppfinnelsen omfatter videre en cellelinje som er kjennetegnet ved at den er deponert ved ATCC HB 8739 og produserer monoklonalt antistoff L17 i henhold til oven-st ående.

Nærværet av en ondartet tilstand i lungen bestemmes

ved å undersøke lungevev og annet, menneskelig vev for nær-

været av et antigen som har egenskapene for Lex og Le^ antic- r;f: . Le X antigenet er beskrevet av Hakomori et al., supra; Brockhaus et al., supra; Fukushi et al., supra; og Chia et al., supra. Le^ antigenet er beskrevet av Abe et al., supra,

Lloyd et al., supra, og Brown et al., supra.

F. eks. kan vev fra et objekt bringes i kontakt med

et antistoff som definerer et determinantsete på et celle-tilknyttet karbohydratantigen som er LeV J eller Le x eller som har egenskapene for LeJ v eller Le x eller en funksjonell ekvi-vcient eller et fragment av et slikt antistoff.

Det foreligger visse diagnostiske fremgangsmåter

hvor de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen an-

vendes. En slik fremgangsmåte innbefatter bestem-

meisen av nærværet av NSCLC-celler i en prøve som mistenkes for å inneholde slike celler. Prøven bringes i kontakt med det monoklonale antistoffet som er i stand til å skille slike celler fra andre celletyper som kan være tilstede i prøven. Kontakten utføres under betingelser for binding av antistoffet til slike celler. Etter kontakt bestemmes nærværet eller fraværet av binding for antistoffet til cellene i prøven. Denne binding er knyttet til nærværet eller fraværet av NSCLC-celler i prøven. Generelt bringes prøven i kontakt med en merket spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoffet. Dette merket er i stand til å produsere et detekterbart signal. En annen diagnostisk fremgangsmåte innbefatter lokaliseringen av en tumor av antistoffer eller antistoffragmenter som er merket på egnet måte (f.eks. med en radioisotop) og injiseres deretter i pasienter. Denne fremgangsmåten kan tilveiebringe bedre måter å vurdere kreftpasienter på når det gjelder omfanget av sykdommen og å overvåke endringer som respons på behandling.

Antistoffene kan reagere med et hvilket som helst eller begge de ovenfor nevnte antigenene som utvikles i høye konsentrasjoner ved overflaten av tumorcellen. Den kan følgelig benyttes som en bærer for forskjellige midler som har en anti-tumorvirk-ning, innbefattende, men ikke begrenset til, kjemoterapeutis-ke legemidler og radioisotoper.

De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved standardteknikkene ifølge Køhler og Milstein, supra. F.eks. anvendes humane lungekarsi-nomceller fra flere effusjoner eller kultiverte celler fra normale ikke-småcelle lungekarsinomer,eller celler fra en normal fosterlunge, som immunogenet. Disse cellene injiseres i en mus og, etter et tilstrekkelig tidsrom, avlives musen og miltceller oppnås. Miltcellekromosomene som koder for ønskede immunoglobuliner gjøres udødelige ved sammensmelt-

ning av miltcellene med myelomceller eller med lymfomceller, generelt i nærvær av polyetylenglykol. De resulterende cellene, som innbefatter de sammensmeltede hybridomene, får gro i et selektivt medium, så som HAT-mediet, og de overlevende cellene

gros i slikt medium ved anvendelse av begrensende fortynnings-betingelser. Cellene gros i en egnet beholder, f.eks. mikro-titerbrønner, og supernatanten undersøkes med hensyn på monoklonale antistoffer som har den ønskede spesifisiteten.

Forskjellige teknikker finnes for å forøke utbyttene av monoklonale antistoffer, så som injeksjon av hybridom-cellene i bukhulen på en pattedyrvert som eksepterer cellene, og deretter høsting av bukvæsken. I tilfeller hvor util-strekkelig mengde av det monoklonale antistoffet samler seg i bukvæsken høstes antistoffet fra vertens blod. Forskjellige konvensjonelle fremgangsmåter eksisterer for iso-lering og rensing av de monoklonale antistoffene, slik at de monoklonale antistoffene frigjøres fra andre proteiner og andre forurensinger (se Køhler og Milstein, supra).

Et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er betegnet L15. Det definerer et celleoverflatekarbo-hydratantigen som er, eller har egenskapene for, LeJ y antigenet. Dette antigenet er identifisert som karakteristisk for humane NSCLC-celler og celler fra visse andre humane karsinomer.Antistoffet er av IgM-isotypen. Det bindes ikke detekterbart til normale celler, så som fibroblaster, endotelceller, eller epitelceller i hovedorganene. L15 antistoffet produseres av L15 muriné hybridomer.

Et annet monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er betegnet L17. Det definerer en celleoverflate-karbohydratdeterminant som er, eller som har egenskapene for, Le antigenet. Dette antigenet er også identifisert som karakteristisk for humane NSCLC-celler og celler fra visse andre humane karsinomer. Dette antistoffet er av IgM isotypen. Det bindes mindre til normale celler, så som fibroblaster, endotelceller, eller epitelceller i hovedorganene enn til tumorceller. L17-antistoffet produseres av det L17 murine hybridomet.

Antistoff L15 gjenkjenner antigen Le^ som har strukturen angitt nedenfor:

En serie av glykolipider med forskjellige kjedelengder kan detekteres av dette antistoffet.

Antistoff L17 reagerer med en serie glykolipid-antigener, hvorav alle bærer Le ved terminalen, dvs.: R kan være forskjellige lengder av blodgruppe type 2 kjede

Antistoffet reagerer også med trifukosyl-Y-strukturen som vist nedenfor:

Innbefattet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er nyttige bindingsfragmenter av de ovenfor nevnte monoklonale antistoffene så som Fab, F(ab')2, Fv-fragmenter osv. Antistoffragmentene oppnås ved konvensjonelle teknikker. F.eks. kan nyttige bindingsfragmenter fremstilles ved peptid-asenedbrytning av antistoffet ved anvendelse av papain eller pepsi n.

Oppfinnelsen kan utnyttes diagnostisk og terapeutisk, ved detektering og behandling av NSCLC karsinomer i mennesker, av Lev -' eller Le x antigen eller antigener som egenskapene for Lex og Le^ antigener, dvs. antigener som er beslektet med, men ikke identiske med Le^ eller Lex og som gjenkjennes av et antistoff som også gjenkjenner Le^ eller Lex. Antigenet kan renses ved konvensjonelle fremgangsmåter, f.eks. som beskrevet av Hakomori et al., supra, og av Abe et al., Supra.

En fremgangsmåte innbefatter bestemmelsen av nærværet av en ondartet tilstand i lungen av et objekt ved undersøkelse av lungevev eller annet vev fra objektet for nærværet av et. karbohydratantigen, som er Le^ eller Lex, eller som har egenskapene for Le<y> eller Lex. Betegnelsen "vev" refererer til utskårne celler, utstøtte celler, kroppsvæsker så som blod, plasma, serum, urin osv.

og lignende. Betegnelsen "ondartet tilstand" refererer til nærværet av dysplastiske celler innbefattende karsinomer in situ, neoplastiske, ondartede, eller tumorceller, eller lignende. F.eks. kan prøven bringes i kontakt med eller blandes med et monoklonalt antistoff som gjenkjenner et determinantsete på Le<y> eller Le<x>,så som et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, f.eks. som L15 eller L17 antistoff eller et antistoff som har tilsvarende egenskaper som f.eks. antistoffene beskrevet av Hakomori et al., supra, Fukushi et al., su<p>ra, Chia et al♦, supra, Abe et al., supra, Lloyd et al., supra, og Brown et al., supra. Kontakten utføres under betingelser for binding av antistoffet til de ondartede cellene. Etter kontakt observeres nærværet av binding av antistoffet til de ondartede cellene i prøven. Dvs. prøven undersøkes ved-rørende immunkomplekser av antistoffet og det antigeniske setet. Denne immunkompleksdannelsen er forbundet med nærværet av ondartede celler i prøven.

Et spesielt eksempel på en fremgangsmåte er en fremgangsmåte for detektering av tumorceller i utskåret ve". Fremgangsmåten ovenfor anvendes på en prøve som er en del ev tumoren som oppnås etter, uttagning av tumoren. Den utskårne tumoren behandles slik at man oppnår deler, denne behandlingen innbefatter innledningsvis nedbrytning av tumoren eller vevet, normalt nedfrysning øyeblikkelig etter utskjæring.

Det frosne laget av vevet skjæres deretter i deler ved anvendelse av f.eks. en kryostat.

Delen av tumoren oppnådd som beskrevet ovenfor bringes i kontakt med et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen og deretter med et andre antistoff rettet mot det ovenfor nevnte monoklonale antistoffet, det andre antistoffet er merket med et detekterbart merke.

Den utskårne prøven, f.eks. delen av tumoren, bringes i kontakt med det første monoklonale antistoffet under betingelser for binding av antistoffet til de ondartede cellene. Inkuberingen gjennomføres generelt i et vandig medium så som f.eks. fosfatbufret saltvannsoppløsning inneholdende en liten mengde natriumazid, i en egnet beholder så som f.eks. en glasspetriskål, i et tidsrom fra 15 til 30 minutter ved en temperatur på fra 20 til 30°C. Mengden av det stoff som anvendes er vanligvis tilstrekkelig til å tilveiebringe detekterbar binding, dvs. til å tilveiebringe et detekterbart antall immunkomplekser mellom antistoffet og den aktuelle determinanten eller det antigeniske setet.

Etter inkuberingen vaskes seksjonen for å redusere eller eliminere ikke-spesifikt bundet antistoff og under-

søkes deretter for å observere de ovenfor nevnte kompleksene som skyldes binding mellom det monoklonale antistoffet og cellene av prøven som har det antigeniske setet. Bindingen er forbundet med nærværet av ondartede celler i delen. Føl-gelig bestemmes binding f.eks. ved å bringe prøven i kontakt med en merket spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoffet. Merket er i stand til å produsere et detekterbart signal og kan være et radioaktivt merke, en kromofor så som et fluorescerende stoff, et enzym eller lignende.

Et eksempel på en teknikk hvor fremgangsmåten ovenfor anvendes er immunofluorescensfarging. Ved denne teknikken festes frosne deler av tumoren på en glassplate med aceton og inkuberes med det monoklonale antistoffet,f.eks. på en petriskål. Etter vasking med en egnet buffer så som f.eks. fosfatbufret saltvannsoppløsning plasseres delen på en petriskål og bringes i kontakt med den merkede spesifikke bindings-partneren for det monoklonale antistoffet som f.eks. kan være et merket antistoff som er spesifikt for det monoklonale antistoffet som anvendes. Siden det monoklonale antistoffet først og fremst vil være avledet fra en murinkilde kan det anvendes et merket anti-mus immunoglobulin som er spesifikt for det monoklonale antistoffet. Slike immunoglobuliner kan dyrkes ved standardteknikker ved å injisere en egnet vert med murint antistoff, vente i et egnet tidsrom, og høste anti-mus immunoglobulinene fra blodet hos den injiserte verten .

Etter en andre vasking av glassplaten med f.eks. en vandig buffer kan delen dekkes med en fluorescerende anti-stoffmonteringsvæske og et dekkglass og deretter undersøkes ved hjelp av et fluorescensmikroskop for å bestemme bindingen av det monoklonale antistoffet til delen. Bestemmelsen av bindingen kan også innbefatte en identifisering av lokasjonen for slik binding innenfor prøven.

Bindingen av det monoklonale antistoffet til prøven kan også bestemmes ved å anvende et monoklonalt antistoff som er kovalent konjugert til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal, så som en radioaktiv enhet, en kromofor innbefattende fargestoffer og fluorescerende stoffer, eller et enzym. Antallet merker som anvendes pr. antistoff bestemmes generelt av kravene til den diagnostiske fremgangsmåten hvori det merkede antistoffet anvendes og tilgjengeligheten av seter for binding av merket til antistoffet.

Fremgangsmåter for konjugering av merker til antistoffer og antistoffragmenter er velkjente innen teknikken. Slike fremgangsmåter kan finnes i US-patentene nr. 4 220 450; 4 235 869; 3 935 074; og 3 996 345.

Et annet eksempel på en teknikk hvori de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes er deteksjonen av molekyler som bærer Le x og LeJ v determinantene i kroppsvæsker innbefattende plasma og serum. For dette formål kan antistoffet ifølge oppfinnelsen anvendes alene eller sammen med et annet antistoff rettet mot en separat determinant.

Nok et eksempel på en teknikk hvori det monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen kan anvendes er immunoper-oksydasemerking (Sternberger, Immunocytochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1979, side 104-169, som modifisert av Garriques et al. , Int. J. Cancer (1982) 29^.: 511-515) . Vevet som skal undersøkes fikseres med et egnet oppløsningsmiddel, så som aceton, på en bærer som f.eks. et preparatglass. Deretter inkuberes vevet med det monoklonale antistoffet og vaskes deretter fritt for ubundet antistoff. Deretter inkuberes vevet med kanin anti-mus IgG, vaskes for å fjerne ubundet antistoff, blandes med museperoksydase-anti-peroksy-dasekompleks, vaskes for å fjerne ubundet konjugat, og behandles deretter med substrat for enzymet. Etter denne behandlingen undersøkes glasset for et detekterbart signal.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved en fremgangsmåte for bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand, f.eks. i en prøve av utstøtte celler fra lungen, så som spytt eller i en servikal utsmøring. Med betegnelsen "utstøtte" menes det at prøven innbefatter isolerte celler eller klumper av celler som er oppnådd ved skraping eller vasking av overflaten av vevet, disse cellene fjernes indi-viduelt eller i lag eller laminater. Det bør skilles mellom utstøtte celleprøver og utskåret vev som oppnås ved biopsi. Kontakt mellom prøven og antistoffet utføres under betingelser for binding av antistoffet til det antigeniske setet. Etter kontakt bestemmes nærværet eller fraværet av binding av antistoffet til det antigeniske setet og dette er forbundet med nærværet av en ondartet tilstand i lungen.

For å bestemme nærværet av en ondartet tilstand i lungen kan en spyttprøve tilveiebringe den prøven av utstøtte celler som anvendes ved fremgangsmåten. Fremgangsmåten kan finne anvendelse ved deteksjon av en ondartet tilstand i prøver av utstøtte celler fra bronkiene, gastro-intestinal-trakten innbefattet svelget, munnen osv.

Prøven av utstøtte celler bringes så i kontakt med de tidligere nevnte antistoffene under betingelser for binding av antistoffet til det spesifikke antigeniske setet i prøven slik at det dannes antigen-antistoffkomplekser. Dette antigeniske setet kan være tilstede på celler eller celle-fragmenter i prøven. Generelt plasseres prøven på en egnet bærer som f.eks. en preparatholder, vanligvis av glass, eller annet egnet materiale. Prøven av utstøtte celler utsmøres generelt på preparatholderen slik at det tilveiebringes et tynt lag av prøven på overflaten av preparatholderen. Kontakten mellom antistoffet og prøven utføres generelt i et vandig bufret medium. Bufferne som kan anvendes innbefatter fosfat, tris, bikarbonat, osv. pH-verdien er knyttet til naturen av prøven og antistoffet, og ligger generelt i om-rådet fra 5 til 8. Det vandige medium kan i tillegg inneholde organiske polare oppløsningsmidler i en mengde på fra

0 til 40%. De organiske polare oppløsningsmidlene er vannoppløselige og inneholder generelt fra 1 til 10 kar-

bonatomer og fra 1 til 4 oksygenatomer. Antistoffet vil være tilstede i det vandige mediet ved en konsentrasjon på 1 til 100 ug/ml, fortrinnsvis fra 10 til 20 yg/ml. Temperaturen under kontakten av prøven med antistoffet er vanligvis fra 4 til 40°C, fortrinnsvis 10 til 30°C. Kontaktperioden er vanligvis fra 15 til 120 minutter, fortrinnsvis fra 30 til 60 minutter.

Etter kontaktperioden mellom prøven og antistoffet behandles bæreren generelt for å fjerne uomsatt antistoff. Normalt oppnås dette ved å vaske bæreren med et vandig, vanligvis bufret medium. Generelt bør mengden av vaskeoppløs-ning være tilstrekkelig til å fjerne det uomsatte antistoffet. Deretter observeres nærværet av antistoff bundet til det antigeniske setet i prøven, denne bindingen er forbundet med nærværet av en ondartet tilstand på stedet. Dvs. prøven under-søkes for å bestemme antallet antigen-antistoff (immun)-sluttkomplekser som er dannet. Det bør bemerkes at i noen tilfeller kan et svært lite antall av de aktuelle antigeniske setene finnes i prøver av utstøtte celler. Ved en ondartet tilstand vil imidlertid et stort antall av de antigeniske setene være tilstede og denne sistnevnte tilstanden kan lett adskilles ved denne fremgangsmåten fra en ikke-ondartet tilstand, fordi et stort antall antigen-antistoffkomplekser vil være målbare når en ondartet tilstand foreligger. For å ut-føre bestemmelsen av nærværet av binding innbefattes innretninger for produksjon av et detekterbart signal i analyse-systemet. F.eks. kan man konjugere antistoffet som anvendes i analysen med et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal. Merket kan være en radioaktiv enhet,

en kromofor innbefattende fargestoffer og fluorescerende stoffer, et enzym eller lignende. Antallet merker som anvendes for antistoffet bestemmes generelt av de kravene fremgangsmåten stiller og tilgjengeligheten av seter for binding av merket til antistoffet.

Alternativt kan man bringe det vaskede preparatglasset i kontakt med en merket spesifikk bindingspartner for antistoffet, denne kan f.eks. være et merket antistoff som er spesifikt for antistoffet som anvendes. Der hvor det monoklonale antistoffet er avledet fra en murin kilde kan et merket anti-mus immunoglobulin som er spesifikt for antistoffet anvendes i fremgangsmåten. Slike immunoglobuliner kan dyrkes ved standard teknikker ved å injisere en egnet vert med det monoklonale antistoffet, vente i et egnet tidsrom, og høste anti-mus immunoglobulinene fra blodet til den injiserte verten. Når en merket spesifikk bindingspartner for antistoffet anvendes må preparatglasset igjen vaskes med et vandig medium før det undersøkes vedrørende fluorescens.

For å bestemme nærværet av binding mellom antistoffet og celleprøven der hvor et fluorescerende merke anvendes kan man undersøke preparatglasset vedrørende fluorescens ved f.eks. å anvende et fluorescensmikroskop. I tilfeller hvor det anvendes et annet merke enn et fluorescerende merke kan man undersøke preparatglasset eller prøven vedrørende dannel-se av et bunnfall, en farge eller lignende.

Beskrivelsen ovenfor er primært rettet mot anvendelsen av antistoffene ifølge oppfinnelsen ved immunofluorescens-teknikker. Imidlertid kan antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes i de fleste analyser som innbefatter antigen-anti-stof f reaksjoner . Analysene kan være homogene eller heterogene. Ved en homogen analysefremgangsmåte kan prøven være biologisk væske så som serum, urin, og lignende eller prøven kan lyseres eller klargjøres for å fjerne forurensninger. Den immunologiske reaksjonen innbefatter vanligvis det spesifikke antistoffet, en merket analytt, og prøven av interesse. Signalet som oppstår fra merket er modifisert, direkte eller indirekte, ved bindingen av antistoffet til den merkede analytten. Både den immunologiske reaksjonen og deteksjonen av omfanget derav utføres i en homogen oppløsning. Immunokjemiske merker som kan anvendes innbefatter frie radikaler, fluorescente fargestoffer, enzymer, bakteriofager, koenzymer osv.

Ved en heterogen analysefremgangsmåte er reagensene vanligvis prøven, det spesifikke antistoffet, og innretninger for produksjon av et detekterbart signal. Prøven plasseres generelt på en bærer, så som en plate eller et preparatglass, og bringes i kontakt med antistoffet i en flytende fase. Bæreren separeres deretter fra væskefasen og enten bærerfasen eller væskefasen undersøkes for et detekterbart signal ved anvendelse av innretninger for produksjon av et slikt signal. Signalet er forbundet med nærværet avanalytten i prøven. Innretninger for produksjon av et detekterbart signal innbefatter anvendelsen av radioaktive merker, fluorescerende for-bindelser, enzymer, osv. Eksempler på heterogene immunoanalyser er radioimmunoanalyser, immunofluorescensfremgangsmåter, enzym-bundede immunoanalyser og lignende.

For en mer detaljert diskusjon av immunoanalysetek-nikkene ovenfor, se "Enzyme-Immunoassay" av Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Se også f.eks. US-patentene nr. 3 690 834; 3 791 932; 3 817 837; 3 850 578; 3 853 987; 3 867 517; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345 og 4 098 876, denne listen er ikke ment å være ut-tømmende .

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes til å danne et bilde av metastatiske avsetninger hos mennes-kelige pasienter med NSCLC på en måte som er analog fremgangsmåten beskrevet for ondartede melanomer i J. Nucl. Med.

(1983) 24:123-129 og i J. Clin. Invest. (1983) 72:2101-2114. Antistoffet eller fragmentene derav radiomerkes og admini-streres intravenøst til en pasient som senere undersøkes ved anvendelse av f.eks. et gammakamera eller lignende.

Selv om de ovenfor angitte spesifikke eksemplene på fremgangsmåter anvender antistoffer som bindes spesifikt til determinantseter på de respektive antigenene og er av IgM underklassene fra en murinkilde er dette ikke nødvendig-vis tilfelle. Antistoffene ovenfor og de antistoffene som har funksjonell ekvivalens med antistoffene ovenfor, enten de er fra en murinkilde, andre pattedyrkilder innbefatter mennesker, eller andre kilder, eller kombinasjoner derav kan anvendes i fremgangsmåten, såvel som andre isotyper. Med betegnelsen "funksjonell ekvivalens" menes det at antistoffet er i stand til binding til en hvilken som helst av de ovenfor omtalte determinantsetene og i stand til å kon-kurrere med et spesielt antistoff ifølge oppfinnelsen for et slikt sete. Det vil se at et slikt antistoff vil, når det blandes med en prøve som inneholder en celle eller celle-fragmenter eller utskilt antigen som et slikt determinantsete, bindes til et slikt determinantsete og vil blokkere et antistoff ifølge oppfinnelsen fra binding til et slikt sete. Siden videre Le^ og Lex antigenene kan ha mer enn ett determinantsete kan det ved fremgangsmåten anvendes monoklonale antistoffer sorn definerer andre determinantseter definert ved hjelp av de tidligere nevnte monoklonale antistoffene.

Oppfinnelsen innbefatter videre et diagnostisk

sett som er kjennetegnet ved at det innbefatter (a) et monoklonalt antistoff L15 som beskrevet ovenfor eller L17 som beskrevet ovenfor, hvor antistoffet definerer et determinantsete på et celleoverflate-karbohydratantigen som er henholdsvis Le<y> eller Lex antigen, og (b) et konjugat av et merke, f.eks. et fluorescerende stoff, som er en del av et signalproduserende system og en spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoffet ifølge (a) ovenfor.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes terapeutisk. Antistoffer med de egnede biologiske egenskapene kan være nyttige direkte som terapeutiske midler Sears, et al, Contrl. Oncol. Karger , Basel, (1 984) 1_9 :1 80-1 92) . Videre kan antistoffer være bundet til et toksin slik at det dannes et immunotoksin eller til et radioaktivt materiale eller en me-disin slik at det dannes en radiofarmasøytisk forbindelse eller en farmasøytisk forbindelse. Fremgangsmåter for fremstilling av immunotoksiner og radiofarmasøytiske forbindel-ser av antistoffer er velkjente (se f.eks. Cancer Treatment Reports (1984) 68^:317-328).

En annen terapeutisk anvendelse av det monoklonale antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse er immuniseringen av en pasient med et anti-idiotypisk antistoff dyrket ved å anvende et av de foreliggende monoklonale antistoffene som et immunogen. Slik immunisering kan indusere en aktiv anti-tumoraktivitet (se f.eks. Nepom et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. (1984) 8M: 2864-2867). Ved en tilsvarende fremgangsmåte kan pasienten immuniseres med det respektive antigenet i renset form eller en modifisert form av de respektive antigenene.

Et fordelaktig trekk ved foreliggende oppfinnelse er at de foreliggende antistoffene kan blandes med andre antistoffer til NSCLC, som de som er beskrevet i US-patentsøk-nadene nr. 667 521 og 684 759, inngitt henholdsvis 2. novem-ber 1984 og 21. desember 1984. Kombinasjonen er effektiv ved detektering av minst de fire typene .lungekarsinomer omtalt ovenfor, nemlig storcelle udifferensiert lungekar sinom., småcelle lungekarsinom , adenokarsinom;, og epidermoid kar-, sinom .

De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen definerer også determinantseter på antigener knyttet til andre karsinomer,så som brystkarsinom. Følgelig kan foreliggende antistoffer finne anvendelse i diagnostiske og terapeutiske produkter som er rettet mot slike karsinomer.

Eksempler

Oppfinnelsen beskrives ytterligere ved hjelp av de følgende illustrerende eksemplene. Et antall fremgangsmåter som anvendes vil først bli beskrevet.

Immunohistologisk teknikk

For immunohistologiske studier av frosne seksjoner ble den umerkede antistoffteknikken ifølge Sternberger i Immunochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1979, side 104-169, modifisert av Garriques et al. i Int. J. Cancer (1982) 29^:511-515, benyttet. Målvevene for disse forsøkene ble oppnådd ved kirurgi og nedfrosset i løpet av 4 timer etter fjernelse i isopentan som på forhånd var avkjølt i flytende nitrogen. Vevet ble deretter lagret i flytende nitrogen eller ved -70°C inntil anvendelsen. Kanin-anti-mus IgG (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) ble anvendt ved en fortynning på 1/50. Musperoksydase-antiperoksydase-kompleks (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc..) inneholdende 2 mg/ml av spesifikt renset PAP ble benyttet ved en fortynning på 1/80. Nedfrosne seksjoner ble preparert, tørket, behandlet med aceton og tørket (Garriques et al., 1982). Seksjoner for anvendelse ved histologisk bedømmelse ble farget med hematoksylin. For å redusere ikke-spesifikk bakgrunn ble seksjoner forinkubert med normalt humant serum fortynnet 1/5 (Garriques et al., 1982). Mus antistoffer, geit anti-mus IgG, og mus PAP ble fortynnet i en oppløsning av 10% normalt humant serum og 3% kaninserum.

Fargefremgangsmåten besto av behandling av serier av seksjoner med enten spesifikt eller kontrollantistoff i 2,5 timer, inkubering i 30 minutter med kanin-anti-mus IgG fortynnet 1/50, og eksponering i 30 minutter til mus PAP-kompleks fortynnet 1/80. Etter hver behandling med antistoff ble pre-paratholderne vasket to ganger i fosfatbufret saltvannsopp-løsning (PBS). Den immunohistokjemiske reaksjonen ble ut-viklet med nyfremstilt 0,05% 3,3<1->diaminobenzidintetrahydro-klorid (Sigma, St. Louis, MO) og 0,01% hydrogenperoksyd i 0,05 M trisbuffer, pH 7,6 i 8 minutter. Ytterligere eksponering til en 1 % OsO^-op<p>løsning i destillert vann i 20 minutter intensiverte fargen. Seksjonene ble renset med vann, dehydrert i alkohol, klargjort i xylen, og montert på prepa-ratholdere.

Preparatglassene ble avlest under kode og kodede prøver ble kontrollert av en uavhengig forsker. Typiske pre-<p>arater ble fotografert ved anvendelse av optisk utstyr med differerisiell interferenskontrast (Zeiss-Nomarski). Graden av antistoffarging ble vurdert som 0 (ingen reaktivitet), +

(få positive celler), ++ (minst en tredjedel av cellene positive) , +++ (de fleste cellene positive), ++++ (tilnærmet alle cellene sterkt positive). Siden forskjellene mellom +

og 0 farging var mindre klare enn mellom ++ og + farging,

ble det bestemt å regne som "positiv" en farging gradert som ++ eller større. Både neoplastiske celler og stromaceller ble observert i tumorprøver; den registrerte fargingen refererer til den for tumorcellene siden stromacellene ikke ble farget i det hele tatt, eller ble farget svakere enn tumorcellene.

Bestemmelse av antigenlokasjon

Lokaliseringen av antigener innenfor cellene ble bestemt ved å måle antistoffbinding til celler før eller etter gjennomtrengning med ikke-ionisk rensemiddel. Antistoffer som bindes til celleoverflaten av intakte kultiverte celler ble identifisert enten ved direkte bindingsanalyser

125

med I-merket antistoff (Brown et al., Proe. Nati. Acad. S ei. U. S. A. (1981) 78:539-543) eller ved indirekte fluorescens ved anvendelse av (FACS) II cellesortereren. Antistoffer som bindes til intracellulære lokasjoner ble bestemt ved

125

direkte binding av I-merket antistoff til celler etterfulgt av fiksering med paraformaldehyd og etterfølgende gjennomtrengning med det ikke-ioniske rensemiddelet "NP-40". Bindingsanalyser

a) For bindingsanalyser utført ved anvendelse av radiomerkede antistoffer (Brown et al., supra), ble kultiverte celler (10<6>) inkubert ved 4°C i 30 minutter med 10<6>

cpm av <125>I-merket antistoff i 100 ul varmeaktivert (30 min. ved 56°C) fetalt kalveserum i kulturmedium. Etter tilsats av 5 ml PBS ble cellene pelletert ved sentrifugering i 10 minutter ved 250 x g. Supernatanten ble utluftet, og pelleten ble underkastet telling for <1>25I. For å måle ikke-spesifikk binding ble parallelle inkuberinger utført med 10 ug umerket antistoff som en konkurrerende substans (Brown, et al., supra). I noen tilfeller ble bindingsanalyser utført på en analog måte på monolag av celler festet til kulturskåler av plast.

b) For bindingsanalyser utført på FACS II celle-sorteringsinnretningen ble celler fjernet fra deres substrater

ved anvendelse av PBS inneholdende 5 mM etylendiamintetra-eddiksyre (EDTA). Prøver inneholdende 1 x 105 celler ble inkubert først med monoklonalt antistoff ved en konsentrasjon på 2 ug/ml etterfulgt av fluorescein-konjugert geit anti-mus antistoff ved en 1:200 fortynning. Celler ble deretter vasket og resuspendert i kulturmediet. Like før FACS-analyse ble propidiumjodid tilsatt i en endelig konsentrasjon på 1 ug/ml for å farge ikke-levedyktige celler. Under FACS-analysen ble

celler som emitterte rød fluorescens elektronisk utsortert slik at bare levedyktige celler ble undersøkt. Den gjennom-snittlige intensiteten av fluorescein fluorescens ble deretter bestemt for hvert antistoff. Negative kontrollprøver besto av prøver hvori monoklonalt antistoff var utelatt; positive kontrollprøver besto av monoklonale antistoffer til HLA type 1 histokompatibilitetsantigener. Fargingen ble betraktet som positiv dersom midlere kanal fluorescein var minst 3 ganger bakgrunnen.

Bestemmelse av reaktiviteten av antistoffer og for glykolipider

Antistoffer ble undersøkt for reaktivitet og for glykolipid antigener ved inkubering med rensede glykolipider absorbert på mikrotestbrønner (sammen med kolesterol og leci-tin) og med tynnsjiktkromatografiplater hvorpå glykolipider var fraksjonert. Bundet antistoff ble detektert ved inkubering med antiserum til museimmunoglobulin og radiojodert protein A.

Isotype bestemmelse

a) Ouchterlony immunodiffusjon

En porsjon av supernatant av spesielle hybridom-celler ble plassert i senterbrønnen av en 2% agarplate. Mono-spesifikke kanin anti-mus lg isotype antistoffer (Meloy) ble plassert i de ytre brønnene og platen ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur og over natten ved 4°C.

b) Fleksible polyvinylklorid 96 brønnplater (Costar) ble belagt med 0,1 mg/ml geit anti-mus lg antistoffer i 2

timer ved 37°C og motbelagt med en 3% BSA-oppløsning i 2 timer ved 37°C. Hybridomsupernatanten ble deretter inkubert ved 3 7°C i 2 timer. Etter vasking med PBS bovint serum albu-min (BSA) ble plater inkubert ved 3 7°C i 2 timer med mono-spesifikke kanin anti-mus lg isotype antistoffer koblet til peroksydase (Zymed). Etter vasking ble platene inkubert med 1 mg/ml ortofenylendiamin og 0,03% H202 i 0,1 M citratbuffer, pH 4,5. Optisk tetthet ved 630 nm ble bestemt på en "Dynatec ELISA" plateavleser.

Stafylokokkisk protein A bindingsanalyse

Mikrotiterbrønner ble inkubert med 5% FCS i PBS pluss 0,02% NaNJ ~ og supernatanten ble 7utluftet. 25 yl av en sus-pensjon av tumorceller (2 x 10 celler/ml) ble tilsatt til hver brønn og inkubert med 25 yl av et spesielt antistoff i

1 time ved romtemperatur. Platene ble sentrifugert ved 1200 opm i 7 minutter, vasket to ganger med 50% NCS/PBS/NaN,, og

125 25 yl I-stafylokokkisk protein A (ca. 50 000 cpm/25 1) ble tilsatt. Platene ble inkubert i 1 time ved 25°C, vasket to ganger med 5% NCS/PBS/NaN^ og tørket. Bunnen av brønnene ble skåret av og tellet i en gammateller.

Eksempel

Fremstilling av monoklonale antistoffer

■ Monoklonale antistoffer ble fremstilt ved immunisering av 3 måneder gamle BALB/c-mus med celler fra pleural effusjoner fra pasienter med metastatiske ikke-småcelle lunge-karsinonver .Immuniseringene ble utført ved å injisere musen intraperitonealt 3-4 ganger med ca. 10 7 celler. Tre dager etter den siste immuniseringen ble miltene fjernet, suspendert i kulturmedium og sammensmeltet med NS1 musemyelom-celler (Køhler og Milstein, supra). Blandingene ble podet for å danne kulturer med lav tetthet med utgangspunkt i enkle sammensmeltede celler (kloner); teknikkene som ble anvendt for hybridiseringen er tidligere beskrevet av Yeh, et al., Int. J. Cancer (1979) 29:269-275.

Supernatanter fra hybridceller ble undersøkt ved anvendelse av både en ELISA-analyse og en autoradiografisk

125

indirekte I-merket protein A-analyse (Brown et al., J. Immunol. Meth. (1979) 31:201-209) mot ekstrakter fra tumorene benyttet for immunisering som inneholdt blant annet celle-membraner. Disse ekstraktene ble fremstilt ved å anvende en fremgangsmåte modifisert fra Colcher et al., Cancer Res.,

(1981) 42:1451-1459; Yeh et al., supra. For dette formål ble vev vasket med PBS og suspendert, dette ble for intakte tumorer utført ved pressing gjennom en sikt av rustfritt stål. Deretter ble det tilsatt 1 mM NaHC03 inneholdende 1 mM fenyl-metylsulfonylfluorid (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA), og materialet ble deretter homogenisert på is, med 50 slag av B-pistillen av en "Dounce" homogenisator. Etter sentrifugering i 15 minutter ved 27 000 x g ble supernatanten fjernet, og pelleten ble resuspendert i PBS, ultralydbehand-let i 1 minutt, og lagret ved -70°C.

Hybridomer som produserte antistoffer med binding til cellemembranekstraktene ble klonet, dyrket in vitro, og ytterligere undersøkt for antistoffspesifisitet. Denne undersøkel-sen ble utført ved å anvende den immunohistologiske teknikken beskrevet ovenfor, hvori antistoffenes evne til å bindes til frosne deler av lungekarsinomer,andre tumorer og normalt menneskelig vev ble undersøkt. De hybridomer som produserte antistoff av tilsynelatende spesifisitet for human lungekreft ble gjenklonet, dyrket og injisert i pris-tan-primerbehandlede 3-måneder gamle BALB/c-mus, hvor de vokste som buktumorer.

Antistoffer utskilt i bukvæske ble renset på protein

"A Sepharo.se" (Ey et al. , Immunochemistry (1 978) 1 5 : 429)

eller ved gelfiltrering i "Sephacryl S-300". Rensede antistoffer ble anvendt for ytterligere karakterisering som innbefattet ytterligere spesifisitetsforsøk ved immunohistologi, bindingsanalyser på intakte celler for å bestemme hvilke antistoffer som ble bundet til celleoverflaten, og radio-immunoutfellingsforsøk som beskrevet ovenfor.

Monoklonale antistoffer L15 og L17 ble fremstilt fra de tilsvarende hybridomer som beskrevet ovenfor. Disse antistoffene viste egenska<p>ene angitt ovenfor i foreliggende be-skrivelse .

Antistoffene L15 OG L17 ble underkastet den immunohistologiske teknikken beskrevet ovenfor.

Antistoff L15 ble bundet sterkt til NSCLC-celler og ble ikke bundet til følgende celler: Colonkarsinom, brystkarsinom., normalt hjerte, leukocytter,hjerne, tarm, nyre, milt, hud og lever.

Antistoff L17 ble bundet sterkt til NSCLC-celler, ta.rmkarsinomceller, og brystkarsinomceller . L17 viste svak binding til leukocytter og ingen binding til følgende celler: Normalt hjerte, hjerne, tarm, nyre, milt, hud, lever.

Cellelinjene betegnet L15 og L17 ble begge deponert ved A.T.C.C. 1 mars 1985 og fikk aksesjonsnummer henholdsvis HB8738 og HB8739.

Claims (7)

1. Monoklonalt antistoff av IgM isotypen, betegnet L15 eller et Fab, F(ab')2 eller Fv fragment derav, for in vitro anvendelse karakterisert ved at det er produsert av hybridomcellelinjen ATCC HB 8738, hvis antigen-kombinerende sete definerer Lev, et overflate-karbohydratantigen karakteristisk for humane, ikke-småcelle lungekarsinomer og som kan konjugeres til et merke som er istand til å produsere et detekterbart signal.

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at merket er et fluorescerende stoff, en radioaktiv isotop, en kromofor eller et enzym.

3. Monoklonalt antistoff av IgM isotypen, betegnet L17, eller et Fab, F(ab')2 eller Fv fragment derav, for in vitro anvendelse, karakterisert ved at det er produsert av hybridomcellelinjen ATCC HB 8739, hvis antigen-kombinerende sete definerer Lex, et overflate-karbohydratantigen som er karakteristisk for humane ikke-småcelle lungekarsinomer og som kan konjugeres til et merke som er istand til å produsere et detekterbart signal.

4. Monoklonalt antistoff ifølge krav 3, karakterisert ved at merket er et fluorescerende stoff, en radioaktiv isotop, en kromofor eller et enzym.

5. Cellelinje, karakterisert ved at den er deponert ved ATCC HB 8738 og produserer monoklonalt antistoff L15 ifølge krav 1.

6. Cellelinje, karakterisert ved at den er deponert ved ATCC HB 8739 og produserer monoklonalt antistoff L17 ifølge krav 3.

7. Diagnostisk sett, karakterisert ved at det innbefatter (a) et monoklonalt antistoff L15 ifølge krav 1, eller L17 ifølge krav 3, hvor antistoffet definerer et determinantsete på et celleoverflate-karbohydratantigen som er henholdsvis Le^ eller Lex antigen, og (b) et konjugat av et merke, f.eks. et fluorescerende stoff, som er en del av et signalproduserende system og en spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoffet ifølge (a) ovenfor.