DK166682B1 - Monoklonale antistoffer og fremgangsmaade til diagnose af en ondartet lungecancer i ikke-smaacellede lungeceller, cellelinier, som producerer disse antistoffer, samt diagnosticeringssaet indeholdende dem - Google Patents

Description

DK 166682 B1

Den foreliggende opfindelse angår monoklonale antistoffer og fremgangsmåde til diagnose af en ondartet lungecancer i ikke-småcellede lungeceller, cellelinier, som producerer disse antistoffer, samt diagnosticeririgssæt indehol-5 dende dem.

Humane lungecarcinomer er blandt mænd ansvarlige for de fleste dødsfald på grund af cancer og er blandt kvinder ved at overhale brystcarcinomer som den hyppigste dødsårsag på grund af kræft (Cancer Facts and Figures, 1983). Denne 10 sygdom kan inddeles i 4 histologiske hovedtyper, nemlig epidermoid (30%), adenocarcinom (35%), stor-cellet udifferen-tieret (15%) og småcellet (20%). De fleste tilfælde af lungecarcinomer kan ikke helbredes med kemoterapi og strålebehandling. Småcellede lungecarcinomer kan reagere på kemoterapi 15 og bestråling med en reduktion af størrelsen, men ikke fuldstændig helbredelse. Fuldstændig kirurgisk fjernelse af tumoren synes at være den eneste effektive terapi. Imidlertid er det desværre sådan, at mindre end 30% af lungecancerpatienter har tumorer, som kan fjernes totalt efter diagnose, 20 og af disse patienter overlever mindre end en tredjedel i 5 år efter tilsyneladende fuldstændig kirurgisk fjernelse af hele tumoren. Der findes derfor et stort behov for fremgangsmåder, som ville muliggøre en tidligere diagnose af lungecancer, en bedre afgrænsning af graden af cancerspred-25 ning og en mere effektiv terapi.

Monoklonale antistoffer kan anvendes til alle disse formål. Det er imidlertid en forudsætning at finde antistoffer mod antigener, som udtrykkes kraftigere i lungecancer end i normalt voksent væv. I betragtning af tumorcellepopu-30 lat ioners kendte heterogeneitet, tilstedeværelsen af adskillige determinanter på det samme antigenmolekyle, de forventede forskelle mellem antigener med hensyn til disses egnethed som diagnosticeringsmærkestoffer sammenlignet med terapeutiske mål og de forskellige biologiske karakteristika 35 hos forskellige antistoffer mod samme antigen, vil en række forskellige antistoffer være påkrævet.

DK 166682 B1 2

Humane monoklonale antistoffer mod lungecancerantigener er blevet beskrevet af Sikora m.fl., Br. J. Cancer 43, 696-700 (1981). Monoklonale antistoffer, som udviser specificitet for flere typer human lungecancer, er beskrevet af 5 Cuttitta m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4591-4595 (1981). Antigener forbundet med et humant lungeadenocarcinoma defineret ved hjælp af monoklonale antistoffer er beskrevet af Varki m.fl., Cancer Research 44, 681-687 (1984).

Monoklonale museantistoffer mod glycolipid-Lex-anti-10 gener er beskrevet af Hakomori m.fl. i Biochemical and Biophysical Research Communications 100, 1578-1586 (1981),

Brockhaus m.fl., Arch. Biochem. Biophys. 217, 647 (1982), Fukushim.fi., J. Biol. Chem. 259, 506 (1984), Fukushim.fi., J. Exp. Med. 159, 506 (1984), og Chia m.fl., Cancer Res.

15 45, 435 (1985). Antistoffer mod LeY-antigener er beskrevet af Abe m.fl., J. Biol. Chem. 258, 8934 (1983), Lloyd m.fl., Immunogenetics 17, 537 (1983), Brown m.fl., Biosci. Rep. 3, 163 (1983).

Kontinuerlige kulturer af fusionerede celler der 20 udskiller antistof af en forud defineret specificitet, er beskrevet af Kohier m.fl., Nature 265, 495-497 (1975).

Endvidere kendes der fra DK nr. 162.531 B monoklonale antistoffer af IgG2AK-isotypen, der genkender forskellige epitoper på proteiner. Udbredelsen af disse antigener er 25 begrænset til ikke-småcellede former for lungecancer.

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte, monoklonale antistoffer, som definerer determinantsteder på carbonhydrat (glycol ipid)-antigener associeret med humane ikke-småcellet-lungecarcinoma- (NSCLC) -celler. Udtrykket 30 "NSCLC-celler" omfatter epidermoide carcinomaceller, adeno-carcinomaceller og storcellede, udifferentierede carcinomaceller. Determinantstedet kan også findes på andre carcino-mers antigener, f.eks. visse carcinomer i brystet, og antistofferne ifølge opfindelsen vil således også bindes til 35 disse andre carcinomaceller.

Opfindelsen angår nærmere betegnet et monoklonalt 3 DK 166682 B1 antistof betegnet L15 eller et Fab-, F(ab1)2- eller Fv-frag-ment deraf, hvilket antistof er ejendommeligt ved, at det produceres af en hybridomacellelinie med egenskaber som cellelinien deponeret hos ATCC med accessionshummer HB8738, 5 og at det antigenkombinerende sted deri definerer LeY, et celleoverflade-carbonhydrat-antigen, der er karakteristisk for lungecarcinoma i humane, ikke-småcellede lungeceller.

Opfindelsen angår desuden et monoklonalt antistof betegnet L17 eller et Fab-, F(ab*)2- eller Fv-fragment deraf, 10 hvilket antistof er ejendommeligt ved, at det produceres af en hybridomacellelinie med egenskaber som cellelinien deponeret hos ATCC med accessionsnummer HB8739, og at det antigenkombinerende sted deri definerer Lex, et celleoverflade-carbonhydrat-antigen, der er karakteristisk for lungecarci-15 noma i humane, ikke-småcellede lungeceller.

Der er væsentlige forskelle mellem de her omhandlede antistoffer L15 og L17 og de fra DK nr. 162.53IB kendte antistoffer. De kendte antistoffer er som nævnt af IgG2“isoty-pen, medens de her omhandlede er af igM-isotypen, hvilket 20 genspejles i, at de kendte antistoffer genkender proteinantigener, medens L15 og L17 definerer carbonhydratantigener, nemlig hhv. Le^ og Lex.

Også i bindingsegenskaber er der forskelle mellem de kendte antistoffer og L15 og L17. De kendte antistoffer 25 binder således ikke til småcellet lungecancer, medens L17 binder til nogle småcellede lungecarcinomer. Til gengæld har de kendte antistoffer en signifikant binding til humane coloncarcinomer, medens L15 ikke binder til sådanne carci-nomer.

30 De her omhandlede, monoklonale antistoffer bindes i langt mindre grad til normale voksne celler end til tumorceller. Udtrykket "bindes i langt mindre grad" betyder, at bindingen ikke vil kunne påvises ved immunohistologiske metoder, og at der vil være langt svagere binding til normale 35 celler end til tumorceller. De monoklonale antistoffer udskilles af musehybridomer.

DK 166682 B1 4

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes fremgangsmåder til bestemmelse af tilstedeværelsen af en ondartet lungecancertilstand i humane, ikke-småcellede lungeceller i en persons lunge, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig 5 ved, at væv fra personen ved hjælp af et her omhandlet, monoklonalt antistof undersøges for tilstedeværelsen af et carbonhydrat-antigen, der er LeY- eller Lex-antigen eller et antigen med disses karakteristika.

Lex-antigenet er blevet beskrevet af Hakomori m.fl., 10 supra, Brokhaus m.fl., supra, Fukushi m.fl., supra, og Chia m.fl., supra. LeY-antigenet er blevet beskrevet af Abe m.fl., supra, Lloyd m.fl., supra, og Brown m.fl., supra.

En foretrukket udførelsesform for den her omhandlede fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 15 (a) en vævsprøve fra personen bringes i kontakt med et her omhandlet, monoklonalt antistof, som definerer et determinant-sted på et antigen, som er LeY- eller Le^antigen eller et antigen, der har Ley- eller Lex-antigens karakteristika, under betingelser for antistoffets binding til prøven, 20 og (b) forekomsten af antistoffets binding til prøven iagttages, idet bindingen er relateret til tilstedeværelse af en ondartet tilstand i lungen.

Ved den her omhandlede fremgangsmåde anvendes de 25 monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen til bestemmelse af tilstedeværelsen af NSCLC-celler i en prøve, der mistænkes for at indeholde sådanne celler. Prøven bringes i berøring med det monoklonale antistof, som er i stand til at skelne sådanne celler fra andre celletyper, der kan forekomme i 30 prøven. Kontakten udføres under betingelserne for binding af antistoffet til sådanne celler. Efter kontakt bestemmes tilstedeværelse af eller mangel på binding mellem antistoffet og cellerne i prøven. Denne binding har relation til tilstedeværelsen af eller manglen på NSCLC-celler i prøven. I 35 reglen bringes prøven i berøring med en mærket, specifik bindingspartner for det monoklonale antistof. Dette mærkestof 5 DK 166682 B1 er i stand til at producere et påviseligt signal. En anden diagnosticeringsmetode indebærer, at en tumor lokaliseres af antistoffer eller antistoffragmenter, som er blevet hensigtsmæssigt mærket (f.eks. med en radioisotop) og derpå 5 injiceret i patienter. Denne fremgangsmåde kan være en bedre måde til at bestemme omfanget af sygdom hos cancerpatienter og til at overvåge forandringer som følge af terapi.

Antistofferne ifølge opfindelsen kan også anvendes terapeutisk. Antistofferne kan reagere med det ene eller 10 begge ovennævnte antigener, som udtrykkes i høje koncentrationer på tumorcel leoverfladen. De kan anvendes som bærer for forskellige midler, der har anti-tumorvirkning, herunder, men ikke blot, kemoterapeutiske medikamenter og radioisotoper.

15 De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan fremstilles ved hjælp af standardmetoderne beskrevet af Kohier og Milstein, supra. Således anvendes som immunogen humane lungecarcinomaceller fra lungehindeudsivninger eller dyrkede celler fra humane, ikke-småcellede lungecarcinomer 20 eller celler fra en normal fosterlunge. Disse celler injiceres i en mus, og efter tilstrækkelig lang tid aflives musen, og miltcellerne udvindes. Miltcellechromosomerne, der koder for de ønskede immunoglobuliner, gøres levedygtige ved fusion af miltcellerne med myelomaceller eller med lymfo-25 maceller, i reglen i nærvær af polyethylenglycol. De fremkomne celler, som omfatter de fusionerede hybridomer, får lov at gro i et selektivt medium, såsom HAT-medium, og de overlevende celler dyrkes i dette medium, idet der anvendes begrænsende fortyndingsbetingelser. Cellerne dyrkes i en 30 passende beholder, f.eks. mikrotiterfordybninger, og den ovenstående væske screenes for monoklonale antistoffer med den ønskede specificitet.

Der findes forskellige metoder til at forøge udbytter af monoklonale antistoffer, såsom injektion af hybridomacel-35 lerne i bughulen hos en pattedyrevært, som accepterer cellerne, og derefter høst af ascitesvæske. Når der samles en DK 166682 B1 6 utilstrækkelig mængde af det monoklonale antistof i ascites-væsken, høstes antistoffet fra værtens blod. Der findes forskellige konventionelle måder til isolering og rensning af de monoklonale antistoffer for at befri de monoklonale 5 antistoffer for andre proteiner og andre forureninger (jfr. Kohier og Milstein, supra).

Et af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen betegnes L15. Det defienrer et celleoverflade-carbonhydrat--antigen, som er LeY-antigen eller har dettes karakteristika.

10 Dette antigen er identificeret som karakteristisk for humane NSCLC-celler og celler fra visse andre humane carcinomer. Antistoffet er af IgM-isotypen. Det binder ikke påviseligt til normale celler, såsom fibroblaster, endothelceller eller epithelceller i de større organer. L15-antistoffet produceres 15 af L15-musehybridomet.

Et andet monoklonalt antistof ifølge opfindelsen betegnes L17. Det definerer en celleoverflade-carbonhydrat-determinant, som er Lex-antigen eller har dettes karakteristika. Dette antigen er ligeledes identificeret som karakte-20 ristisk for humane NSCLC-celler og celler fra visse andre humane carcinomer. Dette antistof er af IgM-isotypen. Det binder mindre til normale celler, såsom fibroblaster, endothelceller eller epithelceller i de større organer end til tumorceller. L17-antistoffet produceres af L17-musehybrido-25 met.

Antistof L15 genkender LeY-antigen, som har den nedenfor anførte struktur:

Gal/31 -» 4GlcNAc/31 -» 3GaljSl -» R 2 3 30 Fucal Fucal

En række glycolipider med forskellig kædelængde kan påvises af dette antistof.

Antistof LI7 reagerer med en række glycolipidantige-ner, som alle bærer Lex i endestillingen, dvs:

35 Gal/31 -i 4G1CNAC -i R

3 7 DK 166682 B1

Fucal R kan have forskellige længder af en kæde af blodgruppe type 2 (Gal/?l-»4GlcANc/31->3Gal/?l->4GlcNac/?l-»3) .

5 Antistoffet reagerer også med trifucosyl-Y med den nedenfor viste struktur

Gal/31-*4GlcNAc/3l-»3Gal/?l-)4GlcNAc/31-*3Gal/31-->4GlcNAc/31->3Gal/?l-->4Glc 3 3 3

Fucal Fucal Fucal 10 Opfindelsen angår desuden de anvendelige bindingsfrag menter af ovennævnte monoklonale antistoffer, dvs. Fab-, (F(ab*)2- og Fv-fragmenter. Antistoffragmenterne fås ved hjælp af gængs teknik. Således kan anvendelige bindingsfragmenter fremstilles ved peptidasefordøjelse af antistoffet 15 ved anvendelse af papain eller pepsin.

Opfindelsen angår også de her omhandlede antistoffer L15 ogL17 til anvendelse ved diagnose af lungecarcinoma i humane, ikke-småcellede lungeceller. Dette sker ved påvisning af NSCLC-carcinomer hos mennesker, af LeY- eller Lex-antigen 20 eller antigener med disses karakteristika, dvs. antigener,som er beslægtet, men ikke identiske med LeY eller Lex, og som genkendes af et antistof, som også genkender LeY eller Lex. Antigenet kan renses ved gængse metoder, f.eks. som beskrevet af Hakomori m.fl., supra, og af Abe m.fl., supra.

25 Ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen bestemmes tilstedeværelsen af en ondartet tilstand i lungen hos et individ ved at undersøge lungevæv eller andet væv fra individet for tilstedeværelse af et carbonhydrat-antigen, som er LeY eller Lex, eller som har disses karakteristika. Ud-30 trykket "væv" refererer til udskårne celler, eksfoliative celler, kropsvæsker, f.eks. blod, plasma, serum og urin. Udtrykket "ondartet tilstand" refererer til tilstedeværelsen af dysplastiske celler, herunder carcinomer in situ, neoplas-tiske, ondartede eller tumorale celler. Således kan prøven 35 bringes i kontakt med eller kombineres med et monoklonalt antistof, som genkender et determinantsted på LeY eller DK 166682 B1 8

Lex, såsom et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, dvs.

L15 eller L17-antistof, eller et antistof med lignende karakteristika, f.eks. de antistoffer, der er beskrevet af Hako-mori ro.fl., supra, Fukushi m.fl. supra, C!hiarm.fl., supra, 5 Abe m.fl., supra, Lloyd m.fl., supra, og Brown m.fl., supra. Kontakten udføres under betingelser for antistoffets binding til de ondartede celler. Efter kontakt iagttages tilstedeværelse af antistoffets binding til de ondartede celler i prøven, dvs. prøven undersøges for immunkomplekser af anti-10 stof og det antigene sted. Denne immunkompleksdannelse har relation til tilstedeværelsen af ondartede celler i prøven.

Et særligt eksempel på en fremgangsmåde ifølge opfindelsen, der skal tjene som illustration, er en fremgangsmåde til påvisning af tumorceller i uskåret væv. Ovennævnte frem-15 gangsmåde anvendes på en prøve, som er et snit af tumoren, der fås, efter at denne er fjernet. Tumoren, der er fjernet, behandles, således at der fås snit, hvilken behandling til at begynde med indbærer frysning af tumoren eller vævet, i reglen frysning umiddelbart efter fjernelsen. Det frosne 20 vævslag skæres derefter i snit, f.eks. ved hjælp af en cryostat.

Tumorsnittet, der fås som beskrevet ovenfor, bringes i kontakt med et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen og derpå med et andet antistof rettet mod ovennævnte monoklonale 25 antistof, hvilket andet antistof er mærket med et påviseligt mærkestof.

Den udskårne prøve, f.eks. tumorsnittet, bringes i berøring med det første monoklonale antistof under betingelserne for antistoffets binding til de ondartede celler.

30 Inkubationen foregår i reglen i et vandigt medium, f.eks. phosphatpufret saltvandsopløsning indeholdende en lille smule natriumazid, i en passende beholder, f.eks. en petriskål af glas, i et tidsrum fra 15 til 30 minutter ved en temperatur fra 20 til 30°C. Den anvendte mængde antistof er 35 i reglen tilstrækkelig til at give påviselig binding, dvs. til at give et påviseligt antal immunkomplekser mellem anti- 9 DK 166682 B1 stoffet og den pågældende determinant eller det antigene sted.

Efter inkubationen vaskes snittet for at reducere eller eliminere ikke-specifikt bundet antistof og undersøges 5 derpå for at iagttage ovennævnte komplekser, som er et resultat af det monoklonale antistofs binding til de celler i prøven, der har det antigene sted. Bindingen har relation til tilstedeværelsen af ondartede celler i snittet. Følgelig bestemmes binding f.eks. ved at bringe prøven i kontakt med 10 en mærket, specifik bindingspartner for det monoklonale antistof. Mærkestoffet er i stand til at producere et påviseligt signal og kan f.eks. være et radioaktivt mærkestof, en chromophor, såsom et fluorescerende stof, eller et enzym.

ET eksempel på en teknikform, der anvendes ved oven-15 nævnte metode, er immunofluorescensfarvning. Ved denne metode fikseres frosne snit af tumoren på et objektglas med acetone og inkuberes med det monoklonale antistof i f.eks. en petriskål. Efter vask med en passende puffer, f.eks. phosphat-pufret saltvandsopløsning, anbringes snittet på en petriskål 20 og bringes i berøring med den mærkede, specifikke bindingspartner for det monoklonale antistof, og denne kan f.eks. være et mærket antistof, der er specifikt for det anvendte monoklonale antistof. Eftersom det monoklonale antistof for det meste vil stamme fra en musekilde, kan der anvendes et 25 mærket anti-muse-immunoglobulin, der er specifikt for det anvendte monoklonale antistof. Sådanne immunoglobuliner kan prduceres ved standardmetoder, ved at en passende vært injiceres med museantistof, hvorpå der ventes en passende tid, og anti-muse-immunoglobulinerne høstes fra den injicerede 30 værts blod.

Efter endnu en vask af objektglasset med f.eks. en vandig puffer kan snittene dækkes med en fluorescerende, antistof-tilførende væske og et dækglas og derpå undersøges i et fluorescensmikroskop til bestemmelse af det monoklonale 35 antistofs binding til snittet. Bindingsbestemmelsen kan også omfatte identificering af en sådan bindings lokalisering DK 166682 B1 10 i prøven.

Det monoklonale antistofs binding til prøven kan også bestemmes ved at anvende et monoklonalt antistof, som er covalent konjugeret til et mærkestof, der er i stand til 5 at producere et påviseligt snignal, såsom et radioaktivt stof, en chromophor, herunder farvestoffer og fluorescerings-midler, eller et enzym. Det antal mærkestoffer, der anvendes pr. antistof, bestemmes i reglen af de krav, som den diagnosticeringsmetode stiller, ved hvilken det mærkede antistof 10 anvendes, samt tilgængeligheden af steder til binding af mærkestoffet til antistoffet.

Fremgangsmåder til konjugering af mærkestoffer til antistoffer og antistoffragmenter er kendte. Sådanne fremgangsmåder er beskrevet i US-patentskrifteme nr. 4.220.450, 15 4.235.869, 3.935.074 og 3.996.345.

Et andet eksempel på en metode, ved hvilken de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes, er påvisning af molekyler, der bærer Lex- og LeY-derterminanter-ne, i kropsvæsker, herunder plasma og serum. Hertil kan anti-20 stoffet ifølge opfindelsen anvendes alene eller kombineret med et andet antistof rettet mod en separat determinant.

Endnu et eksempel på en metode, ved hvilken det monoklonale antistof ifølge opfindelsen kan anvendes, er im-munoperoxidasemærkning (Sternberger, Immunocytochemistry, 25 John Wiley & Son, New York, 104-169 (1979), som modificeret af Garrigues m.fl., Int. J. Cancer 29, 511-515 (1982)). Det væv, der skal afprøves, fikseres med et passende opløsningsmiddel, såsom acetone, på et underlag, såsom et objektglas. Dernæst inkuberes vævet med det monoklonale antistof og 30 vaskes derpå fri for ubundet antistof. DErpå inkuberes vævet med kanin-anti-muse-IgG, vaskes for at fjerne ubundet antistof, kombineres med muse-peroxidase-anti-peroxidase-kom-pleks, vaskes for at fjerne ubundet konjugat og behandles derpå med substrat for enzymet. Efter denne behandling under-35 søges objektglasset for et påviseligt signal.

Antistofferne ifølge opfindelsen kan anvendes ved en 11 DK 166682 B1 fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelse af en ondartet tilstand, f.eks. i en eksfoliativ celleprøve fra lungen, såsom opspyt, eller i en cervikal udstrygning. Ved udtrykket "eksfoliativ" skal forstås, at prøven omfatter iso-5 lerede celler eller celleklumper, der fås ved skrabning eller vask af vævsoverfladen, og hvor cellerne fjernes individuelt eller som skæl eller flager. Den eksfoliative celleprøve må ikke forveksles med udskåret væv, såsom det, der fås ved biopsi. Kontakt mellem prøven og antistoffet sker 10 under betingelser for binding mellem antistof og det antigene sted. Efter kontakt bestemmes tilstedeværelse af eller mangel på binding mellem antistof og det antigene sted, og resultatet har relation til tilstedeværelsen af en ondartet tilstand i lungen.

15 Ved bestemmelsen af forekomsten af en ondartet til stand i lungen udgør en opspytsprøve den eksfoliative celleprøve, der skal anvendes ved fremgangsmåden. Fremgangsmåden kan anvendes til påvisning af en ondartet tilstand i eksfoliative celleprøver fra bronchierne, mave-tarmkanalen, her-20 under svælget og munden.

Den eksfoliative celleprøve bringes derpå i kontakt med ovennævnte antistoffer under betingelser for binding mellem antistof og det specifikke antigene sted i prøven, således at der dannes antigen/antistof-komplekser. Dette 25 antigene sted kan forekomme på celler eller cellefragmenter i prøven. Alment anbringes prøven på et passende underlag, f.eks. et objektglas, i reglen af glas, eller et andet passende materiale. Den eksfoliative celleprøve udstryges i reglen på objektglasset, således at der fås et tyndt lag 30 prøve på glassets overflade. Kontakten mellem antistoffet og prøven udføres i reglen i et vandigt, pufret medium. Pufferne, der kan anvendes, omfatter f.eks. phosphat, tris og bicarbonat. pH-værdien afhænger af prøvens natur og antistoffet og ligger i reglen i intervallet fra 5 til 8. Det 35 vandige medium kan yderligere indeholde organiske, polære opløsningsmidler i en mængde fra 0 til 40%. De organiske, DK 166682 B1 12 polære opløsningsmidler er vandopløselige og har i reglen fra 1 til 10 carbonatomer og fra 1 til 4 oxygenatomer. Antistoffet forekommer i det vandige medium i en koncentration fra 1 til 100 μg/ml, fortrinsvis fra 10 til 20 μg/ml. Tempe-5 raturen under prøvens kontakt med antistoffet ligger i reglen fra 4 til 40°c, fortrinsvis fra 10 til 308c. Kontaktperioden varer i reglen .fra 15 til 120 minutter, fortrinsvis fra 30 til 60 minutter.

Efter kontaktperioden mellem prøven og antistoffet 10 behandles underlaget i reglen for at fjerne uomsat antistof.

I reglen sker dette ved at vaske underlaget med et vandigt, i reglen puf ret medium. I reglen bør vaskeopløsningsmængden være tilstrækkelig til at fjerne det uomsatte antistof.

Dernæst iagttages tilstedeværelsen af antistof, der 15 er bundet til det antigene sted i prøven, hvilken binding afhænger af forekomsten af en ondartet tilstand på det pågældende sted, dvs. prøven undersøges for at bestemme antallet af dannede antigen/antistof-(immun) -komplekser. Det skal bemærkes, at der i nogle tilfælde kan findes et meget lille 20 antal af det pågældende antigene sted i den eksfoliative celleprøve. Imidlertid vil der ved en ondartet tilstand forekomme et stort antal af det antigene sted, og denne sidstnævnte tilstand kan let skelnes fra en ikke-ondartet tilstand ved hjælp af denne fremgangsmåde, fordi der kan 25 måles et stort antal antigen/antistofkomplekser, når der foreligger en ondartet tilstand. Til bestemmelse af forekomsten af binding inkorporeres der i analysesystemet midler, der kan producere et påviseligt signal. Således kan det ved prøven anvendte antistof konjugeres til et mærkestof, som 30 kan producere et påviseligt signal. Mærkestoffet kan f.eks. være et radioaktivt stof, en chromophor, herunder farvestoffer og fluoresceringsmidler, eller et enzym. Det antal mærkestoffer, der anvendes til antstoffet, afgøres i reglen af de krav, som metoden stiller, og af tilgængeligheden af 35 steder for binding af mærkestoffet til antistoffet.

Alternativt kan det vaskede objektglas bringes i 13 DK 166682 B1 kontakt med en mærket, specifik bindingspartner for antistoffet, som f.eks. kan være et mærket antistof, der er specifikt for det anvendte antistof. Når det monoklonale antistof stammer fra en musekilde, kan der anvendes ét mærket anti-5 muse-immunoglobulin, der er specifikt for det antistof, der anvendes ved fremgangsmåden. Sådanne immunoglobuliner kan produceres ved hjælp af standardmetoder ved at injicere en passende vært med det monoklonale antistof, vente en passende tid og høste anti-muse-immunoglobulinerne fra den injicerede 10 værts blod. Når der anvendes en mærket, specifik bindingspartner for antistoffet, skal objektglasset vaskes igen med et vandigt medium, før glasset undersøges for fluorescens.

Når man skal bestemme forekomsten af binding mellem antistoffet og celleprøven, hvor der anvendes et fluore-15 scerende mærkestof, undersøges objektglasset for fluorescens, i reglen ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Når der anvendes et mærkestof, der ikke er et fluoresceringsmiddel, undersøges objektglasset eller prøven for dannelse af et bundfald, en farve eller lignende.

20 Ovenstående beskrivelse er i første række rettet på anvendelsen af antistofferne ifølge opfindelsen til immuno-fluorescensmetoder. Imidlertid kan antistofferne ifølge opfindelsen anvendes til de fleste afprøvninger, der indebærer antigen/antistof-reaktioner. Prøverne kan være homogene 25 eller heterogene. Ved et eksempel på en homogen afprøvning kan prøven være en biologisk væske, f.eks. serum eller urin, eller prøven kan være lyseret og klaret for at fjerne rester. Den immunologiske reaktion indbærer i reglen et specifikt antistof, en mærket analyt og den pågældende prøve.

30 Signalet, der fremkommer fra mærkestoffet, modificeres, direkte eller indirekte, efter binding af antistoffet til den mærkede analyt. Både den immunologiske reaktion og påvisning af dennes omfang udføres i en homogen opløsning. Immunokemi-ske mærkestoffer, der kan anvendes, omfatter f.eks. frie 35 radikaler, fluorescerende farvestoffer, enzymer, bakteriofa-ger og coenzymer.

DK 166682 B1 14

Ved et eksempel på en heterogen afprøvning er reagenserne i reglen prøven, det specifikke antistof samt et middel til frembringelse af et påviseligt signal. Prøven anbringes i reglen på et underlag, såsom en plade elleryet objektglas, 5 og bringes i kontakt med antistoffet i en væskefase. Underslaget adskilles derpå fra væskefasen, og enten underlagsfasen eller væskefasen undersøges for et påviseligt signal, idet der anvendes et middel til at frembringe et sådant signal. Signalet har relation til analyttens forekomst i prøven.

10 Midler til frembringelse af et påviseligt signal omfatter anvendelse af f.eks. radioaktive mærkestoffer, fluoresce-ringsmidler og enzymer. Eksempler på heterogene immunoafprøv-ninger er f.eks. radioimmunoafprøvning, immunofluorescensme-toder og enzymbundne immunoafprøvninger.

15 Med hensyn til en mere detaljeret gennemgang af oven nævnte immunoafprøvningsmetoder henvises til "Enzyme-Immunoassay" af Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Ligeledes henvises til US-patentskrifterne nr. 3.690.834, 3.791.932, 3.817.837, 3.850.578, 20 3.853.987, 3.867.517, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345 og 4.098.876, hvilken opregning ikke skal opfattes som udtømmende.

Antistofferne ifølge opfindelsen kan også anvendes til at vise metastaseforekomster hos patienter med NSCLC 25 analogt med den måde, som er beskrevet for ondartet melanoma i J. Nucl. Med. 24, 123-129 (1983), og i J. Clin. Invest.

72, 2101-2114 (1983). Antistoffet eller fragmenter deraf radiomærkes og indgives intravenøst til en patient, hvoraf der derpå laves optagelser, f.eks. ved hjælp af et gammaka-30 mera.

Selv om der ved de ovennævnte specifikke eksempler på fremgangsmåder ifølge opfindelsen anvendes antistoffer, der binder til specifikke determinantsteder på de respektive antigener, og som er IgM-underklasserne fra en musekilde, 35 skal dette ikke fortolkes som en begrænsning. Ovennævnte antistoffer, og de antistoffer, der funktionelt er ækvivalen- 15 DK 166682 B1 te med ovennævnte antistoffer, hvadenten de stammer fra mus eller andre pattedyr, herunder mennesker, eller andre kilder eller kombinationer deraf, kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tillige med andre isotyperr Ved udtrykket 5 "funktionelt ækvivalente" skal forstås, at antistoffet er i stand til at bindes til ethvert af de respektive, ovenfor beskrevne determinant steder og kan konkurrere med et særligt antistof ifølge opfindelsen om et sådant sted, dvs. at et sådant antistof, når det kombineres med en prøve, der inde-10 holder en celle eller et cellefragment eller et udskilt antigen med et sådant determinantsted, vil bindes til et sådant determinant sted og blokere et sådant sted mod binding med et antistof ifølge opfindelsen. Eftersom desuden LeY-og Lex-antigener kan have mere end ét determinantsted, omfat-15 ter fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendelsen af monoklo-nale antistoffer, som definerer andre determinantsteder end dem, der defineres af ovennævnte monoklonale antistoffer.

Opfindelsen angår også et diagnosticeringssæt til udøvelse af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder. Ved en 20 udførelsesform er det her omhandlede diagnosticeringssæt ejendommeligt ved, at det udgøres af (a) et her omhandlet, monoklonalt antistof, og (b) et konjugat af (1) et mærkestof, som er en del af et signalfrembringende system, og (2) en specifik bindings- 25 partner for det monoklonale antistof i (a) ovenfor.

I det her omhandlede diagnosticeringssæt kan der også indgå hjælpestoffer, såsom puf ringsmidler og proteinstabiliserende midler, f.eks. polysaccharider. Diagnosticeringssættet kan endvidere om nødvendigt omfatte andre dele af det 30 signalf rembringende system, hvoraf mærkestoffet er en del, midler til reduktion af baggrundsinterferens ved en prøve, kontrolreagenser og et apparat til gennemførelse af en prøve.

En anden udførelsesform for det her omhandlede diagnosticeringssæt er ejendommeligt ved, at det udgøres af 35 et konjugat af (1) et mærkestof, som er en del af et signalf rembringende system, og (2) et her omhandlet, monoklo- 16 DK 166682 B1 nalt antistof. Hjælpestoffer som nævnt ovenfor kan også forefindes.

Antistofferne ifølge opfindelsen kan anvendes terapeutisk. Antistoffer med egnede biologiske egenskaber lean anven-5 des direkte som terapeutiske midler, jfr. Sears m.fl., Control. Oncol. Karger, Basel, 19, 180-182 (1984). Endvidere kan antistoffer bindes til et toxin, således at der dannes et immunotoxin, eller til et radioaktivt materiale eller lægemiddel til dannelse af et radiopharmaceuticum eller et 10 pharmaceuticum. Fremgangsmåder til fremstilling af immunotox-iner og radiopharmaceutica af antistoffer er velkendte [jfr. f.eks. Cancer Treatment Reports 68, 317-328 (1984)).

En anden terapeutisk anvendelse af det monoklonale antistof ifølge opfindelsen er til immunisering af en patient 15 med et anti-idiotypisk antistof produceret ved at anvende et af de her omhandlede, monoklonale antistoffer som immunogen. En sådan immunisering kan igangsætte en aktiv antitumor-aktivitet [jfr. f.eks. Nepom m.fl., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 81, 2864-2867 (1984)]. Ved en tilsvarende metode 20 kan patienten immuniseres med det respektive antigen i renset form eller med en modificeret form for de respektive antige ner.

Det er tiltalende, at de her omhandlede antistoffer kan kombineres med andre antistoffer mod NSCLC, som f.eks.

25 omtalt i DK-patentansøgninger nr. 3145/86 A og 3938/86 A. Kombinationen er effektiv til påvisning af mindst de fire ovennævnte typer af lungecarcinomer, nemlig storcellet, udifferentieret lungecarcinoma, småcellet lungecarcinoma, adenocarcinoma og epidermoidt carcinoma.

30 De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen define rer også determinantsteder på antigener, der er associeret med andre carcinomer, såsom brystcarcinomer. De her omhandlede antistoffer finder således anvendelse i diagnosticeringsprodukter og terapeutiske produkter rettet mod sådanne 35 carcinomer.

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret 17 DK 166682 B1 ved hjælp af et eksempel. I dette vil blive anvendt en række metoder, som først vil blive beskrevet.

Tmmnnoh istoloqisk teknik 5 Til immunohistologiske undersøgelser på frosne snit anvendes den af Sternberger i Immunochemistry, John Wiley & Sons, New York, 104-169 (1979), beskrevne metode med umærket antistof, som modificeret af Garrigues m.fl., Int. J. Cancer 29, 511-515 (1982). Målvævene til disse prøver fås ved kirur-10 gi og fryses inden for 4 timer efter fjernelsen i isopentan, som forud er afkølet i flydende nitrogen. Vævene opbevares derpå i flydende nitrogen eller ved -70°C indtil brug. Der anvendes kanin-anti-muse-IgG (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) i en fortynding på 1:50. Muse-15 peroxidase/antiperoxidase-kompleks (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) indeholdende 2 mg/ml specifikt renset PAP anvendes i en fortynding på 1:80. Frosne snit præpareres, tørres og behandles med acetone og tørres (Garrigues m.fl., 1982). Snit, der skal anvendes til histologisk bedømmelse, 20 farves med hæmatoxylin. For at nedsætte den uspecifikke baggrund præinkuberes snit med normalt humanserum fortyndes 1:5 (Garrigues m.fl., 1982). Museantistoffer, gede-anti-muse-IgG og muse-PAP fortyndes i en opløsning af 10% normalt humanserum og 3% kaninserum.

25 Farvningsproceduren består i, at seriesnit behandles med enten specifikt antistof eller kontrolantistof i 2,5 timer, inkuberes i 30 minutter med kanin-anti-muse-IgG fortyndet 1:50 og i 30 minutter udsættes for muse-PAP-kompleks fortyndet 1:80. Efter hver behandling med antistof vaskes 30 objektglassene to gange i phosphatpufret saltvandsopløsning (PBS). Den immunohistokemiske reaktion fremkaldes i 8 minutter med frisk fremstillet 0,05% 3,3‘-diaminobenzidin-tetra-hydrochlorid (Sigma, St. Louis, MO) og 0,01% hydrogenperoxid i 0,05 molær Tris-puffer, pH 7,6. Yderligere eksponering i 35 en 1%'s OSO4-opløsning i destilleret vand i 20 minutter intensiverer farvningen. Snittene skylles i vand, dehydrati- DK 166682 B1 t . 18 seres i alkohol, klares i xylen og monteres på objektglas.

Hvert objektglas aflæses under kode, og kodede prøver kontrolleres af en uvildig person. Typiske objektglas fotograferes ved hjælp af differentiel interferenskontrastoptik 5 (Zeiss-Nomarski). Graden af antistoffarvning bedømmes som 0 « (ingen reaktivitet), + (nogle få positive celler), ++ (mindst 1/3 af cellerne positive), +++ (de fleste celler positive), ++++ (næsten alle celler stærkt positive). Eftersom forskellene mellem +- og o-farvning var mindre tydelige end mellem 10 ++- og +-farvning, blev det besluttet at regne en farvning, dér bedømmes med ++ eller derover, som positiv. Der iagttages både neoplastiske celler og stromaceller i turmorprøver? den noterede farvning refererer til tumorcellers, eftersom stromacelleme slet ikke farves eller kun farves svagere 15 end tumorcellerne.

Bestemmelse af antiqenlokaliserinq

Den subcellulære lokalisering af antigener bestemmes ved at måle antistofbinding til celler før eller efter perme-abilisering med ikke-ionisk detergent. Antistoffer, der 20 binder til celleoverfladen på intakte dyrkede celler, identificeres enten ved direkte bindingsprøver med 125I-mærket antistof [Brown m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 539-543 (1981)] eller ved indirekte fluorescens ved hjælp af (FACS)-II-cellesortereren. Antistoffer, der binder til intra-25 cellulære placeringer, bestemmes ved direkte binding med 125I mærket antistof til celler efter fiksering med paraformaldehyd og efterfølgende permeabilisering med det ikke-ioni-ske detergent ,,NP-40,‘.

Bindinasprøver 30 (a) Til bindingsprøver udført ved hjælp af radiomær kede antistoffer (Brown m.fl., supra) inkuberes dyrkede celler (106) ved 4eC i 30 minutter med 106 cpm 125I mærket antistof i 100 Mliter varmeaktiveret (30 minutter ved 56°C) kalvefosterserum i dyrkningsmedium. Efter tilsætning af 5 35 ml PBS pelletteres cellerne ved centrifugering i 10 minutter ved 250 G. Den ovenstående væskes frasuges, og pellet'en 19 DK 166682 B1 tælles for 125I. Når man skal måle ikke-specifik binding, udføres parallelle inkubationer med 10 βg umærket antistof som konkurrent (Brown m.fl., supra). I nogle tilfælde udføres bindingsprøver på analog måde på cellemonolåg fæstnet til 5 plastdyrkningsskåle.

(b) Ved bindingsprøver udført på FACS-II-cellesorte-reren fjernes celler fra deres substrater ved hjælp af PBS indeholdende 5 mmol ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Prøver indeholdende 1 x 105 celler inkuberes først med mono-10 klonalt antistof ved en koncentration på 2 /xg/ml efterfulgt af fluoresceinkonjugeret gede-antimuse-antistof ved en for-tyndning på 1ϊ200. Cellerne vaskes derpå og resuspenderes i dyrkningsmedium. Umiddelbart før FACS-analyse tilsættes propidiumiodid til en slutkoncentration på 1 /xg/ml for at 15 farve ikke-levedygtige celler. Under FACS-analyse udelukkes celler, der udsender rød fluorescens, elektronisk, således at kun levedygtige celler undersøges. Derpå bestemmes fluore-scein-fluorescensens gennemsnitlige intensitet for hvert antistof. Negative kontroller består af prøver, hvori mono-20 klonalt antistof er udeladt; positive kontroller består af monoklonale antistoffer mod histokompatibilitetsantigener for HLA af type 1. Farvningen anses for positiv, hvis det gennemsnitlige kanalfluorescein er mindst 3 gange baggrunden. BestemmeT se af antistoffers reaktivitet over for glvcolipider 25 Antistoffer afprøves for reaktivitet over for glycoli- pidantigener ved inkubation med rensede glycolipider adsorbe-ret i mikroprøvefordybninger (sammen med cholesterol og lecithin) og med tyndtlagschromatografiplader, hvorpå glyco-1ipider er blevet fraktioneret. Bundet antistof påvises ved 30 inkubation med antiserum mod museimmunoglobulin og radioiode-ret protein A.

ISQtVPebftg't-emmeT se (a) Ouchterlony immunodiffusion

En alikvot mængde ovenstående væske fra særlige hybri-35 domaceller anbringes i midter fordybningen på en 2% agarplade. Monospecifikke kanin-antimuse-Ig-isotype-antistoffer (Meloy) 20 DK 166682 B1 anbringes i de udvendige fordybninger, og pladen inkuberes 1 2 timer ved stuetemperatur og natten over ved 40“C.

(b) Fleksible polyvinylchloridplader med 96 fordybninger ("Costar®") overtrækkes med 0,1 mg/ml gede-antimuse-5 Ig-antistoffer i 2 timer ved 37®C og modovertrækkes med en 38%'s BSA-opløsning i 2 timer ved 37°C. Den ovenstående hybridomavæske inkuberes derpå ved 37°C i 2 timer. Efter vask med PBS inkuberes okseserumalbumin-(BSA) -plader ved 37°C i 2 timer med monospecifikke kanin-antimuse-Ig-isotypeantistof-10 fer koblet til peroxidase ("Zymed"). Efter vask inkuberes plader med 1 mg/ml orthophenylendiamin og 0,03% H2O2 i 0,1 molær citratpuffer, pH 4,5. Optisk tæthed ved 630 nm bestemmes på en "Dynatech®" ELISA-pladeaflæser.

Bindinqsprøve med staphylococ-protein A 15 Mikrotiterfordybninger inkuberes med 5% FCS i PBS

plus 0,02% NaN3, og den ovenstående væske frasuges. 25 pliter af en suspension af tumorceller (2 x 107 celler/ml) sættes til hver fordybning og inkuberes med 25 eliter af et særligt antistof i en time ved stuetemperatur. Pladerne centrifugeres 20 ved 1200 om./min. i 7 minutter, vaskes to gange med 50% NCS/PBS/NaN3, og 25 μliter 125I-staphylococ-protein A (ca.

50.000 cpm/25 liter) tilsættes. Pladerne inkubers i en time ved 15'C, vaskes to gange med 5% NCS/PBS/NaN3 og tørres. Bunden af fordybningerne udskæres og tælles i en gammatæller.

25

Eksempel

Fremstilling af monoklonale antistoffer

Monoklonale antistoffer fremstilles ved at immunisere 3 måneder gamle BALB/c-mus med celler fra lungehindeudsiv-30 ninger fra patienter med metastastisk lungecarcinoma, der ikke er småcellet. Immuniseringerne udføres ved, at musene injiceres intraperitonealt 3-4 gange med ca. 107 celler.

Tre dage efter den sidste immunisering udtages deres milt, suspenderes i dyrkningsmedium og fusioneres med NSl-musemye-35 lomaceller (Kohier og Milstein, supra). Blandingerne podes, således at der dannes kulturer med lav densitet stammende 21 DK 166682 B1 fra fusionerede enkeltceller (kloner). De metoder, der anvendes til hybridiseringen, er tidligere blevet beskrevet af Yeh m.fl. i Int. J. Cancer 29, 269-275 (1979).

ovenstående væsker fra hybridceller " screenes ved 5 hjælp af både en ELISA-prøve og en autoradiografisk, indirekte prøve med 125-I-mærket protein A [Brown m.fl., J. Immunol. Meth. 31, 201-209 (1979)] mod ekstrakter fra de tumorer, der anvendes til immunisering, og indeholdende bl.a. cellemembraner. Disse ekstrakter fremstilles ved hjælp 10 af en metode, der er modificeret ud fra Colcher m.fl., Cancer Res. 42, 1451-1459 (1981), Yeh m.fl., supra. Hertil vaskes væv med PBS og suspenderes, hvilket for intakte tumorers vedkommende gøres, ved at de presses gennem en sigte af rustfrit stål. Herefter tilsættes 1 mmolær NaHC03 indehol-15 dende 1 mmolær phenylmethylsulfonylfluorid (Carbiochem-Beh-ring Corp., San Diego, CA), og materialet homogeniseres derpå på is med 50 slag af B-støderen i en "Dounce"-homogeni-sator. Efter centrifugering i 15 minutter ved 27.000 G fjernes den ovenstående væske, og pelletten resuspenderes i 20 PBS, lydbehandles i 1 minut og opbevares ved -70ec.

Hybridomer, der producerer antistoffer, der binder til cellemembranekstrakterne, klones, ekspanderes in vitro og afprøves yderligere for antistof specificitet. Denne afprøvning udføres ved hjælp af den ovenfor beskrevne immuno-25 histologiske metode, ved hvilken antistoffers evne til at bindes til frosne snit af lungecarcinomer, andre tumorer og normal humant væv afprøves. De hybridomer, som producerer antistof med tilsyneladende specificitet for human lungecancer, reklones, ekspanderes og injiceres i med pristan præpa-30 rerede, 3 måneder gamle BALB/c-mus, hvor de udvikles til ascitestumorer.

Antistoffer, der udskilles i ascites, renses på protein A-HSepharose®" [Ey m.fl., Immunochemistry 15, 429 (1978)] eller ved gelfiltrering i "Sephacryl® S-300". Rensede 35 antistoffer anvendes til yderligere karakterisering, der omfatter yderligere specificitetsprøver ved hjælp af immu- c DK 166682 Bl 22 nohistologi-bindingsprøver på intakte celler for at bestemme, hvilke antistoffer der bindes til celleoverfladen, og radio-immunofældningsprøver som beskrevet ovenfor.

Monoklonale antistoffer L15 og L17 fremstilles ud 5 fra det tilsvarende hybridoma som beskrevet ovenfor. Disse antistoffer udviser de egenskaber, der er anført ovenfor i beskrivelsen.

Antistoffer L15 og L17 underkastes den immunohisto-logiske metode, der er beskrevet ovenfor.

10 Antistof L15 binder stærkt til NSCLC-celler og binder ikke til følgende celler: coloncarcinoma, brystcarcinoma, normalt hjerte, leukocyter, hjerne, colon, nyre, milt, hud og lever.

Antistof L17 binder stærkt til NSCLC-celler, coloncar-15 cinomaceller og brystcarcinomaceller. L17 udviser svag binding med leukocyter og ingen binding med følgende celler: normalt hjerte, hjerne, colon, nyre, milt, hud og lever.

Opfindelsen angår endelig cellelinier, som producerer de her omhandlede antistoffer betegnet L15 og L17. Disse 20 cellelinier er begge deponeret hos ATCC den 1. marts 1985 og har fået accessionsnumrene hhv. HB8738 og HB8739.

25 30 c 35 4

Claims (20)

1. Monoklonalt antistof betegnet L15 eller et Fab-, F(ab')2“ eller Fv-fragment deraf, kendetegnet ved, at det produceres af en hybridomacelleliriie med egenska-5 ber som cellelinien deponeret hos ATCC med accessionsnummer HB8738, og at det antigenkombinerende sted deri definerer LeY, et celleoverflade-carbonhydrat-antigen, der er karakteristisk for lungecarcinoma i humane, ikke-småcellede lungeceller.

2. Monoklonalt antistof betegnet L17 eller et Fab-, F(ab')2"* eller Fv-fragment deraf, kendetegnet ved, at det produceres af en hybridomacellelinie med egenskaber som cellelinien deponeret hos ATCC med accessionsnummer HB8739, og at det antigenkombinerende sted deri definerer

3. Monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 2, k e n-detegnet ved, at det er konjugeret til et mærkestof, 20 der kan producere et påviseligt signal.

4. Monoklonalt antistof ifølge krav 3, kendetegnet ved, at mærkestoffet er et fluoresceringsmiddel, et radiomærkestof, en chromophor eller et enzym.

5. Cellelinie, kendetegnet ved, at den er 25 deponeret hos ATCC med accessionsnummer HB8738.

6. Cellelinie, kendetegnet ved, at den er deponeret hos ATCC med accessionsnummer HB8739.

7. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af en ondartet lungecancertilstand i humane, ikke-småcellede 30 lungeceller i en persons lunge, kendetegnet ved, at væv fra personen ved hjælp af et monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 2 undersøges for tilstedeværelsen af et carbonhydrat-antigen, der er LeY- eller Lex-antigen eller et antigen med disses karakteristika.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendeteg net ved, at vævet er valgt blandt udskåret væv, eksfolia- DK 166682 B1 tivt væv og kropsvæsker.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 til bestemmelse af tilstedeværelsen af en ondartet lungecancertilstand i humane, ikke-småcellede lungeceller i en persons lunge, kende-5 tegnet ved, at (a) en vævsprøve fra personen bringes i kontakt med et monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 2, som definerer et determinant-sted på et antigen, som er LeY- eller Lex-antigen eller et antigen, der har LeY- eller Lex-antigens 10 karakteristika, under betingelser for antistoffets binding til prøven, og (b) forekomsten af antistoffets binding til prøven iagttages, idet bindingen er relateret til tilstedeværelse af en ondartet tilstand i lungen.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendeteg net ved, at omfanget af binding bestemmes ved, at prøven bringes i berøring med et konj ugat af et mærkestof og en specifik bindingspartner for det monoklonale antistof, idet mærkestoffet er i stand til at frembringe et påviseligt 20 signal.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det monoklonale antistof konjugeres til et mærkestof, der kan frembringe et påviseligt signal.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendete g-25 net ved, at den specifikke bindingspartner for det monoklonale antistof er et antistof, der er specifikt for det monoklonale antistof.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12, kendetegnet ved, at mærkestoffet er 30 en chromophor.

14. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 9-13, kendetegnet ved, at det monoklonale antistof er L15-antistof.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af 35 kravene 9-13, kendetegnet ved, at det monoklonale antistof er L17-antistof. DK 166682 B1

15 Lex, et celleoverflade-carbonhydrat-antigen, der er karakteristisk for lungecarcinoma i humane, ikke-småcellede lungeceller.

16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 9-15, kendetegnet ved, at vævet er valgt blandt udskåret væv, eksfoliativt væv og kropsvæsker.

17. Monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 2 til 5 anvendelse ved diagnose af lungecarcinoma i humane, ikke- småcellede lungeceller.

18. Diagnosticeringssæt, kendetegnet ved, at det udgøres af (a) et monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 2, og 10 (b) et konjugat af (1) et mærkestof, som er en del af et signalfrembringende system, og (2) en specifik bindingspartner for det monoklonale antistof i (a) ovenfor.

19. Diagnosticeringssæt, kendetegnet ved, at det udgøres af 15 et konjugat af (1) et mærkestof, som er en del af et signalfrembringende system, og (2) et monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 2.

20. Diagnosticeringssæt ifølge krav 18 eller 19, kendetegnet ved, at mærkestoffet er et fluores- 20 ceringsmiddel eller et enzym.