FI94291B - Monoklonaalinen vasta-aine - Google Patents

Description

r\ A r, 7 4 /. 7 \

Monoklonaalinen vasta-aine

Jakamalla erotettu hakemuksesta 863375.

5

Ihmisen keuhkosyövät aiheuttavat useimmat miesten syöpä-kuolemista ja ovat ohittamassa rintasyövän tavallisimpana syöpäkuoleman aiheuttajana naisten keskuudessa (Cancer Facts and Figures, 1983) . Tämä tauti voidaan jakaa neljään histo-10 logiseen päätyyppiin, so. epidermoidiseen (30 %), rauhas- syöpään (35 %), suursoluiseen järjestäytymättömään (15 %) ja piensoluiseen (20 %). Useimmat keuhkosyöpätapaukset eivät ole parannettavissa kemoterapialla ja säteilyhoidolla. Kemo-terapia ja säteilyhoito saattavat vaikuttaa piensoluisiin 15 keuhkosyöpiin kokoa pienentäen mutta ei kokonaan parantamalla. Kasvaimen täydellinen kirurginen poisto näyttää olevan ainoa tehokas hoitomenetelmä. Valitettavasti kuitenkin vähemmällä kuin 30 %:lla keuhkosyöpäpotilaista on kasvaimia, jotka voidaan täysin poistaa leikkaamalla ja näistä poti-20 laista vähemmän kuin yksi kolmannes elää 5 vuotta kasvaimen ilmeisen täydellisen kirurgisen poiston jälkeen. Sen takia on suuri tarve saada aikaan menetelmiä, jotka tekisivät mahdolliseksi keuhkosyövän aikaisemman toteamisen ja syövän leviämisasteen paremman määrittämisen.

25 * Näihin tarkoituksiin voidaan käyttää monoklonaalisia vasta- aineita. Edellytyksenä on kuitenkin löytää vasta-aineita antigeeneille, joita esiintyy paljon enemmän keuhkosyövässä kuin tavallisissa täysikasvuisissa kudoksissa. Koska tunne-30 taan kasvainsolupopulaatioiden heterogeenisuus, useiden determinanttien läsnäolo samassa antigeenimolekyylissä, ennakoidut erot antigeenien välillä suhteessa sopivuuteen diagnostisina markkereina verrattuna terapeuttisiin kohteisiin ja eri vasta-aineiden erilaiset biologiset ominaisuudet sa-35 maa antigeeniä kohtaan, saatetaan tarvita suuri määrä erilaisia vasta-aineita.

Ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita keuhkosyöpäantigeenejä vastaan kuvataan julkaisussa Sikora et ai., Br. J. Cancer 2

Q A Q O 1 y t c. s I

(1981) 43.:696-700. Monoklonaalisia vasta-aineita, jotka osoittavat spesifisyyttä useita ihmisen keuhkosyöpätyyppejä kohtaan, on esitetty julkaisussa Outitta et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1981) 78.:4591-4595. Ihmisen keuhkorauhas-5 syöpään liittyviä antigeenejä, jotka on määritetty monoklo-naalisilla vasta-aineilla, on kuvattu julkaisussa Varki et ai., Cancer Research (1984) 44:681-687.

Hiiren monoklonaalisia vasta-aineita glykolipidiä ganglio-N-10 triosyyliseramidi (asialo GM^ vastaan on kuvattu julkaisussa Young, et ai., J. Exp. Med. (1979) 150:1008. Asialo GM^-n ilmentymistä potilaiden, joilla on Hodgins'in tauti, soluissa on kuvattu julkaisussa Kniep, et ai., J. Immunol. (1983) 131:1591-1994.

15 US-patenttihakemuksessa 667 521 kuvataan tiettyjä monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen ei-piensoluisia keuhkosyöpä-kasvaimia vastaan.

20 Ennalta määrätyn spesifisyyden omaavia vasta-aineita erittäviä fuusioitujen solujen jatkuvia viljelmiä on kuvannut Köhler et ai., Nature (1975) 265:495-497.

Esillä oleva keksintö koskee uusia monoklonaalisia vasta-25 aineita, joiden antigeeninen sitoutumiskohta sitoutuu (a) hiilihydraattiantigeeniin, joka on ganglio-N-triosyyli-seramidin, jota merkitään asialo-GM^ kaltainen muttei identtinen sen kanssa, ja joka on ihmisen ei-piensolu-keuh-kosyövän solun pintadeterminantti; ja 30 (b) proteiiniantigeeniin, jonka molekyylipaino on noin 20 000 daltonia ja joka liittyy ihmisen ei-piensolu-keuh-kosyöpään.

Edullisesti tällaisia vasta-aineita voidaan tuottaa hybri-dooman, jonka talletusnumero on ATCC HB8677, avulla.

35

Esillä oleva keksintö koskee uusia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat determinanttikohdat glykolipidi-antigeenissä, joka liittyy ihmisen ei-piensoluisen keuhkosyövän (NSCLC) soluihin. Termi "NSCLC-solut" sisältää epi- 3 Ο Λ O .'Λ Ί

9429 I

dermoidiset syöpäsolut, rauhassyöpäsolut ja suursoluiset järjestäytymättömät syöpäsolut. Determinanttikohta voi esiintyä myös joidenkin muiden syöpien antigeeneissä, esim. joidenkin rintasyöpien, ja täten keksinnön mukaiset vasta-5 aineet sitoutuvat myös näihin muihin syöpäsoluihin. Esillä olevat monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat paljon vähemmässä määrin normaaleihin täysikasvuisiin soluihin kuin kas-vainsoluihin. Termillä "sitoutuvat paljon vähemmässä määrin" tarkoitetaan, että sitoutuminen ei ole havaittavissa immuno-10 histologisilla menetelmillä. Monoklonaalisia vasta-aineita erittävät hiiren hybridoomat.

Esillä olevan keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää menetelmissä pahanlaatuisen tilan läs-15 näolon määrittämiseksi ihmisen keuhkokudoksessa ja muissa ihmiskudoksissa. Menetelmässä tutkitaan, onko kudoksessa läsnä glykolipidiantigeeniä, jolla on terminaalinen hiilihydraatti järjestys: GalNAcSl-4GalSl-*3GalNAcSl-*4GalSl ja vastaavanlaisia antigeenejä, kuten ganglio-N-triosyyli-serami-20 di, esim. asialo GMj. Esimerkiksi kudos voidaan saattaa yhteyteen vasta-aineen kanssa, joka tunnistaa determinantti-kohdan glykolipidiantigeeniin liittyvässä solussa, jolla antigeenillä on edellä mainittu terminaalinen hiilihydraatti järjestys tai funktionaalisen ekvivalentin tai tällaisen 25 vasta-aineen osasen kanssa.

Eräs tällainen menetelmä käsittää NSCLC-solujen läsnäolon määrittämisen näytteessä, jonka epäillään sisältävän tällaisia soluja. Näyte saatetaan kosketuksiin keksinnön mukaisen 30 monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka pystyy erottamaan tällaiset solut muista solutyypeistä, joita voi olla läsnä näytteessä. Yhteensaattaminen suoritetaan olosuhteissa, joissa vasta-aine sitoutuu tällaisiin soluihin. Yhteensaat-tamisen jälkeen määritetään, onko vasta-aine sitoutunut 35 näytteen soluihin vai ei. Tämä sitoutuminen on verrannollinen NSCLC-solujen läsnäoloon tai poissaoloon näytteessä. Yleensä näyte saatetaan kosketuksiin yhdessä leimatun mono-klonaaliselle vasta-aineelle spesifisen sitoutumisosapuolen kanssa. Tämä leima kykenee tuottamaan havaittavan signaalin.

4 y q z 91

Toinen diagnostinen menetelmä käsittää kasvaimen paikallistamisen käyttämällä vasta-aineita tai vasta-aineiden osasia, jotka on sopivasti leimattu (esim. radioisotoopilla) ja sen jälkeen ruiskutettu potilaisiin. Tällä menetelmällä saadaan 5 aikaan parempia tapoja syöpäpotilaiden seuraamiseksi taudin laajuuden suhteen ja hoidolla aikaansaatujen muutosten havaitsemiseksi .

Esillä oleva keksintö koskee uusia vasta-aineita, jotka si-10 toutuvat ihmisen NSCLC-solujen antigeeniin ja tiettyjä diagnostisia menetelmiä, joissa käytetään näitä vasta-aineita. Keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa Köhlerin ja Millsteinin, supra, vakiomenetelmien mukaisesti. Immunogeeninä käytetään esimerkiksi ihmisen 15 keuhkosyöpäsoluja useista nestepurkaumista tai viljeltyjä soluja ihmisen ei-piensoluisesta keuhkosyövästä tai soluja normaalista kuolleesta keuhkosta. Nämä solut ruiskutetaan hiireen ja riittävän ajan jälkeen hiiri tapetaan ja perna-solut otetaan talteen. Haluttuja immunoglobuliineja koodaa-20 vat pernasolun kromosomit tallennetaan fuusioimalla perna-solut myeloomasolujen kanssa tai imukudoskasvainsolujen kanssa, yleensä polyetyleeniglykolin läsnäollessa. Saatujen solujen, jotka sisältävät fuusioituneet hybridoomat, annetaan kasvaa selektiivisellä alustalla, kuten HAT-alustalla, 25 ja eloonjääneitä soluja kasvatetaan tällaisella alustalla käyttäen rajoittavia laimennusolosuhteita. Soluja kasvatetaan sopivassa säiliössä, esim. mikrotiitterikuopissa, ja supernatantista seulotaan monoklonaaliset vasta-aineet, joilla on haluttu spesifisyys.

30

On olemassa useita menetelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden saantojen parantamiseksi, kuten hybridoomasolujen ruiskuttaminen nisäkäsisännän, joka hyväksyy solut, vatsaonteloon ja vesivatsanesteen kerääminen. Mikäli vesivatsanes-35 teestä saadaan kerättyä riittämätön määrä monoklonaalista vasta-ainetta, vasta-aine kerätään isännän verestä. On olemassa useita tavanomaisia tapoja eristää ja puhdistaa monoklonaaliset vasta-aineet monoklonaalisten vasta-aineiden 94291 5 vapauttamiseksi muista proteiineista ja muista kontaminan-teista (katso Köhler ja Millstein, supra).

Erästä esillä olevan keksinnön mukaista monoklonaalista 5 vasta-ainetta merkitään L6:lla. Se tunnistaa solun pinnalla olevan glykolipidiantigeenin, joka on identifioitu tyypilliseksi ihmisen NSCLC-soluille ja tietyille muille ihmisen syöpäkasvainsoluille. Useiden tunnettujen glykolipidien ris-tireaktioiden perusteella L6-vasta-aineiden kanssa ja asialo 10 GalNAc-GMj:n reaktiivisuuden perusteella L6-vasta-aineen kanssa on päätelty, että L6-glykolipidiantigeenillä on seu-raava terminaalinen järjestys GalNAcSl-*4GalSl-*3GalNAcfil-* 4GalSl-*R, jossa R on hiilihydraatti, joka toistaiseksi on tuntematon. Edellä olevan antigeenin erityisen uusi piirre 15 on se, että se on vapaa sialiinihappotähteistä ja tähän mennessä sen ei ole tiedetty liittyvän ihmiskudokseen. Sialo-syylijohdannaisia, joilla on edellä mainittu terminaalinen järjestys, on kuvattu julkaisuissa Svennerholm et ai., (1973) J. Biol. Chem. 248:740-742 ja Iwamori et ai., (1978) 20 J. Biochem. M:1601. Lisäksi edellä olevan järjestyksen omaavat sialiinihappojohdannaiset on myös tunnistettu veriryhmä -Sd- antigeeneiksi julkaisuissa Donald et ai., (1984) Biochem. Soc. Trans. 12:596-599 ja Blanchard et ai., (1983) J. Biol. chem. 258:7691-7695.

25 L6-vasta-aine saostaa myös proteiiniantigeenin biosynteet-tisesti leimatuista NSCLC-soluista. Tämä antigeeni tunnistetaan vyöhykkeenä natriumdodekyylisulfaattipolyakryyli-amidigeelielektroforeesissa (SDS-PAGE), jolla on molekyyli-30 paino noin 20 000 daltonia. Tämä vasta-aine on isotyyppiä IgG2a. Se ei sitoudu havaittavasti normaaleihin soluihin, kuten fibroblasteihin, endoteelisoluihin tai epiteelisoluihin suurimmissa elimissä. L6-vasta-ainetta tuotetaan hiiren L6-hybridoomalla.

35

Keksinnön piiriin kuuluvat myös hyödylliset edellä olevien monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumisfragmentit, kuten Fab-, F(ab') 2» Fv-fragmentti jne. Vasta-ainefragmentteja saadaan tavanomaisin menetelmin. Esimerkiksi hyödyllisiä sitou- 94291 6 tumisfragmentteja voidaan valmistaa vasta-aineiden peptidaa-siliuotuksella käyttäen papaiinia tai pepsiiniä.

Vaikkakin edellä oleva spesifinen esimerkki keksinnön mukai-5 sesta uudesta vasta-aineesta on suunnattu vasta-aineeseen, joka sitoutuu vastaavien antigeenien spesifisiin determi-nanttikohtiin ja kuuluu hiirilähteestä olevaan IgG2-alaluok-kaan, tätä ei ole tarkoitettu keksintöä rajoittavaksi. Edellä tämä vasta-aine ja ne vasta-aineet, jotka ovat funktio-10 naalisesti samanlaisia edellä mainitun vasta-aineen kanssa, ovat ne sitten hiirilähteestä, muusta nisäkäslähteestä ihminen mukaan luettuna tai muista lähteistä tai näiden yhdistelmistä, kuuluvat tämän keksinnön piiriin, kuten myös muut isotyypit. Termillä "funktionaalinen samankaltaisuus" tar-15 koitetaan, että vasta-aine kykenee sitoutumaan edellä kuvattuun determinanttikohtaan ja kykenee kilpailemaan keksinnön mukaisen tietyn vasta-aineen kanssa tällaisesta kohdasta.

Nimittäin tällainen vasta-aine yhdistettäessä näytteen kanssa, joka sisältää tällaisen determinanttikohdan omaavan 20 solun tai solufragmentin, sitoutuu tällaiseen determinantti-kohtaan ja estää keksinnön mukaisen vasta-aineen sitoutumisen tähän kohtaan. Lisäksi koska keksinnön mukaisella antigeenillä voi olla enemmän kuin yksi determinanttikohta, keksintö sisältää monoklonaaliset vasta-aineet, jotka tunnis-25 tavat muutkin determinanttikohdat kuin ne determinanttikoh-·' dat, jotka edellä mainittu monoklonaalinen vasta-aine tun nistaa .

Keksintö sisältää L6-antigeenin diagnostisen käytön ihmisis-30 sä ja samankaltaisten antigeenien, kuten asialo-GalNAc-GMj:n ja asialo-GM2:n. Antigeeni voidaan puhdistaa tavanomaisin menetelmin kuten immunosaostuksella, kuten on kuvattu julkaisussa Young et ai., J. Exp. Med. (1979) 150:1008-1019.

35 Eräs menetelmä käsittää keuhkokudoksessa ja muussa ihmisku-doksessa olevan pahanlaatuisen tilan määrittämisen tutkimalla, onko kudoksessa glykolipidiantigeeniä, jolla on L6-anti-geenin tai ganglio-N-triosyyliseramidin ominaisuudet. Termillä "pahanlaatuinen tila" tarkoitetaan kasvuhäiriöisten

II

94291 7 solujen läsnäoloa mukaan lukien syöpäsolut in situ, neoplas-tiset, pahanlaatuiset tai kasvainsolut tai senkaltaiset. Termillä "on samanlaiset ominaisuudet" tarkoitetaan, että antigeeni reagoi vasta-aineen kanssa, joka tunnistaa L6-an-5 tigeenin tai vastaavanlaisen antigeenin, kuten asialo-Gal-NAc-GM^n tai asialo-GM^n. Esimerkiksi näyte voidaan saattaa kosketuksiin tai yhdistää keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, kuten L6-vasta-aine tai vasta-aine, jolla on samanlaiset ominaisuudet kuin niillä, jotka on ku-10 vattu julkaisussa Young et ai., supra, tai Kniep, et ai., supra. Yhteensaattaminen suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, joissa vasta-aine sitoutuu pahanlaatuisiin soluihin. Yh-teensaattamisen jälkeen havaitaan, onko vasta-ainetta sitoutunut pahanlaatuisiin soluihin näytteessä eli näytteestä et-15 sitään vasta-aineen ja antigeenikohdan immuunikompleksia. Tämä immuunikompleksin muodostuminen on verrannollinen pahanlaatuisten solujen esiintymiseen näytteessä.

Erityinen esimerkki, kuvaavana eikä rajoittavana, on mene-20 telmä kasvainsolujen määrittämiseksi irtileikatusta kudoksesta. Edellä mainittua menetelmää sovelletaan näytteeseen, joka on palanen kasvaimen poiston jälkeen saatua kasvainta. Irtileikattua kasvainta käsitellään kappaleiden saamiseksi, joka käsittely ensin käsittää kasvaimen tai kudoksen jäädyt -25 tämisen, tavallisesti jäädyttämisen välittömästi irtileik-kaamisen jälkeen. Sitten jäädytetty kudoskerros leikataan kappaleiksi käyttäen esim. kryostaattia.

Edellä kuvatulla tavalla saatu kasvainkappale saatetaan yh-30 teyteen keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja sitten tätä monoklonaalista vasta-ainetta vastaan suunnataan toinen vasta-aine, joka on leimattu havaittavalla leimalla.

35 Irtileikattu näyte, esim. kasvaimen kappale, saatetaan yhteyteen ensimmäisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa olosuhteissa, joissa vasta-aine sitoutuu pahanlaatuisiin soluihin. Inkubointi suoritetaan yleensä vesipitoisessa väliaineessa, kuten esim. fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, 94291 8 joka sisältää pieniä määriä natriumatsidia, sopivassa säiliössä, kuten esim. lasisessa petri-maljassa, noin 15-30 min ajan lämpötilassa noin 20-30°C. Käytetyn vasta-aineen määrä on yleensä riittävä havaittavan sitoutumisen aikaansaamisek-5 si, so. havaittavan määrän immuunikomplekseja aikaansaamiseksi vasta-aineen ja kyseessä olevan determinantin tai antigeenisen kohdan välillä.

Inkuboinnin jälkeen kappale pestään ei-spesifisesti sitoutu-10 neen vasta-aineen vähentämiseksi tai poistamiseksi ja sitten se tutkitaan edellä mainittujen kompleksien havaitsemiseksi, jotka muodostuvat monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuessa näytteen soluihin, jotka omaavat antigeenisiä kohtia. Sitoutuminen on verrannollinen kappaleessa olevien pahanlaatuis-15 ten solujen läsnäoloon. Tämän mukaisesti sitoutuminen määritetään esimerkiksi saattamalla näyte yhteyteen leimatun monoklonaalisen vasta-aineelle spesifisen sitoutumisosapuo-len kanssa. Leima kykenee tuottamaan havaittavan signaalin ja voi olla radioaktiivinen leima, kromofori, kuten fluore-20 soiva aine, entsyymi tai senkaltainen.

Esimerkki tekniikasta, jossa käytetään edellä mainittua lähestymistapaa, on immunofluoresoiva värjäys. Tässä menetelmässä kasvaimen jäädytetyt kappaleet kiinnitetään lasilevyl-25 le asetonilla ja inkuboidaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, esim. petri-maljassa. Sen jälkeen kun on pesty sopivalla puskurilla, kuten esim. fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, kappale asetetaan petrimaljaan ja saatetaan kosketuksiin leimatulle monoklonaaliselle vasta-aineelle spesi-30 fisen sitoutumisosapuolen kanssa, joka voi olla esim. käytetylle monoklonaaliselle vasta-aineelle spesifinen leimattu vasta-aine. Koska useimmissa tapauksissa monoklonaalinen vasta-aine on saatu hiirilähteestä, voidaan käyttää leimattua anti-hiiri-immunoglobuliinia, joka on spesifinen mono-35 klonaaliselle vasta-aineelle. Tällaisia immunoglobuliineja voidaan tuottaa tavanomaisin menetelmin ruiskuttamalla sopivaan isäntään hiiren vasta-ainetta, odottamalla sopiva aika ja keräämällä anti-hiiri-immunoglobuliini injektoidun isännän verestä.

il 94291 9

Kun levy on pesty toisen kerran esim. vesipitoisella puskurilla, kappaleet voidaan peittää fluoresoivalla vasta-aineen kiinnittävällä nesteellä ja päällyslevyllä ja tutkia sitten fluoresenssimikroskoopilla monoklonaalisen vasta-aineen si-5 toutumisen määrittämiseksi kappaleeseen. Sitoutumisen määrittäminen voi myös sisältää tällaisen sitoutumispaikan identifioimisen näytteestä.

Monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuminen näytteeseen voi-10 daan myös määrittää käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta, joka on sidottu kovalenttisesti leimaan, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin, kuten radioaktiiviseen osaseen, kromoforiin, joka sisältää väri- ja fluoresoivat aineet, tai entsyymiin. Vasta-ainetta kohden käytettävien 15 leimojen määrä määräytyy yleensä sen diagnostisen menetelmän vaatimusten mukaan, jossa leimattua vasta-ainetta käytetään ja paikkojen mukaan, jotka ovat käytettävissä leiman yhdistämiseksi vasta-aineeseen.

20 Aikaisemmasta tekniikasta tunnetaan menetelmiä leimojen kon-jugoimiseksi vasta-aineisiin ja vasta-aineen fragmentteihin. Tällaisia menetelmiä on esitetty US-patenteissa 4 220 450, 4 235 869, 3 935 074 ja 3 996 345.

25 Toinen esimerkki tekniikasta, jossa keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää, on immunoperoksi-daasileimaus (Sternberger, Immunocytochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1979, s. 104-169, jota on modifioinut Garri-ques et ai., Int. J. Cancer (1982) 29.:511-515). Testattava 30 kudos kiinnitetään sopivalla liuottimena, kuten asetonilla, kantajalle, kuten lasilevylle. Seuraavaksi kudosta inkuboi-• daan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja pestään sitten vapaaksi sitoutumattomasta vasta-aineesta. Sitten kudosta inkuboidaan jäniksen anti-hiiri-IGG:llä, pestään sitoutumat-35 toman vasta-aineen poistamiseksi, yhdistetään hiiren perok-sidaasi-antiperoksidaasi-kompleksin kanssa, pestään sitoutumattoman konjugaatin poistamiseksi ja käsitellään sitten entsyymin substraatilla. Tämän käsittelyn jälkeen levyä tutkitaan signaalin havaitsemiseksi.

94291 10

Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää menetelmässä pahanlaatuisen tilan olemassaolon määrittämiseksi, esimerkiksi tutkittaessa keuhkosta irtoavaa solunäytettä, kuten ysköstä, tai kohdunkaulan preparaattia. Termillä "irtoava" 5 tarkoitetaan, että näyte käsittää erillisiä soluja tai solu-rykelmiä, joita saadaan raapimalla tai pesemällä kudoksen pintaa, jotka solut irtoavat erillisinä tai ryhminä tai kerroksina. Irtoava solunäyte tulee erottaa irtileikatusta kudoksesta, kuten biopsialla, saadusta. Yhteensaattaminen 10 näytteen ja vasta-aineen kanssa suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, että vasta-aine sitoutuu antigeenikohtaan. Yh-teensaattamisen jälkeen määritetään, onko vasta-aine sitoutunut antigeeniseen kohtaan vai ei, ja tämä on verrannollinen pahanlaatuisen tilan olemassaoloon keuhkossa.

15

Keuhkossa olevan pahanlaatuisen kasvaimen olemassaolon määrittämiseksi saataisiin ysköksestä menetelmässä käytettävä irtoava solunäyte. Menetelmä voi olla käyttökelpoinen määritettäessä pahanlaatuista tilaa hengitysteistä mukaan lukien 20 oraalinen nielu, suu jne. irtoavissa solunäytteissä ja ruuansulatuskanavan alueelta.

Seuraavaksi irtoava solunäyte saatetaan kosketuksiin edellä mainittujen vasta-aineiden kanssa sellaisissa olosuhteissa, 25 että vasta-aine sitoutuu spesifisiin antigeenisiin kohtiin : näytteessä muodostaen antigeeni-vasta-aine-komplekseja. Tämä antigeeninen kohta voi olla läsnä näytteen soluissa tai so-lufragmenteissa. Yleensä näyte asetetaan sopivalle kantajalle, kuten esimerkiksi objektilevylle, yleensä lasiselle, tai 30 jotain sopivaa materiaalia olevalle. Irtoava solunäyte levitetään yleensä levylle ohuen kerroksen aikaansaamiseksi .· näytteestä levyn pinnalle. Näytteen ja vasta-aineen välinen kontakti suoritetaan yleensä vesipitoisessa puskuroidussa väliaineessa. Puskurit, joita voidaan käyttää, ovat fosfaat-35 ti, tris, bikarbonaati jne. pH-arvo riippuu näytteen luonteesta ja vasta-aineesta, ja on yleensä alueella noin 5-8. Vesipitoinen väliaine voi lisäksi sisältää orgaanisia polymeerisiä liuottimia määrissä noin 0-40 %. Orgaaniset polaa-

II

94291 11 riset liuottimet ovat vesiliukoisia ja yleensä niillä on noin 1-10 hiiliatomia ja noin 1-4 happiatomia. Vasta-ainetta on läsnä vesipitoisessa väliaineessa pitoisuutena noin 1-100 μg/ml, edullisesti noin 10-20 μg/ml. Lämpötila näytteen ja 5 vasta-aineen kontaktin aikana on yleensä noin 4-40°C, edullisesti noin 10-30°C. Kontaktiaika on yleensä noin 15-120 min, edullisesti noin 30-60 min.

Näytteen ja vasta-aineen kosketusajän jälkeen kantajaa 10 yleensä käsitellään reagoimattoman vasta-aineen poistamiseksi. Tavallisesti tämä suoritetaan pesemällä kantaja vesipitoisella, yleensä puskuroidulla väliaineella. Yleensä pesu-liuoksen määrä tulisi olla riittävä poistamaan reagoimaton vasta-aine.

15

Seuraavaksi havaitaan vasta-aineen sitoutuminen näytteen antigeenisiin kohtiin, joka sitoutuminen on verrannollinen pahanlaatuisen tilan olemassaoloon kohteissa, eli näyte tutkitaan sen määrittämiseksi, kuinka monta antigeeni-vasta-20 aine(immuuni)-kompleksia on muodostunut. On huomattava, että joissain tapauksissa hyvin pieniä määriä kyseessä olevia antigeenisiä kohtia esiintyy irtoavassa solunäytteessä. Kuitenkin pahanlaatuisissa tiloissa antigeenisiä kohtia on läsnä suurissa määrissä ja tämä viimeksi mainittu tila on hel-25 posti erotettavissa tällä menetelmällä ei-pahanlaatuisista tiloista, koska voidaan mitata suuri määrä antigeeni-vasta-aine -komplekseja pahanlaatuisen tilan esiintyessä. Sitoutumisen määrittämiseksi analyysisysteemiin on sisällytetty keinot havaittavan signaalin aikaansaamiseksi. Esimerkiksi 30 käytettävä vasta-aine voidaan konjugoida analyysissä leimaan, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Leima voi olla radioaktiivinen osanen, kromofori, joka käsittää väri- ja fluoresoivat aineet, entsyymi tai senkaltainen. Vasta-aineeseen käytettävien leimojen määrä määritetään me-35 netelmän vaatimusten mukaan ja niiden paikkojen mukaan, jotka ovat käytettävissä leiman sitomiseksi vasta-aineeseen.

94291 12

Vaihtoehtoisesti voidaan pesty levy saattaa yhteyteen leimatun spesifisen vasta-aineen sitoutumisosapuolen kanssa, joka voi olla esimerkiksi leimattu, käytetylle vasta-aineelle spesifinen vasta-aine. Kun monoklonaalinen vasta-aine on 5 johdettu hiirilähteestä, voidaan käyttää leimattua anti- hiiri-immunoglobuliinia, joka on spesifinen käytettyä vasta-ainetta kohtaan. Tällaisia immunoglobuliineja voidaan tuottaa tavanomaisten menetelmien mukaisesti injektoimalla sopivaan isäntään monoklonaalista vasta-ainetta, odottamalla 10 sopiva aika ja keräämällä anti-hiiri-immunoglobuliinit injektoidun isännän verestä. Käytettäessä leimattua spesifistä vasta-aineen sitoutumisosapuolta levy täytyy pestä jälleen vesipitoisella väliaineella ennen kuin tutkitaan levyn fluoresenssi. Keksintö sisältää myös anti-idiotyyppiset vasta-15 aineet, jotka on valmistettu L6-vasta-ainetta vastaan; voidaan valmistaa sellaisia vasta-aineita, joilla on samantyyppiset ominaisuudet kuin vastaavilla kasvainantigeeneillä (Nepom et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. 81:2864).

20 Vasta-aineen ja solunäytteen välisen sitoutumisen läsnäolon määrittämiseksi, kun on käytetty fluoresoivaa leimaa, voidaan levystä tutkia fluoresenssi, yleensä käyttäen fluore-senssimikroskooppia. Käytettäessä jotakin muuta leimaa kuin fluoresoivaa voidaan tutkia levyltä tai näytteestä sakan 25 muodostuminen, väri tai jokin muu sellainen.

Edellä oleva kuvaus kohdistuu ensisijaisesti keksinnön mukaisten vasta-aineiden käyttöön immunofluoresenssimenetel-missä. Kuitenkin keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan 30 käyttää useimmissa analyyseissä, jotka sisältävät antigeeni-vasta-aine-reaktioita. Analyysit voivat olla homogeenisiä tai heterogeenisiä. Homogeenisessä analyysissä näyte voi olla biologinen neste, kuten seerumi, virtsa ja niiden kaltaiset, tai näyte voi olla hajotettu ja kirkastettu hajo-35 amistuotteet poistamalla. Yleensä immunologinen reaktio käsittää spesifisen vasta-aineen, leimatun analyytin ja kiinnostuksen kohteena olevan näytteen. Leimasta lähtevä signaali on muodostettu, suorasti tai epäsuorasti, sitomalla vas- 94291 13 ta-aine leimattuun analyyttiin. Sekä immunologinen reaktio että sen määrän havaitseminen suoritetaan homogeenisessä liuoksessa. Immunokernikaalisia leimoja, joita voidaan käyttää, ovat vapaat radikaalit, fluoresoivat väriaineet, ent-5 syymit, bakteriofagit, koentsyymit jne.

Heterogeenisessä analyysissä reagenssit ovat yleensä näyte, spesifinen vasta-aine ja välineet havaittavan signaalin tuottamiseksi. Näyte asetetaan yleensä kantajalle, kuten 10 levylle tai objektilasille, ja saatetaan kosketuksiin vasta-aineen kanssa nestemäisessä faasissa. Sitten kantaja erotetaan nestemäisestä faasista ja joko kantajafaasi tai nestemäinen faasi tutkitaan signaalin havaitsemiseksi käyttäen välineitä, jotka saavat aikaan tällaisen signaalin. Signaali 15 on verrannollinen näytteessä olevan analyytin läsnäoloon.

Välineinä, joilla voidaan saada aikaan havaittava signaali, käytetään radioaktiivisia leimoja, fluoresoivia aineita, entsyymejä jne. Esimerkkejä heterogeenisistä immunoanalyy-seistä ovat radioimmunoanalyysi, immunofluoresoiva menetel-20 mä, entsyymisidottu immunoanalyysi ja senkaltaiset.

Edellä mainittuja immunoanalyysimenetelmiä on kuvattu yksityiskohtaisemmin seuraavassa julkaisussa: "Enzyme - Immunoassay", Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, 25 Florida, 1980. Katso myös esimerkiksi US-patentit 3 690 834, j 3 791 932, 3 817 837, 3 850 578, 3 853 987, 3 867 517, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345 ja 4 098 876, jonka luettelon ei ole tarkoitus olla kaiken kattava.

30 Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan myös käyttää meta-staattisten esiintymien ilmaisemiseen ihmispotilaista, joilla on NSCLC, samalla tavalla kuin on kuvattu pahanlaatuiselle melanoomalle julkaisussa J. Nucl. Med. (1983) 24:123-129 ja julkaisussa J. Clin. Invest. (1983) 72:2101-2114. Vasta-35 aine tai sen fragmentit on radioleimattu ja annosteltu suonensisäisesti potilaalle, jota kuvataan jatkuvasti käyttäen esimerkiksi gamma-kameraa tai senkaltaista. Tutkimukset, jotka on suoritettu siirtämällä vierasta ihmisen keuhko- 3 4291 14 [ syöpäsolukkoa kateenkorvattomaan, "paljaaseen" hiireen, ovat osoittaneet, että ,3,I-leimatut Fab-fragmentit, jotka on valmistettu L6:sta, lokalisoituvat selektiivisesti siirrettyyn kasvaimeen. Tämä osoittaa melanoomille aikaisemmin suoritet-5 tujen tutkimusten perusteella (J. Nucl. Med. (1983) 24:123-129; J. Clin. Invest. (1983) 72:2101-2114, että L6:n ja L6:sta valmistettujen vasta-ainefragmenttien kasvainselek-tiivinen lokalisoituminen todennäköisesti seuraa injektiota ihmispotilaisiin.

10

Keksinnön piiriin kuuluu myös diagnostinen määritysväline-sarja edellä kuvattujen menetelmien suorittamiseksi. Eräässä suoritusmuodossa diagnostinen määritysvälinesarja käsittää (a) monoklonaalisen vasta-aineen, joka on tarkemmin kuvattu 15 edellä, ja (b) spesifisen sitoutumisosapuolen konjugaatin edellä mainitulle monoklonaaliselle vasta-aineelle, ja leiman, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Reagens-sit voivat myös sisältää lisäaineita, kuten puskuriaineita ja proteiineja stabiloivia aineita, esim. polysakkarideja ja 20 senkaltaisia. Diagnostinen määritysvälinesarja voi edelleen sisältää, mikäli tarpeen, muita signaalin tuottavan systeemin osasia, jossa systeemissä leima on osana, aineita taustahäi-riöiden vähentämiseksi kokeessa, kontrollireagensseja, laitteistoja testin suorittamiseksi ja senkaltaisia. Toisessa 25 suoritusmuodossa diagnostinen määritysvälinesarja käsittää ·; keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen ja leiman konjugaatin, joka leima kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. Edellä mainittuja lisäaineita voi myös olla läsnä.

30 Keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet tunnistavat myös antigeenien determinanttikohdat, jotka liittyvät muihin ·< syöpäkasvaimiin, kuten rintasyöpäkasvaimiin. Tämän seurauk sena esillä olevia vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisissa tuotteissa, jotka on suunnattu tällaisia syöpäkasvai-35 mia vastaan.

Keksinnön olennaiset tunnuspiirteet on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

I! 94291 15

Esimerkit

Keksintöä kuvataan edelleen seuraavilla valaisevilla esimerkeillä. Aluksi kuvataan muutamia käytettyjä menetelmiä.

5 Immunohistologinen menetelmä Jäädytettyjen kappaleiden immunohistologisia kokeiluja varten käytettiin Sternbergerin leimaamatonta vasta-aine-menetelmää, joka on kuvattu julkaisussa Immunochemistry,

John Wiley & Sons, New York, 1979, s. 104-169, modifioituna 10 Garrigues et ai. tapaan julkaisussa Int. J. Cancer (1982) 29:511-515. Kohdekudokset näitä kokeita varten saatiin kirurgisesti ja ne jäädytetiin 4 h sisällä poistamisesta iso-pentaaniin, joka oli esijäähdytetty nestemäisellä typellä. Sitten kudokset varastoitiin nestemäiseen typpeen tai 15 -70°C:een käyttöön saakka. Jäniksen anti-hiiri-IgG:tä (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) käytettiin laimennoksena 1/50. Hiiren peroksidaasi-anti-peroksidaasikompleksia (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.), joka sisältää 2 mg/ml erityisesti puhdistettua 20 PAPrtä, käytettiin laimennoksena 1/80. Jäädytetyt kappaleet preparoitiin, kuivattiin, käsiteltiin asetonilla ja kuivattiin (Garriques et ai., 1982). Histologiseen arviointiin käytettävät kappaleet värjättiin hematoksyliinillä. Epäspesifisen taustan vähentämiseksi kappaleita esi-inkuboitiin 25 tavallisen ihmisseerumin kanssa laimennettuna 1/5 (Garroques et ai., 1982). Hiiren vasta-aineet, vuohen anti-hiiri-IgG ja hiiren PAP laimennettiin liuoksella, jossa oli 10 % tavallista ihmisen seerumia ja 3 % jäniksen seerumia.

30 Värjäysmenetelmä käsitti kappalesarjän käsittelemisen joko spesifisellä tai kontrollivasta-aineella 2,5 h, inkuboimisen 30 min jäniksen anti-hiiri-IgG:n kanssa laimennoksena 1/50, ja altistamalla 30 min ajan hiiren PAP-kompleksille laimennettuna 1/80. Jokaisen vasta-aineen käsittelyn jälkeen ob-35 jektilevyt pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Immunohistokemiallista reaktiota kehitettiin juuri valmistetulla 0,05-%:isella 3,3'-diaminobentsi-diini-tetrahydrokloridilla (Sigma, St. Louis, MO) ja 94291 16

0,01-%:isella vetyperoksidilla 0,05 M tris-puskurissa, pH

7,6 8 min ajan. Lisäaltistaminen l-%:iselle 0s04-liuokselle tislatussa vedessä 20 min ajan syvensi väriä. Kappaleet huuhdeltiin vedellä, dehydrattiin alkoholilla, kirkastettiin 5 ksyleenillä ja kiinnitettiin objektilevyihin.

Jokainen objektilevy koodattiin ja koodatut näytteet tutkittiin käyttäen puolueettomia tutkijoita. Tyypilliset objekti-levyt valokuvattiin käyttäen erotusinterferenssikontrasti-10 optiikkaa (Zeiss-Nomarski). Vasta-aineen värjäytymisaste arvioitiin 0:ksi (ei reaktiivisuutta), + (vähän positiivisia soluja), ++ ainakin yksi kolmasosa soluista positiivisia), +++ (useimmat solut positiivisia), ++++ (lähes kaikki solut vahvasti positiivisia). Koska erot värjäytymisessä + ja 0 15 välillä olivat vähemmän selviä kuin ++- ja +-värjäytymisen välillä, päätettiin laskea positiiviseksi värjäysaste, joka oli ++ tai suurempi. Kasvainnäytteistä tarkasteltiin sekä neoplastisia että peruskudossoluja; havaittua värjäytymistä verrattiin kasvainsolujen värjäytymiseen, koska peruskudos-20 solut eivät värjäytyneet lainkaan tai värjäytyivät heikommin kuin kasvainsolut.

Antigeenien sijainnin määrittäminen

Antigeenien solunalainen sijainti määritettiin mittaamalla 25 vasta-aineen sitoutuminen soluihin ennen tai jälkeen per-meabilisoinnin ei-ionisella detergentillä. Vasta-aineet, jotka sitoutuivat vahingoittumattomien viljeltyjen solujen pintaan, tunnistettiin joko suoralla sitoutumisanalyysillä käyttäen I25I-leimattua vasta-ainetta (Brown et ai., Proc.

30 Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1981) 28:539-543) tai epäsuoralla fluoresenssilla käyttäen (FACS) II-solulajittelijaa. Vasta-aineet, jotka sitoutuivat solun sisäisiin paikkoihin, määritettiin 125I-leimatun vasta-aineen suorana sitoutumisena soluihin, minkä jälkeen ne kiinnitettiin paraformaldehydillä 35 ja edelleen permeabilisoitiin ei-ionisella detergentillä NP-40.

94291 17

Sitoutumisanalyysit a) Sitoutumisnanalyysejä varten, jotka suoritettiin käyttäen radioleimattuja vasta-aineita (Brown et ai., supra), inku-boitiin viljeltyjä soluja (106) 4°C:ssa 30 min 106 cpm:n 5 kanssa 125I-leimattua vasta-ainetta 100 μΐ-.ssa lämpöaktivoitua (30 min, 56°C:ssa) vasikan sikiön seerumia viljelyalustalla. Sen jälkeen kun oli lisätty 5 ml PBS:ää, solut pelletoitiin sentrifugoimalla 10 min 250 x g. Supernatantti imettiin pois ja pelletistä mitattiin 125I. Ei-spesifisen sitoutumisen mit-10 taamiseksi suoritettiin samanaikaisia inkubointeja käyttäen 10 μg leimaamatonta vasta-ainetta kilpailijana (Brown et ai., supra). Joissakin tapauksissa sitoutumisanalyysit suoritettiin analogisella tavalla käyttäen muovisiin viljely-maljoihin kiinnitettyä solukerrosta.

15 b) Sitoutumisanalyysejä varten, jotka suoritettiin FACS II-solulajittelijalla, solut poistettiin substraatista käyttäen PBS:ää, joka sisälsi 5 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA). Näytteitä, jotka sisälsivät 1 x 105 solua, inkuboi- 20 tiin ensin monoklonaalisen vasta-aineen kanssa konsentraa-tiossa 2 μg/ml ja sitten fluoreseiini-sidotun vuohen anti-hiiri -vasta-aineen kanssa laimennoksena 1:200. Sitten solut pestiin ja suspendoitiin uudestaan kasvualustaan. Välittömästi ennen FACS-analyysiä lisättiin propidiumjodidia lopul-25 liseen pitoisuuteen 1 μg/ml kuolleiden solujen värjäämisek-• si. FACS-analyysin aikana solut, jotka emittoivat punaista fluoresenssia, suljettiin pois elektronisesti siten, että ainoastaan elävät solut havaittiin. Sitten jokaiselle vasta-aineelle määritettiin fluoreseiinin fluoresenssin keskimää-30 räinen intensiteetti. Negatiiviset kontrollit käsittivät näytteitä, joista monoklonaalinen vasta-aine oli jätetty pois; positiiviset kontrollit käsittivät monoklonaalisia vasta-aineita antigeenejä vastaan, jotka olivat histakompa-tibilistä HLA-tyyppiä 1. Värjäys katsottiin positiiviseksi, 35 mikäli keskimääräinen kanavan fluoreseiini oli vähintään 3 kertaa taustan suuruinen.

94291 18

Proteiiniantigeenien määrittäminen

Proteiiniantigeenien tunnistamista varten keuhkosyöpäkas-vainsolujen pinta radiojodattiin tai leimattiin metaboli-sesti 33S-metioniinilla. Antigeenit eristettiin solulysaa-5 teista inkuboimalla monoklonaalisen vasta-aineen kanssa lisäämällä vuohen anti-hiiri-IgG:tä ja adsorboimalla S. au-reukseen. Immunosaostumat pestiin ja analysoitiin natrium-dodekyylisulfaattipolyakryyligeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) (10-20 % akryyliamidia), kuten on kuvattu (Brown et 10 ai., supra) .

Vasta-aineiden reaktiivisuuden määrittäminen glykolipidejä kohtaan_

Vasta-aineiden reaktiivisuus glykolipidiantigeenejä kohtaan 15 testattiin inkuboimalla vasta-aineita puhdistettujen glyko-lipidien kanssa, jotka oli adsorboitu mikrotestilevyn kuoppiin (kolesterolin ja lesitiinin kanssa) sekä ohut kerros kromatografialevyjen kanssa, joille glykolipidit oli fraktioitu. Sitoutunut vasta-aine määritettiin inkuboimalla hiiren 20 immunoglobuliini antiseerumin ja radiojodatun proteiini A:n kanssa.

Isotyyppimääritvs a) Ouchterlony-immunodiffuusio 25 \ Supernatantin alikvootti erityisiä hybridoomasoluja laitet tiin 2-%:isen agarlevyn keskikuoppaan. Monospesifisiä jäniksen antihiiri-Ig-isotyyppisiä vasta-aineita (Melody) asetettiin ulommaisiin kuoppiin ja maljaa inkuboitiin 2 h ajan 30 huoneen lämpötilassa yli yön 4°C:ssa.

, b) Taipuisia 96 kuoppaa sisältäviä polyvinyylikloridilevyjä (Costar) päällystettiin 0,1 mg/ml:lla vuohen anti-hiiri-Ig-vasta-aineella 2 h ajan 37°C:ssa ja päällystettiin vielä 35 3-%:isella BSA-liuoksella 2 h 37°C:ssa. Hybridoomasuper- natanttia inkuboitiin sitten 37°C:ssa 2 h ajan. Pesun jälkeen PBS-naudan seerumialbumiinilla (BSA) levyjä inkuboitiin 37°C:Ssa 2 h ajan monospesifisten jäniksen anti-hiiri-Ig- 94291 19 isotyyppiä olevien vasta-aineiden kanssa, jotka oli sidottu peroksidaasiin (Zymed). Pesun jälkeen levyä inkuboitiin 1 mg/ml:ssa ortofenyleenidiamiinilla ja 0,03:isella H202:lla, 1 M sitraattipuskurissa, pH 4,5. Optinen tiheys 630 nm:ssä 5 määritettiin Dynatec ELISA-levyn lukijalla.

Stafylokokkisen proteiini A:n sitoutumisanalyysi Mikrotiitterilevyn kuoppia inkuboitiin 5-%:isella MCS:llä PBSrssä sekä 0,02-%:isella NaN3:lla ja supernatantit imettiin 10 pois. Jokaiseen kuoppaan lisättiin 25 μΐ kasvainsolujen suspensiota (2 x 107 solua/ml) ja inkuboitiin 25 μ1:η kanssa nimenomaista vasta-ainetta 1 h ajan huoneen lämpötilassa. Levyjä sentrifugoitiin 1200 kierr/min 7 min ajan, pestiin kahdesti 50-%:isella NCS/PBS/NaN3:11a ja lisättiin 25 μΐ 125I-15 stafylokokkista proteiini A:ta (noin 50 000 cpm/25 μΐ). Levyjä inkuboitiin 1 h ajan 25°C:ssa, pestiin kahdesti 5-%:isella NCS/PBS/NaN3:lla ja kuivattiin. Kuoppien pohjat leikattiin irti ja mitattiin gammalaskijalla.

20 Esimerkki

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen Monoklonaalisia vasta-aineita tuotettiin immunisoimalla 3 kuukautta vanhoja BALB/c-hiiriä yhdellä ihmiskudoksella neljästä eri lähteestä: (1) keuhkopussin nestepurkaumat, jotka 25 oli saatu potilaista, joilla on metastaattinen ei-pienisoluinen keuhkosyöpäkasvain, (2) viljellyt solut ei-pienisoluisesta keuhkosyöpäkasvaimesta ja (3) 3-4 kk vanhojen ih-missikiöiden keuhkokudos. Immunisointi suoritettiin injektoimalla hiiret vatsakalvon sisäisesti 3-4 kertaa noin 107 30 soluilla. Kolme päivää viimeisen immunisoinnin jälkeen pernat poistettiin, suspendoitiin kasvualustaan ja fuusioitiin NS1-hiiren myeloomasolujen kanssa (Köhler ja Millstein, supra) . Seoksia siirrostettiin alhaisen tiheyden omaavien viljelmien aikaansaamiseksi, jotka olivat lähtöisin yksinker-35 täisistä fuusioituneista soluista (klooneista): hybridi- soinnissa käytettyä tekniikkaa on aikaisemmin kuvannut Yeh, et ai., Int. J. Cancer (1979) 29:269-275.

94291 20

Hybridisolujen supernatantit seulottiin käyttäen sekä ELISA-analyysiä että autoradiografista epäsuoraa l25I-leimattua proteiini A -analyysiä (Brown et ai., J. Immunol. Meth. (1979) 31:201-209) immunisointiin käytettyjä kasvainuutteita vas-5 taan, jotka sisälsivät mm. solumembraaneja. Nämä uutteet valmistettiin käyttäen menetelmää, jota ovat modifioineet Colcher et ai.. Cancer Res., (1981) 42:1451-1459; Yeh et ai., supra. Tätä varten seokset pestiin PBSillä ja suspen-doitiin, mikä tehtiin vahingoittumattomille kasvaimille pu-10 ristamalla ne läpi ruostumatonta terästä olevan sihdin. Tämän jälkeen lisättiin 1 mM NaHC03:a, joka sisältää 1 mM fe-nyyli-metyylisulfonyylifluoridia (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA) , ja sitten materiaali homogenisoitiin jäissä 50 Dounce-homogenisaattorin B-survimen työnnöllä. 15 min 15 sentrifugoinnin jälkeen 27 000 x g:ssä supernatantti poistettiin ja pelletti suspendoitiin uudestaan PBSrään, pidettiin 1 min ajan ultraäänihauteessa ja varastoitiin -70°C:een.

20 Hybridoomat, jotka tuottivat solukalvon uutteisiin sitoutuvia vasta-aineita, kloonattiin, kasvatettiin in vitro, ja ne testattiin edelleen vasta-ainespesifisyytensä suhteen. Tämä testaus suoritettiin käyttäen edellä kuvattua immunohistolo-gista menetelmää, jossa testattiin vasta-aineiden kykyä si-25 toutua jäädytettyihin keuhkosyöpäkasvaimen kappaleisiin, .· muihin kasvaimiin ja normaaleihin ihmiskudoksiin. Ne hybri doomat, jotka tuottivat ilmeistä spesifisyyttä omaavia vasta-aineita ihmisen keuhkosyöpää vastaan, kloonattiin uudestaan, kasvatettiin ja ruiskutettiin koskemattomiin valikoi-30 tuihin 3 kk vanhoihin BALB/c-hiiriin, joissa ne kasvoivat vesivatsakasvaimina. Vesivatsaan erittyvät vasta-aineet puh-* distettiin proteiini A-Sepharoseilla (Ey et ai., Immunoche- mistry (1978) 15:429) tai geelisuodattamalla Sephacryl S-300:11a. Puhdistettuja vasta-aineita käytettiin edelleen 35 karakterisointiin, joka sisälsi uusia spesifisyyskokeita immunohietologian suhteen, sitoutumisanalyysejä vahingoittumattomille soluille sen määräämiseksi, mitkä vasta-aineet

II

94291 21 sitoutuvat solupintaan, ja edellä kuvattuja radioimmunosak-kautumistestejä.

Monoklonaalista vasta-ainetta L6 tuotettiin vastaavasti hyb-5 ridoomasta, kuten edellä on kuvattu. Tämä vasta-aine omasi ne ominaisuudet, jotka on edellä tässä selityksessä kuvattu. Solulinja, jota merkitään L6, talletettiin ATCC:hen 6. joulukuuta 1984 ja sille annettiin talletusnumero HB 8677.

10 Esimerkki

Tiettyjen glykolipidien reaktiivisuus L6-vasta-aineen kanssa L6-vasta-aineen reaktiivisuuskokeet suoritettiin vakiomene-telmien mukaisesti, kuten on kuvannut Kannagi et ai., (1983) Cancer Research 43.:4997-5005 ja Nudelman et ai., (1982) J.

15 Biol. Chem. 257:12752-12756. Määrätyt glykolipidit analysoitiin reaktiivisuutensa suhteen L6-vasta-aineen kanssa.

TLC:llä erotetut glykolipidit immunovärjättiin vasta-aineella ja glykolipideille suoritettiin kiinteäfaasi-radioimmuno-analyysi, jotka glykolipidit oli kiinnitetty muovisten kuop-20 pien pintaan. Tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa i.

94291 22

Taulukko I

Rakenne Reaktiivisuus L6:n kanssa

Asialo GalNAc-GM,

GalNAcfil->4GalSl->3GalNAcSl->4GalSl->4GlcSl->lCer +++ 5 -

Ristireaktiot

Gg3 (asialo GM2)

GalNAcSl->4GalSl->4GlcSl->lCer ++

10 Gg4 (asialo GMJ

GalSl->3GalNAcSl->4GalSl->4GlcSl->lCer + x2 -glykolipidi

GalNAcSl->3GalSl->4GlcNAcSl->3GalSl->4GlcSl->lCer ± 15

Gb3 (CTH; pk-antigeeni)

Galal->4GalSl->4GlcSl->lCer

Globosidi (P-antigeeni) 20 GalNAcSl - >3Galoil - >4GalSl - >4GlcSl - >lCer

Paraglobosidi

GalBl->4G1cNAcSl->3GalSl->4GlcSl->lCer 25 5 muuta glykolipidirakennetta L6-vasta-aineet reagoivat spesifisesti asialo GalNAc-GM2:n ja asialo GM^n kanssa, vahvin reaktio havaittiin asialo GalNAc-GM,:n kanssa. Heikkoa reaktiivisuutta esiintyi gangliotetra-30 osyyliseramidin (asialo GM^ ja Xj-glykolipidin kanssa (rakenne esitetty taulukossa I). Globosidi, globotriaosyyli-: seramidi, laktosyyliseramidi, paraglobosidi (laktotetraosyy- liseramidi) , glykolipidit Lex- ja Ley-rakenteiden kanssa, ja gangliosidit ganglio- ja laktosarjan rakenteiden kanssa oli-35 vat kaikki negatiivisia. Tästä ilmenee sen tähden, että L6-vasta-aine tunnistaa seuraavan järjestyksen:

GalNAcSl->4GalSl->3GalNAcSl->4GalSl->R, jossa R on määrittelemätön hiilihydraatti.

Il 94291 23

Esimerkki

Spesifisyys testaamalla immunohistologialla eri kasvaimia vastaan_

Kudos Vasta-aine L6 5 Keuhkosyöpäkasvain Adeno 18/19 suomuinen 8/10 pienisoluinen 2/6 suurisoluinen 2/2

Rintasyöpäkasvain 13/16 10 Paksusuolisyöpäkasvain 9/9

Melanooma 1/4 "Muut kasvaimet" (sarkooma, jne.) 1/9

Keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti erityisesti viit-15 taamalla edellä oleviin suoritusmuotoihin. On kuitenkin ymmärrettävä, että voidaan suorittaa poikkeamia ja modifikaatioita keksinnön hengen ja piirin sisällä.

•'

Claims (7)

94291

1. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että sen antigeeninen sitoutumiskohta sitoutuu (a) hiilihydraattiantigeeniin, joka on ganglio-N-triosyy-5 liseramidin, jota merkitään asialo-GMj, kaltainen muttei identtinen sen kanssa ja joka on ihmisen ei-piensolu-keuh-kosyövän solun pintadeterminantti; ja (b) proteiiniantigeeniin, jonka molekyylipaino on noin 20 000 daltonia ja joka liittyy ihmisen ei-piensolu-keuh- 10 kosyöpään.

2. Monoklonaalinen vasta-aine ihmisen ei-piensolu-keuh-kosyövän antigeenejä vastaan, tunnettu siitä, että se tuotetaan hybridoomalla, jonka talletusnumero on ATCC HB8677. 15

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine käsittää sen Fab-, F(ab')2~ tai Fv-fragmentin.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on konjugoitu leimaan, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen monoklonaalinen vasta- .·; aine, tunnettu siitä, että leima on fluoresoiva aine, radioleima, kromofori tai entsyymi.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen monoklonaalinen vasta-30 aine, tunnettu siitä, että monoklonaalisen vasta-aineen fragmentti on konjugoitu leimaan, joka kykenee tuottamaan .>· havaittavan signaalin.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen monoklonaalinen vasta-35 aine, tunnettu siitä, että leima on fluoresoiva aine, radioleima, kromofori tai entsyymi. li 94291