FI98736C - Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ihmisen ei-pienisoluisia keuhkosyöpäkasvaimia varten - Google Patents
Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ihmisen ei-pienisoluisia keuhkosyöpäkasvaimia varten Download PDFInfo
- Publication number
- FI98736C FI98736C FI863375A FI863375A FI98736C FI 98736 C FI98736 C FI 98736C FI 863375 A FI863375 A FI 863375A FI 863375 A FI863375 A FI 863375A FI 98736 C FI98736 C FI 98736C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antibody
- cells
- monoclonal antibody
- antibodies
- human
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/828—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
98736
Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ihmisen ei-pienisoluisia keuhkosyöpäkasvaimia vastaan
Ihmisen keuhkosyövät aiheuttavat useimmiten miesten syöpäkuo-lemat ja ovat ohittamassa rintasyövän tavallisimpina syöpäkuo-leman aiheuttajina naisten keskuudessa (Cancer Facts and Figures, 1983) . Tämä tauti voidaan jakaa neljään histologiseen päätyyppiin, so. epidermoidiseen (30 %), rauhassyöpään (35 %), suurisoluiseen järjestäytymättömään (15 %) ja pienisoluiseen (20 %). Useimmat keuhkosyöpätapaukset eivät ole parannettavissa kemoterapialla ja säteilyhoidolla. Kemoterapia ja säteilyhoito saattavat vaikuttaa pienisoluisiin keuhkosyöpiin kokoa pienentäen, mutta ei kokonaan parantamalla. Täydellinen kirurginen kasvaimen poisto näyttää olevan ainoa tehokas hoitomenetelmä. Valitettavasti kuitenkin vähemmällä kuin 30 %:lla keuhkosyöpä-potilaista on kasvaimia, jotka voidaan täysin poistaa leikkaamalla ja näistä vähemmän kuin yksi kolmannes elää 5 vuotta ilmeisen täydellisen kirurgisen kasvaimen poiston jälkeen. Sen takia on suuri tarve saada aikaan menetelmiä, jotka tekisivät mahdolliseksi keuhkosyövän aikaisemman toteamisen, paremman syövän leviämisasteen määrittämisen ja tehokkaamman hoidon.
Näihin kaikkiin tarkoituksiin voidaan käyttää monoklonaalisia vasta-aineita. Edellytyksenä on kuitenkin löytää vasta-aineita antigeeneille, joita esiintyy paljon enemmän keuhkosyövässä kuin tavallisissa täysikasvuisissa kudoksissa. Koska tunnetaan kasvainsolupopulaatioiden heterogeenisuus, useiden determinanttien läsnäolo samassa antigeenimolekyylissä, ennakoidut erot antigeenien välillä suhteessa sopivuuteen diagnostisina markkereina verrattuna terapeuttisiin kohteisiin ja eri vasta-aineiden erilaiset biologiset ominaisuudet samaa antigeeniä kohtaan, saatetaan tarvita suuri määrä erilaisia vasta-aineita.
Ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita keuhkosyöpäantigeenejä ·: vastaan kuvataan julkaisussa Sikora et ai., Br. J. Cancer (1981) 42:696-700. Monoklonaalisia vasta-aineita, jotka 2 98736 osoittavat spesifisyyttä useita ihmisen keuhkosyöpätyyppejä kohtaan, on esitetty julkaisussa Cuttitta et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1981) 78:4591-4595. Ihmisen keuhkorauhassyö-pään liittyviä antigeenejä, jotka on määritetty monoklonaali-silla vasta-aineilla, on kuvattu julkaisussa Varki et ai., Cancer Research (1984) 44:681-687.
Hiiren monoklonaalisia vasta-aineita glykolipidia ganglio-N-triosyyliseramidi (alialo GM2) vastaan on kuvattu julkaisussa Young, et ai., J. Exp. Med. (1979) 150:1008. Asialo GM2:n ilmentymistä potilaiden, joilla on Hodgkinin tauti, soluissa on kuvattu julkaisussa Kniep, et ai., J. Immunol. (1983) 131:1591-1994 .
US-patenttihakemuksessa n:o 667 521 kuvataan tiettyjä monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen ei-pienisoluisia keuhkosyöpä-kasvaimia vastaan.
Ennalta määrätyn spesifisyyden omaavia vasta-aineita erittäviä fuusioitujen solujen jatkuvia viljelmiä on kuvannut Köhler et ai., Nature (1975) 265:495-497.
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää uusien monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi, jotka vasta-aineet tunnistavat determinanttikohdat glykolipidiantigeenissa, joka liittyy ihmisen ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) soluihin. Termi "NSCLC-solut" sisältää epidermoidiset syöpäsolut, rauhassyöpä-solut ja suurisoluiset järjestäytymättömät syöpäsolut. Deter-minanttikohta voi esiintyä myös joidenkin muiden syöpien antigeeneissä, esim. joidenkin rintasyöpien ja, täten, keksinnön mukaiset vasta-aineet sitoutuvat myös näihin muihin syöpäsolu!-hin. Esillä olevat monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat paljon vähemmässä määrin normaaleihin täysikasvuisiin soluihin kuin kasvainsoluihin. Termillä "sitoutuvat paljon vähemmässä määrin" tarkoitetaan, että sitoutuminen ei ole havaittavissa immunohistologisilla menetelmillä. Monoklonaalisia vasta-ainei-: ta erittävät hiiren hybridoomat. Keksinnön oleelliset tunnus merkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
li 3 98736
Esillä oleva keksintö sisältää myös menetelmiä pahanlaatuisen tilan läsnäolon määrittämiseksi ihmisen keuhkokudoksessa ja muissa ihmiskudoksissa. Menetelmässä tutkitaan, onko kudoksessa läsnä glykolipidiantigeenia, jolla on terminaalinen hiilihydraatti järjestys: GalNAcBl-*4Galfil-*3GalNAcSl-*4GalBl ja vastaavanlaisia antigeenejä, kuten ganglio-N-triosyyliseramidi, esim. asialo GM2. Esimerkiksi kudos voidaan saattaa yhteyteen vasta-aineen kanssa, joka tunnistaa determinanttikohdan glykolipi-diantigeeniin liittyvässä solussa, jolla antigeenillä on edellä mainittu terminaalinen hiilihydraattijärjestys tai funkionaali-sen ekvivalentin tai tällaisen vasta-aineen osasen kanssa.
Täten menetelmä kohdistuu tiettyihin diagnostisiin menetelmiin, joissa käytetään keksinnön mukaan saatuja monoklonaalisia vasta-aineita. Yksi tällainen menetelmä käsittää NSCLC-solujen läsnäolon määrittämisen näytteessä, jonka epäillään sisältävän tällaisia soluja. Näyte saatetaan kosketuksiin monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka pystyy erottamaan tällaiset solut muista solutyypeistä, joita voi olla läsnä näytteessä. Yhteensaattaminen suoritetaan olosuhteissa, joissa vasta-aine sitoutuu tällaisiin soluihin. Yhteensaattamisen jälkeen määritetään onko vasta-aine sitoutunut näytteen soluihin vai ei. Tämä sitoutuminen on verrannollinen NSCLC-solujen läsnäoloon tai poissaoloon näytteessä. Yleensä näyte saatetaan kosketuksiin yhdessä leimatun monoklonaaliselle vasta-aineelle spesifisen sitoutumia osapuolen kanssa. Tämä leima kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Toinen diagnostinen menetelmä käsittää kasvaimen paikallistamisen käyttämällä vasta-aineita tai vasta-aineiden osasia, jotka on sopivasti leimattu (esim. radioisotoopilla) ja on sen jälkeen ruiskutettu potilaisiin. Tällä menetelmällä saadaan aikaan parempia tapoja syöpäpotilaiden seuraamiseksi taudin laajuuden suhteen ja hoidolla aikaansaatujen muutosten havaitsemiseksi .
Keksinnöllä on myöskin terapeuttisia sovellutuksia. Vasta-aineet voivat reagoida edellä mainitun antigeenin kanssa, jota : ilmenee suurina pitoisuuksina kasvainsolun pinnalla. Sillä voi daan välittää vasta-aineesta riippuvaa sellulaarista sytotoksi- 4 98736 suutta (ADCC), nimittäin, sillä voidaan tappaa NSCLC-soluja (ja tiettyjä muita ihmisen syöpäkasvainsoluja) ihmisen lymfosyyttien tai makrofagien läsnä ollessa: sillä voidaan aktivoida ihmisen komplementteja esimerkiksi siten, että tapetaan NSCLC-soluja ihmisen seerumin läsnäollessa. Sitä voidaan myös käyttää erilaisten aineiden kantajana, joilla on kasvaimenvastainen vaikutus, sisältäen, mutta ei näihin rajoittuen, kemoterapeut-tiset lääkeaineet ja radioisotoopit.
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää uusien vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka sitoutuvat ihmisen NSCLC-solujen antigeeniin. Keksinnön mukaisesti monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa Köhlerin ja Millsteinin, supra, vakiomene-telmien mukaisesti. Immunogeenina käytetään esimerkiksi ihmisen keuhkosyöpäsoluja useista nestepurkaumista tai viljeltyjä soluja ihmisen ei-pienisoluisesta keuhkosyövästä tai soluja normaalista kuolleesta keuhkosta. Nämä solut ruiskutetaan hiireen ja riittävän ajan jälkeen hiiri tapetaan ja pernasolut otetaan talteen. Haluttuja immunoglobuliineja koodaavat pernasolun kromosomit tallennetaan fuusioimalla pernasolut myeloomasolujen kanssa tai imukudoskasvainsolujen kanssa, yleensä polyety-leeniglykolin läsnä ollessa. Saatujen solujen, jotka sisältävät fuusioituneet hybridoomat, annetaan kasvaa selektiivisellä alustalla, kuten HAT-alustalla, ja eloonjääneitä soluja kasvatetaan tällaisella alustalla käyttäen rajoittavia laimennusolo-suhteita. Soluja kasvatetaan sopivassa säiliössä, esim. mikro-tiitterikuopissa, ja supernatantista seulotaan monoklonaaliset vasta-aineet, joilla on haluttu spesifisyys.
On olemassa useita menetelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden saantojen parantamiseksi, kuten hybridoomasolujen ruiskuttaminen nisäkäsisännän, joka hyväksyy solut, vatsaonteloon ja keräämällä vesivatsaneste. Mikäli vesivatsanesteestä saadaan kerättyä riittämätön määrä monoklonaalista vasta-ainetta, vasta-aine kerätään isännän verestä. On olemassa useita tavanomaisia tapoja eristää ja puhdistaa monoklonaaliset vasta-aineet monoklonaalisten vasta-aineiden vapauttamiseksi muista proteiineis- li 5 98736 ta ja muista kontaminanteista (katso Kohler ja Milstein, supra) .
Erästä esillä olevan keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta merkitään L6. Se tunnistaa solun pinnalla olevan glyko-lipidiantigeenin, joka on identifioitu tyypilliseksi ihmisen NSCLC-soluille ja tietyille muille ihmisen syöpäkasvainsoluil-le. Useiden tunnettujen glykolipidien ristireaktioiden perusteella L6-vasta-aineiden kanssa ja asialo GalNAc-GM^n reaktiivisuuden perusteella L6-vasta-aineen kanssa on päätelty, että L6-glykolipidiantigeenilla on seuraava terminaalinen järjestys: GalNacSl-*4GalSl-*3GalNAcEl-*4GalSl-»R
jossa R on hiilihydraatti, joka toistaiseksi on tuntematon.
Edellä olevan antigeenin erityisen uusi piirre on se, että se on vapaa sialiinihappotähteistä ja tähän mennessä sen ei ole tiedetty liittyvän ihmiskudokseen. Sialosyylijohdannaisia, joilla on edellä mainittu terminaalinen järjestys, on kuvattu julkaisuissa Svennerholm et ai., (1973) J. Biol. Chem. 248:740-742 ja Iwamori et ai., (1978) J. Biochem. £4:1601. Edelleen edellä olevan järjestyksen omaavat sialiinihappojohdannaiset on myös tunnistettu veriryhmä-Sd-antigeeneiksi julkaisuissa Donald et ai., (1984) Biochem. Soc. Trans. 12:596-599 ja Blanchard et ai., (1983) J. Biol. Chem. 258:7691-7695. Tämän vuoksi yksi esillä olevan keksinnön kohde on glykolipidiantigeeni puhdistetussa muodossa, jolla on terminaalinen hiilihydraattijärjestys: GalNAcfil-*4GalSl-*3GalNacfil-*4Galfil-*.
L6-vasta-aine saostaa myöskin proteiiniantigeenin biosynteetti-sesti leimatuista NSCLC-soluista. Tämä antigeeni tunnistetaan vyöhykkeenä natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielek-troforeesissa (SDS - PAGE), jolla on molekyylipaino noin 20 000 daltonia. Tämä vasta-aine on isotyyppiä IgG2a. Se ei sitoudu havaittavasti normaaleihin soluihin, kuten fibroblasteihin, endoteelisoluihin tai epiteelisoluihin suurimmissa elimissä.
L6-vasta-ainetta tuotetaan hiiren L6-hybridoomalle.
Keksinnön piiriin kuuluvat myöskin hyödylliset edellä olevien monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumisfragmentit, kuten 6 98736
Fab-, F(ab')2-, Fv-fragmentti jne. Vasta-ainefragmentteja saadaan tavanomaisin menetelmin. Esimerkiksi hyödyllisiä sitoutu-misfragmentteja voidaan valmistaa vasta-aineiden peptidaasili-uotuksella käyttäen papaiinia tai pepsiiniä.
Vaikkakin edellä oleva spesifinen esimerkki keksinnön mukaisesti saadusta uudesta vasta-aineesta on suunnattu vasta-aineeseen, joka sitoutuu vastaavien antigeenien spesifisiin deter-minanttikohtiin ja kuuluu hiirilähteestä olevaan IgG2-alaluokkaan, tätä ei ole tarkoitettu keksintöä rajoittavaksi. Edellä oleva vasta-aine ja ne vasta-aineet, jotka ovat funktionaali-sesti samanlaisia edellä olevan vasta-aineen kanssa, ovat ne sitten hiirilähteestä, muusta nisäkäslähteestä ihminen mukaanluettuna tai muista lähteistä, tai näiden yhdistelmistä, kuuluvat tämän keksinnön piiriin, kuten myös muut isotyypit. Termillä "funktionaalinen samankaltaisuus" tarkoitetaan, että vasta-aine kykenee sitoutumaan edellä kuvattuun determinanttikohtaan ja kykenee kilpailemaan keksinnön mukaisen tietyn vasta-aineen kanssa tällaisesta kohdasta. Nimittäin tällainen vasta-aine yhdistettäessä näytteen kanssa, joka sisältää tällaisen determinant tikohdan omaavan solun tai solufragmentin, sitoutuu tällaiseen determinanttikohtaan ja estää keksinnön mukaisen vasta-aineen sitoutumisen tähän kohtaan. Edelleen, koska keksinnön mukaisella antigeenillä voi olla enemmän kuin yksi determinant-tikohta, keksintö sisältää monoklonaaliset vasta-aineet, jotka tunnistavat muutkin determinanttikohdat kuin ne determinantti-kohdat, jotka edellä mainittu monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa.
Keksintö sisältää myöskin L6-antigeenin diagnostisen ja terapeuttisen käytön ihmisissä ja samankaltaisten antigeenien, kuten asialo-GalNAc-GMj^:n ja asialo-GM2:n. Antigeeni voidaan puhdistaa tavanomaisin menetelmin kuten immunosaostuksella, kuten on kuvattu julkaisussa Young et ai., J. Exp. Med. (1979) 150: 1008-1019.
Eräs menetelmä käsittää keuhkokudoksessa ja muussa ihmiskudok-sessa olevan pahanlaatuisen tilan määrittämisen tutkimalla, li 7 98736 onko kudoksessa glykolipidiantigeeni, jolla on L6-antigeenin tai ganglio-N-triosyyliseramidin ominaisuudet. Termillä "pahanlaatuinen tila" tarkoitetaan kasvuhäiriöisten solujen läsnäoloa, sisältäen syöpäsolut in situ, neoplastiset, pahanlaatuiset tai kasvainsolut tai sen kaltaiset. Termillä "on samanlaiset ominaisuudet" tarkoitetaan, että antigeeni reagoi vasta -aineen kanssa, joka tunnistaa L6-antigeenin tai vastaavanlaisen antigeenin, kuten asialo-GalNAc-GM2:n tai asialo-GM2:n. Esimerkiksi näyte voidaan saattaa kosketuksiin tai yhdistää keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, kuten L6-vasta-aine tai vasta-aine, jolla on samanlaiset ominaisuudet kuin niillä, jotka on kuvattu julkaisussa Young et ai., supra, tai Kniep et ai., supra. Yhteensaattaminen suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, joissa vasta-aine sitoutuu pahanlaatuisiin soluihin. Yhteensaattamisen jälkeen havaitaan, onko vasta-ainetta sitoutunut pahanlaatuisiin soluihin näytteessä. Näytteestä etsitään siis vasta-aineen ja antigeenikohdan immuunikompleksia. Tämä immuunikompleksin muodostuminen on verrannollinen pahanlaatuisten solujen esiintymiseen näytteessä. Keksintö sisältää myöskin L6-vasta-aineen tai L6-antigeenin immuunikompleksit.
Erityinen esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän esimerkki, kuvaavana eikä rajoittavana, on menetelmä kasvainsolujen määrittämiseksi irtileikatusta kudoksesta. Menetelmää sovelletaan näytteelle, joka on palanen kasvaimen poiston jälkeen saatua kasvainta. Irtileikattua kasvainta käsitellään kappaleiden saamiseksi, joka käsittely ensin sisältää kasvaimen tai kudoksen jäädyttämisen, tavallisesti jäädyttämisen välittömästi irti leikkaamisen jälkeen. Sitten jäädytetty kudoskerros leikataan kappaleiksi käyttäen esim. kryostaattia.
Edellä kuvatulla tavalla saatu kasvainkappale saatetaan yhteyteen keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja sitten tätä monoklonaalista vasta-ainetta vastaan suunnataan toinen vasta-aine, joka on leimattu havaittavalla leimalla.
Irtileikattu näyte, esim. kasvaimen kappale, saatetaan yhteyteen ensimmäisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa olosuh 8 98736 teissä, joissa vasta-aine sitoutuu pahanlaatuisiin soluihin. Inkubointi suoritetaan yleensä vesipitoisessa väliaineessa kuten esim. fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisältää pieniä määriä natriumatsidia, sopivassa säiliössä kuten esim. lasisessa petri-maljassa, noin 15-30 min. ajan lämpötilassa noin 20-30°C. Käytetyn vasta-aineen määrä on yleensä riittävä havaittavan sitoutumisen aikaan saamiseksi, so. havaittavan määrän immuunikomplekseja aikaansaamiseksi vasta-aineen ja kyseessä olevan determinantin tai antigeenisen kohdan välillä.
Inkuboinnin jälkeen kappale pestään ei-spesifisesti sitoutuneen vasta-aineen vähentämiseksi tai poistamiseksi ja sitten se tutkitaan edellä mainittujen kompleksien havaitsemiseksi, jotka muodostuvat monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuessa näytteen soluihin, jotka omaavat antigeenisiä kohtia. Sitoutuminen on verrannollinen kappaleessa olevien pahanlaatuisten solujen läsnäoloon. Tämän mukaisesti sitoutuminen määritetään esimerkiksi saattamalla näyte yhteyteen leimatun monoklonaalisen vasta-aineelle spesifisen sitoutumisosapuolen kanssa. Leima kykenee , tuottamaan havaittavan signaalin ja voi olla radioaktiivinen leima, kromofori kuten fluoresoiva aine, entsyymi tai sen kaltainen.
Esimerkki tekniikasta, jossa käytetään edellä mainittua lähestymistapaa, on immunofluoresoiva värjäys. Tässä menetelmässä kasvaimen jäädytetyt kappaleet kiinnitetään lasilevylle asetonilla ja inkuboidaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, esim. petri-maljalla. Sen jälkeen, kun on pesty sopivalla puskurilla kuten esim. fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, kappale asetetaan petri-maljalle ja saatetaan kosketuksiin leimatulle monoklonaaliselle vasta-aineelle spesifisen sitoutumisosapuolen kanssa, joka voi olla esim. käytetylle monoklonaaliselle vasta-aineelle spesifinen leimattu vasta-aine. Koska useimmissa tapauksissa monoklonaalinen vasta-aine on saatu hiirilähteestä, voidaan käyttää leimattua anti-hiiri-immunoglobuliinia, joka on spesifinen monoklonaaliselle vasta-aineelle. Tällaisia immuno-globuliineja voidaan tuottaa tavanomaisin menetelmin ruiskuttamalla sopivaan isäntään hiiren vasta-ainetta, odottamalla sopi- 9 98736 va aika ja keräämällä anti-hiiri -immunoglobuliini injektoidun isännän verestä.
Kun levy on pesty toisen kerran esim. vesipitoisella puskurilla, kappaleet voidaan peittää fluoresoivalla vasta-aineen kiinnittävällä nesteellä ja päällyslevyllä ja tutkia sitten fluo-resenssimikroskoopilla monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumisen määrittämiseksi kappaleeseen. Sitoutumisen määrittäminen voi myös sisältää tällaisen sitoutumispaikan identifioimisen näytteessä.
Monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuminen näytteeseen voidaan myös määrittää käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta, joka on sidottu kovalenttisesti leimaan, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin, kuten radioaktiiviseen osaseen, kromofo-riin, sisältäen väri- ja fluoresoivat aineet, tai entsyymiin.
Vasta-ainetta kohden käytettävien leimojen määrä määräytyy yleensä sen diagnostisen menetelmän vaatimusten mukaan, jossa leimattua vasta-ainetta käytetään ja paikkojen mukaan, jotka ovat käytettävissä leiman yhdistämiseen vasta-aineeseen.
Aikaisemmasta tekniikasta tunnetaan menetelmiä leimojen konju-goimiseksi vasta-aineisiin ja vasta-aineen fragmentteihin. Tällaisia menetelmiä on esitetty US-patenteissa n:ot 4 220 450, 4 235 869, 3 935 074 ja 3 996 345.
Toinen esimerkki tekniikasta, jossa keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää, on immunoperoksidaasi-leimaus (Sternberger, Immunocytochemistry, John Wiley & Sons,
New York, 1979, s. 104-169, jota on modifioinut Garriques et ai., Int. J. Cancer (1982) 2^.:511-515). Testattava kudos kiinnitetään sopivalla liuottimena, kuten asetonilla, kantajalle, kuten lasilevylle. Seuraavaksi kudosta inkuboidaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja pestään sitten vapaaksi sitoutumattomasta vasta-aineesta. Sitten kudosta inkuboidaan jäniksen anti-hiiri-IgG:llä, pestään sitoutumattoman vasta-aineen poistamiseksi, yhdistetään hiiren peroksidaasi-antiperoksidaasi-kompleksin kanssa, pestään sitoutumattoman konjugaatin poista- 10 98736 miseksi, ja käsitellään sitten entsyymin substraatilla. Tämän käsittelyn jälkeen levyä tutkitaan signaalin havaitsemiseksi.
Keksinnön mukaisesti saatuja vasta-aineita voidaan käyttää menetelmässä pahanlaatuisen tilan olemassaolon määrittämiseksi, esimerkiksi tutkittaessa keuhkosta irtoavaa solunäytettä kuten ysköstä tai kohdunkaulan preparaattia. Termillä "irtoava" tarkoitetaan, että näyte käsittää erillisiä soluja tai solurykel-miä, joita saadaan raapimalla tai pesemällä kudoksen pintaa, jotka solut irtoavat erillisinä tai ryhminä tai kerroksina. Irtoava solunäyte tulee erottaa irtileikatusta kudoksesta, kuten biopsialla saadusta. Yhteensaattaminen näytteen ja vasta-aineen kanssa suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, että vasta-aine sitoutuu antigeenikohtaan. Yhteensaattamisen jälkeen määritetään, onko vasta-aine sitoutunut antigeeniseen kohtaan vai ei, ja tämä on verrannollinen pahanlaatuisen tilan olemassaoloon keuhkossa.
Keuhkossa olevan pahanlaatuisen kasvaimen olemassaolon määrittämiseksi saataisiin ysköksestä menetelmässä käytettävä irtoava solunäyte. Menetelmä voi olla käyttökelpoinen määritettäessä pahanlaatuista tilaa irtoavissa solunäytteissä hengitysteistä, ruuansulatuskanavan alueelta, käsittäen oraalisen nielun, suun jne.
Seuraavaksi irtoava solunäyte saatetaan kosketuksiin edellä mainittujen vasta-aineiden kanssa sellaisissa olosuhteissa, että vasta-aine sitoutuu spesifisiin antigeenisiin kohtiin näytteessä muodostaen antigeeni-vasta-aine-komplekseja. Tämä antigeeninen kohta voi olla läsnä näytteen soluissa tai solu-fragmenteissa. Yleensä näyte asetetaan sopivalle kantajalle, kuten esimerkiksi objektilevylle, yleensä lasiselle tai jotain sopivaa materiaalia olevalle. Irtoava solunäyte levitetään yleensä levylle ohuen kerroksen aikaansaamiseksi näytteestä levyn pinnalle. Näytteen ja vasta-aineen välinen kontakti suoritetaan yleensä vesipitoisessa puskuroidussa väliaineessa. Puskurit, joita voidaan käyttää, ovat fosfaatti, tris, bikar-bonaatti jne. pH-arvo riippuu näytteen luonteesta ja vasta-ai- li 11 98736 neesta ja on yleensä alueella noin 5-8. Vesipitoinen väliaine voi lisäksi sisältää orgaanisia polymeerisiä liuottimia määrissä noin 0-40 %. Orgaaniset polaariset liuottimet ovat vesiliukoisia ja yleensä niillä on noin 1-10 hiiliatomia ja noin 1-4 happiatomia. Vasta-ainetta on läsnä vesipitoisessa väliaineessa pitoisuutena noin 1-100 /xg/ml, edullisesti noin 10-20 ^g/ml. Lämpötila näytteen ja vasta-aineen kontaktin aikana on yleensä noin 4-40°C, edullisesti noin 10-30°C. Kontaktiaika on yleensä noin 15-120 min, edullisesti noin 30-60 min.
Näytteen ja vasta-aineen kosketusajan jälkeen kantajaa yleensä käsitellään reagoimattoman vasta-aineen poistamiseksi. Tavallisesti tämä suoritetaan pesemällä kantaja vesipitoisella, yleensä puskuroidulla väliaineella. Yleensä pesuliuoksen määrä tulisi olla riittävä poistamaan reagoimaton vasta-aine.
Seuraavaksi havaitaan vasta-aineen sitoutuminen näytteen antigeenisiin kohtiin, joka sitoutuminen on verrannollinen pahanlaatuisen tilan olemassaoloon kohteissa. Näyte siis tutkitaan sen määrittämiseksi, kuinka monta antigeeni-vasta-aine(immuuni) -kompleksia on muodostunut. On huomattava, että joissain tapauksissa hyvin pieniä määriä kyseessä olevia antigeenisiä kohtia esiintyy irtoavassa solunäytteessä. Kuitenkin pahanlaatuisissa tiloissa antigeenisiä kohtia on läsnä suurissa määrissä ja tämä viimeksi mainittu tila on helposti erotettavissa tällä menetelmällä ei-pahanlaatuisista tiloista, koska voidaan mitata suuri määrä antigeeni-vasta-aine-komplekseja pahanlaatuisen tilan esiintyessä. Sitoutumisen määrittämiseksi analyy-sisysteemiin on sisällytetty keinot havaittavan signaalin aikaansaamiseksi. Esimerkiksi käytettävä vasta-aine voidaan kon-jugoida analyysissä leimaan, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Leima voi olla radioaktiivinen osanen, kromofori käsittäen väri- ja fluoresoivat aineet, entsyymi tai senkaltainen. Vasta-aineeseen käytettävien leimojen määrä määritetään menetelmän vaatimusten mukaan ja niiden paikkojen mukaan, jotka ovat käytettävissä leiman sitomiseksi vasta-aineeseen.
12 98736
Vaihtoehtoisesti voidaan pesty levy saattaa yhteyteen leimatun spesifisen vasta-aineen sitoutumisosapuolen kanssa, joka voi olla esimerkiksi leimattu, käytetylle vasta-aineelle spesifinen vasta-aine. Kun monoklonaalinen vasta-aine on johdettu hiiri-lähteestä, voidaan käyttää leimattua anti-hiiri-immunoglobulii-nia, joka on spesifinen käytettyä vasta-ainetta kohtaan. Tällaisia immunoglobuliineja voidaan tuottaa tavanomaisten menetelmien mukaisesti injektoimalla sopivaan isäntään monoklonaa-lista vasta-ainetta, odottamalla sopiva aika ja keräämällä an-ti-hiiri-immunoglobuliinit injektoidun isännän verestä. Käytettäessä leimattua spesifistä vasta-aineen sitoutumisosapuolta levy täytyy pestä jälleen vesipitoisella väliaineella ennen kuin tutkitaan levyn fluoresenssi. Keksintö sisältää myöskin anti -idiotyyppiset vasta-aineet, jotka on valmistettu L6-vasta-ainetta vastaan; voidaan valmistaa sellaisia vasta-aineita, joilla on samantyyppisest ominaisuudet kuin vastaavilla kas-vainantigeeneilla (Nepom et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. 81:2864) .
Vasta-aineen ja solunäytteen välisen sitoutumisen läsnäolon määrittämiseksi, kun on käytetty fluoresoivaa leimaa, voidaan levystä tutkia fluoresenssi, yleensä käyttäen fluoresenssimik-roskooppia. Käytettäessä jotakin muuta leimaa kuin fluoresoivaa voidaan tutkia levyltä tai näytteestä sakan muodostuminen, väri tai jokin muu sellainen.
Edellä oleva kuvaus kohdistuu ensisijaisesti keksinnön mukaisten vasta-aineiden käyttöön immunofluoresenssimenetelmissä. Kuitenkin keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää useimmissa analyyseissä, jotka sisältävät antigeeni-vasta-aine-reaktioita. Analyysit voivat olla homogeenisia tai heterogeenisia. Homogeenisessa analyysissä näyte voi olla biologinen neste kuten seerumi, virtsa ja sen kaltaiset tai näyte voi olla hajotettu ja kirkastettu hajoamistuotteet poistamalla. Yleensä immunologinen reaktio käsittää spesifisen vasta-aineen, leimatun analyytin ja kiinnostuksen kohteena olevan näytteen. Leimasta lähtevä signaali on muodostettu, suorasti tai epäsuorasti, sitomalla vasta-aine leimattuun analyyttiin. Sekä immunolo 13 98736 ginen reaktio että sen määrän havaitseminen suoritetaan homogeenisessa liuoksessa. Immunokemikaalisia leimoja, joita voidaan käyttää, ovat vapaat radikaalit, fluoresoivat väriaineet, entsyymit, bakteriofagit, koentsyymit jne.
Heterogeenisessa analyysissä reagenssit ovat yleensä näyte, spesifinen vasta-aine ja välineet havaittavan signaalin tuottamiseksi. Näyte asetetaan yleensä kantajalle, kuten levylle tai objektilasille, ja saatetaan kosketuksiin vasta-aineen kanssa nestemäisessä faasissa. Sitten kantaja erotetaan nestemäisestä faasista ja joko kantajafaasi tai nestemäinen faasi tutkitaan signaalin havaitsemiseksi käyttäen välineitä, jotka saavat aikaan tällaisen signaalin. Signaali on verrannollinen näytteessä olevan analyytin läsnäoloon. Välineinä, joilla voidaan saada aikaan havaittava signaali, käytetään radioaktiivisia leimoja, fluoresoivia aineita, entsyymejä jne. Esimerkkejä heterogeenisistä immunoanalyyseistä ovat radioimmunoanalyysi, immunofluoresoiva menetelmä, entsyymisidottu immunoanalyysi ja sen kaltaiset.
Edellä mainittuja immunoanalyysimenetelmiä on kuvattu yksityiskohtaisemmin seuraavissa julkaisuissa: "Enzyme - Immunoassay", Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Katso myös esimerkiksi US-patentit n:ot 3 690 834, 3 791 932, 3 817 837, 3 850 578, 3 853 987, 3 867 517, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345 ja 4 098 876, jonka luettelon ei ole tarkoitus olla kaikenkattava.
Keksinnön mukaisesti saatuja vasta-aineita voidaan myös käyttää metastaattisten esiintymien kuvaamiseen ihmispotilailla, joilla on NSCLC, samalla tavalla, kuin on kuvattu pahanlaatuiselle melanoomalle julkaisussa J. Nucl. Med. (1983) 24.:123-129 ja julkaisussa J. Clin. Invest. (1983) 72:2101-2114. Vasta-aine tai sen fragmentit on radioleimattu ja annosteltu suonensisäisesti potilaalle, jota kuvataan jatkuvasti käyttäen esimerkiksi gamma-kameraa tai sen kaltaista. Tutkimukset, jotka on suoritettu siirtämällä vierasta ihmisen keuhkosyöpäsolukkoa kateenkorvat-tomaan, "paljaaseen" hiireen, ovat osoittaneet, että 131I-leima- 14 98736 tut Fab-fragmentit, jotka on valmistettu L6:sta, lokalisoituvat selektiivisesti siirrettyyn kasvaimeen. Tämä osoittaa melanoomille aikaisemmin suoritettujen tutkimusten perusteella (J.
Nucl. Med. (1983) 24:123-129; J. Clin. Invest. (1983) 72:2101-2114), että L6:n ja L6:sta valmistettujen vasta-ainefragment-tien kasvainselektiivinen lokalisoituminen todennäköisesti seuraa injektiota ihmispotilaisiin.
On esitetty myös diagnostinen määritysvälinesarja edellä kuvattujen menetelmien suorittamiseksi. Erässä suoritusmuodossa diagnostinen määritysvälinesarja käsittää (a) monoklonaalisen vasta-aineen, joka on tarkemmin kuvattu edellä ja (b) spesifisen sitoutumisosapuolen konjugaatin edellä mainitulle mono-klonaaliselle vasta-aineelle, ja leiman, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Reagenssit voivat myös sisältää lisäaineita, kuten puskuriaineita ja proteiineja stabiloivia aineita, esim. polysakkarideja ja sen kaltaisia. Diagnostinen määritysvälinesarja voi edelleen sisältää, mikäli tarpeen, muita signaalin tuottavan systeemin osasia, jossa systeemissä leiman leima on osana, aineita taustahäiriöiden vähentämiseksi kokeessa, kontrollireagensseja, laitteistoja testin suorittamiseksi ja sen kaltaisia. Toisessa suoritusmuodossa diagnostinen määritysvälinesarja käsittää keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen ja leiman konjugaatin, joka leima kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Edellä mainittuja lisäaineita voi myöskin olla läsnä.
Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää terapeuttisesti. Sopivat biologiset ominaisuudet omaavia vasta-aineita voidaan käyttää suoraan terapeuttisina aineina. Vasta-aineella L6 on tällainen ominaisuus, koska se kykenee, yhdistettynä ihmisen lymfosyytteihin tai makrofageihin, välittämään vasta-aineesta riippuvaa sellulaarista sytotoksisuutta (ADCC) in vitro. Nimittäin se kykenee aiheuttamaan ihmisen NSCLC-solujen hajoamisen, joka voidaan havaita esimerkiksi käyttämällä menetelmää, jossa syöpäsolut on leimattu 51Cr:llä ja niitä inkuboidaan lymfosyyttien ja vasta-aineen kanssa. Analogisia tutkimuksia on suoritettu anti-melanooma-vasta-aineilla ja on osoittautu-
II
l5 98736 nut, että korkean ADCCrn omaavat vasta-aineet Kykenevät inhiboimaan ihmisen melanooman kasvua paljaissa hiirissä. Koska L6-vasta-aine on isotyyppiä IgG2a se kykenee myöskin aktivoimaan makrofageja (Sears, et ai., Contrl. Oncol. Karger, Basel, (1984) 1_9:180-192) . Edelleen vasta-aineet voidaan sitoa toksiiniin immunotoksiinin muodostamiseksi tai radioaktiiviseen aineeseen tai lääkeaineeseen radiofarmaseuttisen tai farmaseuttisen aineen muodostamiseksi. Menetelmät vasta-aineiden immunotoksiinien ja radiofarmaseuttisten aineiden tuottamiseksi ovat hyvin tunnettuja (latso. esim. Cancer Treatment Reports (1984) 68^: 317-328). Edelleen L6-vasta-aine voi aktivoida ihmisen komplementteja esimerkiksi siten, että tapetaan NSCLC-soluja ihmisen seerumin läsnäollessa.
Sen tähden keksintö koskee menetelmää ei-pienisoluisten keuhko-syöpäkasvainsolujen populaation vähentämiseksi tai poistamiseksi isännässä, jossa menetelmässä isännälle annostellaan L6-vasta-ainetta tai sen johdannaista määrä, joka riittää aiheuttamaan ei-pienisoluisten keuhkosyöpäkasvainsolujen populaation vähenemisen tai poistamisen. L6-vasta-aineen johdannaisella tarkoitetaan, että L6-vasta-aine on sitoutunut aineeseen, joka avustaa tällaisen solupopulaation vähenemistä tai poistamista, esim. toksiiniin tai radioaktiiviseen aineeseen.
Toinen esillä olevan keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen terapeuttinen käyttö on potilaan immunisoiminen anti-idiotyyppisellä vasta-aineella, joka on tuotettu käyttäen yhtä esillä esillä olevaa monoklonaalista vasta-ainetta immunogee-nina. Tällainen immunisointi voi saada aikaan tehokkaan anti-kasvainaktiivisuuden (katso esim. Nepom et ai., Proc. Natl.
Acad. Sei. U.S.A. (1984) 81:2864-2867. Samalla tavoin potilas voidaan immunisoida L6-antigeenilla puhdistetussa muodossa, tai antigeenin modifioidulla muodolla.
Huomionarvoinen esillä olevan keksinnön näkökohta on, että esillä olevia vasta-aineita voidaan yhdistää muiden vasta-aineiden kanssa NSCLCitä vastaan, kuten niiden, joita on kuvattu US-patenttihakemuksessa 667 521. Yhdistelmä on tehokas havain- i6 98736 noitaessa ainakin yllä mainittuja keuhkosyöpäkasvaintyyppejä, nimittäin suurisoluista järjestäytymätöntä keuhkosyöpäkasvain-ta, rauhassyöpää ja epidermoidista syöpää.
Keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet tunnistavat myöskin antigeenien determinanttikohdat, jotka liittyvät muihin syöpälkasvaimiin, kuten rintasyöpäkasvaimiin. Tämän seurauksen esillä olevia vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisissa ja terapeuttisissa tuotteissa, jotka on suunnattu tällaisia syöpäkasvaimia vastaan.
Esimerkit
Keksintöä kuvataan edelleen seuraavilla valaisevilla esimerkeillä. Aluksi kuvataan muutamia käytettyjä menetelmiä.
Immunohistologinen menetelmä Jäädytettyjen kappaleiden immunohistologisia kokeiluja varten käytettiin Sternbergerin leimaamaton vasta-aine-menetelmää, joka on kuvattu julkaisussa Immunochemistrt, John Wiley & Sons, New York, 1979, s. 104-169, modifoituna Garrigues et ai. tapaan julkaisussa Int. J. Cancer (1982) 25):511-515. Kohdekudokset näitä kokeita varten saatiin kirurgisesti ja ne jäädytettiin 4 h sisällä poistamisesta isopentaaniin, joka oli esijäähdy-tetty nestemäisellä typellä. Sitten kudokset varastoitiin nestemäiseen typpeen tai -70°C:n käyttöön saakka. Jäniksen anti-hiiri-IgG:tä (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) käytettiin laimennoksena 1/50. Hiiren peroksi-daasi-antiperoksidaasikompleksia (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) sisältäen 2 mg/ml erityisesti puhdistettua PAP:tä, käytettiin laimennoksena 1/80. Jäädytetyt kappa-keet preparoitiin, kuivattiin, käsiteltiin astonilla ja kuivattiin (Garriques et ai., 1982). Histologiseen arviointiin käytettävät kappaleet värjättiin hematoksyliinillä. Epäspesifisen taustan vähentämiseksi kappaleita esi-inkuboitiin tavallisen ihmisseerumin kanssa laimennettuna 1/5 (Garroques et ai., 1982). Hiiren vasta-aineet, vuohen anti-hiiri-IgG, ja hiiren ·· PAP laimennettiin liuoksella, jossa oli 10 % tavallista ihmisen seerumia ja 3 % jäniksen seerumia.
17 98736 Värjäysmenetelmä käsitti sarjan kappaleita käsittelemisen joko spesifisellä tai kontrolli vasta-aineella 2,5 h, inku-boimisen 30 min jäniksen anti-hiiri-IgG:n kanssa laimennoksena 1/50, ja altistamalla 30 min ajan hiiren PAP-kompleksille laimennettuna 1/80. Jokaisen vasta-aineen käsittelyn jälkeen objektilevyt pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Immunohistokemiallista reaktiota kehitettiin juuri valmistetulla 0,05 %:sella 3,3'-diaminobentsidiinitetra-hydrokloridilla (Sigma, St. Louis, MO) ja 0,01 %:sella vetyperoksidilla 0,05 M tris-puskurissa, pH 7,6 8 min ajan. Lisä-altistaminen 1 %:selle OsO^-liuokselle tislatussa vedessä 20 min ajan syvensi värin. Kappaleet huuhdeltiin vedellä, de-hydrattiin alkoholilla, kirkastettiin ksyleenillä ja kiinnitettiin objektilevyihin.
Objektilevyt koodattiin jokainen ja koodatut näytteet tutkittiin käyttäen puolueettomia tutkijoita. Tyypilliset objektilevyt valokuvattiin käyttäen erotusinterferenssikontrastioptiik-kaa (Zeiss-Nomarski). Vasta-aineen värjäytymisaste arvioitiin 0:ksi (ei reaktiivisuutta), + (vähän positiivisia soluja), ++ (ainakin yksi kolmasosa soluista positiivisia), +++ (useimmat solut positiivisia), ++++ (lähes kaikki solut vahvasti positiivisia). Koska erot värjäytymisessä + ja 0 välillä olivat vähemmän selviä kuin ++- ja + -värjäytymisen välillä, päätettiin laskea positiiviseksi värjäysaste, joka oli ++ tai suurempi. Kasvainnäytteissä tarkasteltiin sekä neoplastisia että peruskudossoluja; havaittua värjäytymistä verrattiin kasvainsolujen värjäytymiseen, koska peruskudossolut eivät värjäytyneet lainkaan, tai värjäytyivät heikommin kuin kasvain-solut.
Antigeenien sijainnin määrittäminen
Antigeenien solunalainen sijainti määritettiin mittaamalla vasta-aineen sitoutuminen soluihin ennen tai jälkeen permea- bilisoinnin ei-ionisella detergentillä. Vasta-aineet, jotka sitoutuivat vahingoittumattomien viljeltyjen solujen pintaan, 125 tunnisteen joko suoralla sitoutumisanalyysillä käyttäen I-leimattua vasta-ainetta (Brown et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.
ia 98736 U.S.A. (1981) 78.:539-543) tai epäsuoralla fluoresenssilla käyttäen (FACS) II-solulajittelijaa. Vasta-aineet, -jotka si- 125 toutuivat solun sisäisiin paikkoihin, määritettiin I-leima-tun vasta-aineen suorana sitoutumisena soluihin, jonka jälkeen ne kiinnitettiin paraformaldehydillä ja edelleen permeabili-soitiin ei-ionisella detergentillä NP-40.
Sitoutumisanalyysit a) Sitoutumisanalyysejä varten, jotka suoritettiin käyttäen radioleimattuja vasta-aineita (Brown et ai., supra), inku- boitiin viljeltyjä soluja (10^) 4°C:ssa 30 min 106 cpm:n 125 kanssa I-leimattua vasta-ainetta 100 ^ulissa lämpöaktivoi- tua (30 min, 56°C:ssa) vasikan sikiön seerumia viljelyalustal- la. Sen jälkeen kun oli lisätty 5 ml PBS:ää, solut pelletoi- tiin sentrifugoimalla 10 min 250 x g. Supernatantti imettiin 125 pois ja pelletistä mitattiin I. Ei-spesifisen sitoutumisen mittaamiseksi suoritettiin samanaikaisia inkubointeja käyttäen 10 yUg leimaamatonta vasta-ainetta kilpailijana (Brown et ai., supra). Joissakin tapauksissa sitoutumisanalyysit suoritettiin analogisella tavalla käyttäen muovisiin viljelymaljoihin kiinnitettyä solukerrosta.
b) Sitoutumisanalyysejä varten, jotka suoritettiin FACS II-solula j ittelijalla , solut poistettiin substraatista käyttäen PBS:ää, joka sisäksi 5 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA). Näytteitä, jotka sisälsivät 1 x 10^ solua, inkuboi-tiin ensin monoklonaalisen vasta-aineen kanssa konsentraatios-sa 2 ^ug/ml ja sitten fluoreseiini-sidotun vuohen anti-hiiri-vasta-aineen kanssa laimennoksena 1:200. Sitten solut pestiin ja suspendoitiin uudestaan kasvualustaan. Välittömästi ennen FACS-analyysiä lisättiin propidiumjodidia lopulliseen pitoisuuteen 1 ^ug/ml kuolleiden solujen värjäämiseksi. FACS-analyysin aikana solut, jotka emittoivat punaista fluoresenssia, suljettiin pois elektronisesti siten, että ainoastaan elävät solut havaittiin. Sitten jokaiselle vasta-aineelle määritettiin fluoreseiinin fluoresenssin keskimääräinen intesi-teetti. Negatiiviset kontrollit käsittivät näytteitä, joista 19 98736 monoklonaalinen vasta-aine oli jätetty pois; positiiviset kontrollit käsittivät monoklonaalisia vasta-aineita antigeenejä vastaan, jotka olivat histakompatibilistä HLA-tyyppiä 1. Värjäys katsottiin positiiviseksi, mikäli keskimääräinen kanavan fluoreseiini oli vähintään 3 kertaa taustan suuruinen.
Proteiiniantigeenien määrittäminen
Proteiiniantigeenien tunnistamista varten keuhkosyöpäkasvain-solujen pinta radiojodattiin tai leimattiin metabolisesti *5S-metioniinilla. Antigeenit eristettiin solulysaateista inkuboimalla monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, lisäämällä vuohen anti-hiiri-IgG:tä ja adsorboimalla S. aureus'een. Immu-nosaostumat pestiin ja analysoitiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyligeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) (10-20 % akryyli-amidia) , kuten on kuvattu (Brown et ai., supra).
Vasta-aineiden reaktiivisuuden määrittäminen glykolipideja kohtaan_
Vasta-aineiden reaktiivisuus glykolipidiantigeenejä kohtaan testattiin inkuboimalla vasta-aineita puhdistettujen glykoli-pidien kanssa, jotka oli adsorboitu mikrotestilevyn kuoppiin (kolesterolin ja lesitiinin kanssa) sekä ohutkerroskromatograä fialevyjen kanssa, joille glykolipidit oli fraktioitu. Sitoutunut vasta-aine määritettiin inkuboimalla hiiren immunoglo-buliini antiseerumin ja radiojodatun proteiini A:n kanssa.
Isotyyppimääritys a) Ouchterlony-immunodiffuusio
Supernatantin alikvootti erityisiä hybridomasoluja laitettiin 2 %:sen agarlevyn keskikuoppaan. Monospesifisiä jäniksen anti-hiiri-Ig-isotyyppisiä vasta-aineita (Melody) asetettiin ulommaisiin kuoppiin ja maljaa inkuboitiin 2 h ajan huoneen lämpötilassa yli yön 4°C;ssa.
b) Taipuisia 96 kuoppaa sisältäviä polyvinyylikloridilevyjä (Costar) päällystettiin 0,1 mg/ml:lla vuohen anti-hiiri-Ig-vasta-aineella 2 h ajan 37°C:ssa ja päällystettiin vielä 20 9 8 7 3 6 3 %:sella BSA-liuoksella 2 h 37°C:ssa. Hybridoma-supernatant-tia inkuboitiin sitten 37°C:ssa 2 h ajan. Pesun jälkeen PES-naudan seerumialbumiinilla (BSA), levyjä inkuboitiin 37°C:ssa 2 h ajan monospesifisten jäniksen anti-hiiri-Ig-isotyyppia olevien vasta-aineiden kanssa, jotka oli sidottu peroksidaa-siin (Zymed). Pesun jälkeen levyä inkuboitiin 1 mg/ml:ssa orto-fenyleenidiamiinilla ja 0,03 %:sella H202:lla 0,1 M sitraatti-puskurissa, pH 4,5. Optinen tiheys 630 nnussä määritettiin Dynatec ELISA-levyn lukijalla.
Stefylokokkisen proteiini A:n sitoutumisanalyysi Mikrotiitterilevyn kuoppia inkuboitiin 5 %:sella MCSillä PBSissä sekä 0,02 %:sella NaN^illa ja supernatantit imettiin pois. Jokaiseen kuoppaan lisättiin 25 ,ul kasvainsolujen sus- 7 7 pensiota (2 x 10 solua/ml) ja inkuboitiin 25 ^,ul:n kanssa nimenomaista vasta-ainetta 1 h ajan huoneen lämpötilassa.
Levyjä sentrifugoiti in 1200 kierr/min 7 min ajan, pestiin kahdesti 50 %:sella NCS/PBS/NaN3:11a ja lisättiin 25 /ul 125I-staphylokokkista proteiini Aita (noin 50 000 cpm/25 ^ul). Levyjä inkuboitiin 1 h ajan 25°C:ssa, pestiin kahdesti 5 %:sella NCS/PBS/NaN^:11a ja kuivattiin. Kuoppien pohjat leikattiin irti ja mitattiin aammalaskijalla.
Esimerkki
Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen Monoklonaalisia vasta-aineita tuotettiin immunisoimalla 3 kuukautta vanhoja BALB/c-hiiriä yhdellä ihmiskudoksella neljästä eri lähteestä: (1) keuhkopussin nestepurkaumilla, jotka oli saatu potilaista, joilla on metastaattinen ei-pienisoluinen keuhkosyöpäkasvain, (2) viljellyissä soluilla ei-pienisolui- set keuhkosyöpäkasvaimesta ja (3) 3-4 kk vanhojen ihmissikiöi-den keuhkokudoksella. Immunisointi suoritettiin injektoimalla hiiret vatsakalvon sisäisesti 3-4 kertaa noin 10' soluilla.
Kolme päivää viimeisen immunisoinnin jälkeen pernat poistettiin, suspendoitiin kasvualustaan ja fuusioitiin NSl-hiiren myeloomasolujen kanssa (Köhler ja Milstein, supra). Seoksia siirrostettiin alhaisen tiheyden omaavien viljelmien aikaansaamiseksi, jotka olivat lähtöisin yksinkertaisista fuusioitu-
II
98736 21 neista soluista (klooneista): hybridisoinnissa käytettyä tekniikkaa on aikaisemmin kuvannut Yeh, et ai., Int. J. Cancer (1979) 29:269-275.
Hybridisolujen supernatantit seulottiin käyttäen sekä ELISA- 125 analyysiä että autoradiograafista epäsuoraa I-leimattua proteiini A-analyysiä (Brown et ai., J. Immunol. Meth. (1979) 31:201-209) immunisointiin käytettyjä kasvainuutteita vastaan, jotka sisälsivät mm. solumembraaneja. Nämä uutteet valmistettiin käyttäen menetelmää, jota ovat modifioineet Colcher et ai., Cancer Res., (1981) £2:1451-1459; Yeh et ai., supra. Tätä varten seokset pestiin PBS:llä ja suspendoitiin, joka tehtiin vahingoittumattomille kasvaimille puristamalla ne läpi ruostumatonta terästä olevan sihdin. Tämän jälkeen lisättiin 1 mM NaHC0^:a sisältäen 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluori-dia (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA), ja sitten materiaali homogenisoitiin jäissä 50 Dounce-homogenisaattorin B-survimen työnnöllä. 15 min sentrifugoinnin jälkeen 27 000 x g:ssä, supernatantti poistettiin ja pelletti suspendoitiin uudestaan PBS:ään, pidettiin 1 min ajan ultraäänihauteessa ja varastoitiin -70°C:een.
Hybridomat, jotka tuottivat solukalvon uutteisiin sitoutuvia vasta-aineita, kloonattiin, kasvatettiin in vitro, ja ne testattiin edelleen vasta-ainespesifisyytensä suhteen. Tämä testaus suoritettiin käyttäen immunohistologista menetelmää, joka on yllä kuvattu, jossa testattiin vasta-aineiden kykyä sitoutua jääädytettyihin keuhkosyöpäkasvaimen kappaleisiin, muihin kasvaimiin ja normaaleihin ihmiskudoksiin. Ne hybridomat, jotka tuottivat ilmeistä spesifisyyttä omaavia vasta-aineita ihmisen keuhkosyöpää vastaan kloonattiin uudestaan, kasvatettiin ja ruiskutettiin koskemattomiin valikoituihin 3 kk vanhoihin BALB/c-hiiriin, joissa ne kasvoivat vesivatsakasvaimina.
Vesivatsaan erittyvät vasta-aineet puhdistettiin proteiini A-Sepharosilla (Ey et ai., Immunochemistry (1978) £5:429) tai geelisuodattamalla Sephacryl S-300:lla. Puhdistettuja vasta- 22 9 8 7 3 6 aineita käytettiin edelleen karakterisointiin, joka sisälsi uusia spesifisyyskokeita immunohistologian suhteen, sitoutu-misanalyyseja vahingoittumattomille soluille sen määräämiseksi, mitkä vasta-aineet sitoutuvat solupintaan, ja yllä kuvattuja radioimmunosakkautumistestejä.
Monoklonaalista vasta-ainetta L6 tuotettiin vastaavasti hybri-domasta, kuten yllä on kuvattu. Tämä vasta-aine omasi ne ominaisuudet, jotka on yllä tässä selityksessä kuvattu. Solulinja, jota merkitään L6, talletettiin ATCCshen 6. joulukuuta 1984 ja sille annettiin talletusnumero HB 8677.
Esimerkki
Tiettyjen glykolipidien reaktiivisuus L6-vasta-aineen kanssa L6-vasta-aineen reaktiivisuuskokeet suoritettiin vakiomenetel-mien mukaisesti, kuten on kuvannut Kannagi et ai., (1983)
Cancer Research 43:4997-5005 ja Nudelman et ai., (1982) J.
Biol. Chem. 257:12752-12756. Määrätyt glykolipidit analysoitiin reaktiivisuutensa suhteen L6-vasta-aineen kanssa. TLC:llä erotetut glykolipidin immunovärjättiin vasta-aineella ja gly-kolipideille suoritettiin kiinteätaasi-radioimmunoanalyysi, jotka glykolipidit oli kiinnitetty muovisten kuoppien pintaan. Tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa I.
li 23 9 8 7 3 6
Taulukko I
Rakenne Reaktiivisuus L6;n kanssa
Asialo GalNAc-GM^
GalNAc l->4Gal81->3GalNAc 81->4Gal81-> 4Glc 8l->iCer + + +
Ristireaktiot
Gg^ (asialo GM^)
GalNAcβΐ->4Gal81-<4G1cB1->ICer ++
Gg^ (asialo GM-^)
Galβ1-> 3GaINAc 8l->4Gal81-> 4Glc β1->ICer + x2-glykolipidi
GalNac 8l->3Gal81-> 4GlcNac8l-> 3Galβl->4Glc81->ICer +
Jr
Gb^ (CTH; p -antigeeni)
Galal->4Gal81->4GlcSl->lCer
Globosidi (P-antigeeni)
GalNac81-> 3Galal->4Gal81->4Glc81->lCer
Paraglobosidi
Gal81->4GlcNac81->3Gal81->4Glc81->lCer 5 muuta glykolipidirakennetta L6-vasta-aineet reagoivat spesifisesti asialo GalNAc-Gf^Jn ja asialo GM2:n kanssa, vahvin reaktio havaittiin asialo GalNAc-GM^:n kanssa. Heikkoa reaktiivisuutta esiintyi gangliotetra-osyyliseramidin (asialo GM^) ja x2-glykolipidin kanssa (rakenne esitetty taulukossa I). Globosidi, globotriaosyyliserami-di, laktosyyliseramidi, paraglobosidi (laktoteraosyyliseramidi), glykolipidit Lex- ja Le^-rakenteiden kanssa, ja gangliosidit ganglio- ja lakto-sarjan rakenteiden kanssa olivat kaikki negatiivisia. Tästä ilmenee sen tähden, että L6-vasta-aine tunnistaa seuraavan järjestyksen:
GalNac81->4Gal81->3GalNAc81->4Gal81->R, jossa R on määrittelemätön hiilihydraatti.
24 9 8 7 3 6
Esimerkki
Vasta-aineesta riippuva sellulaarinen sytotoksisuus (ADCC) Tämä koe suoritettiin menetelmällä, jonka on aikaisemmin kuvannut Hellström et ai., PNAS 8_2 : 1499 , 1985, inkuboimalla 5^Cr-leimattujen kohdesolujen seoksia (2981 keuhkosyöpäkasvain), vasta-aineita (eri laimennoksia) ja lymfosyytteja (erilaisia suhteita lymfosyyttien ja kohdesolujen välillä) 4 h ja mittaamalla supernatanttiin vapautuneen ^Cr:n määrät. Koe ja tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 2.
Taulukko 2 L6-vasta-aine ( ug/ml) (% ADCC:n sytotoksisuus) 10 yug/ml, ryhmä 1 84 10 ^,ug/ml, ryhmä 2 76 10 ^,ug/ml, ryhmä 3 83 10 yug/ml, ryhmä 4 66 10 yug/ml, ryhmä 5 74 0 ^ug/ml 18 (ei ihmisen lymfosyyttejä, ryhmä 1) 0 Tämän vuoksi vasta-aine L6 välitti ADCC:tä testattaessa kohde-soluilla, jotka ilmensivät L6-antigeeniä.
Esimerkki
Vasta-ainevälitteinen sytotoksisuus ihmiskomplementin läsnäollessa_
Sen kokeilemiseksi, kykeneekö vasta-aine L6 tuhoamaan kasvain-soluja ihmiskomplementin läsnäollessa, "^Cr-leimattuja kohde-soluja (2981 keuhkosyöpä) inkuboitiin 4 h vasta-aineen ja ihmiskomplementin kanssa, jonka jälkeen suoritettiin toimenpiteet (Hellström et ai., PNAS 82; 1499, 1985). Koe ja tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 3.
25 98736
Taulukko 3 L6-vasta-aine _(,ug/ml) Sytotoksisuus 50 3 10 54 1 43 50 (ei komplementtia) 1 10 (ei komplementtia) 3 kohdesolut + väliaine 0
Vasta-aineet, jotka aktivoivat ihmiskomplementtia, ovat mielenkiintoisia ainakin kahdesta syystä: ne voivat suoraan tappaa kasvainsoluja ja ne voivat kyetä indusoimaan tulehdusvas-teen kasvaimen alueella aktivoitujen makrofagien ja muiden solujen kanssa, jotka ovat edullisemmin sytolyvttisia kuin neo-plastisia verrattuna normaaleihin soluihin.
Esimerkki
Spesifisyys testaamalla immunohistologialla eri kasvaimia vastaan_
Kudos Vasta-aine L6
Keuhkosyöpäkasvaine Adeno 18/19 suomuinen 8/10 pienisoluinen 2/6 suurisoluinen 2/2
Rintasyöpäkasvain 13/16
Paksusyöpäkasvain 9/9
Melanooma 1/4 "Muut kasvaimet" (sarkooma, jne.) 1/9
Keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti erityisesti viittaamalla yllä oleviin suoritusmuotoihin. On kuitenkin ymmärrettävä, että voidaan suorittaa poikkeamia ja modifikaatioita keksinnön hengen ja piirin sisällä.
Claims (10)
1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, tunnettu siitä, että (i) identifioidaan monoklonaalista vasta-ainetta tuottava solu (hybridooman talletusnumero ATCC HB8677), jonka vasta-aineen antigeenin sitoutumiskohta sitoutuu (a) hiilihydraattiantigeeniin, joka on ganglio-N-triosyyli-seramidin, jota merkitään asialo-GM2, kaltainen muttei identtinen sen kanssa, ja joka on ihmisen ei-piensolu-keuhkosyövän solun pintadeterminantti; ja (b) proteiiniantigeeniin, jonka molekyylipaino on noin 20 000 daltonia ja joka liittyy ihmisen ei-piensolu-keuhko-syöpään; (ii) viljellään solua olosuhteissa, joissa monoklonaalista vasta-ainetta syntyy; ja (iii) otetaan talteen monoklonaalinen vasta-aine vaiheen (ii) viljelmästä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine käsittää sen Fab-, F(ab')2~ tai Fv-fragmentin.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on konjugoitu leimaan, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leima on fluoresoiva aine, radioleima, kromofori tai entsyymi.
5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalisen vasta-aineen fragmentti on konjugoitu leimaan, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leima on fluoresoiva aine, radioleima, kromofori tai entsyymi. 98736 27
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on IgG-isotyyppiä.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on IgG2a-isotyyppiä.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalista vasta-ainetta merkitään L6.
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine tuotetaan hiiren hybri-doomasolulinjalla, joka on talletettu ATCCrhen ja jolla on HB8677:n identifiointiominaisuudet.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI923418A FI94291C (fi) | 1984-12-21 | 1992-07-29 | Monoklonaalinen vasta-aine |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US68475984 | 1984-12-21 | ||
| US06/684,759 US4935495A (en) | 1984-12-21 | 1984-12-21 | Monoclonal antibodies to the L6 glycolipid antigenic determinant found on human non-small cell lung carcinomas |
| US06/776,321 US4906562A (en) | 1984-12-21 | 1985-10-18 | Monocolonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas |
| US77632185 | 1985-10-18 | ||
| US8502441 | 1985-12-13 | ||
| PCT/US1985/002441 WO1986003838A1 (en) | 1984-12-21 | 1985-12-13 | Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI863375A0 FI863375A0 (fi) | 1986-08-20 |
| FI863375A FI863375A (fi) | 1986-08-20 |
| FI98736B FI98736B (fi) | 1997-04-30 |
| FI98736C true FI98736C (fi) | 1997-08-11 |
Family
ID=27103432
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI863375D FI88808C (fi) | 1984-12-21 | 1986-08-20 | Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ihmisen ei-pienisoluisia keuhkosyöpäkasvaimia varten |
| FI863375A FI98736C (fi) | 1984-12-21 | 1986-08-20 | Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ihmisen ei-pienisoluisia keuhkosyöpäkasvaimia varten |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI863375D FI88808C (fi) | 1984-12-21 | 1986-08-20 | Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ihmisen ei-pienisoluisia keuhkosyöpäkasvaimia varten |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4906562A (fi) |
| EP (1) | EP0207963B1 (fi) |
| JP (1) | JPH09191878A (fi) |
| KR (1) | KR910000956B1 (fi) |
| AT (1) | ATE77701T1 (fi) |
| AU (1) | AU601360B2 (fi) |
| CA (1) | CA1335796C (fi) |
| DE (1) | DE3586262T2 (fi) |
| DK (1) | DK168049B1 (fi) |
| ES (2) | ES8800602A1 (fi) |
| FI (2) | FI88808C (fi) |
| GB (1) | GB2180256B (fi) |
| GR (1) | GR853054B (fi) |
| HU (1) | HUT42637A (fi) |
| IE (1) | IE58572B1 (fi) |
| IL (1) | IL77291A (fi) |
| NO (1) | NO174718C (fi) |
| NZ (1) | NZ214542A (fi) |
| OA (1) | OA08412A (fi) |
| PH (1) | PH25742A (fi) |
| PT (1) | PT81744B (fi) |
| WO (1) | WO1986003838A1 (fi) |
| YU (1) | YU45294B (fi) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4675287A (en) * | 1984-07-26 | 1987-06-23 | Scripps Clinic And Research Foundation | Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2 |
| EP0173648A3 (en) * | 1984-08-30 | 1988-04-27 | Ciba-Geigy Ag | New monoclonal antibodies to glycoconjugates, processes for their production, and applications |
| IL76877A (en) * | 1984-11-02 | 1991-11-21 | Oncogen | Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies |
| US5614610A (en) * | 1984-12-21 | 1997-03-25 | Oncogen | Tumor immunotherapy using anti-idiotypic antibodies |
| AU601680B2 (en) * | 1985-05-28 | 1990-09-20 | Joseph P. Brown | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas |
| EP0234122A3 (en) * | 1986-02-21 | 1989-03-22 | Oncogen Limited Partnership | Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies |
| IL84285A (en) * | 1986-10-27 | 1993-03-15 | Int Genetic Engineering | Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen |
| NZ225599A (en) | 1987-08-04 | 1991-09-25 | Bristol Myers Co | Antibody-enzyme conjugates and combinations with prodrugs for the treatment of tumour cells |
| AU632469B2 (en) * | 1988-04-04 | 1993-01-07 | Johns Hopkins University, The | A method for early detection of lung cancer |
| US5173292A (en) * | 1988-06-14 | 1992-12-22 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies which specifically recognize galactosyl-globoside, compositions containing same and methods of using same |
| US5171665A (en) * | 1989-04-17 | 1992-12-15 | Oncogen | Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors |
| US5192551A (en) * | 1989-05-02 | 1993-03-09 | Johns Hopkins University | Neutral glycolipid as an adsorbent for enteric viral pathogens |
| CA2015862A1 (en) * | 1989-05-04 | 1990-11-04 | Gajanan Nilaver | Cell surface antigen that binds with l6 monoclonal antibody |
| CA2040513A1 (en) * | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Robert C. Bast, Jr. | Method of diagnosing cancer |
| US5165922A (en) * | 1990-05-22 | 1992-11-24 | Bristol-Myers Squibb Company | Synergistic tumor therapy with combinations of biologically active anti-tumor antibodies and chemotherapy |
| US5597707A (en) * | 1993-04-15 | 1997-01-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Tumor associated antigen recognized by the murine monoclonal antibody L6, its oligonucleotide sequence and methods for their use |
| US7745159B2 (en) * | 1999-02-26 | 2010-06-29 | Nathalie B Scholler | Methods and compositions for diagnosing carcinomas |
| US6117981A (en) * | 1999-06-03 | 2000-09-12 | Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. | Hybridomas for lung cancer marker and monoclonal antibodies thereof |
| EP1320551A4 (en) * | 2000-09-01 | 2006-12-20 | Internat Bioimmune Systems Inc | IDENTIFICATION AND DEVELOPMENT OF SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES OF SPINOCELLULAR EPITHELIOMA |
| US20030133939A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7754208B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7829084B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| US20040058445A1 (en) * | 2001-04-26 | 2004-03-25 | Ledbetter Jeffrey Alan | Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB |
| US20030219436A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-11-27 | Ledbetter Jeffrey A. | Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein |
| US7754209B2 (en) | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
| EP2298815B1 (en) * | 2005-07-25 | 2015-03-11 | Emergent Product Development Seattle, LLC | B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules |
| KR101571027B1 (ko) * | 2006-06-12 | 2015-11-23 | 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 | 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질 |
| WO2009126944A1 (en) * | 2008-04-11 | 2009-10-15 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof |
| CA2743487A1 (en) * | 2008-11-13 | 2010-05-20 | Emergent Product Development Seattle, Llc | Cd37 immunotherapeutic combination therapies and uses thereof |
| DK2768308T3 (en) | 2011-10-14 | 2018-07-23 | The Board Of Trustees Of The Univ Of Illionis | COMPOUNDS AND ANTI-TUMOR-NQO1 SUBSTRATES |
| US9353150B2 (en) | 2012-12-04 | 2016-05-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment |
| ES2853973T3 (es) * | 2013-04-09 | 2021-09-20 | The Board Of Trustees Of The Univ Of Illionis | Uso de DNQ o DNQ-87 en combinación con un inhibidor de PARP1 para el tratamiento del cáncer |
| SG10202002577XA (en) | 2015-09-21 | 2020-04-29 | Aptevo Res & Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
| WO2017197045A1 (en) | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Movassaghi Mohammad | Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs |
| WO2018209239A1 (en) | 2017-05-11 | 2018-11-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis |
| US10640508B2 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers |
| US11535634B2 (en) | 2019-06-05 | 2022-12-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof |
| US12030888B2 (en) | 2021-02-24 | 2024-07-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4507391A (en) * | 1982-04-02 | 1985-03-26 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method for detecting the presence of GD3 ganglioside |
| US4579827A (en) * | 1983-03-11 | 1986-04-01 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies |
| US4569788A (en) * | 1983-05-18 | 1986-02-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies against non small cell lung cancer |
| JPS6057254A (ja) * | 1983-09-09 | 1985-04-03 | Dainabotsuto Kk | 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 |
| US4675287A (en) * | 1984-07-26 | 1987-06-23 | Scripps Clinic And Research Foundation | Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2 |
| IL76877A (en) * | 1984-11-02 | 1991-11-21 | Oncogen | Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies |
| JPS61258173A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-15 | Akira Taniuchi | モノクロ−ナル抗体およびその製法ならびに用途 |
| AU601680B2 (en) * | 1985-05-28 | 1990-09-20 | Joseph P. Brown | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas |
-
1985
- 1985-10-18 US US06/776,321 patent/US4906562A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-10 CA CA000497251A patent/CA1335796C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-11 IL IL77291A patent/IL77291A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-12-13 DE DE8686900473T patent/DE3586262T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 WO PCT/US1985/002441 patent/WO1986003838A1/en active IP Right Grant
- 1985-12-13 HU HU86569A patent/HUT42637A/hu unknown
- 1985-12-13 EP EP86900473A patent/EP0207963B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 AU AU53124/86A patent/AU601360B2/en not_active Ceased
- 1985-12-13 AT AT86900473T patent/ATE77701T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-13 NZ NZ214542A patent/NZ214542A/en unknown
- 1985-12-13 GB GB8619900A patent/GB2180256B/en not_active Expired
- 1985-12-17 PH PH33200A patent/PH25742A/en unknown
- 1985-12-18 GR GR853054A patent/GR853054B/el unknown
- 1985-12-18 IE IE322085A patent/IE58572B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-12-19 YU YU1996/85A patent/YU45294B/xx unknown
- 1985-12-20 ES ES550251A patent/ES8800602A1/es not_active Expired
- 1985-12-20 PT PT81744A patent/PT81744B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-12-31 KR KR1019860700504A patent/KR910000956B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-07-29 NO NO863071A patent/NO174718C/no unknown
- 1986-08-19 DK DK393886A patent/DK168049B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-08-20 FI FI863375D patent/FI88808C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-08-20 FI FI863375A patent/FI98736C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-09-18 OA OA58956A patent/OA08412A/xx unknown
- 1986-10-16 ES ES557140A patent/ES8707797A1/es not_active Expired
-
1995
- 1995-10-27 JP JP7280811A patent/JPH09191878A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI98736C (fi) | Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ihmisen ei-pienisoluisia keuhkosyöpäkasvaimia varten | |
| JP2589682B2 (ja) | ヒト非▲下−▼小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体および抗原 | |
| US4737579A (en) | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carinomas | |
| US5185432A (en) | Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinoma and other certain human carcinomas | |
| FI87578C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av monoklonala antikroppar foer ej-smaocelliga lungkraeftsvulster hos maenniska | |
| AU617652B2 (en) | Monoclonal paratopic molecule directed to human ganglioside gd2 | |
| AU601680B2 (en) | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas | |
| FI94291C (fi) | Monoklonaalinen vasta-aine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: ONCOGEN |