KR910000956B1 - 인체의 비-소세포 폐암치료용 단클론의 항체 및 항원 - Google Patents

인체의 비-소세포 폐암치료용 단클론의 항체 및 항원 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
인체의 비-소세포 폐암치료용 단클론의 항체 및 항원
[발명의 상세한 설명]
인체의 폐암은 남자의 암에 의한 사망의 주 원인이 되며, 부인의 암에 의한 사망의 가장 빈번한 원인이 되는 유방암이 유발되는 과정이 된다(Cancer Facts and Figures, 1983).
이 질병은 예로서 유피피종(30%), 신암(35%), 대-세포 퇴행변화(15%) 및 소-세포퇴행변화(20%)와 같이 4개의 커다란 조직학적 형태로 분류된다. 폐암의 대부분의 경우는 화학요법이나 방사선요법으로는 치유가 불가능하다. 소세포폐암은 그 크기의 축소에 의하여 화학요법이나 방사선요법으로 차도가 생기지만, 완전히 치유되지는 않는다. 종양을 수술로 완전히 제거하는 것만이 유일한 효과적 요법으로 판명되었다. 그러나 불행히도 폐암환자중 진단시 완전하게 진단되는 종양을 가지는 환자는 30% 이하가 되며, 이중에서 3분의 1이하가 모든 종양을 수술로 완전히 제거한 뒤 5년 생존하였다. 이로 인하여 폐암을 조기 진단하여, 암의 확대된 정도를 정확하게 결정하고 보다 효과적인 요법을 취할 수 있게하는 방법이 절실히 요구된다.
이러한 모든 목적에 단클론의(monoclonal) 항체를 사용할 수 있다. 그러나, 정상성인의 조직에서 보다는 폐암조직에 보다 강력하게 표현하는 항원에 대한 항체를 발견하는 일이 선행조건이 된다. 종양세포군의 공지된 이성체, 동일한 항원분자에 대한 여러가지 결정인자의 존재, 진단의 표시물로서의 적합성에 관련되는 항원을 치료학적 표적에 비교할 때의 예상되는 차이점 및 동일한 항원에 대한 다른 항체의 생물학적 차이점의 견지에서 볼때, 다수의 상이한 항체가 필요하게 된다. 폐암항원에 대한 인체 단클론의 항체에 관하여 Sikora et al., Br.j.Cancer(1981) 43 : 696-700에 기술되어 있다. 인체 폐암의 여러형태에 대한 특이성을 증명하는 단클론의 항체에 관여하는 Cuttitta et al., Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A.(1981) 78 : 4591-4595에 기술되어 있다. 단클론의 항체에 의해서 정의되는 인체 폐선암에 관련되는 항원에 관하여는 Varki et al., Cancer Research(1984) 44 : 681-687에 기술되어 있다. 당지질 신경질-N-트리오실세르아미드(aliolo GM2)에 대한 쥐의 단클론의 항체에 관하여는 Young et al., J.Exp.Med.(1979) 150 : 1008에 기술되어 있다.
호지킨병 환자의 세포에 있는 무타액증(無唾液症) GM2의 표현은 Kniep et al., J.Immunol. (1983) 131 : 1591-1594에 기술되어 있다.
미국특허출원 제667,521호(1984변 11월 2일 출원)에는 인체의 비-소세포 폐암치료용의 어떤 단클론의 항체가 공개되어 있다.
사전에 정해진 특이성이 있는 항체를 분비하는 유합된 세포의 계속적인 배양에 관하여는 Kohler et al., Nature(1975) 265 : 495-497에 기술되어 있다.
본 발명은 인체의 비-소(非-小) 세포폐암(non-small cell lung carcinoma)(NSCLC)세포와 관련되는 당지질 항원의 결정인자 위치를 정하는 신규의 단클론의 항체에 관한 것이다. "NSCLC 세포"란 용어는 유표피암종세포, 선암세포 및 다세포의 퇴행변화된 암종세포를 포함한다. 또한 결정인자의 위치는 예로서 어떤 유방암과 같은 다른암의 항원에서 발견되어서 본 발명의 항체가 이러한 다른 암세포에도 결합한다. 본 발명의 단클론의 항체는 종양세포보다는 정상성인세포에 매우 적은 정도로 결합된다. 이 "매우 적은 정도로 결합한다"는 용어는 면역조직학적 기술로는 검출이 안된다는 것을 의미한다. 단클론의 항체는 쥐의 하이브리도마에 의해서 분리된다.
본 발명은 또한 인체 폐조직과 다른 인체조직의 악성조건의 유무를 결정하는 방법도 포함한다. 이 방법은 말단의 탄수화물 결합서열 : GalNAc β1-4Gal β1→3GalNAc β1→4Gal β1을 가지는 당지질 항원과 예로서 무타액증 GM2인 신경질-N-트리오실세르아미드와 같은 관련된 항원의 유무를 알기 위하여 조직을 시험하는 것을 포함한다.
예로서, 조직을 당지질 항원과 관련되는 세포의 결정인자 위치를 결정하는 항체와 접촉시킬 수 있으며, 이때의 당지질 항원은 상기한 말단의 탄수화물 결합서열이나 이러한 항체의 단편이나 관능의 등가증(等價症)을 가진다.
이와 같이, 본 발명은 본 발명의 단클론의 항체를 이용하는 특정의 진단방법에 관한 것이다. 이러한 진단방법중 하나는 이러한 세포를 포함하는 것으로 심증이 가는 피검물속에 NSCLC 세포의 유무를 결정하는 것을 포함한다. 피검물을 단클론의 항체와 접촉시키며, 이때 항체는 피검물속에 있을지도 모르는 이러한 세포를 다른형태의 세로와 식별해낼 수 있다. 이 접촉은 항체를 이러한 세포에 결합시키는 조건하에서 수행한다. 일반적으로, 피검물을 단클론의 항체용으로서 라벨을 붙인 특정의 결합상대물과 접촉시킨다.
이 라벨은 검출신호를 발생할 수 있다. 또 다른 진단방법은 적절하게 라벨이 붙여진(예로서 방사성 등위원소로서)항체나 항원단편을 종양에 집적하고 다음에 환자에게 주사하는 방법을 포함한다. 이 방법은 질병의 정도에 따른 암환자의 기(期)를 정하고 치료를 하기 위한 반응의 변화를 추적하는데 보다 나은 방법이 된다.
본 발명은 또한 치료학적응용에도 적용된다. 항체는 종양세포표면에 고농도로 표출되는 상기한 항원과 반응할 수 있다. 이것은 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 조정할 수 있다. 즉 이것은 인체 임파세포나 대식세포(大食細胞)의 존재하에 NSCLC 세포(및 어떤 다른 인체 암세포)를 죽일 수 있고 ; 이것은 인체보체(補體)를 활성화하여 예로서 인체혈청의 존재하에 NSCLC 세포를 죽일 수 있다. 이것은 화학요법 약물 및 방사성 동위원소를 포함하지만 이들에 국한되지는 않는, 항-종양효과를 가지는 각종 약품의 담체로서 사용될 수 있다.
본 발명은 인체의 NSCLC의 항원에 결합되는 신규의 항체 및 이러한 항체를 이용하는 진단학 및 치료학적 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단클론의 항체는 Kohler 및 Milstein의 표준기술에 의하여 제조할 수 있다. 예로서, 많은 삼출액(參出液)에서 취한 인체폐암세포 또는 인체 비-소세포의 폐암에서 취한 배양된 세포, 또는 정상적인 태아의 폐에서 취한 세포를 임뮤노겐으로서 사용한다. 이러한 세포를 쥐에 주입하고 충분한 시간이 지난뒤에 쥐를 잡아서 비장세포를 취한다. 일반적으로 폴리에틸렌글리콜의 존재하에서, 비장세포와 골수종세포 또는 임파종세포를 유합시켜서, 소요의 면역글로블린을 인코우드 하는 비장면역 세포 염색체를 비가동화 시킨다. 여기서 수득한 세포는 유합된 하이브리도마를 포함하며, HAT 배지와 같은 선택된 배지에서 성장시키며 살아남은 세포는 희석조건을 제한하는 용매내에서 성장시킨다. 이 세포를 예로서 미량적정 웰(well)과 같은 적합한 용기에서 성장시키고, 상충액에서 소요의 특수성을 가지는 단클론의 항체를 길러낸다. 단클론 항체의 수율을 상승시키는 기술로서는 세포를 수용하는 포유동물의 숙주의 복막동공으로 하이브리도마를 주입하여 복수중의 액체를 거둬들이는 것과 같은 여러가지 기술이 있다. 복막중의 액체에 단클론의 항체를 충분히 모들 수 없는 경우에는 숙주의 혈액에서 항체를 거둬들인다. 단클론의 항체를 분리하여 정제함으로써 다른 단백질 및 다른 오염물질로부터 단클론의 항체를 유지시키는데는 여러가지 통상적인 방법이 있다. (Kohler and Milstein, supra 참조).
본 발명에 따른 하나의 단클론의 항체는 L6으로 지칭된다. 이것은 인체 NSCLC 및 어떤 다른 인체 암에서 취한 세포의 특성으로 판명된 세포표면 당지질 항원으로 정의된다. 몇개의 공지된 당지질과 L6 항체와의 교차반응(交差反應)과 무타액증 GalNAc-GM1과 L6항체와의 반응성을 기초로하여 본인들이 결론을 내린것은 L6 당지질 항원이 다음의 말단 결합서열을 가진다는 것이다 : GalNAc β1→4Gal β1→3GalNAc β1→4Gal β1→R 여기서 R는 아직까지 정의되지 않은 탄수화물이다. 상기한 항원의 특별히 신규 특징은 이것이 시알산 잔기가 없으며 지금까지는 인체조직과 관련되는 것으로 알려지지 않았다.
상기한 말단결합서열의 시알로실(sialosyl) 유도체는 Svennerholm et al., (1973) J.Biol.Chem.248 : 740-742 및 Iwamori et al., (1978) J.Biochem.84 : 1601에 기술되어 있다. 더우기, 상기한 결합서열의 시일산 유도체는 또한 Donald et al., (1984) Biochem. Soc. Trans. 12 : 596-599와 Blanchard et al., (1983) J.Biol.Chem.258-7691-7695에 의해서 혈액 그룹의 Sd항원으로 인정되었다. 그러므로, 본 발명의 한가지 형태는 말단의 탄수화물 결합서열 : GalNAc β1→4Gal β1→3GalNAc β1→4Gal β1→을 가지는 정제된 형태의 당지질 항원이다.
또한 L6 항체는 생합성적으로 라벨을 한 NSCLC 세포로부터 얻는 단백질 항원을 침전시킨다. 이 항원은 약 20,000달톤의 분자량을 가진 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-파지)의 대(帶)에 의해서 특징이 지워진다. 이 항체는 IgG2a 중복기준이다. 이것은 주장기내의 섬유아세포, 내피세포 또는 상피세포와 같은 정상세포에는 검출될 정도로 결합하지 않는다. L6 항체는 L6 쥐의 하이브리도마에 의해서 생성된다.
또한 Fab,F(ab')2,Fv 단편등과 같은 상기한 단클론의 항체의 유용한 결합단편이 본 발명의 범위에 포함된다. 이 항체단편은 통상적인 기술에 의해서 수득된다. 예로서, 유용한 결합단편은 파파인이나 펩신을 사용하는 항체의 펩티타제소화(消化)에 의해서 제조된다.
본 발명에 따른 신규의 항체의 상기한 특수한 실시예는 각 항원이 특정의 결합인자 위치를 결합하고 쥐의 공급원에 얻는 IgG2 아강(亞鋼)인 항체를 목적으로 하지만, 이것에만 제한되는 것은 아니다. 상기한 항체와 이 항체의 관능적 등가성을 가지는 항체들은 이들이 쥐의 공급원, 인체를 포함하는 다른 포유동물 공급원 또는 기타 공급원 또는 이들의 혼합물에서 나왔든 아니든간에 다른 중복기준과 마찬가지로 본 발명의 범위내에 포함된다. "관능적 등가성"이란 용어는 항체가 상기한 결합인자 위치에 결합될 수 있고 이러한 위치에서 본 발명이 특수한 항체에 필적할 수 있다는 것을 의미한다. 즉 이러한 항체는 이러한 결정인자 위치를 가지는 세포나 세포단편을 포함하는 피검물과 결합될때에 이러한 결정인자 위치에 결합하고 이러한 위치에 결합하는 것에서부터 본 발명의 항체를 막는다.
또한 본 발명은 인체의 L6 항원과 무타액증 GalNAc-GM1및 무타액증 GM2와 같은 관련되는 항원을 진단학적 그리고 치료학적으로 사용하는 것도 포함한다. 항원은 Young et al., J.Exp.Med.(1979) 150 : 1008 : 1019에 의해서 기술된 것과 같은 면역침전과 같은 통상적인 방법으로 정제된다.
본 발명의 한가지 방법은 L6 항원이나 신경질-N-트리오실 세르아미드의 특성을 가지는 당지질 항원의 유무를 알기 위한 조직의 시험으로서 폐조직이나 다른 인체조직의 악성조건의 유무를 결정하는 것을 포함한다. "악성조건"이란 용어는 동소발생부위의 암, 종양, 악성 또는 종양의 세포를 포함하는 형성이상(形成異狀)의 존재를 의미한다. "-의 특성을 가지는"란 용어는 L6 항원이나 무타액증 GalNAc-GM2또는 무타액증-GM2와 같은 관련되는 항원을 인정하는 항체에 대해 항원이 반응성이라는 것을 의미한다. 예로서, Young et al., supra, 나 kniep, et al, supra에 의해서 기술된 것과 같은 유사한 특성을 가지는 항체나 L6항체와 같은 본 발명의 단클론의 항체에 피검물을 접촉시키거나 결합시킬 수 있다. 접촉은 항체를 악성세포에 결합시키는 조건하에서 실시한다. 접촉후, 피검물의 악성세포에 항체의 결합의 유무를 관찰한다. 즉, 피검물을 항체의 면역복합체 및 항원위치에 대해서 시험한다. 이 면역복합체 형성은 피검물의 악성세포 유무와 관련된다. 또한 본 발명은 L6 항체나 L6 항원의 면역복합체를 포함한다.
본 발명을 제한하지 않는 설명의 방법으로서 본 발명에 따른 방법의 특수한 실시예는 여기(勵起)된 조직의 종양세포를 검출을 위한 방법이다. 여기된 종양은 절편을 얻기위해 처리하며, 이 처리는 최초에는 종양이나 조직을 냉동시키는 것을 포함하며, 정상적으로는 절개직후에 냉동시킨다. 냉동시킨 조직을 층을 예로서 한냉고정시켜 절편으로 절단한다.
상기한 방법으로 취득한 종양의 절편을 본 발명의 단클론의 항체와 접촉시킨 후 상기한 단클론의 항체에 대항되도록 검출 가능한 라벨이 붙은 제2항체와 접촉시킨다.
예로서 종양의 절편과 같은 절개된 피검물을 악성세포에 제1의 단클론의 항체를 결합시키는 조건하에서 접촉시킨다. 배양은 약 20 내지 30℃의 온도에서 약 15 내지 30분간, 예로서 페르티접시 같은 적합한 용기안에서 예로서 소량의 아지화 나트륨(sodium azide)을 포함하는 인산염으로 완충된 식염과 같은 액체 매체 속에서 이루어진다. 사용된 항체의 양은 예로서 항체와 문제의 결정인자 또는 항원위치 사이의 면역복합체의 검출가능한 수를 제공할 정도로, 검출 가능한 결합을 제공하는데 충분하다.
배양후에 절편을 씻어서 비-특성적으로 결합된 항체를 감소시키거나 제거하고 다음에 단클론의 항체를 항원위치를 가지는 피검물의 세포에 결합시켜서 얻어지는 상기한 복합체를 관찰하는 시험을 한다. 이 결합은 절편속의 악성세포 유무와 관련된다. 따라서, 예로서 피검물을 단클론의 항체에 대한 라벨붙인 특정의 결합상태물과 접촉시켜서 결합이 결정된다. 라벨에 의해서 식별되는 신호가 발생되며 라벨은 방사성 라벨, 형광 효소와 같은 발색단 또는 이의 유사품이 될 수도 있다.
상기한 시도를 이용하는 기술의 한가지 실시예는 면역형광 염색이다. 이 기술에서는 종양을 냉동시킨 절편을 아세톤을 바른 유리 슬라이드에 고정시키고 예로서 페트리접시속에 넣은 단클론의 항체와 배양시킨다. 예로서 인산염-완충된 식염과 같은 적절한 완충제를 써서 세척한 후, 절편을 페트리접시에 담고 단클론의 항체용 라벨붙은 특정한 결합상대물과 접촉시켜서, 이결합상대물은 사용되는 단클론의 항체용 특정한 라벨붙인 항체이다. 대부분의 경우 단클론의 항체가 쥐에서부터 유도되기 때문에, 단클론의 항체용으로 특수한 라벨붙인 항-쥐.임뮤노글루블린을 사용한다. 이러한 임뮤노글루블린은 표준기술에 의거하여 쥐항체를 가진 적합한 숙주를 주입시키고, 적절한 시간동안 방치하고, 주입된 숙주의 혈액으로부터 항-쥐임뮤노글루블린을 수거함으로서 증가시킬 수 있다.
예로서, 슬라이드를 완충수용액으로서 두번째로 씻은 후, 절편에 형광항체를 고정시키는 액체와 덮개유리를 덮고 형광현미경으로 시험하여 절편에 결합된 단클론의 항체를 결정한다. 또한 결합을 결정하는 것은 피검물 속에든 이러한 결합의 위치를 확인하는 것도 포함된다.
또한 피검물의 단클론의 항체를 결합시키는 것은 방사성 단위체, 염료나 형광을 포함하는 염색체와 같은 검출가능한 신호나 효소를 생성시킬 수 있는 라벨에 공유결합으로 공액된 단클론의 항체를 사용하여 결정할 수 있다. 항체당 사용된 라벨의 수는 일반적으로 라벨이된 항체가 사용하고 항체에 라벨을 붙이는 위치의 유용도가 사용되는 진단방법의 요구사항에 의하여 결정된다.
항체나 항체단편에 라벨을 공액시키는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 미국특허 제4,220,450호, 제4,235,869호, 제3,935,074호 및 제3,996,345호에 공개되어 있다.
본 발명의 단클론의 항체가 사용되는 기술의 또 다른 실시예에는 임뮤노페록시다제라벨방법이다(Sternberger, Immunocytochemistry, John Wiley ＆ Sons, New York, 1979, PP : 104-169 as modified by Garrigues et al., Int J. Cancer(1982) 29 : 511-515). 시험할 조직은 아세톤과 같은 적합한 용매로서 유리슬라이드와 같은 지지물위에 고정시킨다. 다음에 조직을 단클론의 항체와 배양시키고 다시 결합안된 항체가 없도록 세척한다. 그리고, 조직을 토끼의 항-쥐 IgG로서 배양시키고 세척하여 결합안된 항체를 제거하고, 쥐의 페록시타제-항-페록시다제와 혼합시키고, 씻어서 미결합 공액을 제거하고, 다음에 효소용 기질로서 처리한다. 이 처리를 한후에 슬라이드에서 검출할 신호를 찾는 시험을 한다.
본 발명의 항체들 예로서 객담과 같은 폐의 탈피세포 피검물이나 경부(頸部)의 도말표본속의 악성조건의 유무를 결정하는 방법으로 사용된다. 용어 "박탈성"은 피검물이 조직의 표면을 조각으로 자르거나 세척할 때 생기는 세포의 응집괴나 분리된 세포를 포함하는 것을 의미하며, 이들 세포는 개별적으로나 인설(鱗屑)이나, 박편속에서 제거된다. 박탈세포 피검물은 생검으로 취하는 것과 같은 절개된 조직과는 다르다. 피검물과 항체와의 접촉은 항체를 항원의 위치에 결합시키는 조건하에서 된다. 접촉 다음에는 항원 위치에 항체가 결합되어 있는지의 여부를 결정하고, 이 사실은 폐속의 악성조건의 유무와도 관련된다.
폐속의 악성조건의 유무를 결정하기 위하여는 객담시료로서 본 발명에 사용되는 박탈세포 피검물로 한다. 이 방법은 기관지, 인두, 입등을 포함하는 위장관에서의 박탈세포 피검물의 악성조건 검물에도 이용될 수 있다.
다음에 박탈세포 피검물을 피검물속에 있는 특정의 항원위치에 항체를 결합시키는 조건하에 있는 상술한 항체와 접촉시켜서 항원-항체 복합물을 형성한다. 이 항원위치는 피검물속의 세포나 세포단편에 존재할 수 있다. 일반적으로, 피검물은 예로서 일반적으로 유리로되는 슬라이드 같은 적절한 지지물이나 또는 다른 적합한 물질위에 놓는다. 일반적으로 박탈세포 피검물은 슬라이드 위에서 도말하여 슬라이드의 표면에 피검물의 엷은 층을 제공한다. 피검물과 항체와의 접촉은 일반적으로 완충된 매체수용액 속에서 이루어진다. 사용되는 완충액은 인산염, 트리스(tris), 중탄산염 등을 포함한다. pH는 피검물 및 항체의 성질과 관련되고 일반적으로 약 5 내지 8의 범위가 된다. 매체수용액은 약 0 내지 40%의 양의 유기극성(極性) 용매를 추가로 포함한다. 유기극성용매는 수용성이며 일반적으로 약 1 내지 10의 탄소원자와 약 1 내지 4의 산소원자를 갖는다. 항체는 약 1 내지 100㎍/ml 바람직하게는 약 10 내지 20㎍/ml의 농도로서 매체수용액중에서 존재한다. 피검물과 항체를 접촉시킬 때의 온도는 통상적으로 약 4 내지 40℃ 바람직하게는 약 10 내지 30℃가 된다. 접촉시간은 통상적으로 약 15 내지 120분, 바람직하게는 약 30 내지 60분이 된다.
피검물과 항체를 접촉시킨 후에는, 일반적으로 지지물을 처리하여 미반응 항체를 제거한다. 보통은 이것은 수용액으로 지지물을 씻지만, 통상적으로 완충된 매체로 씻는다. 일반적으로 세척용액의 양은 미반응된 항체를 씻어내기에 충분해야 한다.
다음에 결합위치에 있는 악성조건의 존재와 관련이 있는 결합, 즉 피검물속에 있는 항원위치에 대한 항체의 결합을 관찰한다. 말하자면, 형성된 항원-항체(면역성) 복합체의 수를 결정하기 위하여 피검물을 시험한다. 알 수 있는 것은 어떤경우에는 문제의 항원위치의 매우 적은 수가 탈피세포 피검물에서 발견된다는 것이다. 그러나, 악성조건에서는 항원위치의 많은 수가 존재하고 이후자 조건은 이 방법으로 비-악성조건과 쉽게 구별되며, 이것은 많은 수의 항원-항체 복합물이 악성조건이 존재하는 곳에서 측정되기 때문이다. 결합의 유무를 결정하기 위하여 효력검정 시스템속으로 검색신호를 발생시키는 장치를 삽입한다. 예로서, 효력검정에 사용된 항체를 검색신호를 보낼 수 있는 라벨에 공액시킬 수 있다. 이 라벨은 방사성단위, 염료 및 형광을 포함하는 염색체, 효소 또는 그 유사체일 수 있다. 항체에 사용된 라벨의 수는 일반적으로 방법의 요구사항과 라벨을 항체에 연결시키는 위치의 유용성에 의하여 결정한다.
또한, 세척된 슬라이드를 항체용의 라벨이 붙은 특정의 결합대상물과 접촉시킬 수도 있으며, 이때의 항체는 예로서 사용된 항체용으로 특별히 라벨을 붙인 항체이다. 단클론의 항체가 쥐의 공급원에서 유도되는 경우에는, 본 발명에 사용된 항체용으로 독특한 라벨을 붙은 항-쥐 임뮤노글로블린을 사용할 수 있다. 이러한 임뮤노글로블린은 표준기술에 따라서 단클론의 항체를 가진 적합한 숙주를 주입하고, 적당한 시간동안 방치하고, 주입한 숙주로부터 항-쥐 임뮤노글로블린을 취하여, 상승시킬 수 있다. 항체용으로 라벨이 붙은 특수한 결합상대물을 사용할때에는, 슬라이드를 형광시험하고, 전에 매체수용액으로서 다시 씻어야 한다. 또한 본 발명은 L6 항체에 응하여 제조된 항-유전형 항체를 포함하며, 이러한 항체는 관련된 종양 항원과 유사한 특성으로 제조된다(Nepom et al., (1984) Proc.Natl.Acad.Sci.81 : 2864)
형광라벨을 사용한 경우 항체와 세포피검물 사이의 결합의 유무를 결정하기 위하여는 통상적으로 형광현미경을 사용하여 슬라이드의 형광물을 시험할 수 있다. 형광이 아닌 다른 라벨을 사용한 경우에는 침전물, 색상 또는 그 유사물의 형성으로서 슬라이드나 피검물을 시험할 수 있다.
상기한 설명은 면역형광 기술분야에서 본 발명의 항체를 사용하는 것을 그 1차적인 목적으로 하고 있다. 그러나, 본 발명의 항체를 항원-항체반응을 포함하는 대부분의 역가검정에 사용될 수 있다. 균질의 역가검정시도에서는 피검물을 혈청, 뇨 및 그유사체와 같은 생물학적 액체일 수 있거나 피검물을 파편을 제거하기 위하여 용해하고 청징화(淸澄化)할 수 있다. 통상적으로 면역학적 반응에는 특수한 항체, 라벨을 한 분석분해물(analyte) 및 목적물의 시료를 포함한다.
라벨에서 발생되는 신호는 항체가 라벨이 있는 항원에 결합될때 직접적으로나 간접적으로 제조된다. 면역학적 반응 및 이 반응정도의 검출은 양자 모두 균질의 용액에서 이루어진다. 사용될 수 있는 면역화학적 라벨은 유리라디칼, 형광염료, 효소, 박테리오파지, 보효소 등을 포함할 수 있다.
불균질의 역가검정 시도에서는 통상적으로 시약은 피검물, 특정의 항체 및 검출신호를 보내는 수단이 된다. 일반적으로 피검물은 판이나 슬라이드와 같은 지지물위에 놓고 액상에 들어있는 항체와 접촉시킨다. 그후 지지물을 액상에서 분리하고 지지물상이나 액상중 어느 하나를 검출신호를 보내는 수단을 써서 검출신호를 시험한다. 이 신호는 피검물속에 있는 분석분해물의 존재와 관련된다. 검출신호를 보내는 수단은 방사선 라벨, 형광물, 효소등의 사용을 포함한다. 불균질의 면역역가검정의 본보기는 방사성 면역역가검정, 면역형광방법, 효소-결합된 면역역가검정 및 그 유사물이 된다.
상기한 면역역가검정 기술에 관하여 보다 상세한 논의를 보려면 다음책을 참조한다. "Enzyme-Immunoassay, "by Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. 또한 예로서, 다음 특허를 참조하며, 이들도 전부는 아니다. 미국특허 제3,690,834호, 제3,791,932호, 제3,817,837호, 제3,850,578호, 제3,853,987호, 제3,867,517호, 제3,901,654호, 제3,935,074호, 제3,984,533호, 제3,996,345호 및 제4,098,876호 또한 본 발명의 항체를 아래의 문헌에서 악성 흑색종(黑色腫)에 관하여 기술한 것과 유사한 방법으로 NSCLC로서 환자의 전이침착물의 투영에 사용된다(J.Nucl.Med(1983) 24 : 123-129 및 J.Clin.Invest.(1983) 72 : 2101-2114. 항체나 그의 단편에 방사성 라벨을 하여 환자에게 정맥투여하고, 그후 이환자를 예로서 감마카메라 또는 그 유사품을 사용하여 투영한다. 인체의 폐암으로서 이물 조직이식한 무흉선(無胸腺)의 "털없는" 쥐에 대해 실시한 연구에 의하면에서 제조된 1311-라벨을 한 항원결합분설(抗原結合分屑)(Fab) 단편은 조직이식한 종양에 선택적으로 극소화된다는 것을 나타낸다. 이것은 흑색종에 관한 앞선 연구(j.Nucl.Med.(1983) 24 : 123-129; J.Clin.Invest.(1983) 72 : 2101-2114를 기초하여 L6의 종양 선택적 국소화와 L6에서 제조한 항체단편이 아마도 인간 환자의 주사에 따른 다는 것을 나타낸다.
또는 본 발명은 상기 공개된 방법을 수행하기 위한 진단 장비를 포함한다. 한 실시예에서, 진단장비에는 (a) 상기한 것같이된 더욱 툭수하게 정의된 단클론의 항체, (b) 상기한 단클론의 항체와 검출신호를 보낼 수 있는 라벨을 위한 특수한 결합대상물의 공액을 포함한다. 또한 시약도 완충제및 예로서 다당류 및 그 유사체와 같은 단백질 안정제와 같은 보조제를 포함한다. 더우기 진단장치는 필요할경우, 신호-발생시스템의 다른 부분을 포함하며, 이 시스템에서는 라벨은 한부분, 시험중 백그라운드 간섭의 감소제, 조절제, 시험을 수행하는 장치 및 그 유사품이 된다. 또다른 실시예에서는 진단장치가 본 발명의 단클론의 항체의 공액과 검출신호를 발생시킬 수 있는 라벨을 포함한다. 상기한 보조제도 또한 존재할 수도 있다.. 본 발명의 항체를 치료학적으로 사용할 수 있다. 적합한 생물학적 성질을 가진 항체는 치료제로서 직접 사용할 수 있다. 항체 L6도 이러한 성질을 가지는데 이것은, 인체 임파세포나 대식세포와 결합할때 인공조건에서(invitro) 항체의존성 세포독성(ADCC)를 매개할 수 있기 때문이다. 즉, 예로서 암세포를 51cr로서 라벨하고 임파세포와 항체로서 배양시키는 기술을 사용하여 검출할 수 있을 정도로, 이것은 인체 NSCLC 세포를 파괴시킨다. 항-흑색종 항체로서 유사한 연구를 실시하였으며 높은 ADCC를 가진 항체는 털없는 쥐에서의 인체 흑색종의 생장을 억제시킬 수 있다는 것이다.
L6항체는 IgG2a 중복기준이기 때문에, 이 또한 대식세포를 활성화시킬 수 있다(Sears, et al., Contrl Oncol. Karger, Basel, (1984) 19 : 180-192). 더우기 항체는 독소와 결합하여 면역독성을 형성하거나 방사성 활성 물질이나 약물과 결합하여 방사성 약제나 약제를 형성할 수 있다. 항체의 면역독성 및 방사성 약제를 제조하는 방법은 공지되어 있다 (예로서, Cancer Treatment Reports(1984) 68 : 317-328) 참조). 더우기, 항체는 인체보체(補體)를 활성화시킬 수 있으며, 예로서 인체혈청의 존재하에 NSCLC 세포를 죽인다.
그러므로, 본 발명은 숙주속에 있는 비소세포 폐암의 집단을 감소시키거나 제거하는 방법을 제공하며, 이 방법은 L6항체나 그의 유도체를 비소세포 폐암세포의 집단을 감소시키거나 제거하기에 충분함으로서 숙주에 투여하는 것을 포함한다.
L6 항의 유도체란 이 L6 항체가 예로서 독소나 방사성활성물질과 같은 세포의 집단을 감소나 제거를 돕는 물질에 결합한다는 것을 의미한다.
본 발명의 단클론의 항체의 또다른 치료용 용도는 임뮤노겐으로서 본 발명의 단클론의 항체를 사용하여 증가된 항-유전형 항체를 가진 환자의 면역법에 사용하는 것이다. 이러한 면역법은 하나의 활성의 항-종양활성도를 유발할 수 있다(예로서, Nepom et al. ; Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1984) 81 : 2864-2867 참조). 유사한 시도에서, 환자를 정제된 형태의 L6 항원이나 개조된 형태의 항원으로 면역시킬 수 있다.
본 발명에서 주목할 사항은 본 발명의 항체를 미국특허출원 제667,521호(1984년 11월 2일)에 공개된 것과 같은 NSCLC에 다른 항체와 같이 결합될 수 있다는 것이다. 이 결합은 상기한 폐암중 최소한의 형태, 말하자면 대세포의 퇴형변화된 폐암, 선암 및 유표피종을 검출하는데 유효하다.
또한 본 발명의 단클론의 항체는 유방암과 같은 다른암과 관련이 있는 항원의 결정인자 위치를 정한다. 따라서, 본 발명의 항체는 이러한 암을 목적으로 하는 진단 및 치료제품에는 그 용도가 발견된다.
[실시예]
본 발명은 또한 다음의 상세한 실시예로서 잘 나타난다. 사용된 몇가지 방법을 먼저 기술한다.
[면역조직학적 기술]
냉동한 절편에 대한 면역조직학적 연구를 위하여, Immunochemistry, John Wiley ＆ Sons, New York, 1979, pp : 104-169 및 개조된 Garrigues et al. in Int. J. Cancer(1982) 29 : 511-515에 있는 스테론베르크(Sternberger)의 라벨이 안된 항체기술을 이용하였다. 본 시험을 위한 표적조직을 수술로 취하여 제거한 4시간 이내에 액화질소로 예비냉각한 이소펜탄에서 냉동시킨다. 그리고 조직을 사용할때까지 액화질소나 -70℃에서 보관한다. 토끼의 항-마우스 IgG(Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., jarettsville, MD)를 1/50으로 희석하여 사용하였다. 특별히 정베한 PAP 2mg/ml를 포함하는 마우스 과산화효소-항과산화효소 복합체(PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD)를 1/80으로 희석하여 사용하였다. 냉동된 단편을 준비하고, 건조하고, 아세토으로 처리한 후 건조한다.(Garrigues et al., 1982). 조직학적 평가용으로 사용할 단편은 헤마톡실린으로 염색한다. 독특하지 않은 백그라운드를 감소시키기 위하여, 1/5로 희석한 정상의 인체혈청으로 단편을 예비보온 배양시킨다(Garrigues et al., 1982). 생쥐향체, 염소 항-마우스 IgG 및 마우스 PAP를 10% 정상 인체혈청 및 3% 토끼혈청의 용액에 희석한다.
염색방법으로는, 일련의 단편을 2.5시간 동안 특수하거나 조절용 항체로 처리하고, 1/50으로 희석된 토끼항-마우스 IgG로서 30분간 보온배양하고, 그리고 1/80으로 희석된 마우스 PAP 복합체에 30분간 노출시킨다. 항체로 각각의 처리를 한 후에는, 슬라이드를 인산염으로 완충된 식염수(PBS)에 두번 세척한다. 0.05 M 트리스(Tris)완충액에 0.05%의 3,3'-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드(Sigma, St. Louis, MO) 및 0.01%의 과산화수소를 넣어서 새로 준비한 용액, (PH 7.6) 에서 8분간 면역조직 화학반응을 일으킨다. 또한 증류수에 희석한 1% OsO4용액에 20분간 노출시켜서 염색이 된 것을 확인한다. 단편을 물로 씻고 알코올로 탈수시키고, 크실렌으로 세척하고 슬라이드에 놓는다.
코드 및 코드화된 시료로서 판독된 각 슬라이드를 독자적인 연구로서 점검한다. 대표적인 슬라이드를 미분간섭의 대비광(Zeiss-Nomarski)을 사용하여 사진을 찍는다. 항체 염색도는 0(반응성이 없음), +(약간의 반응성세포), ++(최소한1/3이 반응성세표), +++(대부분이 반응성 세포),++++(거의 전부가 반응성세포)의 기준으로 평가한다. + 및 0의 염색의 사이에는 차이가 ++및 + 염색의 사이보다 절단(clear cut)이 덜 명백하므로, ++또는 그 이상의 것을 "반응성" 염색등급으로 계수한다. 종양성 월경곤난 및 기질(stroma)세포 모두가 종양시료에서 발견되었으며, 염색은 종양세포의 그것을 참조하여 기록하는 데, 이것은 기질세포가 전부 염색되지 않거나 종양세포보다 더 약하게 염색되기 때문이다.
[항원의 위치결정]
항원의 서브(sub)세포의 위치는 비이온성 계면활성제로 투과시키기 전이나 후에 세포에 결합된 항체를 측정하여 결정한다. 상처없이 배양된 세포의 표면에 결합된 항체를 125I- 라벨이된 항체(Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1981) 78 : 539-543)을 사용하는 직접 결합역가검정이나, (FACS) II 세포 분류기를 사용하는 간접형광으로 확인한다. 세포내의 위치에 결합된 항체의 결정은 세포에 1251-라벨이된 항체의 직접 결합하고 다음에 포름알데히드로 고정시키고 그후에 비이온성 계면활성제NP-40으로 투과시켜서 된다.
[결합역가검정]
a) 방사성 라벨이 된 항체(Brown et al., supra)를 사용하여 이루어지는 결합역가검정용으로, 배양된 세포(106)를 배양배지속에서 100㎕의 열-활성화한(56℃에서 30분간) 태아송아지의 혈청에 106cpm의 1251-라벨이된 항체를 넣은 것으로서 4℃에서 30분간 배양한다. 5ml의 PBS를 첨가한 후, 250xg에서 10분간 원심분리시켜 작은 알맹이(pellet)로 만든다. 상층액을 흡인하고, 작은 알맹이를 1251로 계수한다. 비특정의 결합을 계산하기 위하여, 10㎍의 라벨을 않은 항체를 경합체로 하여 평행배양을 실시한다(Brown et al., supra) 어떤 경우에는 결합역가검정을 플라스틱 배양접시에 부착시킨 세포의 단층에서 유사한 방벙으로 실시한다. b) FACS II 세포 분류기로 시행하는 결합역가검정에서는, 5mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 PBS를 사용하여 세포를 그의 기질에서 제거한다. 1x105세포를 함유하는 시료를 처음에 2㎍/ml의 농도에서 단클론의 항체로 배양하고 다음에 1:200으로 희석시켜 형광-공액된 염소의 항-마우스 항체로 배양한다. 그후 세포를 세척하고 배양배지에서 재현탁시킨다. FACS 분석직전에, 요드와 푸로피듐을 1㎍/ml의 최종농도가 되게 첨가하여 비-생육성 세포를 염색한다. FACS 분석중에는, 적색형광을 발하는 세포를 전자식으로 통로를 열어서 생육성 세포만을 시험할 수 있게 한다. 각 항체에 대한 플루어레신 형광의 주강도를 결정한다. 부(負)조절에는 단클론의 항체를 발생시키는 시료가 포함하고, 정(正)조절에는 HLA형태 1의 조직적 합성항원에 대한 단클론의 항체가 포함된다. 만일 평균채널 플루어레신이 백그라운드의 최소한 3배가 되면 염색이 정으로된 것으로 간주한다.
[단백질 항원결정]
단백질 항원을 확인키 위하여 폐암세포를 표면방사성 요드와 하거나 35s-메타오닌으로 대사식으로 라벨을 한다. 단클론의 항체를 배양시키고, 산양 항-쥐 IgG를 첨가하고, 에스. 아우로이스(S. aureus.)에 흡착시켜, 항원을 세포분해물로부터 분리한다. 면역침전물을 씻어내고 Brown et al., supra에 설명된 것 같이 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기영도(SDS-파지)(10-20% 아크릴아미드)로서 분석한다.
[당지질에 대한 항체의 반응성 결정]
당지질 항원에 대한 항체의 반응성은 마이크로 테스트 웰(microtest wells)(콜레스텔로 및 레시딘과 함께)에 흡수시킨 정제한 당지질과 당지질을 분별시킨 박층 크로마토그래피로서 배양시켜서 시험한다. 결합된 항체는 쥐의 임뮤노 글루블린 및 방사성 요오드화한 단백질 A에 대한 항혈청으로 배양시켜 검출한다.
[중복기준 결정]
a) 한천(寒天)면역확산
특수한 하이브리도마(hybridoma)세포의 상층액의 분취량을 2% 한천판의 중심웰(well)속에 넣는다. 단일 특이성의 토끼 항-마우스 Ig 증복기준항체(meloy)를 바깥 웰에 넣고, 판을 실온에서 2시간 배양하고 4℃에서 하룻밤 배양한다.
b) 유연한 폴리비닐클로라이드 96 웰판(costar)을 0.1mg/ml 염소 항-마우스 Ig항체로 37℃에서 2시간 피복하고, 3% BSA 용액으로 37℃에서 2시간 동안 재피복한다. 그리고 하이브리도마 상충액을 37℃에서 2시간동안 배양한다. PBS로서 세착한 후 소혈청알부민(BSA)판을 과산화효소(유기화 효소)에 결합된 단일 특이성의 토끼 항-마우스 Ig 증복기준항체로서 37℃에서 2시간 동안 배양한다. 세척후, 판을 pH 4.5의 0.1M 구연산염 완충액에 1mg/ml 오르토페닐렌디아민 및 0.03% H2O2을 넣은 용액으로 배양한다. 630nm에서의 광밀도를 Dynatec ELISA 판의 판독기로 결정한다.
[포도상구균성의 단백질 A 결합역가검정]
마이크로 적정웰을 PBS에 넣은 5% FCS 및 0.02% NaN3로 배양하고 상충액을 흡인한다. 25㎕의 표면세포 현탁액(2x107세포/ml)을 각 웰에 첨가하고 25㎕의 특수한 항체로서 실온에서 1시간 동안 배양한다. 판을 1200rpm으로 7분간 원심분리하고 50% NCS/PBS/NaN3로 2번 세척하고 25㎕의 1251-포도상구균성 단백질 A(약 50,000cpm/251)를 첨가한다. 판을 25℃에서 1시간 동안 배양하고 5% NCS/PBS/NaN3로 2번 세척하고 건조시킨다. 웰의 바닥을 절단하여 감마계수기로 계수한다.
[실시예]
[단클론의 항체제조]
4개의 상이한 공급원중 하나의 인체조직으로서 3개월된 BALB/c 쥐를 면역시켜서 단클론의 항체를 제조한다 : (1) 전이 비-소세포 폐암이 있는 환자에서 취한 훔막산출액, (2) 비-소세포 폐암에서 취해 배양한 세포 및 (3) 3-4개월된 사람 태아에서 취한 폐조직. 약 107의 세포로서 쥐의 복강에 3-4회 주사하여 면역시킨다. 마지막 면역시킨 3일 후에, 비장을 제거하여 배양배지에 현탁시키고 NSI 마우스 골수증 세포로 융합시킨다(Kohler and Milstein, supra). 혼합물을 단일 융합세포(클론)에서 공급되는 저밀도 배양물로 거품을 낸다. 교잡에 사용되는 기술은 상기한 Yeh, et al., Int. J. Cancer(1979) 29 : 269-275에 있다. 교잡세포에서 취한 상충액은, ELISA 역가 검정 및 자동방사선 사진식 간접 1251-라벨을 한 단백질 A 역가검정 Brown et al., J. Immunol. Meth. (1979) 31 : 201-209) 두가지 모두를 사용하여, 세포막을 포함하는 면역법용으로 사용되는 종양에서 추출한 액에서 걸러낸다. 이 추출액은 Colcher et al., Cancer Res., (1981) 42 : 1451-1459; Yeh et al., supra에서 개조한 방법을 써서 만든다. 이것을 위하여는, 조직을 PBS로 씻고 현탁하고, 스테인레스강 스크린으로 눌러서 본래의 종양으로 된다. 이과정을 거친 후에 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA)를 포함하는 1mM NaHCO3를 첨가하고, 다음에 이 물질을 Dounce 균질화장치의 B 유봉의 50 박동으로서, 얼음위에서 규질화한다. 27,000xg에서 15분간 원심분리하고, 상충액을 제거하고, 작은 알맹이를 PBS에 재현탁하고 1분간 음파파쇄하고, -70℃에서 보관한다. 세포막 추출액에 결합하는 항체를 만드는 하이브리도마르 클론닝하고, 인공조건에서 팽창시키고, 항체의 특이성을 시험한다.
이 시험은 상기한 면역조직학적 기술로 행하며, 여기서 항체의 폐암의 냉동한 단편, 다른 종양 및 정상 인체조직에 대한 결합력을 시험한다. 인체 폐암에 대해서 뚜렷한 특이성을 갖는 항체를 만드는 이러한 하이브리도마스를 재클로닝하고, 팽창시키고, 프리스탄(pristane)으로 프라임된 3개월짜리 BALB/c 쥐에 주사하며, 여기서 이것이 복수종 종양으로 정상한다.
복수종속으로 분비되는 항체는 단백질 A Sepharose(Ey et al., Immunochemistry(1978) 15 : 429)로 정제하거나 또는 Sephacryl S-300에서 겔여과로 정제한다. 정제된 항체는 면역조직학에 의한 추가의 특이성시험, 세포표면에 어느 항체가 결합하는가를 결정하는 본래 세포의 결합역가시험 및 상기한 방사성 면역침전시험을 포함하는 특정시험에 사용된다.
단클론의 항체 L6은 상기한 상응하는 하이브리도마에서 제조한다. 이러한 항체는 본 명세서에 기술된 성질을 나타내었다. L6으로 지칭되는 세포배양주(cell line)는 1984년 12월 6일에 ATCC에 기탁하고 기탁번호 HB 8677을 받았다.
[실시예]
어떤 당지질의 L6 항체와의 반응성 Kannai et al. (1983) Cancer Research 43 : 4997-5005 및 Nudelman et al. (1982) J. Biol. Chem. 257 : 12752-12756에 기술된 것과 같은 표준방법에 따라 I6 항체의 반응성에 관한 연구를 실시하였다. 정의된 당지질을 L6 항체와의 반응성에 관한 시험을 하였다. TLC에 분리된 당지질을 항체로서 면역염색을 하고 고체-상의 방사성 면역역가검정을 플라스틱벽에 피복된 당지질에서 실시하였다. 결과는 표 1과 같다.
[표 1]
Figure kpo00001
L6 항체는 무타액증 GalNAc-GM2및 무타액증 GM2와 특별하게 반응하였으며 무타액증 GalNAc-GM1으로 관찰하여 강한 반응성을 나타내었다. 신경절 테트라오실세라미드(무타액증 GM1)과 X2당지질(표 1에서 정의된 구조)는 약한 반응성을 가지는 것으로 발견되었다. Lex및 Ley구조를 가지는 글로보사이드, 글로보트리아오실세라미드, 락트오실세라미드, 파라글보사이드(락토테트라오실세라미드), 당지질과 신경절-(ganglio) 및 락토-계열의 구조를 가지는 강글리오시드(gandlioside)는 모두 음성이었다. 따라서, L6 항체는 다음의 결합서열을 인정하는 것으로 나타났다. GalNAcβ1→4Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1→R 여기서 R는 정의되지 않은 탄수화물이다.
[실시예]
[항체-의존성 세포독성(ADCC)]
이 연구는 앞서 기술한 Hellstrom et al., PNAS 82 : 1499, 1985의 방법으로, 51cr-라벨을 한 표적세포(2981 폐암), 항체(각종 희석) 및 임파세포(임파세포와 표적세포간에는 각종 비율이 있음)의 혼합물을 4시간동안 배양시키고 상청액속으로 배출된 양을 측정하여 실시하였다. 실험결과는 표 2에 요약하였다.
[표 2]
Figure kpo00002
그러므로, 항체 L6은 L6 항원을 표시하는 표적세포로 시험할때 ADCC를 매개하였다.
[실시예]
[인체보체의 존재하의 항체-매개된 세포독성]
인체보체의 존재하에 항체 L6의 종양세포 파괴가능여부를 시험하기 위하여 성립된 방법(Hellstrom et al, PNAS 82 : 1499, 1985)에 따라 51cr-라벨을 한 표적세포(2981 폐암)를 항체와 인체보체로서 54시간 동안 배양시킨다. 실험결과는 표 3에 요약한다.
[표 3]
Figure kpo00003
인체보체를 활성화시키는 항체는 최소한 2가지 이유 때문에 중요하다 : 이들이 직접 종양세포를 죽이며, 정상세포 하나는 종양성세포에 선택적으로 세포독성이 있는 활성화 대식세포와 기타세포를 가진 종양부위에서 염증성 반응을 유발할 수 있다는 것이다.
[실시예]
[각종 종양에 대한 면역조직학적 특성시험]
[표 4]
Figure kpo00004
본 발명은 상기 실시예를 특별히 참조하여 상세히 설명하였다. 그러나, 본 발명의 요지와 범위내에서 변경과 개조가 가능하다는 것을 알 수 있다.

Claims (55)

  1. 인체 비-소세포 폐암세포와 기능상 동등한 세포와 그 단편의 당지질 항원특이성이 있는 세포에 특이성 결정부위가 되는 IgG2 아강(subclass)의 단일클론항체.
  2. 제1항에 있어서, IgG2a와 동형상(isotype)인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 강글리오-N-트리오실세라미드(ganglio-N-triosylceramide)의 특이성을 가지는 당지질 항원이 있는 전술한 세포에 세포의 항체.
  4. 제1항에 있어서, L6 항체나 기능적으로 동등한 그 단편으로된 단일클론항체.
  5. 제1항에 있어서, 검출신호를 발생시킬 수 있는 라벨이 공약된 단일클론항체.
  6. 제5항에 있어서, 라벨이 형광체인 단클론항체.
  7. 인체 비-소 세포 폐암세포와 관련되고 일반적으로 강글리오-N-트리오실세라미드(ganglio-N-triosylceramide)로된 특이성 결정부위가 적어도 하나이상을 가지는 것을 특징으로 하는 정제된 형태의 단백질 항원.
  8. 제7항에 있어서, 폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 결정하여 약 20,000달톤의 분자량을 가지는 단백질 항원.
  9. L6 쥐의 하이브리도마에 의해서 제조되고 전술한 항체의 단편의 결합이 유용한 단일클론항체.
  10. 인체 비-소 세포 폐암세포와 기능적으로 동등한 세포와 그러한 단일클론항체의 단편의 단백질 항원 특이성과 당지질 항원이 있는 세포의 특이성 결정부위가 되는 단일클론항체.
  11. 제10항에 있어서, 폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정하여 분자량이 약 20,000달톤인 것을 특징으로 하는 단백질 항원과 관련된 전술한 세포의 항체.
  12. 제10항에 있어서, 전술한 당지질 항원이 강글리오-N-트리오실아미드의 특이결정부위인 항체.
  13. 제10항에 있어서, 항체가 L6인 항체.
  14. 인체조직속의 악성조건의 유무를 결정하는 방법으로서 : (a) 전술한 항체를 피검물에 결합시키는 조건하에서 당지질 항원과 관련된 세포의 결정인자위치를 정하는 항체와 전술한 조직의 피검물을 접촉시키는 단계를 포함하며, (b) 전술한 피검물에 전술한 항체의 결합유무를 관찰하는 단계를 포함하며, 결합은 전술한 조직속의 악성조건의 존재유무와 관련되는 결정방법.
  15. 제14항에 있어서, 라벨이 공액된 전술한 피검물과 전술한 단클론항체를 위한 특정의 결합 대상물을 접촉시켜서 결합의 정도를 결정하며, 전술한 라벨은 검출신호를 발생시킬 수 있는 결합정도 측정방법.
  16. 제14항에 있어서, 단클론항체가 검출신호를 발생할 수 있는 라벨에 공액되는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 전술한 단클론항체를 위한 라벨이된 특정결합 대상물이 전술한 단클론의 항체에 대해 독특한 항체인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 라벨이 발색단인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 전술한 항체가 L6항체인 방법.
  20. 제14항에 있어서, 전술한 인체조직이 폐조직인 방법.
  21. 진단장비로서 : (a) 인체조직속의 악성조건 유무를 결정하는데 유용한 단클론항체를 포함하며, 전술한 항체는 인체 비-소 세포 폐암이나 이의 기능적 등가성 또는 단편의 당지질 항원특이성이 있는 세포에 결정부위를 나타내며, (b) 신호발생 시스템의 일부분인 라벨(1)과 L6 단클론항체의 특이적 결합 대상물(2)를 공액시키는 것으로 구성된 진단장비.
  22. 제21항에 있어서, 라벨이 효소인 진단장비.
  23. 제21항에 있어서, 라벨이 형광체인 진단장비.
  24. 제21항에 있어서, 전술한 단클론의 항체가 L6항체인 진단장비.
  25. 진단장비로서, 신호발생 시스템의 일부분인 라벨(1)과 인체조직속의 악성조건의 유무를 결정하는데 유용한 단클론의 항체(2)를 공액시키는 것을 포함하며, 전술한 항체가 인체 비-소 폐암이나 이와 기능상 등가성 또는 그 단편의 특이적 당지질 항원이 있는 세포의 결정인자위치가 되는 항체로 구성된 진단장비.
  26. 제25항에 있어서, 라벨이 효소인 진단장비.
  27. 제25항에 있어서, 라벨이 효소인 진단장비.
  28. 제25항에 있어서, 전술한 단클론의 항체가 L6 항체인 진단장비.
  29. 인체조직의 악성조건 유무를 결정하는 방법으로서 강글리오-N-트리오실세라미드 특이성을 가지는 당지질 항원의 유무를 알기 위하여 전술한 조직을 시험하는 것을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 전술한 방법이 (a) 전술한 항체를 전술한 피검물에 접촉시는 조건하에서 당지질 항원이 있는 세포의 결정인자부위가 되는 항체와 전술한 조직을 접촉시키고 그리고 (b) 전술한 항체와 전술한 피검물의 결합유무를 관찰하는 것을 포함하며, 전술한 결합이 전술한 조직속의 악성조건의 유무에 관련되는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 전술한 단클론항체에 특이적 결합 대상물과 라벨이 공액된 전술한 피검물을 접촉시켜서 결합의 정도를 결정하고, 전술한 라벨이 검출신호를 발생시킬 수 있는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 단클론항체가 검출신호를 발생할 수 있는 라벨이 공액되어 있는 방법.
  33. 제30항에 있어서, 전술한 단클론항체의 라벨된 특이적 결합 대상물이 전술한 단클론항체의 특이적 항체인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 라벨이 발색단인 방법.
  35. 제30항에 있어서, 전술한 항체가 L6 항체인 방법.
  36. 제30항에 있어서, 전술한 인체조직이 폐조직인 방법.
  37. 인체 비-소 세포 폐암세포와 관련된 정제된 형태의 당지질 항원으로서, GalNAcβ1→4Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1의 탄수화물 결합서열을 가지며, 시알산(sialic acid)과 그의 면역 복합체가 전혀 없는 것을 특징으로 하는 당지질 항원.
  38. 인체의 악성조건의 유무를 결정하는 방법으로서, 강글리오-N-트리오실세라이드 특이성이 있는 당지질 항원의 유무를 알기 위해 전술한 조직을 시험하는 것을 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 방법이 (a) 전술한 항체를 전술한 피검물에 결합시키는 조건하에서 당지질 항원이 있는 세포의 결정인자부위가 되는 항체와 전술한 조직의 피검물을 접촉시키는 것을 포함하며, (b) 전술한 항체와 전술한 피검물의 결합유무를 관찰하는것을 포함하며 전술한 결합이 전술한 조직속의 악성조건 유무에 관계되는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 전술한 단클론항체의 특이적 결합 대상물과 라벨이 공약된 전술한 피검물을 접촉시킴으로써 결합의 정도를 결정하는 방법.
  41. 제39항에 있어서, 단클론항체가 검출신호를 발생할 수 있는 라벨이 공액되는 방법.
  42. 제39항에 있어서, 전술한 단클론항체의 라벨된 특이적 결합대상이 전술한 단클론항체의 특이적 항체인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 라벨이 발색단인 방법.
  44. 제39항에 있어서, 전술한 항체가 L6 항체인 방법.
  45. 제39항에 있어서, 전술한 인체조직이 폐, 결장 및 유방조직을 포함하는 집단에서 선택되는 방법.
  46. 제38항에 있어서, 항원이 또한 다음의 탄수화물 결합서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법. GalNAcβ1→4Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1
  47. 인체조직속의 악성조건의 유무를 결정하는 방법으로서 GalNAcβ1→4Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1의 결합서열을 가지는 것을 특징으로 하는 당지질 항원의 유무를 알기 위해 전술한 조직을 시험하는 것을 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 방법이 (a) 전술한 항체와 전술한 피검물을 결합시키는 조건하에서 당지질 항원이 있는 세포의 결정부위가 되는 항체와 전술한 조직의 피검물을 접촉시키는 것을 포함하며, 그리고 (b) 전술한 항체와 전술한 피검물의 결합의 유무를 관찰하고, 전술한 결합이 전술한 조직속의 악성조건의 유무에 관계되는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 전술한 단클론의 항체를 위한 특정의 결합 대상물과 라벨이 공액된 전술한 피검물을 접촉시켜 결합의 정도를 결정하는 방법으로서, 전술한 라벨이 검출신호를 발생시킬 수 있는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 단클론항체가 검출신호를 발생시킬 수 있는 라벨에 공액되는 방법.
  51. 제49항에 있어서, 전술한 항체를 위한 라벨을 한 특정의 결합 대상물이 전술한 단클론항체의 특이적 항체인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 라벨이 발색단인 방법.
  53. 제48항에 있어서, 전술한 항체가 L6 항체인 방법.
  54. 제48항에 있어서, 전술한 인체조직이 폐조직인 방법.
  55. 숙주속에 있는 비-소 세포 폐암세포의 집단을 감소시키는 방법으로서, 전술한 숙주에 L6 항체나 그의 유도체를 비-소 세포 폐암세포의 집단을 감소시키기에 충분한 정도의 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
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