NO174718B - Monoklonalt antistoff, anvendelse av dette samt diagnostisk forpakning omfattende antistoffet - Google Patents

Monoklonalt antistoff, anvendelse av dette samt diagnostisk forpakning omfattende antistoffet Download PDF

Info

Publication number
NO174718B
NO174718B NO863071A NO863071A NO174718B NO 174718 B NO174718 B NO 174718B NO 863071 A NO863071 A NO 863071A NO 863071 A NO863071 A NO 863071A NO 174718 B NO174718 B NO 174718B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
monoclonal antibody
antigen
cells
binding
Prior art date
Application number
NO863071A
Other languages
English (en)
Other versions
NO863071L (no
NO174718C (no
NO863071D0 (no
Inventor
Ingegerd Hellstroem
Diane Horn
Joseph P Brown
Karl E Hellstroem
Peter Linsley
Original Assignee
Oncogen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/684,759 external-priority patent/US4935495A/en
Application filed by Oncogen filed Critical Oncogen
Publication of NO863071L publication Critical patent/NO863071L/no
Publication of NO863071D0 publication Critical patent/NO863071D0/no
Publication of NO174718B publication Critical patent/NO174718B/no
Publication of NO174718C publication Critical patent/NO174718C/no

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023Lung
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806Antigenic peptides or proteins
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828Cancer
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/866Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Nye monoklonale antistoffer som definerer et glykolipidantigen forbundet med humane ikke-småcelle lungekarsinoma ("NSCLC") -. og visse andre humane karsinoma. Antistoffene bindes til normale humane celler i mye mindre grad enn til tumorceller.Antistoffene finner anvendelse innen diagnostiske fremgangsmåter såsom deteksjonen av ondartede celler forbundet med NSCLC og ved terapeutiske fremgangsmåter. Beskrevet er videre et nytt glykolipidantigen. Oppfinnelsen innbefatter videre en fremgangsmåte for bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i lungevev og annet humant vev. Fremgangsmåten innbefatter undersøkelse av humant vev med henblikk på nærvær av et glykolipidantigen inneholdende den terminale karbohydrat-sekvensen:

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et monoklonalt antistoff som bindes til et antigen på humane ikke-småcelle lunge-karsinoma for in vitro anvendelse, videre anvendelse av det monoklonale antistoffet for in vitro bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i en vevsprøve tatt fra et individ samt en diagnostisk forpakning innbefattende det monoklonale antistoffet.
Humane lungekarsinoma er ansvarlige for de fleste dødsfallene forårsaket av kreft blant menn og er i ferd med å overta for brystkarsinoma som den vanligste dødsårsaken i forbindelse med kreft blant kvinner ("Cancer Facts and Figures", 1983). Disse sykdomstilstandene kan inndeles i fire histologiske hovedtyper, dvs. epidermoid (30$), adenokarsinoma (35$), stor-celleudifferensiert (15$) og små-celle (20$). De fleste tilfeller av lungekarsinoma kan ikke helbredes ved kjemoterapi og strålingsterapi. Småcelle lungekarsinoma kan vise respons på kjemoterapi og strålingsterapi ved en reduksjon i størrelse, men ikke en fullstendig helbredelse. Fullstendig kirurgisk fjernelse av tumoren synes å være den eneste effektive behandlingen. Uheldigvis har imidlertid færre enn 30% av lungekreftpasientene tumorer som kan fjernes fullstendig ved reseksjon og av disse overlever mindre enn en tredjedel 5 år etter tilsynelatende fullstendig kirurgisk fjernelse av hele tumoren. Det foreligger følgelig et stort behov for fremgangsmåter som muliggjør en tidligere diagnose av lungekreft, en bedre definisjon av spredningsgraden for kreften, og en mer effektiv behandling.
Monoklonale antistoffer kan benyttes for alle disse fo-rmålene. En forutsetning er imidlertid at det finnes antistoffer til antigener som eksprimeres sterkere i lungekreftvev enn i normalt voksent vev. På bakgrunn av den kjente heterogeniteten for tumorcellepopulasjoner, nærværet av flere determinanter på det samme antigenmolekylet, de forventede forskjellene med antigener med hensyn på deres egnethet for diagnostiske markører sammenliknet med terapeutiske mål, og de forskjellige biologiske egenskapene for forskjellige antistoffer til det samme antigenet, kan et antall forskjellige antistoffer være påkrevet.
Humane monoklonale antistoffer for lungekreftantigener er beskrevet av Sikora et al., Br. J. Cancer (1981) 43:696-700. Monoklonale antistoffer som viser spesifisitet for flere typer human lungekreft er beskrevet av Cuttitta et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1981) 78:4591-4595. Antigener forbundet med humane lungeadenokarsinoma definert ved monoklonale antistoffer er beskrevet av Varki et al., Cancer Research
(1984) 44:681-687.
Muse monoklonale antistoffer til glykolipid-ganglio-N-triosylceramid (alialo GM2) er beskrevet av Young et al., J. Exp. Med. (1979) 150:1008. Ekspresjon av asialo GM2 på celler fra pasienter med Hodgkins sykdom er beskrevet av Kniep et al., J. Immunol. (1983) 131:1591-1594.
US patentpublikasjon nr. 667.521 beskriver visse monoklonale antistoffer for humane ikke-småcelle lungekarsinoma.
Kontinuerlige kulturer av sammensmeltede celler som utskiller antistoff av på forhånd definert spesifisitet er beskrevet av Kohler et al., Nature (1975) 265:495-497.
Foreliggende oppfinnelse vedrører nye monoklonale antistoffer som definerer et determinantsete på et glykolipidantigen forbundet med humane ikke-småcelle lungekarsinoma (NSCLC) celler. Betegnelsen "NSCLC-celler" innbefatter epidermoide karsinomaceller, adenokarsinomaceller, og storcelle, udifferensierte karsinomaceller. Determinantsetet kan også finnes på antigener fra noen andre karsinoma, f.eks. visse brystkarsinoma, og følgelig vil antistoffene ifølge oppfinnelsen også bindes til disse andre karsinomacellene. Foreliggende monoklonale antistoffer bindes i mye mindre grad til normale voksne celler enn til tumorceller. Betegnelsen "bindes i mye mindre grad" betyr at bindingen ikke vil være detekterbar ved immunohistologiske teknikker. De monoklonale antistoffene utskilles ved hjelp av murine hybridomas.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig et monoklonalt antistoff som bindes til et antigen på humane ikke-småcelle lunge-karsinoma for in vitro anvendelse, som er kjennetegnet ved at dets antigen-kombinerende sete binder til: (a) et karbohydrat antigen beslektet, men ikke identisk med ganglio-N-triosylceramid, betegnet asialo GM2» som er en celleoverflate determinant av humant ikke-småcelle lunge karsinom; og (b) et proteinantigen som har en molekylvekt på ca.
20.000 dalton og som er forbundet med humant ikke-små-celle lunge karsinom,
og nevnte monoklonale antistoff er L6-antistoff produsert av hybridom HB 8677, deponert ved ÅTCC, eller en funksjonell ekvivalent derav, er eventuelt konjugert til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal, eksempelvis et merke i form av en fluorescerende forbindelse og er produsert ved hjelp av L6-murint hybridom og de nyttige bindingsfragmentene av nevnte antistoff.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av det monoklonale antistoffet omtalt ovenfor for in vitro bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i en vevsprøve tatt fra et individ, hvor
(a) vevsprøven bringes i kontakt med et monoklonalt antistoff hvis antigen-kombinerende sete kompetitivt inhiberer den immunospesifikke bindingen av monoklonalt antistoff L6, produsert av hybridom HB8677
deponert ved ATCC, til dens målantigen; og
(b) deteksjon av om det monoklonale antistoffet immunospesifikt bindes til vevsprøven, hvor immunospesifikk binding av det monoklonale anti-
stoffet til vevsprøven indikerer nærværet av en ondartet tilstand i vevsprøven.
En slik anvendelse innbefatter bestemmelse av nærværet av NSCLC-celler i en prøve som mistenkes for å inneholde slike celler. Prøven bringes i kontakt med det monoklonale antistoffet som er i stand til å skille slike celler fra andre celletyper som kan være tilstede i prøven. Kontakten bevirkes under betingelser for binding av antistoffet til slike celler. Etter kontakt bestemmes nærværet eller fraværet av binding av antistoffet til cellene i prøven. Denne bindingen er forbundet med nærværet eller fraværet av NSCLC-celler i prøven. Generelt bringes prøven i kontakt med en merket spesifikk bindingspartner for det monklonale antistoffet. Dette merket er i stand til å produsere et detekterbart signal.
De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles i overensstemmelse med standardteknikkene ifølge Kohler og Milstein, supra. F.eks. benyttes humane lungekarsinomaceller fra pleuraleffusjoner eller kultiverte celler fra humane ikke-småcelle lungekarsinoma, eller celler fra en normal fetal lunge, som immunogen. Disse cellene injiseres i en mus og, etter tilstrekkelig tid, avlives musen og miltcellene fjernes. Miltcellekromosomene som koder for ønskede immunoglobuliner immortaliseres ved sammensmeltning av miltcellene med myelomceller eller med lymfomceller, generelt i nærvær av polyetylenglykol. De resulterende cellene, som innbefatter sammensmeltede hybridomer, får gro i et selektivt medium, såsom HÅT-mediet, og de overlevende cellene gros i et slikt medium ved anvendelse av begrensende fortynningsbetingelser. Cellene dyrkes i en egnet beholder, f.eks. mikrotiterbrønner, og supernatanten undersøkes med henblikk på monoklonale antistoffer som har den ønskede spesifisiteten.
Det finnes forskjellige teknikker for å øke utbyttene av monoklonale antistoffer, som f.eks. injeksjon av hybridoma-cellene inn i bukhulen på en pattedyrvert, som aksepterer cellene, og høsting av bukvaesken. Der hvor en utilstrekkelig mengde av det monoklonale antistoffet samler seg i bukvaesken, høstes antistoffet fra vertens blod. Forskjellige konvensjonelle fremgangsmåter finnes for isolering og rensing av de monoklonale antistoffene, som f.eks. rensing av de monoklonale antistoffene for andre proteiner og andre foru-rensninger (se Kohler og Milstein, supra).
Et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er betegnet L6. Det definerer et celleoverflateglykolipidantigen som er identifisert som karakteristisk for humane NSCLC-celler og celler fra visse andre humane karsinomer. På basis av kryssreaksjoner for flerkjente glykolipider med L6-antistoff og reaktiviteten for asialo GalNAc-GM^ med L6-antistoff konkluderes det med at L6-glykolipidantigenet har følgende terminalsekvens:
hvori R er et karbohydrat som fremdeles er udefinert. Et spesielt nytt trekk ved antigenet ovenfor er at det er fritt for sialinsyrerester og derfor ikke vites å knyttes til menneskelig vev. Sialosylderivater av terminalsekvensen ovenfor er beskrevet av Svennerholm et al., (1973), J. Biol. Chem., 248:740-742 og av Iwamori et al., (1978), J. Biochem., 84:1601. Videre er sialinsyrederivater av sekvensen ovenfor også gjenkjent som blodgruppe Sd-antigener av Donald et al.
(1984) Biochem. Soc. Trans., 12: 596-599 og av Blanchard et al. (1983), J. Biol. Chem. 258: 7691-7695.
L6-antistoffet utfeller også et proteinantigen fra bio-syntetisk merkede NSCLC-celler. Dette antigenet er karakterisert ved et bånd ved natriumdodecylsulfatpoly-akrylamidgel-elektroforeser (SDS - PAGE) med en molekylvekt på ca. 20.000 dalton. Dette antistoffet er av IgG2a-isotypen. Det bindes ikke detekterbart til normale celler, såsom fibro-blaster, endotelceller eller epitelceller i hovedorganene. L6-antistoffet produseres ved hjelp av L6-murine hybridomer.
Innbefattet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er også nyttige bindende fragmenter av det ovenfor nevnte monoklonale antistoffet, såsom Fab-, F(ab')2-, Fv-fragmenter osv. Åntistoff-fragmentene oppnås ved konvensjonelle teknikker. F.eks. kan nyttige bindende fragmenter fremstilles ved peptidase-nedbrytning av antistoffet ved å anvende papain eller pepsin.
Selv om det ovenfor angitte spesifikke eksemplet på det nye antistoffet ifølge oppfinnelsen er rettet mot et antistoff som binder til spesifikke determinantseter på de respektive antigenene og er av IgG2-underklassen fra en murin kilde, er dette ikke å oppfatte som en begrensning. Antistoffet ovenfor og de antistoffene som har funksjonell ekvivalens med antistoffet ovenfor, enten de stammer fra en murin kilde, annen pattedyrkilde innbefattet mennesker, eller andre kilder, eller kombinasjoner derav, er innbefattet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse, så vel som andre isotyper. Ved betegnelsen "funksjonell ekvivalens" menes at antistoffet er i stand til binding til det ovenfor omtalte determinantsete og i stand til å konkurrere med et spesielt antistoff ifølge oppfinnelsen om et slikt sete. Dvs. at et slikt antistoff, når det blandes med en prøve som inneholder en celle eller et cellefragment som har et slikt determinant-sete, vil bindes til et slikt determinantsete og blokkere et antistoff ifølge oppfinnelsen fra binding til et slikt sete. Siden videre antigenet kan ha mer enn et determinant-sete innbefatter oppfinnelsen monoklonale antistoffer som definerer andre determinantseter enn de som defineres av det tidligere nevnte monoklonale antistoffet.
Oppfinnelsen vedrører også in vitro diagnostisk avendelse av L6-antigenet og beslektede antigener såsom asialo GalNAc-GM^ og asialo GM2> Antigenet kan renses ved konvensjonelle fremgangsmåter såsom immunoutfelling som beskrevet av Young et al., J. Exp. Med., (1979), 150:1008-1019.
En anvendelse ifølge oppfinnelsen innbefatter bestemmelsen av nærværet av en ondartet tilstand i lungevev eller annet menneskelig vev ved undersøkelse av vevet med henblikk på nærvær av et glykolipidantigen som har egenskapene for L6-antigenet eller for et ganglio-N-triosylceramid. Betegnelsen "ondartet tilstand" refererer til nærværet av dysplastiske, innbefattende karsinoma in situ, neoplastiske, ondartede, eller tumorceller, eller liknende. Betegnelsen "har egenskapene for" betyr at antigenet er reaktivt med et antistoff som gjenkjenner L6-antigenet eller et beslektet antigen såsom asialo GalNAc-GM2 eller asialo-GM2« F.eks. kan prøven bringes i kontakt med eller blandes med et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen såsom L6-antistoff eller et antistoff som har liknende egenskaper som de som er beskrevet av Young et al., supra, eller Kniep et al., supra. Kontakttrinnet utføres under betingelser for binding av antistoffet til de ondartede cellene. Etter kontakt observeres nærværet av binding av antistoffet til de ondartede cellene i prøven. Dvs. prøven undersøkes med henblikk på immunkomplekser av antistoffet og det antigeniske setet. Denne immunkompleksdannelsen er forbundet med nærværet av ondartede celler i prøven.
Et spesielt eksempel, som er en illustrasjon på en anvendelse ifølge oppfinnelsen, er en anvendelse for deteksjon av tumorceller i utskåret vev. Anvendelsen ovenfor anvendes på en prøve som er en del av tumoren oppnådd etter fjernelse av tumoren. Tumoren som er utskåret behandles slik at man oppnår deler, denne behandlingen innbefatter innledningsvis nedfrysning av tumoren eller vevet, normalt nedfrysning straks etter utskjæring. Det frosne laget av vev skjæres deretter i deler ved f.eks. å anvende en kryostat.
Delen av tumoren oppnådd som beskrevet ovenfor, bringes i kontakt med et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen og deretter med et andre antistoff rettet mot det monoklonale antistoffet ovenfor, dette andre antistoffet er merket med et detekterbart merke.
Den utskårede prøven, f.eks. delen av tumoren, bringes i kontakt med det første monoklonale antistoffet under betingelser for binding av antistoffet til de ondartede cellene. Inkuberingen gjennomføres generelt i et vandig medium såsom f.eks. fosfatbufret saltvann inneholdende en liten mengde natriumazid, i en egnet beholder såsom f.eks. en petriskål av glass, i et tidsrom på 15-30 minutter ved en temperatur på 20-30°C. Mengden antistoff som anvendes er vanligvis tilstrekkelig til å tilveiebringe detekterbar binding, dvs. til å tilveiebringe et detekterbart antall immunkomplekser mellom antistoffet og den aktuelle determi-nanten eller det antigeniske setet.
Etter inkuberingen vaskes delen for å redusere eller eliminere ikke-spesifikt bundet antistoff og undersøkes deretter for å observere de ovenfor nevnte kompleksene som oppstår ved binding av det monoklonale antistoffet til cellene av prøven som har det antigeniske setet. Bindingen er forbundet med nærværet av ondartede celler i delen. Følgelig bestemmes binding, f.eks., ved å bringe prøven i kontakt med en merket spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoffet. Merket er i stand til å produsere et detekterbart signal og kan være et radioaktivt merke, en kromofor såsom en fluorescent forbindelse, et enzym eller liknende.
Et eksempel på en slik teknikk er immunofluorescensfarging. Ved denne teknikken fikseres frosne deler av tumoren på et preparatglass med aceton og inkuberes med det monoklonale antistoffet i, f.eks., en petriskål. Etter vasking med en egnet buffer såsom, f.eks., fosfat-bufret saltvann, plasseres delen på en petriskål og bringes i kontakt med den merkede spesifikke bindingspartneren for det monoklonale antistoffet, som f.eks. kan være et merket antistoff som er spesifikt for det monoklonale antistoffet som anvendes. Siden det monoklonale antistoffet hovedsakelig vil være avledet fra en murin kilde, kan et merket anti-mus immunoglobulin som er spesifikt for det monoklonale antistoffet anvendes. Slike immunoglobuliner kan dyrkes ifølge standardteknikker ved å injisere en egnet vert med murint antistoff, vente i en egnet tid, og høste anti-mus immunoglobulinene fra blodet hos verten som har fått injeksjonen.
Etter en andre vasking av preparatglasset med, f.eks., en vandig buffer, kan delene dekkes med en monteringsvæske av fluorescent antistoff og et dekkglass og deretter eksamineres ved hjelp av et fluorescensmikroskop for å bestemme bindingen av det monoklonale antistoffet til delen. Bestemmelsen av bindingen kan også innbefatte en identifikasjon av plasserin-gen av slik binding inne i prøven.
Bindingen av det monoklonale antistoffet til prøven kan også bestemmes ved å anvende et monoklonalt antistoff som er kovalent konjugert til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal, såsom en radioaktiv del, et kromofor innbefattende fargestoffer og fluorescerende stoffer, eller et enzym. Antallet merker som anvendes pr. antistoff bestemmes generelt av kravene til den diagnostiske fremgangsmåten hvori det merkede antistoffet anvendes og tilgjengeligheten av seter for binding av merket til antistoffet.
Fremgangsmåter for konjugering av merker til antistoffer og antistoff-fragmenter er velkjente innen teknikken. Slike fremgangsmåter kan finnes i US patent nr. 4.220.450; 4.235.869; 3.935.074; og 3.996.345.
Et annet eksempel på en teknikk hvori det monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen kan anvendes er immunoperok-sydase-merking (Sternberger, "Immunocytochemistry", John Wiley & Sons, New York, 1979, s. 104-169, modifisert av Garrigues et al., Int. J. Cancer (1982) 2^9:511-515). Vevet som skal undersøkes fikseres med et egnet oppløsningsmiddel, såsom aceton, på en bærer, f.eks. et preparatglass. Deretter inkuberes vevet med det monoklonale antistoffet og vaskes deretter fritt for ubundet antistoff. Deretter inkuberes vevet med kanin anti-mus IgG, vaskes for å fjerne ubundet antistoff, blandes med mus-peroksydase-anti-peroksydase-kompleks, vaskes for å fjerne ubundet konjugat, og behandles deretter med substrat for enzymet. Etter denne behandlingen undersøkes glasset med henblikk på et detekterbart signal.
Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand, f.eks. i avstøtte celleprøver fra lungen, såsom spytt eller i en cervikal utsmøring. Ved betegnelsen "avstøtt" menes at prøven innbefatter isolerte celler eller klumper av celler oppnådd ved skraping eller vasking av overflaten av vev, disse cellene fjernes individuelt eller i lag eller laminater. Den utstøtte celleprøven skal skilles fra det utskårne vevet som f.eks. oppnås ved biopsi. Kontakt mellom prøven og antistoffet utføres under betingelser for binding av antistoffet til det antigeniske setet. Etter kontakt bestemmes nærværet eller fraværet av binding av antistoffet til det antigeniske setet og er forbundet med nærværet av en ondartet tilstand i lungen.
For å bestemme nærværet av en ondartet tilstand i lungen vil en spyttprøve tilveiebringe den utstøtte celleprøven som benyttes. Fremgangsmåten kan finne anvendelse ved deteksjon av en ondartet tilstand i utstøtte celleprøver fra bronkiene, gastro-intestinaltrakten innbefattende svelget, munnen osv. Den utstøtte celleprøven bringes så i kontakt med det tidligere nevnte antistoffet under betingelser for binding av antistoffet til det spesifikke antigeniske setet i prøven slik at det dannes antigen-antistoffkomplekser. Dette antigeniske setet kan være tilstede på celler eller ce-llefragmenter i prøven. Generelt plasseres prøven på en egnet bærer, såsom f.eks., en preparatholder, vanligvis av glass, eller et annet egnet materiale. Den utstøtte celleprøven utsmøres generelt på preparatglasset slik at det tilveie-bringes et tynt lag av prøven på overflaten av glasset. Kontakten mellom antistoffet og prøven utføres generelt i et vandig bufret medium. Bufrene som kan anvendes innbefatter fosfat, tris, bikarbonat, osv. pH er forbundet med naturen av prøven og antistoffet og er generelt i området fra 5 til 8. Det vandige mediet kan i tillegg inneholde organiske polare oppløsningsmidler i en mengde på fra 0 til 40$. De organiske polare oppløsningsmidlene er vannoppløselige og har generelt fra 1-10 karbonatomer og fra 1-4 oksygenatomer. Antistoffet vil være tilstede i det vandige mediet ved en konsentrasjon på 1-100 jjg/ml, fortrinnsvis fra 10-20 jjg/ml. Temperaturen under kontakten av prøven med antistoffet er vanligvis fra 4-40°C, fortrinnsvis 10-30°C. Tidsrommet for kontakten er vanligvis fra 15-120 minutter, fortrinnsvis fra 30-60 minutter.
Etter kontakttiden mellom prøven og antistoffet behandles bæreren generelt for å fjerne uomsatt antistoff. Normalt oppnås dette ved å vaske bæreren med et vandig, vanligvis bufret medium. Generelt bør mengden vaskeoppløsning være tilstrekkelig til å fjerne det uomsatte antistoffet.
Deretter observeres nærværet av antistoffet bundet til det antigeniske setet i prøven, denne bindingen er forbundet med nærværet av en ondartet tilstand ved posisjonen. Dvs. prøven undersøkes for å bestemme antallet antigen-antistoff (immun)komplekser som er dannet. Det bør bemerkes at i noen tilfeller kan svært små antall av det aktuelle antigeniske setet finnes i den utstøtte celleprøven. Ved en ondartet tilstand vil imidlertid store antall av det antigeniske setet være tilstede, og denne sistnevnte tilstanden kan lett adskilles ved foreliggende oppfinnelse sammenliknet med en ikke-ondartet tilstand fordi et stort antall antigen-antistof f komplekser vil være målbare der hvor en ondartet tilstand foreligger. For å utføre bestemmelsen av nærværet av binding, er innretninger for produksjon av et detekterbart signal inkorporert i analysesystemet. For eksempel kan man konjugere antistoffet som anvendes i analysen til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal. Merket kan være en radioaktiv enhet, en kromofor innbefattende fargestoffer og fluorescerende stoffer, et enzym eller liknende. Antallet merker som anvendes for antistoffet bestemmes generelt av kravene ved fremgangsmåten og tilgjengeligheten av seter for binding av merket til antistoffet. Alternativt kan man bringe det vaskede preparatglasset i kontakt med en merket spesifikk bindingspartner for antistoffet, som f.eks., kan være et merket antistoff som er spesifikt for antistoffet som anvendes. Der hvor det monoklonale antistoffet er avledet fra en murin kilde, kan et merket anti-mus immunoglobulin som er spesifikt for antistoffet anvendes ved fremgangsmåten. Slike immunoglobuliner kan dyrkes ifølge standardteknikker ved å injisere en egnet vert med det monoklonale antistoffet, vente i en egnet tid, og høste anti-mus immunoglobulinene fra blodet til verten som er blitt injisert. Når en merket spesifikk bindingspartner for antistoffet anvendes, må preparatglasset vaskes igjen med et vandig medium før undersøkelse av glasset med hensyn på fluorescens.
For å bestemme nærværet av binding mellom antistoffet og celleprøven hvor et fluorescensmerke anvendes, kan man undersøke preparatglasset med henblikk på fluorescens, vanligvis ved å anvende et fluorescensmikroskop. Der hvor det anvendes et annet merke enn et fluorescerende stoff, kan man undersøke preparatglasset eller prøven med henblikk på dannelsen av en utfelling, en farge eller liknende.
Beskrivelsen ovenfor er hovedsakelig rettet mot anvendelsen av antistoffene ifølge oppfinnelsen ved immunoflu-orescensteknikker. Imidlertid kan antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes i de fleste analyser innbefattende antigen-antistoffreaksjoner. Analysene kan være homogene eller heterogene. Ved en homogen analysefremgangsmåte kan prøven være en biologisk væske såsom serum, urin eller liknende eller prøven kan være lysert og gjort klar for å fjerne nedbrytningsprodukter. Den immunologiske reaksjonen innbefatter vanligvis det spesifikke antistoffet, en merket analytt, og prøven av interesse. Signalet som oppstår fra merket modifiseres, direkte eller indirekte, ved binding av antistoffet til den merkede analytten. Både den immunologiske reaksjonen og deteksjonen av omfanget av denne utføres ved en homogen oppløsning. Immunokjemiske merker som kan anvendes innbefatter frie radikaler, fluorescens-
fargestoffer, enzymer, bakteriofager, koenzymer, osv.
Ved en heterogen analysefremgangsmåte er reagensene vanligvis prøven, det spesifikke antistoffet og innretninger for produksjon av et detekterbart signal. Prøven plasseres generelt på en bærer, såsom en plate eller en preparatholder, og bringes i kontakt med antistoffet i en flytende fase. Bæreren separeres deretter fra væskefasen og enten bærerfasen eller den flytende fasen undersøkes med henblikk på et detekterbart signal ved anvendelse av innretninger for produksjon av et slikt signal. Signalet er forbundet med nærværet av analytten i prøven. Innretninger for produksjon av detekterbare signaler innbefatter anvendelse av radio-aktive merker, fluorescerende forbindelser, enzymer, osv. Eksempler på heterogene immunoanalyser er radioimmunoana-lysen, immunofluorescensfremgangsmåtene, enzym-bundne immunoanalyser og liknende.
For en mer detaljert diskusjon av de ovenfor nevnte i-mmunoanalyseteknikkene, se "Enzyme-Immunoassay", av Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Se også, f.eks., US patentene nr. 3.690.834, 3.791.932, 3.817.837, 3,850.578, 3.853.987, 3.867.517, 3.901.654, 3.935.074. 3.984.533, 3.996.345 og 4.098.876, denne listen er ikke ment å være uttømmende.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en diagnostisk forpakning, som er kjennetegnet ved at den innbefatter (a) et monoklonalt antistoff i form av L6-antistoff, som er nyttig for bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i humant Vev, hvor antistoffet definerer et determinantsete på et celle-tilknyttet glykolipidantigen som er karakteristisk for humane ikke-småcelle lungekarsinomer eller en funksjonell ekvivalent eller et fragment derav, og (b) et konjugat av (1) et merke som er en del av et signalproduserende system og (2) en spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoffet.
Reagensene kan også innbefatte hjelpemidler såsom buffer-midler og proteinstabiliseringsmidler, f.eks. polysakkarider og liknende. Den diagnostiske forpakningen kan videre, der det er påkrevet, innbefatte andre elementer av det signalproduserende systemet hvorav merket er en del, midler for reduksjon av bakgrunnsinterferensen ved forsøk, kontroll-reagenser, apparatur for utførelse av et forsøk, og liknende.
Et fordelaktig trekk ved foreliggende oppfinnelse er at de foreliggende antistoffene kan blandes med andre antistoffer til NSCLC, som f. eks. de som er beskrevet i US patentpublikasjon nr. 667.521. Kombinasjonen er effektiv ved deteksjon av i det minste de typene lungekarsinoma som er omtalt ovenfor, nemlig storcelle-udifferensiert lungekarsinoma, adenokarsinoma og epidermoid karsinoma.
De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen definerer også determinantseter på antigener forbundet med andre karsinoma, såsom brystkarsinoma. Følgelig kan foreliggende antistoffer finne anvendelse ved diagnostiske og terapeutiske produkter rettet mot slike karsinoma.
EKSEMPLER
Oppfinnelsen belyses ytterligere ved følgende illustrerende eksempler. Et antall fremgangsmåter som anvendes vil først bli beskrevet.
Immunohistologisk teknikk
For immunohistologiske studier av frosne deler ble den umerkede antistoffteknikken ifølge Sternberger i "Immunochemistry", John wiley & Sons, New York, 1979, s. 104-169, slik denne er modifisert av Garrigues et al. i Int. J. Cancer
(1982) 29:511-515, benyttet. Målvevet for disse forsøkene ble oppnådd ved kirurgi og nedfrysning i løpet av 4 timer etter fjernelse i isopentan som på forhånd var avkjølt i flytende nitrogen. Vevene ble deretter lagret i flytende nitrogen eller ved -70°C inntil de ble anvendt. Kanin anti-mus IgG
(Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD)
ble benyttet ved en fortynning på 1/50. Mus peroksydase-antiperoksydasekompleks (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) inneholdende 2 mg/ml spesifikt renset PAP ble benyttet ved en fortynning på 1/80. Nedfrosne deler ble fremstilt, tørket, behandlet med aceton og tørket (Garrigues et al., 1982). Deler som skulle benyttes for histologisk bedømmelse ble farget med hematoxylin. For å nedsette den ikke-spesifikke bakgrunnen, ble deler forinku-bert med normalt humant serum fortynnet 1/5 (Garrigues et al., 1982). Mus-antistoffer, geit-anti-mus IgG, og mus-PAP ble fortynnet i en oppløsning av 10% normalt humant serum og 39é kaninserum.
Fargefremgangsmåten besto i behandling av serier av deler med enten spesifikt eller kontrollantistoff i 2,5 timer, inkubering i 30 minutter med kanin-anti-mus IgG fortynnet 1/50, og eksponering i 30 minutter mot mus-PAP-kompleks fortynnet 1/80. Etter hver behandling med antistoff, ble preparatholderne vasket to ganger i fosfatbufret saltvann (PBS). Den immunohistokjemiske reaksjonen ble utviklet med nyfremstilt 0,0556 3,3'-diaminobenzidintetrahydroklorid (Sigma, St. Loius, MO) og 0,01$ hydrogenperoksyd i 0,05 M tris-buffer, pE 7,6 i 8 minutter. Videre eksponering til en 19é 0s04-oppløsning i destillert vann i 20 minutter intensi-verte fargen. Delene ble renset med vann, dehydrert i alkohol, klargjort i xylen og montert på preparatglass.
Preparatglassene ble alle avlest under kode og kodede prøver ble undersøkt av en uavhengig forsker. Typiske preparatglass ble fotografert ved å anvende optiske innretninger med differensiell interferenskontakt (Zeiss-Nomarski). Graden av antistoff-farging ble vurdert som 0 (ingen reaktivitet), +
(få positive celler), ++ (minst en tredjedel av cellene positive), +++ (de fleste celler positive), ++++ (tilnærmet alle celler sterkt positive). Siden forskjellen mellom + og 0 farging var mindre klar enn mellom ++ og + farging, ble det besluttet å telle som "positiv" en farging gradert som ++ eller større. Både neoplastiske og stromaceller ble observert i tumorprøver; fargingen som ble registrert, refererte til den for tumorceller, idet stromacellene ikke var farget i det hele, eller var farget mye svakere enn tumorcellene.
Den subcellulære lokaliseringen av antigener ble bestemt ved å måle antistoff som bindes til celler før og etter permeabilisering med ikke-ionisk rensemiddel. Antistoffer som bindes til celleoverflaten av intakte kultiverte celler ble identifisert enten ved direkte bindingsanalyser med <125>j_ merket antistoff (Brown et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA
(1981), 78:539-543) eller ved indirekte fluorescens ved å anvende (FACS) II-cellersortereren. Antistoff som bindes til intracellulære posisjoner ble bestemt ved direkte binding av <12>^I-merket antistoff til celler etterfulgt av fiksering med paraformaldehyd og etterfølgende permeabilisering med det ikke-ioniske rensemidlet "NP-40".
Bindingsanalvser
a) For bindingsanalyser utført ved å anvende radiomerkede antistoffer (Brown et al., supra), ble kultiverte celler
(IO<6>) inkubert ved 4°C i 30 minutter med IO<6> cpm av <125>l-merket antistoff i 100 jil varmeaktivert (30 minutter ved 56°C) fetalt kalveserum i kulturmedium. Etter tilsats av 5 ml PBS ble cellene pelletisert ved sentrifugering i 10 minutter ved 250 x g. Supernatanten ble suget av, og pelleten ble telt med henblikk på ^<2>^I. For å måle ikke-spesifikk binding ble parallelle inkuberinger utført med 10 jjg umerket antistoff som en konkurrent (Brown et al.,
supra). I noen tilfeller ble bindingsanalyser utført på en analog måte på cellemonolag knyttet til kulturskåler av plast.
b) For bindingsanalyser utført på FACS II-cellesortereren, ble celler fjernet fra sine substrater ved å anvende PBS
inneholdende 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Prøver inneholdende 1 x IO<5> celler ble inkubert først med monoklonalt antistoff ved en konsentrasjon på 2 jjg/ml, etterfulgt av fluorescein-konjugert geit-anti-mus-antistoff ved en 1:200-fortynning. Celler ble deretter vasket og resuspendert i kulturmedium. Straks før FACS-analyse ble propidiumjodid tilsatt i en endelig konsentrasjon på 1 jjg/ml for å farge ikke-levedyktige celler. Under FACS-analyse ble celler som emitterte rød fluorescens elektronisk filtrert ut slik at bare levedyktige celler ble undersøkt. Den gjennomsnittlige intensiteten av fluorescein-
fluorescens ble deretter bestemt for hvert antistoff. Negative kontrollprøver besto av prøver hvori det monoklonale antistoffet var utelatt; positive kontroll-prøver besto av- monoklonale antistoffer til HLA-type 1 histokompatibilitetsantigener. Farging ble betraktet som
positiv dersom den midlere kanalfluorescein var minst tre ganger "bakgrunnen.
Proteinantigenbestemmelse
For å identifisere proteinantigener ble lungekarsinomaceller overflateradiojodert eller metabolisk merket med <35>g_ metionin. Antigener ble isolert fra cellelysater ved inkubering med monoklonalt antistoff, tilsats av geit-anti-mus IgG, og adsorpsjon til S. aureus. Immunutfellinger ble vasket og analysert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) (10-20$ akrylamid) som beskrevet (Brown et al., supra).
Bestemmelse av reaktivitet for antistoffer med glykolipider
Antistoffer ble undersøkt med henblikk på reaktivitet med glykolipidantigener ved inkubering med rensede glykolipider adsorbert på mikroforsøksbrønner (sammen med kolesterol og lecitin) og med tynnsjiktkromatografiplater hvorpå glykolipider var fraksjonert. Bundet antistoff ble detektert ved inkubering med antiserum til mus-immunoglobulin og radiojo-dert protein A.
Isotypebestemmelse
a) Duchterlony-immunodiffusjon
En porsjon av supernatant av spesielle hybridomaceller ble
plassert i senterbrønnen av 2$ agarplate. Monospesifikke kanin-anti-mus Ig-isotyper antistoff (Meloy) ble plassert i de ytre brønnene og platen ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur og over natten ved 4°C.
b) Bøyelige polyvinylklorid 96 brønnplater (Costar) ble belagt med 0,1 mg/ml geit-anti-mus Ig-antistoffer i 2
timer ved 37°C og motbelagt med en 3% BSA-oppløsning i 2 timer ved 37°C. Hybridoma-supernatanten ble deretter inkubert ved 37 °C i 2 timer. Etter vasking med PBS bovinserumalbumin (BSA), ble plater inkubert ved 37°C i 2 timer med monospesifikke kanin-anti-mus Ig-isotype-
antistoffer koplet til peroksydase (Zymed). Etter vasking ble plater inkubert med 1 mg/ml ortofenylendiamin og 0, 03% H202 i 0,1 M citratbuffer, pH 4,5. Optisk tetthet ved 630 nm ble bestemt på en "Dynatec" ELISA-plateavleser.
Stafvlokokkisk protein A bindingsanalyse
Mikrotiterbrønner ble inkubert med 5% NCS i PBS pluss 0,02$ NaN3 og supernatanten ble avsugd. 25 pl av en suspensjon av epidermceller (2 x IO<7> celler/ml) ble tilsatt til hver brønn og inkubert med 25 pl av et spesielt antistoff i en time ved romtemperatur. Platene ble sentrifugert ved 1200 opm i 7 minutter, vasket to ganger med 50$ NCS/PBS/NaN3 og 25 pl <125>I-stafylokokkisk protein A (ca. 50.000 cpm/25 1) ble tilsatt. Platene ble inkubert i en time ved 25"C, vasket to ganger med 5% NCS/PBS/NaN3 og tørket. Bunnen av brønnene ble avskåret og telt i en gammateller.
EKSEMPEL
Fremstilling av monoklonale antistoffer
Monoklonale antistoffer ble produsert ved å immunisere 3 måneder gamle BALB/c-mus med menneskevev fra en av fire forskjellige kilder: (1) pleuraleffusjoner fra pasienter med metastatiske ikke-småcelle lungekarsinoma, (2) kultiverte celler fra ikke-småcelle lungekarsinoma og (3) lungevev fra 3-4 måneder gamle menneskefostre. Immuniseringene ble utført ved å injisere musene intraperitonealt 3-4 ganger med ca. IO<7 >celler. Tre dager etter den siste immuniseringen ble miltene fjernet, suspendert i kulturmedium og sammensmeltet med NS1-musemyelomaceller (KShler og Milstein, supra). Blandingene ble podet slik at det ble dannet kulturer med lav tetthet med utgangspunkt i enkle sammensmeltede celler (kloner); teknikkene som benyttes for hybridiseringen er tidligere beskrevet av Yeh et al., Int. J. Cancer (1979) 29:269-275.
Supernatanter fra hybrideeller ble undersøkt ved å anvende både en ELISA-analyse og en autoradiografisk indirekte <125>l-merket protein A-analyse (Brown et al., J. Immunol. Meth.
(1979) 31:201-209) mot ekstrakter fra tumorene anvendt for immunisering som inneholdt, bl.a., cellemembraner. Disse ekstraktene ble fremstilt ved å anvende en fremgangsmåte modifisert fra Colcher et al., Cancer Res., (1981) 42:1451-1459, Yeh et al., supra. For dette formål ble vev vasket med PBS og suspendert, hvilket for intakte tumorer ble utført ved å presse disse gjennom en sikt av rustfritt stål. Etter dette ble 1 mM NaHCOs inneholdende 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA) tilsatt, og materialet ble deretter homogenisert på is, med 50 slag av B-pistillen av en "Dounce"-homogenisator. Etter sentrifugering i 15 minutter ved 27.000 x g, ble supernatanten fjernet, og pelleten ble igjen suspendert i PBS, ultralydbehandlet i 1 minutt, og lagret ved -70°C.
Hybridoma som produserte antistoffer som bindes til cel-lemembranekstraktene ble klonet, dyrket in vitro, og ytterligere undersøkt med hensyn på antistoffspesifisitet. Denne undersøkelsen ble utført ved å anvende den immunohistologiske teknikken beskrevet ovenfor, hvori antistoffenes evne til å bindes til nedfrosne deler av lungekarsinoma, andre tumorer og normalt humant vev ble undersøkt. De hybridoma som produserte antistoff av tilsynelatende spesifisitet for human lungekreft ble reklonet, dyrket og injisert i pristan-primerbehandlede 3 måneder gamle BALB/c-mus, hvor de vokste som ascites-tumorer.
Antistoffer utskilt i ascites ble renset på protein A "Sepharose" (Ey et al., Immunochemistry (18@978) 15:429) eller ved gelfiltrering i "Sephacryl S-300". Rensede antistoffer ble benyttet for ytterligere karakterisering som innbefattet ytterligere spesifisitetsforsøk ved hjelp av immunohistologi, bindingsanalyser på intakte celler for å bestemme hvilke antistoffer ble bundet til celleoverflaten, og radioimmunoutfellingsforsøkene beskrevet ovenfor. Monoklonalt antistoff L6 ble produsert fra det tilsvarende hybidoma som beskrevet ovenfor. Dette antistoffet viste egenskapene angitt ovenfor i foreliggende beskrivelse.
En cellelinje, betegnet L6 ble deponert ved ÅTCC 6. desember 1984, og fikk aksesjonsnummeret HB 8677.
EKSEMPEL
Reaktivitet av visse glvkolipider med L6- antistoff
Studier av reaktiviteten av L6-antistoffet ble utført ifølge standard fremgangsmåter som f.eks. beskrevet av Kannagi et al. (1983), Cancer Research, 43:4997-5005 Qg Nudelman et al.
(1982), J. Biol. Chem., 257:12752-12756. Definerte glykolipider ble analysert med hensyn på reaktivitet med L6-antistoffet. Glykolipider separert på TLC ble immunofarget ved antistoffet og radioimmunoanalyser i fast fase ble utført på glykolipider som var belagt på plastbrønner. Resultatene er sammenfattet i tabell 1. L6-antistoffet reagerte spesifikt med asialo GalNAc-GM2 og asialo GM2, med den sterkeste reaksjonen observert med asialo GalNAc-GM^. En svak reaktivitet ble funnet med gangliotetra-osylceramid (asialo GM^) og x2 glykolipid (struktur definert i tabell 1). Globosid, globotriaosylceramid, laktosylceramid, paraglobosid (laktotetraosylceramid), glykolipider med Lex-og Lev<->strukturer, og gangliosider med ganglio- og lakto-seriestrukturer var alle negative. Det synes derfor som om L6-antistoffet gjenkjenner følgende sekvens:
GalNAcPl -» 4Gal3l -» 3GalNAcPl Y 4Galpl -» R
hvori R er et udefinert karbohydrat.
EKSEMPEL
Antistoff- avhengig cellulærtoksisitet ( ADCC)
Dette forsøket ble utført ved en fremgangsmåte tidligere beskrevet av Hellstrøm et al., PNAS 82: 1499, 1985, ved å inkubere blandinger av <51>Cr-merkede målceller (2981 lunge-karsinoma), antistoffer (forskjellige fortynninger) og lymfocytter (forskjellige forhold mellom lymfocytter og målceller) i 4 timer og måling av mengden <51>Cr frigitt i supernatanten. Forsøket og resultatene er sammenfattet i tabell 2.
Derfor formidlet antistoff L6 ADCC når det ble undersøkt på målceller som eksprimerte L6-antigenet.
EKSEMPEL
Antistoff- formidlet cytotokslsitet i nærvær av humant komplement
For å undersøke om antistoff L6 kan ødelegge tumorceller i nærvær av humant komplement, ble <5*>Cr-merkede målceller (2981 lungekarsinoma) inkubert i 4 timer med antistoff og humant komplement, ved etablerte fremgangsmåter (Hellstrøm et al., PNAS 82: 1499, 1985). Forsøket og resultatene er sammenfattet i tabell 3.
Antistoffer som aktiverer humant komplement er av interesse av minst to grunner: de kan direkte avlive tumorceller og de kan være i stand til å indusere en inflammatorisk respons i tumorområdet med aktiverte makrofager og andre celler som fortrinnsvis er cytolytiske overfor neoplastiske tilstander sammenliknet med normale celler.
EKSEMPEL
Spesifisitetsundersøkelse med immunohistologi mot forskjellige tumorer
Oppfinnelsen er beskrevet i detalj med spesiell referanse til utførelsene ovenfor. Det skal imidlertid understrekes at variasjoner og modifikasjoner kan bevirkes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Claims (11)

1. Monoklonalt antistoff som bindes til et antigen på humane ikke-småcelle lunge-karsinoma for in vitro anvendelse, karakterisert ved at dets antigen-kombinerende sete binder til: (a) et karbohydrat antigen beslektet, men ikke identisk med ganglio-N-triosylceramid, betegnet asialo GM2, som er en celleoverflate determinant av humant ikke-småcelle lunge karsinom; og (b) et proteinantigen som har en molekylvekt på ca. 20.000 dalton og som er forbundet med humant ikke-små-celle lunge karsinom, og nevnte monoklonale antistoff er L6-antistoff produsert av hybridom HB 8677, deponert ved ATCC, eller en funksjonell ekvivalent derav, er eventuelt konjugert til et merke som er i stand til å produsere et detekterbart signal, eksempelvis et merke i form av en fluorescerende forbindelse og er produsert ved hjelp av L6-murint hybridom og de nyttige bindingsfragmentene av nevnte antistoff.
2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er av IgG2a-isotypen.
3. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det definerer et determinantsete på et celle-tilknyttet glykolipidantigen og et proteinantigen som er karakteristisk for humane ikke-småcelle lungekarsinomceller og funksjonelle ekvivalenter og fragmenter av slikt monoklonalt antistoff.
4. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at det celle-tilknyttede glyko- lipidantigenet har egenskapene for et ganglio-N-triosylceramid.
5 . Anvendelse av det monoklonale antistoffet ifølge krav 1 for in vitro bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i en vevsprøve tatt fra et individ, hvor (a) vevsprøven bringes i kontakt med et monoklonalt antistoff hvis antigen-kombinerende sete kompetitivt inhiberer den immunospesifikke bindingen av monoklonalt antistoff Lb, produsert av hybridom HB8677 deponert ved ATCC, til dens målantigen; og (b) deteksjon av om det monoklonale antistoffet immunospesifikt bindes til vevsprøven, hvor immunospesifikk binding av det monoklonale antistoffet til vevsprøven indikerer nærværet av en ondartet tilstand i vevsprøven.
6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor bindingen av det monoklonale antistoffet til vevsprøven detekteres i trinn (b) ved at vevsprøven bringes i kontakt med et konjugat av et merke og en spesifikk bindende partner for det monoklonale antistoffet, hvor merket er istand til å produsere et detekterbart signal slik at deteksjon av signalet bundet til vevsprøven indikerer bindingen av det monoklonale antistoffet til vevsprøven.
7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor den bindende partneren omfatter et antistoff som er spesifikt for det monoklonale antistoffet.
8. Anvendelse ifølge krav 6 eller 7, hvor merket omfatter et fluorescerende stoff, et radiomerke, en kromofor eller et enzym.
9. Anvendelse Ifølge krav 5, hvor det monoklonale antistoffet er konjugert til et merke som er istand til å produsere et detekterbart signal slik at deteksjonen av signalet bundet til vevsprøven indikerer binding av det monoklonale antistoff konjugatet til vevsprøven.
10. Diagnostisk forpakning, karakterisert ved at den innbefatter (a) et monoklonalt antistoff i form av L6-antistoff, som er nyttig for bestemmelse av nærværet av en ondartet tilstand i humant vev, hvor antistoffet definerer et determinantsete på et celle-tilknyttet glykolipidantigen som er karakteristisk for humane ikke-småcelle lungekarsinomer eller en funksjonell ekvivalent eller et fragment derav, og (b) et konjugat av (1) et merke som er en del av et signalproduserende system og (2) en spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoffet.
11. Diagnostisk forpakning ifølge krav 10, karakterisert ved at merket er et enzym, eller et fluorescerende stoff.
NO863071A 1984-12-21 1986-07-29 Monoklonalt antistoff, anvendelse av dette samt diagnostisk forpakning omfattende antistoffet NO174718C (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/684,759 US4935495A (en) 1984-12-21 1984-12-21 Monoclonal antibodies to the L6 glycolipid antigenic determinant found on human non-small cell lung carcinomas
US06/776,321 US4906562A (en) 1984-12-21 1985-10-18 Monocolonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas
PCT/US1985/002441 WO1986003838A1 (en) 1984-12-21 1985-12-13 Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO863071L NO863071L (no) 1986-07-29
NO863071D0 NO863071D0 (no) 1986-07-29
NO174718B true NO174718B (no) 1994-03-14
NO174718C NO174718C (no) 1994-06-22

Family

ID=27103432

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO863071A NO174718C (no) 1984-12-21 1986-07-29 Monoklonalt antistoff, anvendelse av dette samt diagnostisk forpakning omfattende antistoffet

Country Status (23)

Country Link
US (1) US4906562A (no)
EP (1) EP0207963B1 (no)
JP (1) JPH09191878A (no)
KR (1) KR910000956B1 (no)
AT (1) ATE77701T1 (no)
AU (1) AU601360B2 (no)
CA (1) CA1335796C (no)
DE (1) DE3586262T2 (no)
DK (1) DK168049B1 (no)
ES (2) ES8800602A1 (no)
FI (2) FI98736C (no)
GB (1) GB2180256B (no)
GR (1) GR853054B (no)
HU (1) HUT42637A (no)
IE (1) IE58572B1 (no)
IL (1) IL77291A (no)
NO (1) NO174718C (no)
NZ (1) NZ214542A (no)
OA (1) OA08412A (no)
PH (1) PH25742A (no)
PT (1) PT81744B (no)
WO (1) WO1986003838A1 (no)
YU (1) YU45294B (no)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4675287A (en) * 1984-07-26 1987-06-23 Scripps Clinic And Research Foundation Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2
EP0173648A3 (en) * 1984-08-30 1988-04-27 Ciba-Geigy Ag New monoclonal antibodies to glycoconjugates, processes for their production, and applications
IL76877A (en) * 1984-11-02 1991-11-21 Oncogen Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies
US5614610A (en) * 1984-12-21 1997-03-25 Oncogen Tumor immunotherapy using anti-idiotypic antibodies
AU601680B2 (en) * 1985-05-28 1990-09-20 Joseph P. Brown Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas
EP0234122A3 (en) * 1986-02-21 1989-03-22 Oncogen Limited Partnership Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
IL84285A (en) * 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
NZ225599A (en) 1987-08-04 1991-09-25 Bristol Myers Co Antibody-enzyme conjugates and combinations with prodrugs for the treatment of tumour cells
AU632469B2 (en) * 1988-04-04 1993-01-07 Johns Hopkins University, The A method for early detection of lung cancer
US5173292A (en) * 1988-06-14 1992-12-22 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies which specifically recognize galactosyl-globoside, compositions containing same and methods of using same
US5171665A (en) * 1989-04-17 1992-12-15 Oncogen Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US5192551A (en) * 1989-05-02 1993-03-09 Johns Hopkins University Neutral glycolipid as an adsorbent for enteric viral pathogens
CA2015862A1 (en) * 1989-05-04 1990-11-04 Gajanan Nilaver Cell surface antigen that binds with l6 monoclonal antibody
CA2040513A1 (en) * 1990-04-16 1991-10-17 Robert C. Bast, Jr. Method of diagnosing cancer
US5165922A (en) * 1990-05-22 1992-11-24 Bristol-Myers Squibb Company Synergistic tumor therapy with combinations of biologically active anti-tumor antibodies and chemotherapy
US5597707A (en) * 1993-04-15 1997-01-28 Bristol-Myers Squibb Company Tumor associated antigen recognized by the murine monoclonal antibody L6, its oligonucleotide sequence and methods for their use
US7745159B2 (en) * 1999-02-26 2010-06-29 Nathalie B Scholler Methods and compositions for diagnosing carcinomas
US6117981A (en) * 1999-06-03 2000-09-12 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Hybridomas for lung cancer marker and monoclonal antibodies thereof
CA2421070A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-14 International Bioimmune Systems, Inc. The identification and development of specific monoclonal antibodies to squamous cell carcinoma
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20040058445A1 (en) * 2001-04-26 2004-03-25 Ledbetter Jeffrey Alan Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB
US20030219436A1 (en) * 2002-03-15 2003-11-27 Ledbetter Jeffrey A. Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
SI1912675T1 (sl) * 2005-07-25 2014-07-31 Emergent Product Development Seattle, Llc zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20
CA2654317A1 (en) * 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
PT2132228E (pt) * 2008-04-11 2011-10-11 Emergent Product Dev Seattle Imunoterapia de cd37 e sua combinação com um quimioterápico bifuncional
JP2012508774A (ja) * 2008-11-13 2012-04-12 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル, エルエルシー Cd37免疫治療薬併用療法およびその使用
PL2768308T3 (pl) * 2011-10-14 2018-12-31 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Związki i substraty przeciwnowotworowe nqo1
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
WO2014168991A1 (en) * 2013-04-09 2014-10-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Tumor-selective combination therapy
EP3352760A4 (en) 2015-09-21 2019-03-06 Aptevo Research and Development LLC CD3 BINDING POLYPEPTIDES
WO2017197045A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Movassaghi Mohammad Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs
WO2018209239A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
WO2020247054A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
US12030888B2 (en) 2021-02-24 2024-07-09 Massachusetts Institute Of Technology Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4507391A (en) * 1982-04-02 1985-03-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for detecting the presence of GD3 ganglioside
US4579827A (en) * 1983-03-11 1986-04-01 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies
US4569788A (en) * 1983-05-18 1986-02-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies against non small cell lung cancer
JPS6057254A (ja) * 1983-09-09 1985-04-03 Dainabotsuto Kk 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法
US4675287A (en) * 1984-07-26 1987-06-23 Scripps Clinic And Research Foundation Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2
IL76877A (en) * 1984-11-02 1991-11-21 Oncogen Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies
JPS61258173A (ja) * 1985-05-10 1986-11-15 Akira Taniuchi モノクロ−ナル抗体およびその製法ならびに用途
AU601680B2 (en) * 1985-05-28 1990-09-20 Joseph P. Brown Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas

Also Published As

Publication number Publication date
FI98736C (fi) 1997-08-11
AU5312486A (en) 1986-07-22
EP0207963A4 (en) 1988-08-29
AU601360B2 (en) 1990-09-13
EP0207963B1 (en) 1992-06-24
FI98736B (fi) 1997-04-30
DE3586262T2 (de) 1992-12-10
DE3586262D1 (de) 1992-07-30
DK393886D0 (da) 1986-08-19
IL77291A (en) 1992-01-15
KR870700139A (ko) 1987-03-14
KR910000956B1 (ko) 1991-02-19
IE853220L (en) 1986-06-21
JPH09191878A (ja) 1997-07-29
EP0207963A1 (en) 1987-01-14
ES557140A0 (es) 1987-08-16
ES8707797A1 (es) 1987-08-16
PH25742A (en) 1991-10-18
WO1986003838A1 (en) 1986-07-03
US4906562A (en) 1990-03-06
FI88808C (fi) 1993-07-12
YU45294B (en) 1992-05-28
ATE77701T1 (de) 1992-07-15
DK168049B1 (da) 1994-01-24
NO863071L (no) 1986-07-29
GB2180256B (en) 1989-08-31
NO174718C (no) 1994-06-22
PT81744B (pt) 1987-11-30
GR853054B (no) 1986-04-15
DK393886A (da) 1986-08-19
ES8800602A1 (es) 1987-11-16
YU199685A (en) 1988-12-31
FI863375A (fi) 1986-08-20
FI863375A0 (fi) 1986-08-20
GB2180256A (en) 1987-03-25
IE58572B1 (en) 1993-10-06
OA08412A (en) 1988-06-30
ES550251A0 (es) 1987-11-16
FI88808B (fi) 1993-03-31
NO863071D0 (no) 1986-07-29
GB8619900D0 (en) 1986-09-24
PT81744A (en) 1986-01-02
NZ214542A (en) 1991-07-26
CA1335796C (en) 1995-06-06
HUT42637A (en) 1987-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO174718B (no) Monoklonalt antistoff, anvendelse av dette samt diagnostisk forpakning omfattende antistoffet
US4935495A (en) Monoclonal antibodies to the L6 glycolipid antigenic determinant found on human non-small cell lung carcinomas
Hellström et al. Monoclonal mouse antibodies raised against human lung carcinoma
US4737579A (en) Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carinomas
US5185432A (en) Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinoma and other certain human carcinomas
IE58590B1 (en) Monoclonal antibodies and antigens for human non-small cell lung carcinomas
EP0203552B1 (en) Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas
CA1320689C (en) Monoclonal antibody specific for human basal cell surface antigen
US4886745A (en) Monoclonal antibody specific for human basal cell surface antigen
AU601680B2 (en) Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas
FI94291B (fi) Monoklonaalinen vasta-aine
CA1337049C (en) Anti-human pulmonary adenocarcinoma monoclonal antibody