NO174718B - Monoklonalt antistoff, anvendelse av dette samt diagnostisk forpakning omfattende antistoffet - Google Patents
Monoklonalt antistoff, anvendelse av dette samt diagnostisk forpakning omfattende antistoffet Download PDFInfo
- Publication number
- NO174718B NO174718B NO863071A NO863071A NO174718B NO 174718 B NO174718 B NO 174718B NO 863071 A NO863071 A NO 863071A NO 863071 A NO863071 A NO 863071A NO 174718 B NO174718 B NO 174718B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- antibody
- monoclonal antibody
- antigen
- cells
- binding
- Prior art date
Links
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 title claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 90
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 43
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims abstract description 22
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 43
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 14
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 8
- FOCMISOLVPZNSV-CANPYCKCSA-N N-[(E,2R,3S)-1-[5-[5-[3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3-hydroxyoctadec-4-en-2-yl]octadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H](COC1OC(CO)C(OC2OC(CO)C(OC3OC(CO)C(O)C(O)C3NC(C)=O)C(O)C2O)C(O)C1O)[C@@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC FOCMISOLVPZNSV-CANPYCKCSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 24
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 abstract description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 abstract description 7
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 abstract 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 25
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 14
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 101001035658 Mus musculus 28 kDa heat- and acid-stable phosphoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101000785917 Mus musculus Arf-GAP with SH3 domain, ANK repeat and PH domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000735426 Mus musculus Poly(A) RNA polymerase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 206010053614 Type III immune complex mediated reaction Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000009227 antibody-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WPIHMWBQRSAMDE-YCZTVTEBSA-N beta-D-galactosyl-(1->4)-beta-D-galactosyl-N-(pentacosanoyl)sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)[C@H](O)[C@H]1O)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC WPIHMWBQRSAMDE-YCZTVTEBSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 230000005773 cancer-related death Effects 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000018732 detection of tumor cell Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- -1 e.g. Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 150000002298 globosides Chemical class 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000016178 immune complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 201000003445 large cell neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000009546 lung large cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000013197 protein A assay Methods 0.000 description 1
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical class CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004085 sialosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010576 undifferentiated carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/828—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Nye monoklonale antistoffer som definerer et glykolipidantigen forbundet med humane ikke-småcelle lungekarsinoma ("NSCLC") -. og visse andre humane karsinoma. Antistoffene bindes til normale humane celler i mye mindre grad enn til tumorceller.Antistoffene finner anvendelse innen diagnostiske fremgangsmåter såsom deteksjonen av ondartede celler forbundet med NSCLC og ved terapeutiske fremgangsmåter. Beskrevet er videre et nytt glykolipidantigen. Oppfinnelsen innbefatter videre en fremgangsmåte for bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i lungevev og annet humant vev. Fremgangsmåten innbefatter undersøkelse av humant vev med henblikk på nærvær av et glykolipidantigen inneholdende den terminale karbohydrat-sekvensen:
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører et monoklonalt antistoff som bindes til et antigen på humane ikke-småcelle lunge-karsinoma for in vitro anvendelse, videre anvendelse av det monoklonale antistoffet for in vitro bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i en vevsprøve tatt fra et individ samt en diagnostisk forpakning innbefattende det monoklonale antistoffet.
Humane lungekarsinoma er ansvarlige for de fleste dødsfallene forårsaket av kreft blant menn og er i ferd med å overta for brystkarsinoma som den vanligste dødsårsaken i forbindelse med kreft blant kvinner ("Cancer Facts and Figures", 1983). Disse sykdomstilstandene kan inndeles i fire histologiske hovedtyper, dvs. epidermoid (30$), adenokarsinoma (35$), stor-celleudifferensiert (15$) og små-celle (20$). De fleste tilfeller av lungekarsinoma kan ikke helbredes ved kjemoterapi og strålingsterapi. Småcelle lungekarsinoma kan vise respons på kjemoterapi og strålingsterapi ved en reduksjon i størrelse, men ikke en fullstendig helbredelse. Fullstendig kirurgisk fjernelse av tumoren synes å være den eneste effektive behandlingen. Uheldigvis har imidlertid færre enn 30% av lungekreftpasientene tumorer som kan fjernes fullstendig ved reseksjon og av disse overlever mindre enn en tredjedel 5 år etter tilsynelatende fullstendig kirurgisk fjernelse av hele tumoren. Det foreligger følgelig et stort behov for fremgangsmåter som muliggjør en tidligere diagnose av lungekreft, en bedre definisjon av spredningsgraden for kreften, og en mer effektiv behandling.
Monoklonale antistoffer kan benyttes for alle disse fo-rmålene. En forutsetning er imidlertid at det finnes antistoffer til antigener som eksprimeres sterkere i lungekreftvev enn i normalt voksent vev. På bakgrunn av den kjente heterogeniteten for tumorcellepopulasjoner, nærværet av flere determinanter på det samme antigenmolekylet, de forventede forskjellene med antigener med hensyn på deres egnethet for diagnostiske markører sammenliknet med terapeutiske mål, og de forskjellige biologiske egenskapene for forskjellige antistoffer til det samme antigenet, kan et antall forskjellige antistoffer være påkrevet.
Humane monoklonale antistoffer for lungekreftantigener er beskrevet av Sikora et al., Br. J. Cancer (1981) 43:696-700. Monoklonale antistoffer som viser spesifisitet for flere typer human lungekreft er beskrevet av Cuttitta et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1981) 78:4591-4595. Antigener forbundet med humane lungeadenokarsinoma definert ved monoklonale antistoffer er beskrevet av Varki et al., Cancer Research
(1984) 44:681-687.
Muse monoklonale antistoffer til glykolipid-ganglio-N-triosylceramid (alialo GM2) er beskrevet av Young et al., J. Exp. Med. (1979) 150:1008. Ekspresjon av asialo GM2 på celler fra pasienter med Hodgkins sykdom er beskrevet av Kniep et al., J. Immunol. (1983) 131:1591-1594.
US patentpublikasjon nr. 667.521 beskriver visse monoklonale antistoffer for humane ikke-småcelle lungekarsinoma.
Kontinuerlige kulturer av sammensmeltede celler som utskiller antistoff av på forhånd definert spesifisitet er beskrevet av Kohler et al., Nature (1975) 265:495-497.
Foreliggende oppfinnelse vedrører nye monoklonale antistoffer som definerer et determinantsete på et glykolipidantigen forbundet med humane ikke-småcelle lungekarsinoma (NSCLC) celler. Betegnelsen "NSCLC-celler" innbefatter epidermoide karsinomaceller, adenokarsinomaceller, og storcelle, udifferensierte karsinomaceller. Determinantsetet kan også finnes på antigener fra noen andre karsinoma, f.eks. visse brystkarsinoma, og følgelig vil antistoffene ifølge oppfinnelsen også bindes til disse andre karsinomacellene. Foreliggende monoklonale antistoffer bindes i mye mindre grad til normale voksne celler enn til tumorceller. Betegnelsen "bindes i mye mindre grad" betyr at bindingen ikke vil være detekterbar ved immunohistologiske teknikker. De monoklonale antistoffene utskilles ved hjelp av murine hybridomas.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig et monoklonalt antistoff som bindes til et antigen på humane ikke-småcelle lunge-karsinoma for in vitro anvendelse, som er kjennetegnet ved at dets antigen-kombinerende sete binder til: (a) et karbohydrat antigen beslektet, men ikke identisk med ganglio-N-triosylceramid, betegnet asialo GM2» som er en celleoverflate determinant av humant ikke-småcelle lunge karsinom; og (b) et proteinantigen som har en molekylvekt på ca.
20.000 dalton og som er forbundet med humant ikke-små-celle lunge karsinom,
og nevnte monoklonale antistoff er L6-antistoff produsert av hybridom HB 8677, deponert ved ÅTCC, eller en funksjonell ekvivalent derav, er eventuelt konjugert til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal, eksempelvis et merke i form av en fluorescerende forbindelse og er produsert ved hjelp av L6-murint hybridom og de nyttige bindingsfragmentene av nevnte antistoff.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av det monoklonale antistoffet omtalt ovenfor for in vitro bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i en vevsprøve tatt fra et individ, hvor
(a) vevsprøven bringes i kontakt med et monoklonalt antistoff hvis antigen-kombinerende sete kompetitivt inhiberer den immunospesifikke bindingen av monoklonalt antistoff L6, produsert av hybridom HB8677
deponert ved ATCC, til dens målantigen; og
(b) deteksjon av om det monoklonale antistoffet immunospesifikt bindes til vevsprøven, hvor immunospesifikk binding av det monoklonale anti-
stoffet til vevsprøven indikerer nærværet av en ondartet tilstand i vevsprøven.
En slik anvendelse innbefatter bestemmelse av nærværet av NSCLC-celler i en prøve som mistenkes for å inneholde slike celler. Prøven bringes i kontakt med det monoklonale antistoffet som er i stand til å skille slike celler fra andre celletyper som kan være tilstede i prøven. Kontakten bevirkes under betingelser for binding av antistoffet til slike celler. Etter kontakt bestemmes nærværet eller fraværet av binding av antistoffet til cellene i prøven. Denne bindingen er forbundet med nærværet eller fraværet av NSCLC-celler i prøven. Generelt bringes prøven i kontakt med en merket spesifikk bindingspartner for det monklonale antistoffet. Dette merket er i stand til å produsere et detekterbart signal.
De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles i overensstemmelse med standardteknikkene ifølge Kohler og Milstein, supra. F.eks. benyttes humane lungekarsinomaceller fra pleuraleffusjoner eller kultiverte celler fra humane ikke-småcelle lungekarsinoma, eller celler fra en normal fetal lunge, som immunogen. Disse cellene injiseres i en mus og, etter tilstrekkelig tid, avlives musen og miltcellene fjernes. Miltcellekromosomene som koder for ønskede immunoglobuliner immortaliseres ved sammensmeltning av miltcellene med myelomceller eller med lymfomceller, generelt i nærvær av polyetylenglykol. De resulterende cellene, som innbefatter sammensmeltede hybridomer, får gro i et selektivt medium, såsom HÅT-mediet, og de overlevende cellene gros i et slikt medium ved anvendelse av begrensende fortynningsbetingelser. Cellene dyrkes i en egnet beholder, f.eks. mikrotiterbrønner, og supernatanten undersøkes med henblikk på monoklonale antistoffer som har den ønskede spesifisiteten.
Det finnes forskjellige teknikker for å øke utbyttene av monoklonale antistoffer, som f.eks. injeksjon av hybridoma-cellene inn i bukhulen på en pattedyrvert, som aksepterer cellene, og høsting av bukvaesken. Der hvor en utilstrekkelig mengde av det monoklonale antistoffet samler seg i bukvaesken, høstes antistoffet fra vertens blod. Forskjellige konvensjonelle fremgangsmåter finnes for isolering og rensing av de monoklonale antistoffene, som f.eks. rensing av de monoklonale antistoffene for andre proteiner og andre foru-rensninger (se Kohler og Milstein, supra).
Et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er betegnet L6. Det definerer et celleoverflateglykolipidantigen som er identifisert som karakteristisk for humane NSCLC-celler og celler fra visse andre humane karsinomer. På basis av kryssreaksjoner for flerkjente glykolipider med L6-antistoff og reaktiviteten for asialo GalNAc-GM^ med L6-antistoff konkluderes det med at L6-glykolipidantigenet har følgende terminalsekvens:
hvori R er et karbohydrat som fremdeles er udefinert. Et spesielt nytt trekk ved antigenet ovenfor er at det er fritt for sialinsyrerester og derfor ikke vites å knyttes til menneskelig vev. Sialosylderivater av terminalsekvensen ovenfor er beskrevet av Svennerholm et al., (1973), J. Biol. Chem., 248:740-742 og av Iwamori et al., (1978), J. Biochem., 84:1601. Videre er sialinsyrederivater av sekvensen ovenfor også gjenkjent som blodgruppe Sd-antigener av Donald et al.
(1984) Biochem. Soc. Trans., 12: 596-599 og av Blanchard et al. (1983), J. Biol. Chem. 258: 7691-7695.
L6-antistoffet utfeller også et proteinantigen fra bio-syntetisk merkede NSCLC-celler. Dette antigenet er karakterisert ved et bånd ved natriumdodecylsulfatpoly-akrylamidgel-elektroforeser (SDS - PAGE) med en molekylvekt på ca. 20.000 dalton. Dette antistoffet er av IgG2a-isotypen. Det bindes ikke detekterbart til normale celler, såsom fibro-blaster, endotelceller eller epitelceller i hovedorganene. L6-antistoffet produseres ved hjelp av L6-murine hybridomer.
Innbefattet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er også nyttige bindende fragmenter av det ovenfor nevnte monoklonale antistoffet, såsom Fab-, F(ab')2-, Fv-fragmenter osv. Åntistoff-fragmentene oppnås ved konvensjonelle teknikker. F.eks. kan nyttige bindende fragmenter fremstilles ved peptidase-nedbrytning av antistoffet ved å anvende papain eller pepsin.
Selv om det ovenfor angitte spesifikke eksemplet på det nye antistoffet ifølge oppfinnelsen er rettet mot et antistoff som binder til spesifikke determinantseter på de respektive antigenene og er av IgG2-underklassen fra en murin kilde, er dette ikke å oppfatte som en begrensning. Antistoffet ovenfor og de antistoffene som har funksjonell ekvivalens med antistoffet ovenfor, enten de stammer fra en murin kilde, annen pattedyrkilde innbefattet mennesker, eller andre kilder, eller kombinasjoner derav, er innbefattet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse, så vel som andre isotyper. Ved betegnelsen "funksjonell ekvivalens" menes at antistoffet er i stand til binding til det ovenfor omtalte determinantsete og i stand til å konkurrere med et spesielt antistoff ifølge oppfinnelsen om et slikt sete. Dvs. at et slikt antistoff, når det blandes med en prøve som inneholder en celle eller et cellefragment som har et slikt determinant-sete, vil bindes til et slikt determinantsete og blokkere et antistoff ifølge oppfinnelsen fra binding til et slikt sete. Siden videre antigenet kan ha mer enn et determinant-sete innbefatter oppfinnelsen monoklonale antistoffer som definerer andre determinantseter enn de som defineres av det tidligere nevnte monoklonale antistoffet.
Oppfinnelsen vedrører også in vitro diagnostisk avendelse av L6-antigenet og beslektede antigener såsom asialo GalNAc-GM^ og asialo GM2> Antigenet kan renses ved konvensjonelle fremgangsmåter såsom immunoutfelling som beskrevet av Young et al., J. Exp. Med., (1979), 150:1008-1019.
En anvendelse ifølge oppfinnelsen innbefatter bestemmelsen av nærværet av en ondartet tilstand i lungevev eller annet menneskelig vev ved undersøkelse av vevet med henblikk på nærvær av et glykolipidantigen som har egenskapene for L6-antigenet eller for et ganglio-N-triosylceramid. Betegnelsen "ondartet tilstand" refererer til nærværet av dysplastiske, innbefattende karsinoma in situ, neoplastiske, ondartede, eller tumorceller, eller liknende. Betegnelsen "har egenskapene for" betyr at antigenet er reaktivt med et antistoff som gjenkjenner L6-antigenet eller et beslektet antigen såsom asialo GalNAc-GM2 eller asialo-GM2« F.eks. kan prøven bringes i kontakt med eller blandes med et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen såsom L6-antistoff eller et antistoff som har liknende egenskaper som de som er beskrevet av Young et al., supra, eller Kniep et al., supra. Kontakttrinnet utføres under betingelser for binding av antistoffet til de ondartede cellene. Etter kontakt observeres nærværet av binding av antistoffet til de ondartede cellene i prøven. Dvs. prøven undersøkes med henblikk på immunkomplekser av antistoffet og det antigeniske setet. Denne immunkompleksdannelsen er forbundet med nærværet av ondartede celler i prøven.
Et spesielt eksempel, som er en illustrasjon på en anvendelse ifølge oppfinnelsen, er en anvendelse for deteksjon av tumorceller i utskåret vev. Anvendelsen ovenfor anvendes på en prøve som er en del av tumoren oppnådd etter fjernelse av tumoren. Tumoren som er utskåret behandles slik at man oppnår deler, denne behandlingen innbefatter innledningsvis nedfrysning av tumoren eller vevet, normalt nedfrysning straks etter utskjæring. Det frosne laget av vev skjæres deretter i deler ved f.eks. å anvende en kryostat.
Delen av tumoren oppnådd som beskrevet ovenfor, bringes i kontakt med et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen og deretter med et andre antistoff rettet mot det monoklonale antistoffet ovenfor, dette andre antistoffet er merket med et detekterbart merke.
Den utskårede prøven, f.eks. delen av tumoren, bringes i kontakt med det første monoklonale antistoffet under betingelser for binding av antistoffet til de ondartede cellene. Inkuberingen gjennomføres generelt i et vandig medium såsom f.eks. fosfatbufret saltvann inneholdende en liten mengde natriumazid, i en egnet beholder såsom f.eks. en petriskål av glass, i et tidsrom på 15-30 minutter ved en temperatur på 20-30°C. Mengden antistoff som anvendes er vanligvis tilstrekkelig til å tilveiebringe detekterbar binding, dvs. til å tilveiebringe et detekterbart antall immunkomplekser mellom antistoffet og den aktuelle determi-nanten eller det antigeniske setet.
Etter inkuberingen vaskes delen for å redusere eller eliminere ikke-spesifikt bundet antistoff og undersøkes deretter for å observere de ovenfor nevnte kompleksene som oppstår ved binding av det monoklonale antistoffet til cellene av prøven som har det antigeniske setet. Bindingen er forbundet med nærværet av ondartede celler i delen. Følgelig bestemmes binding, f.eks., ved å bringe prøven i kontakt med en merket spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoffet. Merket er i stand til å produsere et detekterbart signal og kan være et radioaktivt merke, en kromofor såsom en fluorescent forbindelse, et enzym eller liknende.
Et eksempel på en slik teknikk er immunofluorescensfarging. Ved denne teknikken fikseres frosne deler av tumoren på et preparatglass med aceton og inkuberes med det monoklonale antistoffet i, f.eks., en petriskål. Etter vasking med en egnet buffer såsom, f.eks., fosfat-bufret saltvann, plasseres delen på en petriskål og bringes i kontakt med den merkede spesifikke bindingspartneren for det monoklonale antistoffet, som f.eks. kan være et merket antistoff som er spesifikt for det monoklonale antistoffet som anvendes. Siden det monoklonale antistoffet hovedsakelig vil være avledet fra en murin kilde, kan et merket anti-mus immunoglobulin som er spesifikt for det monoklonale antistoffet anvendes. Slike immunoglobuliner kan dyrkes ifølge standardteknikker ved å injisere en egnet vert med murint antistoff, vente i en egnet tid, og høste anti-mus immunoglobulinene fra blodet hos verten som har fått injeksjonen.
Etter en andre vasking av preparatglasset med, f.eks., en vandig buffer, kan delene dekkes med en monteringsvæske av fluorescent antistoff og et dekkglass og deretter eksamineres ved hjelp av et fluorescensmikroskop for å bestemme bindingen av det monoklonale antistoffet til delen. Bestemmelsen av bindingen kan også innbefatte en identifikasjon av plasserin-gen av slik binding inne i prøven.
Bindingen av det monoklonale antistoffet til prøven kan også bestemmes ved å anvende et monoklonalt antistoff som er kovalent konjugert til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal, såsom en radioaktiv del, et kromofor innbefattende fargestoffer og fluorescerende stoffer, eller et enzym. Antallet merker som anvendes pr. antistoff bestemmes generelt av kravene til den diagnostiske fremgangsmåten hvori det merkede antistoffet anvendes og tilgjengeligheten av seter for binding av merket til antistoffet.
Fremgangsmåter for konjugering av merker til antistoffer og antistoff-fragmenter er velkjente innen teknikken. Slike fremgangsmåter kan finnes i US patent nr. 4.220.450; 4.235.869; 3.935.074; og 3.996.345.
Et annet eksempel på en teknikk hvori det monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen kan anvendes er immunoperok-sydase-merking (Sternberger, "Immunocytochemistry", John Wiley & Sons, New York, 1979, s. 104-169, modifisert av Garrigues et al., Int. J. Cancer (1982) 2^9:511-515). Vevet som skal undersøkes fikseres med et egnet oppløsningsmiddel, såsom aceton, på en bærer, f.eks. et preparatglass. Deretter inkuberes vevet med det monoklonale antistoffet og vaskes deretter fritt for ubundet antistoff. Deretter inkuberes vevet med kanin anti-mus IgG, vaskes for å fjerne ubundet antistoff, blandes med mus-peroksydase-anti-peroksydase-kompleks, vaskes for å fjerne ubundet konjugat, og behandles deretter med substrat for enzymet. Etter denne behandlingen undersøkes glasset med henblikk på et detekterbart signal.
Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand, f.eks. i avstøtte celleprøver fra lungen, såsom spytt eller i en cervikal utsmøring. Ved betegnelsen "avstøtt" menes at prøven innbefatter isolerte celler eller klumper av celler oppnådd ved skraping eller vasking av overflaten av vev, disse cellene fjernes individuelt eller i lag eller laminater. Den utstøtte celleprøven skal skilles fra det utskårne vevet som f.eks. oppnås ved biopsi. Kontakt mellom prøven og antistoffet utføres under betingelser for binding av antistoffet til det antigeniske setet. Etter kontakt bestemmes nærværet eller fraværet av binding av antistoffet til det antigeniske setet og er forbundet med nærværet av en ondartet tilstand i lungen.
For å bestemme nærværet av en ondartet tilstand i lungen vil en spyttprøve tilveiebringe den utstøtte celleprøven som benyttes. Fremgangsmåten kan finne anvendelse ved deteksjon av en ondartet tilstand i utstøtte celleprøver fra bronkiene, gastro-intestinaltrakten innbefattende svelget, munnen osv. Den utstøtte celleprøven bringes så i kontakt med det tidligere nevnte antistoffet under betingelser for binding av antistoffet til det spesifikke antigeniske setet i prøven slik at det dannes antigen-antistoffkomplekser. Dette antigeniske setet kan være tilstede på celler eller ce-llefragmenter i prøven. Generelt plasseres prøven på en egnet bærer, såsom f.eks., en preparatholder, vanligvis av glass, eller et annet egnet materiale. Den utstøtte celleprøven utsmøres generelt på preparatglasset slik at det tilveie-bringes et tynt lag av prøven på overflaten av glasset. Kontakten mellom antistoffet og prøven utføres generelt i et vandig bufret medium. Bufrene som kan anvendes innbefatter fosfat, tris, bikarbonat, osv. pH er forbundet med naturen av prøven og antistoffet og er generelt i området fra 5 til 8. Det vandige mediet kan i tillegg inneholde organiske polare oppløsningsmidler i en mengde på fra 0 til 40$. De organiske polare oppløsningsmidlene er vannoppløselige og har generelt fra 1-10 karbonatomer og fra 1-4 oksygenatomer. Antistoffet vil være tilstede i det vandige mediet ved en konsentrasjon på 1-100 jjg/ml, fortrinnsvis fra 10-20 jjg/ml. Temperaturen under kontakten av prøven med antistoffet er vanligvis fra 4-40°C, fortrinnsvis 10-30°C. Tidsrommet for kontakten er vanligvis fra 15-120 minutter, fortrinnsvis fra 30-60 minutter.
Etter kontakttiden mellom prøven og antistoffet behandles bæreren generelt for å fjerne uomsatt antistoff. Normalt oppnås dette ved å vaske bæreren med et vandig, vanligvis bufret medium. Generelt bør mengden vaskeoppløsning være tilstrekkelig til å fjerne det uomsatte antistoffet.
Deretter observeres nærværet av antistoffet bundet til det antigeniske setet i prøven, denne bindingen er forbundet med nærværet av en ondartet tilstand ved posisjonen. Dvs. prøven undersøkes for å bestemme antallet antigen-antistoff (immun)komplekser som er dannet. Det bør bemerkes at i noen tilfeller kan svært små antall av det aktuelle antigeniske setet finnes i den utstøtte celleprøven. Ved en ondartet tilstand vil imidlertid store antall av det antigeniske setet være tilstede, og denne sistnevnte tilstanden kan lett adskilles ved foreliggende oppfinnelse sammenliknet med en ikke-ondartet tilstand fordi et stort antall antigen-antistof f komplekser vil være målbare der hvor en ondartet tilstand foreligger. For å utføre bestemmelsen av nærværet av binding, er innretninger for produksjon av et detekterbart signal inkorporert i analysesystemet. For eksempel kan man konjugere antistoffet som anvendes i analysen til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal. Merket kan være en radioaktiv enhet, en kromofor innbefattende fargestoffer og fluorescerende stoffer, et enzym eller liknende. Antallet merker som anvendes for antistoffet bestemmes generelt av kravene ved fremgangsmåten og tilgjengeligheten av seter for binding av merket til antistoffet. Alternativt kan man bringe det vaskede preparatglasset i kontakt med en merket spesifikk bindingspartner for antistoffet, som f.eks., kan være et merket antistoff som er spesifikt for antistoffet som anvendes. Der hvor det monoklonale antistoffet er avledet fra en murin kilde, kan et merket anti-mus immunoglobulin som er spesifikt for antistoffet anvendes ved fremgangsmåten. Slike immunoglobuliner kan dyrkes ifølge standardteknikker ved å injisere en egnet vert med det monoklonale antistoffet, vente i en egnet tid, og høste anti-mus immunoglobulinene fra blodet til verten som er blitt injisert. Når en merket spesifikk bindingspartner for antistoffet anvendes, må preparatglasset vaskes igjen med et vandig medium før undersøkelse av glasset med hensyn på fluorescens.
For å bestemme nærværet av binding mellom antistoffet og celleprøven hvor et fluorescensmerke anvendes, kan man undersøke preparatglasset med henblikk på fluorescens, vanligvis ved å anvende et fluorescensmikroskop. Der hvor det anvendes et annet merke enn et fluorescerende stoff, kan man undersøke preparatglasset eller prøven med henblikk på dannelsen av en utfelling, en farge eller liknende.
Beskrivelsen ovenfor er hovedsakelig rettet mot anvendelsen av antistoffene ifølge oppfinnelsen ved immunoflu-orescensteknikker. Imidlertid kan antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes i de fleste analyser innbefattende antigen-antistoffreaksjoner. Analysene kan være homogene eller heterogene. Ved en homogen analysefremgangsmåte kan prøven være en biologisk væske såsom serum, urin eller liknende eller prøven kan være lysert og gjort klar for å fjerne nedbrytningsprodukter. Den immunologiske reaksjonen innbefatter vanligvis det spesifikke antistoffet, en merket analytt, og prøven av interesse. Signalet som oppstår fra merket modifiseres, direkte eller indirekte, ved binding av antistoffet til den merkede analytten. Både den immunologiske reaksjonen og deteksjonen av omfanget av denne utføres ved en homogen oppløsning. Immunokjemiske merker som kan anvendes innbefatter frie radikaler, fluorescens-
fargestoffer, enzymer, bakteriofager, koenzymer, osv.
Ved en heterogen analysefremgangsmåte er reagensene vanligvis prøven, det spesifikke antistoffet og innretninger for produksjon av et detekterbart signal. Prøven plasseres generelt på en bærer, såsom en plate eller en preparatholder, og bringes i kontakt med antistoffet i en flytende fase. Bæreren separeres deretter fra væskefasen og enten bærerfasen eller den flytende fasen undersøkes med henblikk på et detekterbart signal ved anvendelse av innretninger for produksjon av et slikt signal. Signalet er forbundet med nærværet av analytten i prøven. Innretninger for produksjon av detekterbare signaler innbefatter anvendelse av radio-aktive merker, fluorescerende forbindelser, enzymer, osv. Eksempler på heterogene immunoanalyser er radioimmunoana-lysen, immunofluorescensfremgangsmåtene, enzym-bundne immunoanalyser og liknende.
For en mer detaljert diskusjon av de ovenfor nevnte i-mmunoanalyseteknikkene, se "Enzyme-Immunoassay", av Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Se også, f.eks., US patentene nr. 3.690.834, 3.791.932, 3.817.837, 3,850.578, 3.853.987, 3.867.517, 3.901.654, 3.935.074. 3.984.533, 3.996.345 og 4.098.876, denne listen er ikke ment å være uttømmende.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en diagnostisk forpakning, som er kjennetegnet ved at den innbefatter (a) et monoklonalt antistoff i form av L6-antistoff, som er nyttig for bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i humant Vev, hvor antistoffet definerer et determinantsete på et celle-tilknyttet glykolipidantigen som er karakteristisk for humane ikke-småcelle lungekarsinomer eller en funksjonell ekvivalent eller et fragment derav, og (b) et konjugat av (1) et merke som er en del av et signalproduserende system og (2) en spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoffet.
Reagensene kan også innbefatte hjelpemidler såsom buffer-midler og proteinstabiliseringsmidler, f.eks. polysakkarider og liknende. Den diagnostiske forpakningen kan videre, der det er påkrevet, innbefatte andre elementer av det signalproduserende systemet hvorav merket er en del, midler for reduksjon av bakgrunnsinterferensen ved forsøk, kontroll-reagenser, apparatur for utførelse av et forsøk, og liknende.
Et fordelaktig trekk ved foreliggende oppfinnelse er at de foreliggende antistoffene kan blandes med andre antistoffer til NSCLC, som f. eks. de som er beskrevet i US patentpublikasjon nr. 667.521. Kombinasjonen er effektiv ved deteksjon av i det minste de typene lungekarsinoma som er omtalt ovenfor, nemlig storcelle-udifferensiert lungekarsinoma, adenokarsinoma og epidermoid karsinoma.
De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen definerer også determinantseter på antigener forbundet med andre karsinoma, såsom brystkarsinoma. Følgelig kan foreliggende antistoffer finne anvendelse ved diagnostiske og terapeutiske produkter rettet mot slike karsinoma.
EKSEMPLER
Oppfinnelsen belyses ytterligere ved følgende illustrerende eksempler. Et antall fremgangsmåter som anvendes vil først bli beskrevet.
Immunohistologisk teknikk
For immunohistologiske studier av frosne deler ble den umerkede antistoffteknikken ifølge Sternberger i "Immunochemistry", John wiley & Sons, New York, 1979, s. 104-169, slik denne er modifisert av Garrigues et al. i Int. J. Cancer
(1982) 29:511-515, benyttet. Målvevet for disse forsøkene ble oppnådd ved kirurgi og nedfrysning i løpet av 4 timer etter fjernelse i isopentan som på forhånd var avkjølt i flytende nitrogen. Vevene ble deretter lagret i flytende nitrogen eller ved -70°C inntil de ble anvendt. Kanin anti-mus IgG
(Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD)
ble benyttet ved en fortynning på 1/50. Mus peroksydase-antiperoksydasekompleks (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) inneholdende 2 mg/ml spesifikt renset PAP ble benyttet ved en fortynning på 1/80. Nedfrosne deler ble fremstilt, tørket, behandlet med aceton og tørket (Garrigues et al., 1982). Deler som skulle benyttes for histologisk bedømmelse ble farget med hematoxylin. For å nedsette den ikke-spesifikke bakgrunnen, ble deler forinku-bert med normalt humant serum fortynnet 1/5 (Garrigues et al., 1982). Mus-antistoffer, geit-anti-mus IgG, og mus-PAP ble fortynnet i en oppløsning av 10% normalt humant serum og 39é kaninserum.
Fargefremgangsmåten besto i behandling av serier av deler med enten spesifikt eller kontrollantistoff i 2,5 timer, inkubering i 30 minutter med kanin-anti-mus IgG fortynnet 1/50, og eksponering i 30 minutter mot mus-PAP-kompleks fortynnet 1/80. Etter hver behandling med antistoff, ble preparatholderne vasket to ganger i fosfatbufret saltvann (PBS). Den immunohistokjemiske reaksjonen ble utviklet med nyfremstilt 0,0556 3,3'-diaminobenzidintetrahydroklorid (Sigma, St. Loius, MO) og 0,01$ hydrogenperoksyd i 0,05 M tris-buffer, pE 7,6 i 8 minutter. Videre eksponering til en 19é 0s04-oppløsning i destillert vann i 20 minutter intensi-verte fargen. Delene ble renset med vann, dehydrert i alkohol, klargjort i xylen og montert på preparatglass.
Preparatglassene ble alle avlest under kode og kodede prøver ble undersøkt av en uavhengig forsker. Typiske preparatglass ble fotografert ved å anvende optiske innretninger med differensiell interferenskontakt (Zeiss-Nomarski). Graden av antistoff-farging ble vurdert som 0 (ingen reaktivitet), +
(få positive celler), ++ (minst en tredjedel av cellene positive), +++ (de fleste celler positive), ++++ (tilnærmet alle celler sterkt positive). Siden forskjellen mellom + og 0 farging var mindre klar enn mellom ++ og + farging, ble det besluttet å telle som "positiv" en farging gradert som ++ eller større. Både neoplastiske og stromaceller ble observert i tumorprøver; fargingen som ble registrert, refererte til den for tumorceller, idet stromacellene ikke var farget i det hele, eller var farget mye svakere enn tumorcellene.
Den subcellulære lokaliseringen av antigener ble bestemt ved å måle antistoff som bindes til celler før og etter permeabilisering med ikke-ionisk rensemiddel. Antistoffer som bindes til celleoverflaten av intakte kultiverte celler ble identifisert enten ved direkte bindingsanalyser med <125>j_ merket antistoff (Brown et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA
(1981), 78:539-543) eller ved indirekte fluorescens ved å anvende (FACS) II-cellersortereren. Antistoff som bindes til intracellulære posisjoner ble bestemt ved direkte binding av <12>^I-merket antistoff til celler etterfulgt av fiksering med paraformaldehyd og etterfølgende permeabilisering med det ikke-ioniske rensemidlet "NP-40".
Bindingsanalvser
a) For bindingsanalyser utført ved å anvende radiomerkede antistoffer (Brown et al., supra), ble kultiverte celler
(IO<6>) inkubert ved 4°C i 30 minutter med IO<6> cpm av <125>l-merket antistoff i 100 jil varmeaktivert (30 minutter ved 56°C) fetalt kalveserum i kulturmedium. Etter tilsats av 5 ml PBS ble cellene pelletisert ved sentrifugering i 10 minutter ved 250 x g. Supernatanten ble suget av, og pelleten ble telt med henblikk på ^<2>^I. For å måle ikke-spesifikk binding ble parallelle inkuberinger utført med 10 jjg umerket antistoff som en konkurrent (Brown et al.,
supra). I noen tilfeller ble bindingsanalyser utført på en analog måte på cellemonolag knyttet til kulturskåler av plast.
b) For bindingsanalyser utført på FACS II-cellesortereren, ble celler fjernet fra sine substrater ved å anvende PBS
inneholdende 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Prøver inneholdende 1 x IO<5> celler ble inkubert først med monoklonalt antistoff ved en konsentrasjon på 2 jjg/ml, etterfulgt av fluorescein-konjugert geit-anti-mus-antistoff ved en 1:200-fortynning. Celler ble deretter vasket og resuspendert i kulturmedium. Straks før FACS-analyse ble propidiumjodid tilsatt i en endelig konsentrasjon på 1 jjg/ml for å farge ikke-levedyktige celler. Under FACS-analyse ble celler som emitterte rød fluorescens elektronisk filtrert ut slik at bare levedyktige celler ble undersøkt. Den gjennomsnittlige intensiteten av fluorescein-
fluorescens ble deretter bestemt for hvert antistoff. Negative kontrollprøver besto av prøver hvori det monoklonale antistoffet var utelatt; positive kontroll-prøver besto av- monoklonale antistoffer til HLA-type 1 histokompatibilitetsantigener. Farging ble betraktet som
positiv dersom den midlere kanalfluorescein var minst tre ganger "bakgrunnen.
Proteinantigenbestemmelse
For å identifisere proteinantigener ble lungekarsinomaceller overflateradiojodert eller metabolisk merket med <35>g_ metionin. Antigener ble isolert fra cellelysater ved inkubering med monoklonalt antistoff, tilsats av geit-anti-mus IgG, og adsorpsjon til S. aureus. Immunutfellinger ble vasket og analysert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) (10-20$ akrylamid) som beskrevet (Brown et al., supra).
Bestemmelse av reaktivitet for antistoffer med glykolipider
Antistoffer ble undersøkt med henblikk på reaktivitet med glykolipidantigener ved inkubering med rensede glykolipider adsorbert på mikroforsøksbrønner (sammen med kolesterol og lecitin) og med tynnsjiktkromatografiplater hvorpå glykolipider var fraksjonert. Bundet antistoff ble detektert ved inkubering med antiserum til mus-immunoglobulin og radiojo-dert protein A.
Isotypebestemmelse
a) Duchterlony-immunodiffusjon
En porsjon av supernatant av spesielle hybridomaceller ble
plassert i senterbrønnen av 2$ agarplate. Monospesifikke kanin-anti-mus Ig-isotyper antistoff (Meloy) ble plassert i de ytre brønnene og platen ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur og over natten ved 4°C.
b) Bøyelige polyvinylklorid 96 brønnplater (Costar) ble belagt med 0,1 mg/ml geit-anti-mus Ig-antistoffer i 2
timer ved 37°C og motbelagt med en 3% BSA-oppløsning i 2 timer ved 37°C. Hybridoma-supernatanten ble deretter inkubert ved 37 °C i 2 timer. Etter vasking med PBS bovinserumalbumin (BSA), ble plater inkubert ved 37°C i 2 timer med monospesifikke kanin-anti-mus Ig-isotype-
antistoffer koplet til peroksydase (Zymed). Etter vasking ble plater inkubert med 1 mg/ml ortofenylendiamin og 0, 03% H202 i 0,1 M citratbuffer, pH 4,5. Optisk tetthet ved 630 nm ble bestemt på en "Dynatec" ELISA-plateavleser.
Stafvlokokkisk protein A bindingsanalyse
Mikrotiterbrønner ble inkubert med 5% NCS i PBS pluss 0,02$ NaN3 og supernatanten ble avsugd. 25 pl av en suspensjon av epidermceller (2 x IO<7> celler/ml) ble tilsatt til hver brønn og inkubert med 25 pl av et spesielt antistoff i en time ved romtemperatur. Platene ble sentrifugert ved 1200 opm i 7 minutter, vasket to ganger med 50$ NCS/PBS/NaN3 og 25 pl <125>I-stafylokokkisk protein A (ca. 50.000 cpm/25 1) ble tilsatt. Platene ble inkubert i en time ved 25"C, vasket to ganger med 5% NCS/PBS/NaN3 og tørket. Bunnen av brønnene ble avskåret og telt i en gammateller.
EKSEMPEL
Fremstilling av monoklonale antistoffer
Monoklonale antistoffer ble produsert ved å immunisere 3 måneder gamle BALB/c-mus med menneskevev fra en av fire forskjellige kilder: (1) pleuraleffusjoner fra pasienter med metastatiske ikke-småcelle lungekarsinoma, (2) kultiverte celler fra ikke-småcelle lungekarsinoma og (3) lungevev fra 3-4 måneder gamle menneskefostre. Immuniseringene ble utført ved å injisere musene intraperitonealt 3-4 ganger med ca. IO<7 >celler. Tre dager etter den siste immuniseringen ble miltene fjernet, suspendert i kulturmedium og sammensmeltet med NS1-musemyelomaceller (KShler og Milstein, supra). Blandingene ble podet slik at det ble dannet kulturer med lav tetthet med utgangspunkt i enkle sammensmeltede celler (kloner); teknikkene som benyttes for hybridiseringen er tidligere beskrevet av Yeh et al., Int. J. Cancer (1979) 29:269-275.
Supernatanter fra hybrideeller ble undersøkt ved å anvende både en ELISA-analyse og en autoradiografisk indirekte <125>l-merket protein A-analyse (Brown et al., J. Immunol. Meth.
(1979) 31:201-209) mot ekstrakter fra tumorene anvendt for immunisering som inneholdt, bl.a., cellemembraner. Disse ekstraktene ble fremstilt ved å anvende en fremgangsmåte modifisert fra Colcher et al., Cancer Res., (1981) 42:1451-1459, Yeh et al., supra. For dette formål ble vev vasket med PBS og suspendert, hvilket for intakte tumorer ble utført ved å presse disse gjennom en sikt av rustfritt stål. Etter dette ble 1 mM NaHCOs inneholdende 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA) tilsatt, og materialet ble deretter homogenisert på is, med 50 slag av B-pistillen av en "Dounce"-homogenisator. Etter sentrifugering i 15 minutter ved 27.000 x g, ble supernatanten fjernet, og pelleten ble igjen suspendert i PBS, ultralydbehandlet i 1 minutt, og lagret ved -70°C.
Hybridoma som produserte antistoffer som bindes til cel-lemembranekstraktene ble klonet, dyrket in vitro, og ytterligere undersøkt med hensyn på antistoffspesifisitet. Denne undersøkelsen ble utført ved å anvende den immunohistologiske teknikken beskrevet ovenfor, hvori antistoffenes evne til å bindes til nedfrosne deler av lungekarsinoma, andre tumorer og normalt humant vev ble undersøkt. De hybridoma som produserte antistoff av tilsynelatende spesifisitet for human lungekreft ble reklonet, dyrket og injisert i pristan-primerbehandlede 3 måneder gamle BALB/c-mus, hvor de vokste som ascites-tumorer.
Antistoffer utskilt i ascites ble renset på protein A "Sepharose" (Ey et al., Immunochemistry (18@978) 15:429) eller ved gelfiltrering i "Sephacryl S-300". Rensede antistoffer ble benyttet for ytterligere karakterisering som innbefattet ytterligere spesifisitetsforsøk ved hjelp av immunohistologi, bindingsanalyser på intakte celler for å bestemme hvilke antistoffer ble bundet til celleoverflaten, og radioimmunoutfellingsforsøkene beskrevet ovenfor. Monoklonalt antistoff L6 ble produsert fra det tilsvarende hybidoma som beskrevet ovenfor. Dette antistoffet viste egenskapene angitt ovenfor i foreliggende beskrivelse.
En cellelinje, betegnet L6 ble deponert ved ÅTCC 6. desember 1984, og fikk aksesjonsnummeret HB 8677.
EKSEMPEL
Reaktivitet av visse glvkolipider med L6- antistoff
Studier av reaktiviteten av L6-antistoffet ble utført ifølge standard fremgangsmåter som f.eks. beskrevet av Kannagi et al. (1983), Cancer Research, 43:4997-5005 Qg Nudelman et al.
(1982), J. Biol. Chem., 257:12752-12756. Definerte glykolipider ble analysert med hensyn på reaktivitet med L6-antistoffet. Glykolipider separert på TLC ble immunofarget ved antistoffet og radioimmunoanalyser i fast fase ble utført på glykolipider som var belagt på plastbrønner. Resultatene er sammenfattet i tabell 1. L6-antistoffet reagerte spesifikt med asialo GalNAc-GM2 og asialo GM2, med den sterkeste reaksjonen observert med asialo GalNAc-GM^. En svak reaktivitet ble funnet med gangliotetra-osylceramid (asialo GM^) og x2 glykolipid (struktur definert i tabell 1). Globosid, globotriaosylceramid, laktosylceramid, paraglobosid (laktotetraosylceramid), glykolipider med Lex-og Lev<->strukturer, og gangliosider med ganglio- og lakto-seriestrukturer var alle negative. Det synes derfor som om L6-antistoffet gjenkjenner følgende sekvens:
GalNAcPl -» 4Gal3l -» 3GalNAcPl Y 4Galpl -» R
hvori R er et udefinert karbohydrat.
EKSEMPEL
Antistoff- avhengig cellulærtoksisitet ( ADCC)
Dette forsøket ble utført ved en fremgangsmåte tidligere beskrevet av Hellstrøm et al., PNAS 82: 1499, 1985, ved å inkubere blandinger av <51>Cr-merkede målceller (2981 lunge-karsinoma), antistoffer (forskjellige fortynninger) og lymfocytter (forskjellige forhold mellom lymfocytter og målceller) i 4 timer og måling av mengden <51>Cr frigitt i supernatanten. Forsøket og resultatene er sammenfattet i tabell 2.
Derfor formidlet antistoff L6 ADCC når det ble undersøkt på målceller som eksprimerte L6-antigenet.
EKSEMPEL
Antistoff- formidlet cytotokslsitet i nærvær av humant komplement
For å undersøke om antistoff L6 kan ødelegge tumorceller i nærvær av humant komplement, ble <5*>Cr-merkede målceller (2981 lungekarsinoma) inkubert i 4 timer med antistoff og humant komplement, ved etablerte fremgangsmåter (Hellstrøm et al., PNAS 82: 1499, 1985). Forsøket og resultatene er sammenfattet i tabell 3.
Antistoffer som aktiverer humant komplement er av interesse av minst to grunner: de kan direkte avlive tumorceller og de kan være i stand til å indusere en inflammatorisk respons i tumorområdet med aktiverte makrofager og andre celler som fortrinnsvis er cytolytiske overfor neoplastiske tilstander sammenliknet med normale celler.
EKSEMPEL
Spesifisitetsundersøkelse med immunohistologi mot forskjellige tumorer
Oppfinnelsen er beskrevet i detalj med spesiell referanse til utførelsene ovenfor. Det skal imidlertid understrekes at variasjoner og modifikasjoner kan bevirkes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.
Claims (11)
1.
Monoklonalt antistoff som bindes til et antigen på humane ikke-småcelle lunge-karsinoma for in vitro anvendelse, karakterisert ved at dets antigen-kombinerende sete binder til: (a) et karbohydrat antigen beslektet, men ikke identisk med ganglio-N-triosylceramid, betegnet asialo GM2, som er en celleoverflate determinant av humant ikke-småcelle lunge karsinom; og (b) et proteinantigen som har en molekylvekt på ca. 20.000 dalton og som er forbundet med humant ikke-små-celle lunge karsinom,
og nevnte monoklonale antistoff er L6-antistoff produsert av hybridom HB 8677, deponert ved ATCC, eller en funksjonell ekvivalent derav, er eventuelt konjugert til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal, eksempelvis et merke i form av en fluorescerende forbindelse og er produsert ved hjelp av L6-murint hybridom og de nyttige bindingsfragmentene av nevnte antistoff.
2.
Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er av IgG2a-isotypen.
3.
Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det definerer et determinantsete på et celle-tilknyttet glykolipidantigen og et proteinantigen som er karakteristisk for humane ikke-småcelle lungekarsinomceller og funksjonelle ekvivalenter og fragmenter av slikt monoklonalt antistoff.
4.
Monoklonalt antistoff ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at det celle-tilknyttede glyko-
lipidantigenet har egenskapene for et ganglio-N-triosylceramid.
5 .
Anvendelse av det monoklonale antistoffet ifølge krav 1 for in vitro bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i en vevsprøve tatt fra et individ, hvor (a) vevsprøven bringes i kontakt med et monoklonalt antistoff hvis antigen-kombinerende sete kompetitivt inhiberer den immunospesifikke bindingen av monoklonalt antistoff Lb, produsert av hybridom HB8677 deponert ved ATCC, til dens målantigen; og (b) deteksjon av om det monoklonale antistoffet immunospesifikt bindes til vevsprøven, hvor immunospesifikk binding av det monoklonale antistoffet til vevsprøven indikerer nærværet av en ondartet tilstand i vevsprøven.
6.
Anvendelse ifølge krav 5, hvor bindingen av det monoklonale antistoffet til vevsprøven detekteres i trinn (b) ved at vevsprøven bringes i kontakt med et konjugat av et merke og en spesifikk bindende partner for det monoklonale antistoffet, hvor merket er istand til å produsere et detekterbart signal slik at deteksjon av signalet bundet til vevsprøven indikerer bindingen av det monoklonale antistoffet til vevsprøven.
7.
Anvendelse ifølge krav 6, hvor den bindende partneren omfatter et antistoff som er spesifikt for det monoklonale antistoffet.
8.
Anvendelse ifølge krav 6 eller 7, hvor merket omfatter et fluorescerende stoff, et radiomerke, en kromofor eller et enzym.
9.
Anvendelse Ifølge krav 5, hvor det monoklonale antistoffet er konjugert til et merke som er istand til å produsere et detekterbart signal slik at deteksjonen av signalet bundet til vevsprøven indikerer binding av det monoklonale antistoff konjugatet til vevsprøven.
10.
Diagnostisk forpakning, karakterisert ved at den innbefatter (a) et monoklonalt antistoff i form av L6-antistoff, som er nyttig for bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i humant vev, hvor antistoffet definerer et determinantsete på et celle-tilknyttet glykolipidantigen som er karakteristisk for humane ikke-småcelle lungekarsinomer eller en funksjonell ekvivalent eller et fragment derav, og (b) et konjugat av (1) et merke som er en del av et signalproduserende system og (2) en spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoffet.
11.
Diagnostisk forpakning ifølge krav 10, karakterisert ved at merket er et enzym, eller et fluorescerende stoff.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/684,759 US4935495A (en) | 1984-12-21 | 1984-12-21 | Monoclonal antibodies to the L6 glycolipid antigenic determinant found on human non-small cell lung carcinomas |
US06/776,321 US4906562A (en) | 1984-12-21 | 1985-10-18 | Monocolonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas |
PCT/US1985/002441 WO1986003838A1 (en) | 1984-12-21 | 1985-12-13 | Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO863071L NO863071L (no) | 1986-07-29 |
NO863071D0 NO863071D0 (no) | 1986-07-29 |
NO174718B true NO174718B (no) | 1994-03-14 |
NO174718C NO174718C (no) | 1994-06-22 |
Family
ID=27103432
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO863071A NO174718C (no) | 1984-12-21 | 1986-07-29 | Monoklonalt antistoff, anvendelse av dette samt diagnostisk forpakning omfattende antistoffet |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4906562A (no) |
EP (1) | EP0207963B1 (no) |
JP (1) | JPH09191878A (no) |
KR (1) | KR910000956B1 (no) |
AT (1) | ATE77701T1 (no) |
AU (1) | AU601360B2 (no) |
CA (1) | CA1335796C (no) |
DE (1) | DE3586262T2 (no) |
DK (1) | DK168049B1 (no) |
ES (2) | ES8800602A1 (no) |
FI (2) | FI88808C (no) |
GB (1) | GB2180256B (no) |
GR (1) | GR853054B (no) |
HU (1) | HUT42637A (no) |
IE (1) | IE58572B1 (no) |
IL (1) | IL77291A (no) |
NO (1) | NO174718C (no) |
NZ (1) | NZ214542A (no) |
OA (1) | OA08412A (no) |
PH (1) | PH25742A (no) |
PT (1) | PT81744B (no) |
WO (1) | WO1986003838A1 (no) |
YU (1) | YU45294B (no) |
Families Citing this family (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4675287A (en) * | 1984-07-26 | 1987-06-23 | Scripps Clinic And Research Foundation | Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2 |
EP0173648A3 (en) * | 1984-08-30 | 1988-04-27 | Ciba-Geigy Ag | New monoclonal antibodies to glycoconjugates, processes for their production, and applications |
IL76877A (en) * | 1984-11-02 | 1991-11-21 | Oncogen | Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies |
US5614610A (en) * | 1984-12-21 | 1997-03-25 | Oncogen | Tumor immunotherapy using anti-idiotypic antibodies |
AU601680B2 (en) * | 1985-05-28 | 1990-09-20 | Joseph P. Brown | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas |
EP0234122A3 (en) * | 1986-02-21 | 1989-03-22 | Oncogen Limited Partnership | Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies |
IL84285A (en) * | 1986-10-27 | 1993-03-15 | Int Genetic Engineering | Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen |
NZ225599A (en) | 1987-08-04 | 1991-09-25 | Bristol Myers Co | Antibody-enzyme conjugates and combinations with prodrugs for the treatment of tumour cells |
AU632469B2 (en) * | 1988-04-04 | 1993-01-07 | Johns Hopkins University, The | A method for early detection of lung cancer |
US5173292A (en) * | 1988-06-14 | 1992-12-22 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies which specifically recognize galactosyl-globoside, compositions containing same and methods of using same |
US5171665A (en) * | 1989-04-17 | 1992-12-15 | Oncogen | Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors |
US5192551A (en) * | 1989-05-02 | 1993-03-09 | Johns Hopkins University | Neutral glycolipid as an adsorbent for enteric viral pathogens |
CA2015862A1 (en) * | 1989-05-04 | 1990-11-04 | Gajanan Nilaver | Cell surface antigen that binds with l6 monoclonal antibody |
CA2040513A1 (en) * | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Robert C. Bast, Jr. | Method of diagnosing cancer |
US5165922A (en) * | 1990-05-22 | 1992-11-24 | Bristol-Myers Squibb Company | Synergistic tumor therapy with combinations of biologically active anti-tumor antibodies and chemotherapy |
US5597707A (en) * | 1993-04-15 | 1997-01-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Tumor associated antigen recognized by the murine monoclonal antibody L6, its oligonucleotide sequence and methods for their use |
US7745159B2 (en) * | 1999-02-26 | 2010-06-29 | Nathalie B Scholler | Methods and compositions for diagnosing carcinomas |
US6117981A (en) * | 1999-06-03 | 2000-09-12 | Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. | Hybridomas for lung cancer marker and monoclonal antibodies thereof |
EP1320551A4 (en) * | 2000-09-01 | 2006-12-20 | Internat Bioimmune Systems Inc | IDENTIFICATION AND DEVELOPMENT OF SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES OF SPINOCELLULAR EPITHELIOMA |
US20030133939A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
US7754208B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
US7829084B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
US20040058445A1 (en) * | 2001-04-26 | 2004-03-25 | Ledbetter Jeffrey Alan | Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB |
US20030219436A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-11-27 | Ledbetter Jeffrey A. | Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein |
US7754209B2 (en) | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
EP2298815B1 (en) * | 2005-07-25 | 2015-03-11 | Emergent Product Development Seattle, LLC | B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules |
KR101571027B1 (ko) * | 2006-06-12 | 2015-11-23 | 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 | 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질 |
WO2009126944A1 (en) * | 2008-04-11 | 2009-10-15 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof |
CA2743487A1 (en) * | 2008-11-13 | 2010-05-20 | Emergent Product Development Seattle, Llc | Cd37 immunotherapeutic combination therapies and uses thereof |
DK2768308T3 (en) | 2011-10-14 | 2018-07-23 | The Board Of Trustees Of The Univ Of Illionis | COMPOUNDS AND ANTI-TUMOR-NQO1 SUBSTRATES |
US9353150B2 (en) | 2012-12-04 | 2016-05-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment |
ES2853973T3 (es) * | 2013-04-09 | 2021-09-20 | The Board Of Trustees Of The Univ Of Illionis | Uso de DNQ o DNQ-87 en combinación con un inhibidor de PARP1 para el tratamiento del cáncer |
SG10202002577XA (en) | 2015-09-21 | 2020-04-29 | Aptevo Res & Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
WO2017197045A1 (en) | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Movassaghi Mohammad | Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs |
WO2018209239A1 (en) | 2017-05-11 | 2018-11-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis |
US10640508B2 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers |
US11535634B2 (en) | 2019-06-05 | 2022-12-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof |
US12030888B2 (en) | 2021-02-24 | 2024-07-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4507391A (en) * | 1982-04-02 | 1985-03-26 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method for detecting the presence of GD3 ganglioside |
US4579827A (en) * | 1983-03-11 | 1986-04-01 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies |
US4569788A (en) * | 1983-05-18 | 1986-02-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies against non small cell lung cancer |
JPS6057254A (ja) * | 1983-09-09 | 1985-04-03 | Dainabotsuto Kk | 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 |
US4675287A (en) * | 1984-07-26 | 1987-06-23 | Scripps Clinic And Research Foundation | Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2 |
IL76877A (en) * | 1984-11-02 | 1991-11-21 | Oncogen | Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies |
JPS61258173A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-15 | Akira Taniuchi | モノクロ−ナル抗体およびその製法ならびに用途 |
AU601680B2 (en) * | 1985-05-28 | 1990-09-20 | Joseph P. Brown | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas |
-
1985
- 1985-10-18 US US06/776,321 patent/US4906562A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-10 CA CA000497251A patent/CA1335796C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-11 IL IL77291A patent/IL77291A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-12-13 DE DE8686900473T patent/DE3586262T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 WO PCT/US1985/002441 patent/WO1986003838A1/en active IP Right Grant
- 1985-12-13 HU HU86569A patent/HUT42637A/hu unknown
- 1985-12-13 EP EP86900473A patent/EP0207963B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 AU AU53124/86A patent/AU601360B2/en not_active Ceased
- 1985-12-13 AT AT86900473T patent/ATE77701T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-13 NZ NZ214542A patent/NZ214542A/en unknown
- 1985-12-13 GB GB8619900A patent/GB2180256B/en not_active Expired
- 1985-12-17 PH PH33200A patent/PH25742A/en unknown
- 1985-12-18 GR GR853054A patent/GR853054B/el unknown
- 1985-12-18 IE IE322085A patent/IE58572B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-12-19 YU YU1996/85A patent/YU45294B/xx unknown
- 1985-12-20 ES ES550251A patent/ES8800602A1/es not_active Expired
- 1985-12-20 PT PT81744A patent/PT81744B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-12-31 KR KR1019860700504A patent/KR910000956B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-07-29 NO NO863071A patent/NO174718C/no unknown
- 1986-08-19 DK DK393886A patent/DK168049B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-08-20 FI FI863375D patent/FI88808C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-08-20 FI FI863375A patent/FI98736C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-09-18 OA OA58956A patent/OA08412A/xx unknown
- 1986-10-16 ES ES557140A patent/ES8707797A1/es not_active Expired
-
1995
- 1995-10-27 JP JP7280811A patent/JPH09191878A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO174718B (no) | Monoklonalt antistoff, anvendelse av dette samt diagnostisk forpakning omfattende antistoffet | |
US4935495A (en) | Monoclonal antibodies to the L6 glycolipid antigenic determinant found on human non-small cell lung carcinomas | |
Hellström et al. | Monoclonal mouse antibodies raised against human lung carcinoma | |
US4737579A (en) | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carinomas | |
US5185432A (en) | Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinoma and other certain human carcinomas | |
IE58590B1 (en) | Monoclonal antibodies and antigens for human non-small cell lung carcinomas | |
EP0203552B1 (en) | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas | |
CA1320689C (en) | Monoclonal antibody specific for human basal cell surface antigen | |
US4886745A (en) | Monoclonal antibody specific for human basal cell surface antigen | |
AU601680B2 (en) | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas | |
FI94291B (fi) | Monoklonaalinen vasta-aine | |
CA1337049C (en) | Anti-human pulmonary adenocarcinoma monoclonal antibody |