FI87578B - Foerfarande foer framstaellning av monoklonala antikroppar foer ej-smaocelliga lungkraeftsvulster hos maenniska - Google Patents

Description

1 87578

Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ihmisen ei-pienisoluisia keuhkosyöpäkasvaimia vastaan -Förfarande för framställning av monoklonala antikroppar för ej-smdcelliga lungkräftsvulster hos människa

Ihmisen keuhkosyövät aiheuttavat useimmat miesten syöpäkuole-mat ja ovat ohittamassa rintasyövän tavallisimpina syöpä-kuoleman aiheuttajina naisten keskuudessa (Cancer Facts and Figurs, 1983). Tämä tauti voidaan jakaa neljään histologiseen päätyyppiin, so. epidermoidiseen (30 %), rauhassyöpään (35%), suurisoluiseen järjestäytymättömään (15 %) ja pienisoluiseen (20 %). Useimmat keuhkosyöpätapaukset eivät ole parannettavissa kemoterapialla ja säteilyhoidolla. Kemoterapia ja sä-teilyhoito saattavat vaikuttaa pienisoluisiin keuhkosyöpiin kokoa pienentämällä, mutta ei kokonaan parantamalla. Täydellinen kirurginen kasvaimen poisto näyttää olevan ainoa tehokas hoitomenetelmä. Valitettavasti kuitenkin vähemmällä kuin 30 %:11a keuhkosyöpäpotilaista on kasvaimia, jotka voidaan täysin poistaa leikkaamalla ja näistä vähemmän kuin yksi kolmannes elää 5 vuotta ilmeisen täydellisen kirurgisen kasvaimen poiston jälkeen. Sen takia on suuri tarve saada aikaan menetelmiä, jotka tekisivät mahdolliseksi keuhkosyövän aikaisemman toteamisen, paremman syövän leviämisasteen määrittämisen ja tehokkaamman hoidon.

Näihin kaikkiin tarkoituksiin voidaan käyttää monoklonaalisia vasta-aineita. Edellytyksenä on kuitenkin löytää vasta-aineita antigeeneille, joita esiintyy paljon enemmän keuhkosyövässä kuin tavallisissa täysikasvuisissa kudoksissa. Koska tunnetaan kasvainsolupopulaatioiden heterogeenisuus, useiden determinanttien läsnäolo samassa antigeenimolekyylissä, ennakoidut erot antigeenien välillä suhteessa sopivuuteen diagnostisina markkereina verrattuna terepeuttisiin kohteisiin ja eri vasta-aineiden erilaiset biologiset ominaisuudet samaa antigeeniä kohtaan, saatetaan tarvita suuri määrä erilaisia vasta-aineita.

2 87578

Ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita keuhkosyöpäantigeeneja vastaan kuvataan julkaisussa Sikora et ai., Br. J. Cancer (1981) 43.:696-700. Monoklonaalisia vasta-aineita, jotka osoittavat spesifisyyttä useita ihmisen keuhkosyöpätyyppejä kohtaan, on esitetty julkaisussa Cuttitta et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981) 78:4591-4595. Ihmisen keuhkorauhas-syöpään liittyviä antigeenejä, jotka on määritetty mono-klonaalisilla vasta-aineilla, on kuvattu julkaisussa Varki et ai., Cancer Research (1984) 44:681-687.

Hiiren monoklonaalisia vasta-aineita glykolipidi Lex-anti-geeneja vastaan on kuvattu Hakomori et ai. julkaisussa Biochemical and Biophysical Research Communications (1981) 100:1578-1586; Borchaus et ai., Arch. Biochem. Biophys.

(1982) 217:647; Fukushi et ai., J. Biol. Chem. (1984) 259:506; Fukushi et ai., J. Exp. Med. (1984) 159:506: Chia et ai., Cancer Res. (1985) 45:435. Vasta-aineita Le^-antigeenejä vastaan ovat kuvanneet Abe et al.f J. Biol. Chem. (1983) 258:8934; Lloyd et ai., Immunogenetics (1983) 17:537; Brown et ai., Biosci. Rep. (1983) 2:163.

Ennalta määrätyn spesifisyyden omaavia vasta-aineita erittäviä fuusioitujen solujen jatkuvia viljelmiä on kuvannut Köhler et ai., Nature (1975) 265:495-497.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka tunnistavat determinantti-kohdat hiilihydraatti-(glykolipidi)antigeeneissä, jotka liittyvät ihmisten ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) so-luihin. Termi "NSCLC-solut" sisältää epidermoidiset syöpäso-V. lut, rauhassyöpäsolut ja suurisoluiset järjestäytymättömät syöpäsolut. Determinanttikohta voi esiintyä myös joidenkin muiden syöpien antigeeneissä, esim. joidenkin rintasyöpien ja, täten, keksinnön mukaiset vasta-aineet sitoutuvat myös näihin muihin syöpäsoluihin. Esillä olevat monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat paljon enemmässä määrin normaaleihin täysikasvuisiin soluihin kuin kasvainsoluihin. Termillä "sitoutuvat 3 87578 paljon pienemmässä määrin" tarkoitetaan, että sitoutuminen ei ole havaittavissa immunohistologisilla menetelmillä, ja että sitoutuminen on paljon heikompaa normaaleihin soluihin kuin kasvainsoluihin. Monoklonaalisia vasta-aineita erittävät hiiren hybridomat.

Esillä oleva keksintö sisältää myös menetelmiä keuhkossa olevan pahanlaatuisen tilan toteamiseksi tutkimalla keuhko-kudosta ja muita ihmiskudoksia sellaisen antigeenin läsnäolon toteamiseksi, jolla on Lex- tai Le^ -antigeenien omi-naisuudet. Le -antigeeniä on kuvannut Hakomori et ai., yllä; Brockhaus et ai., yllä; Fukushi et ai., yllä; ja Chia et ai., yllä. Le^-antigeenia on kuvannut Abe et ai., yllä, Lloyd et ai., yllä ja Brown et ai., yllä.

Esimerkiksi, kohteesta saatu kudos voidaan saattaa yhteyteen vasta-aineen kanssa, joka tunnistaa determinanttikohdan hiilihydraattiantigeeniin liittyvässä solussa, joka anti-geeni on LeJ tai Le tai jolla on LeJ :n tai Le :n ominaisuudet tai funktionaalinen ekvivalentti tai tällaisen vasta-aineen osanen.

Täten, menetelmä kohdistuu tiettyihin diagnostisiin menetelmiin, joissa käytetään keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita. Yksi tällainen menetelmä käsittää NSCLC-so-lujen läsnäolon määrittämisen näytteessä, jonka epäillään sisältävän tällaisia soluja. Näyte saatetaan kosketuksiin monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka pystyy erottamaan tällaiset solut muista solutyypeistä, joita voi olla läsnä näytteessä. Yhteensaattaminen suoritetaan olosuhteissa, joissa vasta-aine sitoutuu tällaisiin soluihin. Yhteensaatta-misen jälkeen määritetään onko vasta-aine sitoutunut soluihin vai ei. Tämä sitoutuminen on verrannollinen NSCLC-solujen läsnäoloon tai poissaoloon näytteessä. Yleensä näyte saatetaan kosketuksiin yhdessä leimatun monoklonaali-selle vasta-aineelle spesifisen sitoutumisosapuolen kanssa. Tämä leima kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Toinen 4 87578 diagnostinen menetelmä käsittää kasvaimen paikallistamisen käyttämällä vasta-aineita tai vasta-aineiden osasia, jotka on sopivasti leimattu (esim. radioisotoopilla) ja on sen jälkeen ruiskutettu potilaisiin. Tällä menetelmällä saadaan aikaan parempia tapoja syöpäpotilaiden seuraamiseksi taudin laajuuden suhteen ja hoidolla aikaansaatujen muutosten havaitsemiseksi.

Keksinnöllä on myöskin terapeuttisia sovellutuksia. Vasta-aineet voivat reagoida toisen tai kummankin edellä mainitun antigeenin kanssa, joita esiintyy suurissa pitoisuuksissa kasvainsolujen pinnalla. Sitä voidaan käyttää kantajana useille aineille, joilla on kasvaimenvastainen vaikutus, sekä myös, mutta ei ainoastaan, kemoterapeuttisille lääkeaineille ja radioisotoopeilie.

Esillä oleva keksintö koskee uusia vasta-aineita, jotka sitoutuvat ihmisen NSCLC-solujen antigeeneihin ja tiettyjä diagnostisia ja terapeuttisia menetelmiä, joissa käytetään näitä vasta-aineita. Keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa Köhlerin ja Milsteinin yllä, vakiomenetelmien mukaisesti. Immunogeeninä käytetään esimerkiksi, ihmisen keuhkosyöpäsoluja yleisistä nestepurkaumista . . tai viljeltyjä soluja ihmisen ei-pienisoluisesta keuhko-* * syövästä, tai soluja normaalista kuolleesta keuhkosta. Nämä ···'- ruiskutetaan hiireen ja, riittävän ajan jälkeen, hiiri ta- ·. ·. petaan ja pernasolut otetaan talteen. Haluttuja immunoglobu-Y : liineja koodaavat pernasolun kromosomit tallennetaan fuusioisi ; maila pernasolut myeloomasolujen kanssa tai imukudoskasvain- • : solujen kanssa, yleensä polyetyleeniglykolin läsnäollessa.

Saatujen solujen, jotka sisältävät fuusioituneet hybridomat, : annetaan kasvaa selektiivisellä alustalla, kuten HAT-alus- .·, talla, ja eloonjääneitä soluja kasvatetaan tällaisella alustalla käyttäen rajoittavia laimennusolosuhteita. Soluja kasvatetaan sopivassa säiliössä, esim. mikrotiitterikuopissa, ja supernatantista seulotaan monoklonaaliset vasta-aineet, joilla on haluttu spesifisyys.

i 5 87578

On olemassa useita menetelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden saantojen parantamiseksi, kuten hybridomasolujen ruiskuttaminen nisäkäsisännän, joka hyväksyy solut, vatsaonteloon ja keräämällä vesivatsaneste. Mikäli vesivatsa-nesteestä saadaan riittämätön määrä monoklonaalista vasta-ainetta kerättyä, vasta-aine kerätään isännän verestä. On olemassa useita tavanomaisia tapoja eristää ja puhdistaa monoklonaaliset vasta-aineet, monoklonaalisten vasta-aineiden vapauttamiseksi muista proteiineista ja muista konta-minanteista (katso Köhler ja Milstein, yllä).

Erästä esillä olevan keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta merkitään L15. Se tunnistaa solun pinnalla olevan hiilihydraattiantigeenin, joka on Le^-antigeeni,tai jolla on sen ominaisuudet. Me olemme tunnistaneet tämän antigeenin tyypilliseksi ihmisen NSCLC-soluille ja soluille tietyistä muista ihmisen syöpäkasvaimista. Vasta-aine on on IgM-isotyyppiä. Se ei havaittavasti sitoudu suurimpien elinten normaaleihin soluihin, kuten fibroblasteihin, endo-teelisiin soluihin tai epiteelisoluihin. L15-vasta-ainetta tuotetaan L15-hiirihybridomalla.

. . Toista esillä olevan keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta merkitään L17. Se tunnistaa solun pinnassa oelvan hiilihydraattideterminantin, joka Lex-antigeeni, tai jolla on sen ominaisuudet. Myös tämän antigeenin olemme tunnistaneet tyypilliseksi ihmisen NSCLC-soluille ja tietyille muille ihmisen syöpäkasvainsoluille. Tämä vasta-aine on IgM-isotyyppiä. Se sitoutuu vähemmän suurimpien normaaleihin soluihin, kuten fibroblasteihin, endoteelisiin soluihin tai epiteelisoluihin, kuin kasvainsoluihin. L17-vasta-ainetta tuotetaan L17-hiirihybridomilla.

Vusta-uino 1.15 tunnistaa antigeenin Le^, jolla on alla kuvatunlainen rakenne:

Gal61-4GlcNa61-3Gal81-R 2 3

Fucal Fucal 6 37578 Tällä vasta-aineella voidaan tunnistaa monia glykolipidejä, joilla on eri pituiset ketjut.

Vasta-aine L17 reagoi monien glykolipidiantigeenien anti-geenien kanssa, joilla kaikilla on Le loppupäässään, so.:

Gal (31-4GlcNAc-R 3

Fucal R voi olla vaihtelevan pituinen tyyppiä 2 oleva veriryhmä-ketju (Gal31-4GlcANc Bl-3GalBl-4GlcNac Bl-3) .

Vasta-aine voi myös reagoida trifukosyyli Y-rakenteen kanssa, joka on esitetty alla:

Gal61-4GlcNAcBl-3GalBl-4GlcNA61-3Gal61-4GlcNAcBl-3Gal61-4Glc 3 3 3

Fucal Fucal Fucal

Keksinnön piiriin kuuluvat myöskin hyödylliset yllä olevien monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumisfragmentit, kuten Fab7, F(ab')2-» Fv-fragmentit jne. Vasta-aine fragmentteja saadaan tavanomaisin menetelmin. Esimerkiksi, hyödyllisiä sitoutumisfragmentteja voidaan valmistaa vasta-aineiden peptidaasiliuotuksella käyttäen papaiinia tai pepsiiniä.

Keksintö sisältää myöskin diagnostisen ja terapeuttisen käytön NSCLC-syöpäkasvaimien havaitsemiseksi ja hoitamiseksi ihmisissä, joissa kasvaimissa on LeJ- tai Le -antigeeni tai antigeenejä, joilla on Le - ja Le-* - antigeenien ominaisuudet, eli antigeenejä, jotka ovat sukua mutta eivät yhteneväisiä

V X

Le':n tai Le :n kanssa, ja jotka tunnistetaan vasta-aineel-

V X

la, joka tunnistaa myöskin Le^:n tai Le :n. Antigeeni voidaan puhdistaa tavanomaisin menetelmin, kuten on kuvannut Hakomori et ai., yllä, ja Abe et ai., yllä.

Yksi keksinnön mukainen menetelmä käsittää kohteen keuhkossa olevan pahanlaatuisen tilan määrittämisen tutkimalla onko kohteen keuhkokudoksessa tai muussa kudoksessa hiili- 7 87578 hydraattiantigeeni, joka on Ley tai Lex tai jolla on Le^:n tai LeX:n ominaisuudet. Termillä "kudos" tarkoitetaan irtileikattuja soluja, irtoavia soluja, kehon nesteitä, kuten verta, plasmaa, seerumia, virtsaa jne., ja sen kaltaisia. Termillä "pahanlaatuinen tila" tarkoitetaan kasvu-häiriöisten solujen läsnäoloa, sisältäen syöpäsolut in situ, neoplastiset, pahanlaatuiset tai kasvainsolut, tai sen kaltaiset. Esimerkiksi, näyte voidaan saattaa kosketuksiin tai yhdistää monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka tunnistaa Le^:n ja Lex:n determinanttikohdan, kuten keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine, esim. L15 tai L17 vasta-aine tai vasta-aine, jolla on samanlaiset ominaisuudet kuten, esimerkiksi, niillä vasta-aineilla, joita ovat kuvanneet Hakomori et ai., yllä, Fukushi et ai., yllä, Chia et ai., yllä, Abe et ai., yllä, Lloyd et ai., yllä ja Brown et ai., yllä. Yhteensaattaminen suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, joissa vasta-aine sitoutuu pahanlaatuisiin soluihin. Yhteensaattamisen jälkeen havaitaan onko vasta-ainetta sitoutunut pahanlaatuisiin soluihin näytteessä. Eli näytteestä etsitään vasta-aineen ja antiqeenikohdan irmuuni- komplekseja. Tämä immuunikompleksin muodostuminen on verrannollinen pahanlaatuisten solujen esiintymiseen näytteessä.

Erityinen esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän esimerkki, kuvaavana eikä rajoittavana, on menetelmä kasvain-solujen määrittämiseksi irtileikatusta kudoksesta. Yllä olevaa menetelmää sovelletaan näytteelle, joka on palanen kasvaimen poiston jälkeen saatua kasvainta. Irtileikattua kasvainta käsitellään kappaleiden saamiseksi, joka käsittely ensin käsittää kasvaimen tai kudoksen jäädyttämisen, tavallisesti jäädyttämisen välittömästi irti leikkaamisen jälkeen. Sitten jäädytetty kudoskerros leikataan kappaleiksi käyttäen, esimerkiksi, kryostaattia.

Yllä kuvatulla tavalla saatu kasvainkappale saatetaan yhteyteen keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen 8 87578 kanssa ja sitten tätä monoklonaalista vasta-ainetta vastaan suunnataan toinen vasta-aine, joka on leimattu havaittavalla leimalla.

Irtileikattu näyte,esim., kasvaimen kappale, saatetaan yhteyteen ensimmäisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa olosuhteissa, joissa vasta-aine sitoutuu pahanlaatuisiin soluihin. Inkubointi suoritetaan yleensä vesipitoisessa väliaineessa kuten, esimerkiksi, fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisältää pieniä määriä natriumatsidia, sopivassa säiliössä kuten, esimerkiksi, lasisessa petri-mal-jassa, noin 15-30 minuutin ajan lämpötilassa noin 20-30 °C. Käytetyn vasta-aineen määrä on yleensä riittävä havaittavan sitoutumisen aikaansaamiseksi, so. havaittavan määrän immuunikomplekseja aikaansaamiseksi vasta-aineen ja kyseessä olevan determinantin tai antigeenisen kohdan välillä.

Inkuboinnin jälkeen kappale pestään ei-spesifisesti sitoutuneen vasta-aineen vähentämiseksi tai poistamiseksi ja sitten se tutkitaan yllä mainittujen kompleksien havaitsemiseksi, jotka muodostuvat monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuessa näytteen soluihin, jotka omaavat antigeenisiä kohtia. Sitoutuminen on verrannollinen kappaleessa olevien pahanlaatuisten solujen läsnäoloon. Tämän mukaisesti, sitoutuminen määritetään, esimerkiksi, saattamalla näyte yhteyteen leimatun monoklonaaliselle vasta-aineelle spesifi-• sen sitoutumisosapuolen kanssa. Leima kykenee tuottamaan havaittavan signaalin ja voi olla radioaktiivinen leima, kromofoori, kuten fluoresoiva aine, entsyymi tai sen kaltainen , - ’ Esimerkki menetelmästä, jossa käytetään yllä mainittua lä hestymistapaa, on immunofluoresoiva värjäys. Tässä menetelmässä kasvaimen jäädytetyt kappaleet kiinnitetään lasilevylle asetonilla ja inkuboidaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, esimerkiksi, petri-maljalle. Sen jälkeen kun on pesty sopivalla puskurilla kuten, esimerkiksi, fosfaatti- 9 87578 puskuroidulla suolaliuoksella, kappale asetetaan petri-maljalle ja saatetaan kosketuksiin leimatun monoklonaali-selle vasta-aineelle spesifisen sitoutumisosapuolen kanssa, joka voi olla, esimerkiksi, käytetylle monoklonaaliselle vasta-aineelle spesifinen leimattu vasta-aine. Koska, useimmissa tapauksissa, monoklonaalinen vasta-aine on saatu hiirilähteestä, voidaan käyttää leimattua anti-hiiri-immu-noglobuliinia, joka on spesifinen monoklonaaliselle vasta-aineelle. Tällaisia immunoglobuliineja voidaan tuottaa tavanomaisin menetelmin ruiskuttamalla sopivaan isäntään hiiren vasta-ainetta, odottamalla sopiva aika, ja keräämällä anti-hiiri- immunoglobuliinit injektoidun isännän verestä.

Kun levy on pesty toisen kerran, esimerkiksi, vesipitoisella puskurilla, kappaleet voidaan peittää fluoresoivalla vasta-aineen kiinnittävällä nesteellä ja päällyslevyllä ja tutkia sitten fluoresenssimikroskoopilla monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumisen määrittämiseksi kappaleeseen. Sitoutumisen määrittäminen voi myös sisältää tällaisen sitoutumis-paikan identifioimisen näytteessä.

Monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuminen näytteeseen voidaan myös määrittää käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta, joka on sidottu kovalenttisesti leimaan, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin, kuten radioaktiiviseen osaseen, kromofooriin sisältäen väri- ja fluoresoivat aineet tai entsyymiin. Vasta-ainetta kohden käytettävien leimojen määrä yleensä määräytyy sen diagnostisen menetelmän vaatimusten mukaan, jossa leimattua vasta-ainetta käytetään ja paikkojen mukaan, jotka ovat käytettävissä leiman yhdistämiseen vasta-aineeseen.

Aikaisemmasta tekniikasta tunnetaan menetelmien leimojen konjugoimiseksi vasta-aineisiin ja vasta-aineen fragment-teihin. Tällaisia menetelmiä on esitetty US-patenteissa no:t 4 220 490, 4 235 869, 3 935 074 ja 3 996 345.

,0 87578

Toinen esimerkki tekniikasta, jossa keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää, on molekyy-lien, joissa on Le - ja LeJ - determinantteja, havaitseminen kehon nesteissä mukaan luettuina plasma ja seerumi. Tätä tarkoitusta varten keksinnön mukaista vasta-ainetta voidaan käyttää yksinään tai konjugoituna toiseen vasta-aineeseen, joka on suunnattu eri determinanttia vastaan.

Vielä eräs esimerkki tekniikasta, jossa keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää, on immuno-peroksidaasileimaus (Sternberger, Immunocytochemistry,

John Wiley & Sons, New York, 1979, s. 104-169, jota on modifioinut Garrigues et ai., Int. J. Cancer (1982) 29: 511-515). Testattava kudos kiinnitetään sopivalla liuottimena, kuten asetonilla, kantajalle, kuten lasilevylle. Seuraavaksi kudosta inkuboidaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja pestään sitten vapaaksi sitoutumattomasta vasta-aineesta. Sitten kudosta inkuboidaan jäniksen anti-hiiri-IgG:llä, pestään sitoutumattoman vasta-aineen poistamiseksi, yhdistetään hiiren peroksidaasi-anti-peroksi-daasi -kompleksin kanssa, pestään sitoutumattoman konju-gaatin poistamiseksi, ja käsitellään sitten entsyymisubst-raatilla. Tämän käsittelyn jälkeen levyä tutkitaan signaalin havaitsemiseksi.

Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää menetelmässä pahanlaatuisen tilan olemassaolon määrittämiseksi, esimerkiksi tutkittaessa keuhkosta irtoavaa solunäytettä, kuten ysköstä tai kohdun kaulan preparaattia. Termillä "irtoava” tarkoitetaan, että näyte käsittää erillisiä soluja tai solurykelmiä, joita saadaan raapimalla tai pesemällä kudoksen pintaa, jotka solut irtoavat erillisinä tai ryhminä tai kerroksina. Irtoava solunäyte tulee erottaa irtileikatusta kudoksesta, kuten biopsialla saadusta. Yhteen saattaminen näytteen ja vasta-aineen kanssa suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, että vasta-aine sitoutuu antigeenikohtaan. Yhteensaattamisen jälkeen määritetään, 11 87578 onko vasta-aine sitoutunut antigeeniseen kohtaan vai ei ja tämä on verrannollinen pahanlaatuisen tilan olemassaoloon keuhkossa.

Keuhkossa olevan pahanlaatuisen kasvaimen olemassaolon määrittämiseksi saataisiin ysköksestä menetelmässä käytettävä irtoava solunäyte. Menetelmä voi olla käyttökelpoinen määritettäessä pahanlaatuista tilaa irtoavissa solunäytteissä hengitysteistä, ruoansulatuskanavan alueelta, käsittäen oraalisen nielun, suun, jne.

Seuraava irtoava solunäyte saatetaan kosketuksiin edellä mainittujen vasta-aineiden kanssa sellaisissa olosuhteissa, että vasta-aine sitoutuu spesifisiin antigeenisiin kohtiin näytteessä muodostaen antigeeni-vasta-aine -komplekseja.

Tämä antigeeninen kohta voi olla läsnä näytteen soluissa tai solufragmenteissa. Yleensä näyte asetetaan sopivalle kantajalle, kuten esimerkiksi objekti levy lie, yleensä lasiselle, tai jotain sopivaa materiaalia olevalle. Irtoava solunäyte yleensä levitetään levylle ohuen kerroksen aikaansaamiseksi näytteestä levyn pinnalle. Näytteen ja vasta-aineen välinen kontakti suoritetaan yleensä vesipitoisessa puskuroidussa väliaineessa. Puskurit, joita voidaan käyttää, ovat fosfaatti, tris, bikarbonaatti jne. pH-arvo riippuu näytteen luonteesta ja vasta-aineesta, ja on yleensä alueella noin 5-8. Vesipitoinen väliaine voi lisäksi sisältää orgaanisia polaarisia liuottimia määrissä noin 0-40 %. Orgaaniset polaariset liuottimet ovat vesiliukoisia ja yleensä niillä on noin 1-10 hiiliatomia ja noin 1-4 happiatomia. Vasta-ainetta on läsnä vesipitoisessa väliaineessa pitoisuutena noin 1-100 |ig/ml, edullisesti noin 10-20 iig/ml. Lämpötila näytteen ja vasta-aineen kontaktin aikana on yleensä noin 4-40 °C, edullisesti noin 10-30 °C. Kontaktiaika on yleensä noin 15-120 min, edullisesti noin 30-60 min.

Näytteen ja vasta-aineen kosketusajan jälkeen kantajaa yleensä käsitellään reagoimattoman vasta-aineen poistami- 12 87578 seksi. Tavallisesti tämä suoritetaan pesemällä kantaja vesipitoisella, yleensä puskuroidulla, väliaineella. Yleensä pesuliuoksen määrä tulisi olla riittävä poistamaan reagoimaton vasta-aine.

Seuraavaksi havaitaan vasta-aineen sitoutuminen näytteen antigeenisiin kohtiin, joka sitoutuminen on verrannollinen pahanlaatuisen tilan olemassaoloon kohteessa. Eli näyte tutkitaan sen määrittämiseksi, kuinka monta antigeeni-vasta-aine (immuuni) -kompleksia on muodostunut. On huomattava, että joissain tapauksissa hyvin pieniä määriä kyseessä olevia antigeenisiä kohtia esiintyy irtoavassa solunäytteessä. Kuitenkin, pahanlaatuisissa tiloissa antigeenisiä kohtia on läsnä suurissa määrissä ja tämä viimeksi mainittu tila on helposti erotettavissa tällä menetelmällä ei-pahanlaatuisesta tilasta, koska voidaan mitata suuri määrä antigeeni-vasta-aine -komplekseja pahanlaatuisen tilan esiintyessä. Sitoutumisen määrittämiseksi analyysisystee-miin on sisällytetty keinot havaittavan signaalin aikaansaamiseksi. Esimerkiksi käytettävä vasta-aine voidaan kon-jugoida analyysissä leimaan, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Leima voi olla radioaktiivinen osanen, kromofoori käsittäen väri- ja fluorisoivat aineet, entsyymi tai sen kaltainen. Vasta-aineeseen käytettävien leimojen määrä yleensä määritetään menetelmän vaatimusten mukaan ja niiden paikkojen mukaan, jotka ovat käytettävissä leiman sitomiseksi vasta-aineeseen.

Vaihtoehtoisesti voidaan pesty levy saattaa yhteyteen leimatun spesifisen vasta-aineen sitoutumisosapuolen kanssa, joka voi olla, esimerkiksi, leimattu, käytettylle vasta-aineelle spesifinen vasta-aine. Kun monoklonaalinen vasta-aine on johdettu hiirilähteestä, voidaan käyttää leimattua anti-hiiri immunoglobuliin ia, joka on spesifistä käytettyä vasta-ainetta kohtaan. Tällaisia immunoglobuliineja voidaan tuottaa tavanomaisten menetelmien mukaisesti injektoimalla sopivaan isäntään monoklonaalista vasta-ainetta, 13 87578 odottamalla sopiva aika, ja keräämällä anti-hiiri immuno-globuliinit injektoidun isännän verestä. Käytettäessä leimattua spesifistä vasta-aineen sitoutumisosapuolta levy täytyy pestä jälleen vesipitoisella väliaineella ennen kuin tutkitaan levyn fluoresenssi.

Vasta-aineen ja solunäytteen välisen sitoutumisen läsnäolon määrittämiseksi, kun on käytetty fluoresoivaa leimaa, voidaan levystä tutkia fluoresenssi, yleensä käyttäen fluore-senssimikroskooppia. Käytettäessä jotakin muuta leimaa kuin fluoresoivaa, voidaan tutkia levyltä tai näytteestä sakan muodostuminen, väri tai jokin muu sen kaltainen.

Yllä olevan kuvaus on suunnattu ensisijaisesti keksinnön mukaisten vasta-aineiden käyttöön immunofluoresenssimene-telmissä. Kuitenkin keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää useimmissa analyyseissä, jotka sisältävät antigeeni-vasta-aine -reaktioita. Analyysit voivat olla homogeenisia tai heterogeenisia. Homogeenisessa analyysissä näyte voi olla biologinen neste, kuten seerumi, virtsa ja sen kaltaiset tai näyte voi olla hajotettu ja kirkastettu hajoamistuotteet poistamalla. Yleensä immunologinen reaktio käsittää spesifisen vasta-aineen, leimatun analyytin, ja kiinnostuksen kohteena olevan näytteen. Leimasta lähtevä signaali on muodostettu, suorasti tai epäsuorasti, sitomalla vasta-aine leimattuun analyyttiin. Sekä immunologinen reaktio että sen määrän havaitseminen suoritetaan homogeenisessa liuoksessa. Immunokemikaalisia leimoja, joita voidaan käyttää, ovat vapaat radikaalit, fluoresoivat väriaineet, entsyymit, bakteriofagit, koentsyymit jne.

Heterogeenisessa analyysissä reagenssit ovat yleensä näyte, spesifinen vasta-aine ja välineet havaittavan signaalin tuottamiseksi. Näyte asetetaan yleensä kantajalle, kuten levylle tai objektilasilie, ja saatetaan kosketuksiin vasta-aineen kanssa nestemäisessä faasissa. Sitten kantaja erotetaan nestemäisestä faasista ja joko kantajafaasi tai 14 87578 nestemäinen faasi tutkitaan signaalin havaitsemiseksi käyttäen välineitä, jotka saavat aikaan tällaisen signaalin. Signaali on verrannollinen näytteessä olevan analyytin läsnäoloon. Välineinä, joilla voidaan saada aikaan havaittava signaali, käytetään radioaktiivisia leimoja, fluoresoivia aineita, entsyymejä jne. Esimerkkejä heterogeenisistä immunoanalyyseistä ovat radioimmunoanalyysi, immuno-fluoresoiva menetelmä, entsyymi-sidottu immuunianalyysi ja sen kaltaiset.

Yllä mainittuja immunoanalyysimenetelmiä on kuvattu yksityiskohtaisemmin seuraavissa "Enzyme-Immunoassay", Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Katso myös esimerkiksi, US-patentit no:t 3 690 834, 3 791 932, 3 817 837, 3 850 578, 3 853 987, 3 867 517, 3 901 654, 3 935 074, 3 994 533, 3 990 345 ja 4 098 876, jonka listan ei ole tarkoitus olla kaiken kattava.

Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan myös käyttää metas-taattisten esiintymien kuvaamiseen ihmispotilailla, joilla on NSCLC, samalla tavalla, kuin on kuvattu pahanlaatuiselle melanoomalle julkaisussa J. Nucl. Med. (1983) 24:123-129 ja julkaisussa J. Clin. Invest. (1983) :2101-2114. Vasta- aine tai sen fragmentit on radioleimattu ja annosteltu suonensisäisesti potilaalle, jota kuvataan jatkuvasti käyttäen, esimerkiksi, gamma-kameraa tai sen kaltaista.

Sitä, että yllä kuvatuissa spesifisissä esillä olevan keksinnön mukaisissa menetelmäesimerkeissä käytetään vasta-aineita, jotka sitoutuvat vastaavien antigeenien spesifisiin determinanttikohtiin ja kuuluvat hiirestä peräisin olevaan IgM alaluokkaan, ei ole tarkoitettu olevan rajoitus. Yllä mainittuja vasta-aineita ja niitä vasta-aineita, jotka ovat funktionaalisesti samanlaisia yllä mainittujen vasta-aineiden kanssa, ovat ne sitten hiiri lähteestä, jostain toisesta nisäkäslähteestä, ihminen mukaan luettuna, tai muista lähteistä tai niiden yhdistelmistä, voidaan käyttää tämän kek- i is 87578 sinnön mukaisissa menetelmissä, kuten myös muita isotyyp-pejä. Termillä "funktionaalinen samankaltaisuus" tarkoitetaan, että vasta-aine kykenee sitoutumaan jompaan kumpaan vastaavaan yllä mainittuun determinanttikohtaan ja kykenee kilpailemaan keksinnön mukaisen erityisen vasta-aineen kanssa tällaisesta kohdasta. Eli tällainen vasta-aine, kun se saatetaan yhteyteen näytteen kanssa, joka sisältää tällaisen determinanttikohdan sisältävän solun tai solufrag-mentin tai erittynyttä antigeeniä, sitoutuu tällaiseen determinanttikohtaan ja estää keksinnön mukaisen vasta-aineen sitoutumisen tähän kohtaan. Edelleen, koska Le^- ja

V

Le -antigeeneillä on enemmän kuin yksi determinanttikohta, keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään monoklonaali-sia vasta-aineita, jotka tunnistavat determinanttikohtia, jotka ovat muita kuin ne determinanttikohdat, jotka yllä mainitut monoklonaaliset vasta-aineet tunnistavat.

Keksintö käsittää myöskin diagnostisen määritysvälinesarjän yllä kuvattujen menetelmien suorittamiseksi. Eräässä suoritusmuodossa, diagnostinen määritysvälinesarja käsittää (a) monoklonaalisen vasta-aineen, joka on tarkemmin kuvattu yllä ja (b) spesifisen sitoutumisosapuolen konju-gaatin yllä mainitulle monoklonaaliselle vasta-aineelle ja leiman, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Reagenssit voivat myös sisältää lisäaineita, kuten puskuri-aineita ja proteiineja stabiloivia aineita, esim. polysakkarideja ja sen kaltaisia. Diagnostinen määritysväline-sarja voi edelleen sisältää, mikäli tarpeen, muita signaalin tuottavan systeemin osasia, missä systeemissä leima on osana, aineita taustalla» r iöiden vähentämiseksi kokeessa, kontrollireagensseja, laitteistoja testin suorittamiseksi ja sen kaltaisia. Toisessa suoritusmuodossa, diagnostinen määritysvälinesarja käsittää keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen ja leiman konjugaatin, joka leima kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Yllä mainittuja lisäaineita voi myöskin olla läsnä.

16 87578

Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää terapeuttisesti. Sopivat biologiset ominaisuudet omaavia vasta-aineita voidaan käyttää suoraan terapeuttisina aineina (Sears, et al.# Contrl. Oncol. Karger, Basel, (1 984) _1_9:180-192) . Edelleen, vasta-aineet voidaan sitoa toksiiniin immunotoksiinin muodostamiseksi tai radioaktiiviseen aineeseen tai lääkeaineeseen radiofarmaseuttisen tai farmaseuttisen aineen muodostamiseksi. Menetelmät vasta-aineiden immunotoksiinien ja radiofarmaseuttisten aineiden tuottamiseksi ovat hyvin tunnettuja (katso esim., Cancer Treatment Reports (1984) 68: 317-328).

Toinen esillä olevan keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen terapeuttinen käyttö on potilaan immunisoiminen anti-idiotyyppisellä vasta-aineella, joka on tuotettu käyttäen yhtä esillä olevaa monoklonaalista vasta-ainetta immunogeeninä. Tällainen immunisointi voi saada aikaan tehokkaan anti-kasvain aktiivisuuden (katso esim., Nepom et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1984) 8j[:2864-2867) . Samalla tavoin potilas voidaan immunisoida vastaavalla antigeenillä puhdistetussa muodossa tai vastaavien antigeenien modifioiduilla muodoilla.

Huomionarvoinen esillä olevan keksinnön näkökohta on, että esillä olevia vasta-aineita voidaan yhdistää muiden vasta-aineiden kanssa NSCLC:tä vastaa, kuten niiden, joita on kuvattu US-patenttihakemuksissa no:t 667 521 ja 684 759, jätetty sisään marraskuun 2. päivänä 1984 ja joulukuun 21. päivänä 1984, vastaavasti. Yhdistelmä on tehokas havainnoitaessa ainakin yllä mainittuja neljää keuhkosyöpä-kasvaintyyppiä, nimittäin, suurisoluista järjestäytymätöntä keuhkosyöpäkasvainta, pienisoluista keuhkosyöpä-kasvainta, rauhassyöpää ja epidermoidista syöpää.

Keksinnön mukaise monoklonaaliset vasta-aineet tunnistavat myöskin antigeenien determinanttikohdat, jotka liittyvät muihin syöpäkasvaimiin, kuten rintasyöpäkasvaimiin. Tämän 17 87578 seurauksena esillä olevia vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisissa ja terapeuttisissa tuotteissa, jotka on suunnattu tällaisia syöpäkasvaimia vastaan.

Esimerkit

Keksintöä kuvataan edelleen seuraavilla valaisevilla esimerkeillä. Aluksi kuvataan muutamia käytettyjä menetelmiä.

Immunohistologinen menetelmä Jäädytettyjen kappaleiden immunohistologisia kokeiluja varten käytettiin Sternbergerin leimaamaton vasta-aine -menetelmää julkaisussa Immunochemistry, John Wiley & Sons,

New York, 1979, s. 104-169, modifioituna Garrigues et ai. tapaan julkaisussa Int. J. Cancer (1982) 2_9^ r511—515. Kohde-kudokset näitä kokeita varten saatiin kirurgisesti ja ne jäädytettiin neljän tunnin sisällä poistamisesta isopentaa-niin, joka oli esijäähdytetty nestemäisellä typellä. Sitten kudokset varastoitiin nestemäiseen typpeen tai -70 °C:een käyttöön saakka. Jäniksen anti-hiiri-IgG:tä (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) käytettiin laimennoksena 1/50. Hiiren peroksidaasi-antiperoksidaasi-kompleksia (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) sisältäen 2 mg/ml erityisesti puhdistettua PAP:ta, käytettiin laimennuksena 1/80. Jäädytetyt kappaleet preparoitiin, kuivattiin, käsiteltiin asetonilla ja kuivattiin (Garrigues et ai., 1982). Histologiseen arviointiin käytet-·; tävät kappaleet värjättiin hematoksyliinillä. Epäspesifiseen taustaan vähentämiseksi kappaleita esi-inkuboitiin tavallisen ihmisseerumin kanssa laimennettuna 1/5 (Garrigues et ai., 1982). Hiiren vasta-aineet, vuohen anti-hiiri IgG, ja hiiren PAP laimennettiin liuoksella, jossa oli 10 % tavallista ihmisen seerumia ja 3 % jäniksen seerumia.

Värjäysmenetelmä käsitti sarjan kappaleita käsittelemisen joko spesifisellä tai kontrolli vasta-aineella 2,5 tuntia, inkuboimisen 30 minuuttia jäniksen anti-hiiri IgG:n kanssa laimennoksena 1/50, ja altistamalla 30 minuutin ajan hiiren ,8 87578 PAP-kompleksille laimennettuna 1/80. Jokaisen vasta-aineen käsittelyn jälkeen objektilevyt pestiin kahdesti fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Immunohistokemiallista reaktiota kehitettiin juuri valmistetulla 0,05 %:lla 3,3’-diamincbentsldiinitetrahydrokloridilla (Sigma, St. Louis, MO) ja 0,01 %:lla vetyperoxidilla 0,05 M tris-puskurissa, pH 7,6 8 minuutin ajan. Lisäaltistaminen 1 %:lle OsO^-liu-okselle tislatussa vedessä 20 minuutin ajan syvensi värin. Kappaleet huuhdeltiin vedellä, dehydrattiin alkoholilla, kirkastettiin ksyleenillä ja kiinnitettiin objektilevyihin.

Objektilevyt koodattiin jokainen ja koodatut näytteet tutkittiin käyttäen puolueettomia tutkijoita. Tyypilliset objektilevyt valokuvattiin käyttäen erotusinterferenssi-kontrastioptiikkaa (Zeiss-Nomarski). Vasta-aineen värjäy-tymisaste arvioitiin 0:ksi (ei reaktiivisuutta), + (vähän positiivisia soluja), ++ (ainakin 1/3 soluista positiivisia) , +++ (useimmat solut positiivisia), ++++ (lähes kaikki solut vahvasti positiivisia). Koska erot värjäytymisessä + ja 0 välillä olivat vähemmän selviä kuin ++ ja + -värjäyty-misen välillä, päätettiin laskea positiiviseksi värjäysaste, joka oli ++ tai suurempi. Kasvainnäytteissä tarkasteltiin sekä neoplastisia että peruskudossoluja; havaittua värjäy-: tyrnistä verrattiin kasvainsolujen värjäytymiseen, koska peruskudossolut eivät värjäytyneet lainkaan, tahi värjäy-tyivät heikommin kuin kasvainsolut.

• " Antigeenien sijainnin määrittäminen .· Antigeenien solunalainen sijainti määritettiin mittaamalla V vasta-aineen sitoutuminen soluihin ennen tai jälkeen per- meabilisoinnin ei-ionisella detergentillä. Vasta-aineet, jotka sitoutuivat vahingoittumattomien viljeltyjen solujen pintaan, tunnistettiin joko suoralla sitoutumisanalyysillä 125 käyttäen I-leimattua vasta-ainetta (Brown et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981) 78^:539-543) tai epäsuoralla fluoresenssillä käyttäen (FACS) II-solulajittelijaa. Vasta-aineet, jotka sitoutuivat solun sisäisiin paikkoihin, määri- 125 19 37578 tettiin I-leimatun vasta-aineen suorana sitoutumisena soluihin, jonka jälkeen ne kiinnitettiin paraformaldehydil-lä ja edelleen permeabilisoitiin ei-ionisella detergentillä NP-40.

Si toutumisanalyysit a) Sitoutumisanalyysejä, jotka suoritettiin käyttäen radioleimattuja vasta-aineita (Brown et ai., yllä) varten, 6 o 6 inkuboitiin viljeltyjä soluja (10 ) 4 C:ssa 30 min. 10 125 cpm:n kanssa I-leimattua vasta-ainetta 100 yl:ssa lämpö- aktivoitua (39 min. 56 °C:ssa) vasikan sikiön seerumia viljelyalustalla. Sen jälkeen kun oli lisätty 5 ml PBS:ää, solut pelletoitiin sentrifuaoimalla 10 min 250 x g. Super- 125 natantti imettiin pois ja pelletistä mitattiin I. Ei-spesifisen sitoutumisen mittaamiseksi suoritettiin samanaikaisia inkubointeja 10 yg:lla leimaamatonta vasta-ainetta kilpailijana ( Brown et ai., yllä). Joissain tapauksissa sitoutumisanalyysit suoritettiin analogisella tavalla käyttäen muovisiin viljelymaljoihin kiinnitettyä soiukerrosta.

b) Sitoutumisanalyysejä varten, jotka suoritettiin FACS II -solulajittelijalla, solut poistettiin substraatistaan käyttäen PBS:ää, joka sisälsi 5 mM etyleenidiamiini tetraetikkahappoa (EDTA). Näytteitä, jotka sisälsivät 1 x 103 solua, inkuboitiin ensin monoklonaalisen vasta-aineen kanssa konsentraatiossa 2 yg/ml ja sitten fluoreseiini-sidotun vuohen anti-hiiri vasta-aineen kanssa laimennoksena 1:200. Sitten solut pestiin ja suspendoitiin uudestaan kasvatusalustaan. Välittömästi ennen FACS-analyysiä lisättiin propidium jodidia lopulliseen pitoisuuteen 1 yg/ml kuolleiden solujen värjäämiseksi. FACS-analyysin aikana solut, jotka emittoivat punaista fluoresenssia, suljettiin pois elektronisesti siten, että ainoastaan elävät solut tutkittiin. Sitten jokaiselle vasta-aineelle määritettiin fluere-seiinin fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti. Negatiiviset kontrollit käsittivät näytteitä, joista monoklo-naalinen vasta-aine oli jätetty pois; positiiviset kontrollit käsittivät monoklonaalisia vasta-aineita HLA tyyppiä 1 20 87578 oleville histocompatibilisille antigeeneille. Värjäys katsottiin positiiviseksi, mikäli keskimääräinen kanavan fluo-reseiini oli vähintään 3 x tausta.

Vasta-aineiden reaktiivisuuden määrittäminen glykolipidejä kohtaan

Vasta-aineiden reaktiivisuus glykolipidiantigeenejä kohtaan testattiin inkuboimalla vasta-aineita puhdistettujen glyko-lipidien kanssa, jotka oli adsorboitu mikrotestilevykuoppiin (kolesterolin ja lesitiinin kanssa) sekä ohut kerros kroma-togorafialevyjen kanssa, joille glykolipidit oli fraktioitu. Sitoutunut vasta-aine määritettiin inkuboimalla hiiren immu-noglobuliinin ja radiojodatun proteiini A:n antiseerumin kanssa.

Isotyyppimääritys a) Ouchterlony-immunodiffuusio

Supernatantin alikvootti erityisiä hybridomasoluja laitettiin 2 %:n agar-levyn keskikuoppaan. Monospesifisiä jäniksen anti-hiiri -Ig-isotyyppisiä vasta-aineita (Meloy) asetettiin ulommaisiin kuoppiin ja levyä inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja yli yön 4 °C:ssa.

b) Taipuisia 96 kuoppaa sisältäviä polyvinyylikloridi-levyjä (Costar) päällystettiin 0,1 mg/ml vuohen anti-hiiri Ig vasta-aineilla 2 tunnin ajan 37 °C:ssa ja päällystettiin uudelleen 3 %:lla BSA-liuoksella 2 tuntia 37 °C:ssa. Hybri- '· doma-supernatanttia inkuboitiin sitten 37 °C:ssa 2 tunnin ajan. Pesun jälkeen PBS-naudan seerumin albumiinilla (BSA), levyä inkuboitiin 37 °C:ssa 2 tunnin ajan monospesifisten jäniksen anti-hiiri Ig-isotyyppiä olevien vasta-aineiden kanssa, jotka oli sidottu peroksidaasiin (Zymed). Pesun jäl-: · : keen levyä inkuboitiin 1 mg/ml:ssa ortofenyleenidiamiinilla ja 0,03 %:lla I^C^illa 0,1 molaarisessa sitraattipuskurissa, pH 4,5. Optinen tiheys 630 nmrssä määritettiin Dynatec Elisa -levynlukijalla.

21 87578

Stafylokokkisen proteiini A:n sitoutumisanalyysi Mikrotiitterilevyn kuoppia inkuboitiin 5 %:lla FCS:llä PBS:ssä sekä 0,02 %:lla NaN^:lla ja supernatantit imettiin pois. Jokaiseen kuoppaan lisättiin 25 ui kasvainsolujen 7 suspensiota (2 x 10 solua/ml) ja inkuboitiin 25 yl:n kanssa nimenomaista vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Levyjä sentrifugoitiin 1200 rpm 7 min. ajan, pes.tiin kahdesti 50 %:lla NCS/PBS/NaN,:11a ja lisättiin 25 ui

125 J

I-stafylokokkista proteiini A:ta (n. 50 000 cpm/25 1).

Levyjä inkuboitiin 1 tunnin ajan 25 °C:ssa, pestiin kahdesti 5 %:lla NCS/PBS/NaN^:11a ja kuivattiin. Kuoppien pohjat leikattiin irti ja mitattiin gammalaskijalla.

Esimerkki

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen Monoklonaalisia vasta-aineita tuotettiin immunisoimalla 3 kk vanhoja BALB/c -hiiriä keuhkopussin nestepurkaumista saaduilla soluilla potilaista, joilla oli metastaattinen ei-pienisoluinen keuhkosyöpäkasvain. Immunisointi suoritettiin injektoimalla hiiret vatsakalvonsisäisesti 3-4 kertaa 7 noin 10 soluilla. Kolme päivää viimeisen immunisoinnin jälkeen pernat poistettiin, suspendoitiin kasvualustaan ja fuusioitiin NS1 hiiren myelomasolujen kanssa (Köhler ja Milstein, yllä). Seoksia siirrostettiinalhaisen tiheyden omaavien viljelmien aikaansaamiseksi, jotka olivat lähtöisin yksinkertaisista fuusioituneista soluista (klooneista); hybridisoinnissa käytettyä tekniikkaa on aikaisemmin kuvannut Yeh, et ai., Int. J. Cancer (1979) 29:269-275.

Hybridisolujen supernatantit seulottiin käyttäen sekä 125 ELISA-analyysiä että autoradiograafista epäsuoraa I-leimattua proteiini A-analyysiä (Brown et ai., J. Immunol. Meth. (1979) 3^:201-209). Immunisointiin käytettyjä kasvain-uutteita vastaan, jotka sisälsivät mm. solumembraaneja.

Nämä uutteet valmistettiin käyttäen menetelmää, jota ovat modifioineet Colcher et ai.. Cancel' Ros., (1981 ) 42 : 1451 -1459; Yeh et ai., yllä. Tätä tarkoitusta varten kudokset 22 87578 pestiin PBS:llä ja suspendoitiin, joka tehtiin vahingoittumattomille kasvaimille puristamalla ne läpi ruostumatonta terästä olevan sihdin Tämän jälkeen lisättiin 1 mM NaHCO^ra sisältäen 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA), ja sitten materiaali homogenisoitiin jäissä, 50 Dounce-homogenisaattorin B-survimen työnnöllä. Kun oli sentrifugoitu 15 min. 27 000 x g:ssä, supernatantti poistettiin ja pelletti suspendoitiin uudestaan PBS:ään, pidettiin 1 min. ajan ultraäänihauteessa ja varastoitiin -70 °C:een.

Vasta-aineita, jotka sitoutuivat solukalvon uutteisiin, tuottavat hybridomat kloonattiin, kasvatettiin in vitro, ja ne testattiin edelleen vasta-ainespesifisyytensä suhteen. Tämä testaus suoritettiin käyttäen immunohistologista menetelmää, joka on yllä kuvattu, jossa testattiin vasta-aineiden kyky sitoutua jäädytettyihin keuhkosyöpäkasvaimen kappaleisiin, muihin kasvaimiin ja normaaleihin ihmiskudoksiin.

Ne hybridomat, jotka tuottivat ilmeistä spesifisyyttä omaa-via vasta-aineita ihmisen keuhkosyöpää vastaan kloonattiin uudestaan, kasvatettiin ja ruiskutettiin koskemattomiin valikoituihin 3 kk vanhoihin BALB/c-hiiriin, joissa ne kas-voivat vesivatsakasvaimina.

Vesivatsaan erittyvät vasta-aineet puhdistettiin proteiini A -sefaroosilla (Ey et ai., Immunochemistry (1978) 15:429) tai geelisuodattamalla sefacryl S-300:lla. Puhdistettuja vasta-aineita käytettiin edelleen karakterisointiin, joka sisälsi uusia spesifisyyskokeita immunohistologian suhteen, sitoutumisanalyysejä vahingoittumattomille soluille sen määräämiseksi, mitkä vasta-aineet sitoutuvat solun pintaan, ja yllä kuvattuja radioimmunosakkautumistestejä.

MonokJonaalisia vasta-aineita 1.15 ja 1.17 tuotettiin vastaavista hybridomista, kuten yllä on kuvattu. Nämä vasta-aineet omasivat ne ominaisuudet, jotka on yllä tässä selityksessä kuvattu.

i 23 37578

Vasta-aineet L15 ja L17 altistettiin immunohistologiselle menetelmälle, joka on yllä kuvattu.

Vasta-aine L15 sitoutui vahvasti NSCLC-soluihin ja ei sitoutunut seuraaviin soluihin: paksun suolen syöpäkasvain, rintasyöpäkasvain, normaali sydän, leukosyytit, aivot, paksusuoli, munuaiset, perna, iho ja maksa.

Vasta-aine L17 sitoutui vahvasti NSCLC-soluihin, paksunsuolen syöpäkasvainsoluihin ja rintasyöpäkasvainsoluihin.

L17 osoitti heikkoa sitoutumista leukosyytteihin eikä lainkaan sitoutumista seuraaviin soluihin: normaali sydän, aivot, paksusuoli, munuaiset, perna, iho, maksa.

Solulinjat, joita merkitään L15 ja L17, talletettiin molemmat ATCC:hen 1. maaliskuuta 1985, ja niille annettiin talletusnumerot HB8738 ja HB8739, vastaavasti.

Keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti erityisesti viittaamalla yllä oleviin suoritusmuotoihin. On kuitenkin ymmärrettävä, että voidaan suorittaa poikkeamia ja modifikaatioita keksinnön hengen ja piirin sisällä.

Claims (5)

24 37578

1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen, jota merkitään L15, tai sen Fab-, F(ab')2- tai Fv-fragmentin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään hybridoomasoluIinjaa, joka on talletettu ATCC:hen talletusnumerolla HB8738 ja jonka monoklonaalisen vasta-aineen antigeenin sitoutumiskohta tunnistaa Ley:n, joka on ihmisen ei-piensolukeuhkosyövälle tunnusomainen pinnan hiilihydraattiantigeeni, joka voidaan kon-jugoida havaittavan signaalin tuottavaan leimaan.

2. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen, jota merkitään LI7, tai sen Fab-, F(ab')2- tai Fv-fragmentin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään hybridoomasolulinjaa, joka on talletettu ATCC:hen talletusnumerolla HB8739 ja jonka monoklonaalisen vasta-aineen antigeenin sitoutumiskohta tunnistaa Lex:n, joka on ihmisen ei-piensolukeuhkosyövälle tunnusomainen pinnan hiilihydraattiantigeeni, joka voidaan kon-jugoida havaittavan signaalin tuottavaan leimaan.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leima on fluoresoiva aine, radioleima, kromo-fori tai entsyymi.

4. Solulinja, joka on talletettu ATCCshen talletusnumerol-la HB8738 ja joka tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta L15.

5. Solulinja, joka on talletettu ATCCshen talletusnumerol-la HB8739 ja joka tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta L17.