JPH06503177A

JPH06503177A - 抗―炭水化物抗体の組合せを利用しての肺癌の早期診断

Info

Publication number: JPH06503177A
Application number: JP5501688A
Authority: JP
Inventors: サイトウ　ダイゾウ; センイチロウハコモリ; キムラ　サトシ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-06-26
Filing date: 1992-06-25
Publication date: 1994-04-07
Also published as: WO1993000588A1; EP0544898A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】抗−炭水化物抗体の組合せを利用しての肺癌の早期診断技術分野本発明は一般に肺癌の検査、そしてより詳しくは抗−炭水化物抗体の組合せの利用を介するかかる検査に関する。

発明の背景肺癌は米国において癌による死亡の主たる原因である。例えば肺癌のケースの全体の２０％−２５％を占める小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）はそれにかかった患者の９５−９９％を死に至らしめる悪性の高い種類の癌である。化学と放射線療法の組合せは一定の段階の疾患を有する患者の２年間の生存率を１％から３０％にまで効果的に高めたが、広範囲に及んだ疾患を有する患者の２年間の生存率は現状の療法では改善されていない。この疾患は早期に且つ広く転移し、一般に手術不能をもたらす。従って５ＣＬＣの早期且つ正確な診断は、この疾患を育する患者の適切な処置において本質的であり、そして診断の精度を存意に高める何らかの手法は有利である。

肺癌の早期診断の現状での難しさに基づき、改良された方法が当業界で要望されている。本発明はこの要望を満たし、且つその他の関連の利点を提供する。

発明の概要簡単に述べると、−観点において、本発明は抗−炭水化物抗体の組合せを利用する肺癌の早期診断のための方法を提供する。第一の態様において、この方法は、痰検体を３種以上の抗体のパネルに接触させ（ここで、Ｌｅｘ、シアロシルＬｅ ”　、　Ｌｅｙ、　Ｔｎ、シアロシルＴｎ及びＬｅ’より成る群から選ばれる３種の抗原それぞれに特異的な少なくとも１種の抗体が存在している）二次いでこの抗体それぞれによる免疫複合体の形成の有無を検出することを含んで成り、ここでいづれか１種の抗体による免疫複合体の形成の存在は肺癌の存在の指標である。

他の態様において、該方法は以下の段階：　（ａ）温血動物より採取した痰検体の−又は複数のアリコートを、Ｌｅ”に特異的な抗体と、これらより免疫複合体を形成せしめるような条件及び十分なる時間のもとで接触させ；　（ｂ）該抗体と該アリコートとで形成される免疫複合体の有無を検出し：　（Ｃ）段階（ａ）と（ｂ）をシアロシルＬｅ”に特異的な抗体により繰り返し；　（ｄ）段階（ａ）と（ｂ）をＬｅＹに特異的な抗体により繰り返し、（ｅ）段階（ａ）と（ｂ）をＴｎに特異的な抗体により繰り返し；　（ｆ）段階（ａ）と（ｂ）をシアロシルＴｎに特異的な抗体により繰り返し：そして（ｇ）段階（ａ）と（ｂ）をＬｅ ”に特異的な抗体により繰り返すことを含んで成り；ここで段階（ａ）−（ｇ）のいづれかにて生ずる免疫複合体の存在は肺癌の存在の指標である。

本発明の他の観点において、肺癌を有する温血動物における癌治療の効果をモニターする方法を提供する。第一の態様において、この本発明は、治療開始前の温血動物から採取した第−痰検体を３種以」二の抗体のパネルに接触さぜ（ここで、Ｌｅｘ、シアロシルＬｅ”　。

Ｌ、ｅＶ、　Ｔｎ、シアロシルＴｎ及びＬｅ’より成る群から選ばれる３種の抗原それぞれに特異的な少なくとも１種の抗体が存在している）；この抗体はそれぞれによる免疫複合体の形成の有無を検出しくここでいづれか１種の抗体による免疫複合体の形成の存在は肺癌の存在の指標である）；次いで治療を開始した後の該動物から採取した第二痰検体に基づいてこの接触と検出段階を繰り返すことを含んで成り、これにより動物における治療の効果がモニターされる。

他の態様において、該方法は以下の段階：　（ａ）治療を開始する前の温血動物より採取した第−痰検体の−又は複数のアリコートを、Ｌｅ”に特異的な抗体と、これらより免疫複合体を形成せしめるような条件及び十分なる時間のもとで接触させ；　（ｂ）該抗体と該アリコートとで形成される免疫複合体の有無を検出し：　（Ｃ）段階（ａ）と（ｂ）をシアロシルＬｅ”に特異的な抗体により繰り返し；　（ｄ）段階（ａ）と（ｂ）をＬｅ’に特異的な抗体により繰り返し；　（ｅ）段階（ａ）と（ｂ）をＴｎに特異的な抗体により繰り返し；　（ｆ）段階（ａ）と（ｂ）をシアロシルＴｎに特異的な抗体により繰り返し；（ｇ）段階（ａ）と（ｂ）をＬｅ’に特異的な抗体により繰り返しくここで段階（ａ）−（ｇ）のいづれかにて生ずる免疫複合体の存在は肺癌の指標である）；そして（ｈ）段階（ａ）−（ｇ）を、治療の開始した後の温血動物から採取した第二痰検体に基づいて繰り返すことを含んで成り、これにより動物における治療の効果をモニターする。

本発明のこれら及びその他の観点は以下の詳細な説明及び添付図面を参照することによってより明らかとなるであろう。

図面の簡単な説明図１は免疫組織学的に又はその他の方法により染色するための痰検体の準備の手順を図解したフローチャートを示す。

図２は種々の抗−炭水化物抗体と痰検体との反応性を図解する。

示している目盛りは痰の中の悪性又は境界線にある細胞の免疫組織学的染色に由来する平均値を表わす。全部で３８検体を集めた：クラスＣ又はＢは１１検体、クラスＤ又はＥは２６検体である。

発明の詳細な説明本発明は一般に、肺癌の早期診断又は肺癌を有する温血動物（こおける癌治療の効果のモニターのための方法に関する。より詳しく（よ、本発明の開示内容は抗 −炭水化物抗体の組合せが肺癌の検出↓こ寥１用できることを示す。

肺癌を検出する古典的な方法はＰａｐａｎｉｃｏｌａｏｕの染色である。この方法に関する問題は、これは治療目的のための早期６二十分（こ癌細胞を検出できないことにある。本発明において開示される通り、一定の抗原に対する抗体の組合せの利用によって肺癌は臨床症状の前に検出されうる。更に、Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ染色よりも本発明の方法（こよってより簡単に悪性細胞は発見される。

本発明の方法において有用であると見い出された抗原に１よＬｅ”　。

Ｌｅ”二量体、シアロシルＬｅ”　＋　ＬｅＹｓ　シアロシルＴｎ、フコシｌしＧＭ　１　。

Ｔｎ及びＬｅ“が含まれる。これらの抗原の構造を表Ｈこ示す。

表　１シアロシルＬｅ”　ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−］］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβｌ−１ｃｅｒアロシルＴｎ　ｎｅｕＡｃａ２−ｅｒｃａＩＮＡｃａｌ−０−５ｅｒ／ＴｈｒＴｎ　Ｇａ１ＮＡｃａｌ−＋０−５ｅｒ／ＴｈｒＬｅ”　Ｇａｌβ？３ＧｌｃＮＡｃβ１−コＧａｌβ？４Ｇｌｃβ？１ＣａｒＧａｌはガラクトースを表わす；　ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコ−スアミンす；　ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を表わす；　ＧａｌＮａｃｌよＮ −アセチルガラクトースアミンを表す；　Ｓｅｒはセリンを表わす；　Ｔｈｒｌ；！ス１７オニンを表わす、そしてＣｅｌはセラミドを表わす。セラミドはスフィンゴ脂質塩基であり、そのアミンは脂肪酸によりアシル化されている。

本発明において採用する抗体は−１−記に挙げた抗原に特異的に結合する（即ち、約１０７リツトル１モル以上の親和性を伴って）。本明細書で用いる「抗体Ｊなる語は、モノクローナル及びポリクローナル抗体の両者を含み、そして完全分子、そのフラグメント、又はその機能的同等物でありうる。抗体は遺伝子操作されていてよい。抗体のフラグメントの例にはＦ（ａｂ’　）、　、　Ｆａｂ’　、　Ｆａｂ及びＦｖが含まれる。

簡単に述べると、ポリクローナル抗体は動物の免疫化、その後のその血清の回収によって生産されつる。免疫化は例えば、ウサギ又はマウスへの皮下、牌庫内又は筋肉内注射によるような全身系投与によって行われる。最初の免疫の後に、血清回収の前での１又は数回の促進免疫が引き続くことが一般に好ましい。このような方法論はよく知られ、且つ数多くの文献に詳細されている。

本発明においてポリクローナル抗体を採用してよいが、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が好ましい。本発明において適するＭＡｂにはネズミもしくはヒト起源のもの、又はヒトとネズミの抗体の両方の一部（即ち、ネズミ抗体の抗原結合領域とヒト抗体の定常領域）を組合せたようなキメラ抗体が含まれる。ヒト及びキメラ抗体は当業者によく知られている方法を利用して作ることができる。ヒト抗体及びキメラ抗体は臨床的に投与する際に有利であり、その理由はネズミ抗体はど抗−抗体の生産を引き起こさせないからである。

とがてきる。簡単に言えば、表１に列挙した抗原のうちの１って免疫処置した動物のリンパ節および／または牌臓をミエロ−マ細胞と融合してハイブリッド細胞系（「ハイブリドーマ」または「クローン」）を形成せしめる。各ハイブリドーマは単一の型の免疫グロブリンを分泌し、そしてミエローマ細胞と同様に、無限の細胞分裂の能力を存する。そのような分子を担体と組み合わせて免疫原性を高めることが望ましい場合がある。適当な担体としては、アオガイヘモシアニン、千ログロブリン、ウシ血清アルブミンおよびその誘導体が挙げられる。ハイブリドーマを経由したＭＡｂの産生に代わる別法は、バクテリオファージど細菌を使ったＭＡｈ発現ライブラリーの示す抗体の選択は、当業者に明らかであろう様々な方法で実施することができる。

本発明の範囲内で適当であるＭＡｂの典型例として、ＳＨｌ、　ＳＨ２゜５ＮＨ３，ＡＩ（６，ＴＫＨ２，ＴＫＨ６およびＣＡ３Ｆ４が挙げられる。５ｉｌｌはＬｅ”に対して向けられたＩｇＧｓである（Ｓｉｎｇｈａｌら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　５０　：　１３７５−１３８０、１９９０）　、　５ＮＨ３はシアロシルＬｅ”に対して向けられたＩｇＭであり、Ｃ３−ＬＥＸと同様な特異性を有する（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４４　：　５２７９−５２８５．１９８４）　。ＡＩ６はＬｅ’に対して向けられたＩｇＭであ２２２０、１９８８）。ＴＫＨ５はフコシルＧＭＩに対して向けられた［ｇＧｓである（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、同文献）。ＴＫＨ６はＴｎに対して向けられたＩｇＭである（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、同文献）。ＣＡ３Ｆ４はＬｅ ”に対して向けられたＩｇＧで用された参考文献を参照のこと）。

本発明に開示されるように、上記抗原の組合せに対する抗体を使って、肺細胞の試料、例えば痰標本において肺癌を検出することができる。選択した他の抗原の各々に対して少なくとも１つの抗体がある限り、特定抗原に対する複数の抗体を使用することができる。

好ましい態様では、抗原Ｌｅ”　、シアロシルＬｅ”　、　Ｌｅ’　、シアロシルＴｎ、　ＴｎおよびＬｅ”の各々について少なくとも１つのパネルを使う。

それらの抗体に対する特に好ましい抗原は、それぞれ、ＭＡｂＳＨｌ。

５ＮＨ３，ＡＩ６．　ＴＫＨ２，ＴＫＨ＠およびＣＡ３Ｆ４である。別の好ましい態様では、１．ｅ”　、シアロシルＬｅ”　、　Ｌｅ’　、シアロシルＴｎ、　ＴｎおよびＬｅ’から選ばれた２つまたは３つの抗原の各々について少なくとも１つの抗体のパネルを使用する。例えば抗原Ｌｅ’　、　Ｌｅ’およびＬｅ’ の各々に対する１または複数の抗体が１つのパネルを構成することができる。本明細書中に与えられる教示があれば、別の抗体の組合せを使用できることは当業者に明白であろう。

典型的には、抗体の組合せに対する抗体を痰標本からの個々のアリコートと個別に反応させる。しかしながら、それらの個々の抗原・＼の結合について抗体間で全く妨害がない場合には、単一アリコートを連続的にまたは同時に分析することができる。異なる抗体による多数のアリコートの試験（または単一アリコートの連続的試験）を実施する順序は様々である。

上述の抗原と該抗原に特異的な抗体との間で形成される免疫複合体の存在の検出は、様々な公知方法、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびエンザイムーリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって達成することができる。適当なイムノアッセイとしては、Ｄａｖｉｄらの二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ技術（米国特許４．３７６、１１０）　；モノクローナル−ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ　（Ｗｉｄｅら、　ＫｉｒｋｈａｍおよびＨｕｎｔｅｒａｉ。

Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｅ、ａｎｄ　Ｓ、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ。

１９７０）　；　Ｇｏｒｄｏｎらの「ウェスタンプロット」法（米国特許第４．４５２．９０１５１５４−５１６０．１９８２）により記載されたようなエンザイムーリンクドイムノソルベントアッセイ、蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学技が挙げられる。上述のイムノアッセイに加えて、多数の他のイムノアッセイが利用可能であり、米国特許第３．８１７．８２７号；同第３．８５０．７５２号：同第３．９０１．６５４号；同第３．９３５．０７４号；同第３．９８４．５３３号；同第３．９９６．３４５号；同第４．０３４．０７４号；および同第４．０９８．８７６号に記載されたものを包含する。

検出のために抗体を標識してもよくまたは未標識でもよい。未標識の時、抗体は凝集アッセイに利用される。加えて、未標識の抗体は免疫複合体と反応性である標識分子と組み合わせて、または該化合物に対して向けられた抗体と反応性である標識抗体（第二抗体）、例えば免疫グロブリンに特異的な抗体と組み合わせて使うことができる。あるいは、抗体を直接標識することができる。抗体が標識される場合、レポーター基は放射性同位体、蛍光団、酵素、発光体または色素粒子を包含することができる。それらおよび他の標識は当業者に公知であり、例えば次の米国特許：第３．７６６、１６２号；第３、７９１．９３２号；第３．８１７．８３７号；第３．９９６．３４５号；および第４．２３３．４０２号に記載されている。

免疫複合体を検出するための１つの好ましい態様では、レポーター基が抗体に結合している。免疫複合体を検出する段階は、未結合の抗体を実質的に除去し、次いでレポーター基の存在を検出することを含む。未結合の抗体は抗原に結合しなかった抗体である。

別の好ましい態様では、レポーター基が抗原に特異的な抗体に結合することのできる第二抗体に結合している。免疫複合体を検出する段階は、（ａ）未結合の抗体（即ち、抗原に結合していない抗体）を実質的に除去し、（ｂ）第二抗体を添加し、（ｃ）未結合の第二抗体を実質的に除去し、そして（ｄ）レポーター基の存在を検出することを含んで成る。抗原に特異的な抗体がマウス由来である場合、第二抗体は抗マウス抗体である。

免疫複合体を検出するための第三の好ましい態様では、レポーター基が免疫複合体に結合することのできる分子に結合している。検出段階は（ａ）該分子を添加し、（ｂ）未結合の分子を実質的に除去し、そして（Ｃ）レポーター基の存在を検出することを含んで成る。免疫複合体に結合することのできる分子の例はプロティンＡである。

標識抗体、標識第二抗体または免疫複合体と反応性である標識分子の使用に代わるものは、一般に、標識抗原を使用するイムノアッセイある。そのようなアッセイでは、試料中に存在する抗原が抗体を目当てに標識抗原と競争するだろう。

免疫複合体を検出するための様々な方法を本発明に使用できることは当業者にとって明白であろう。いずれかの方法における使用に適当であるレポーター基としては、放射性同位体、蛍光団、酵素、発光体および色素粒子が挙げられる。

本発明の関連の観点ては、痰標本と上記抗体の１つに特異的な抗体との間で形成された免疫複合体の検出を使って、肺癌療法の有効性を監視することができる。

温血動物、例えばヒト、から療法の開始前と開始後に採取した痰試料を、上述した本発明の方法によって分析することができる。事後の試料（療法開始後）中に特異的免疫複合体が無いことは、好結果の療法を反映する。

次の実施例は例示のつもりで与えられ、限定のつもりではない。

例例１痰検体の免疫染色Ａ、痰の収集痰を毎朝、３日間、対象から集め、そして室温で“サコマノ溶液（Ｓａｃｏｍａｎｏ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）”　（５０％エタノール中、２％ポリエチレングリコール）に貯蔵した。“高−危険性”対象はヘビー喫煙者、すなわち２０年間、毎日、少なくとも１箱の紙巻タバコを吸って来た喫煙者であった。痰検体の染色は好ましくは、収集の後、数日内に行なわれる。しかしながら、検体は４°Ｃで６か月間、貯蔵され得る。

Ｂ、痰の染色粘液を、ブレンダーを用いて庚から除去した（たとえばＷａｒｉｎｇ”ブレンダーモデル３１ＢＬ９１　；　１１．００Ｏｒｐｍで１０秒間）。細胞を、２．００Ｏｒｐｍで５分間の遠心分離により沈殿物から集めた。細胞を免疫組織学的染色のためにガラススライド上に塗布し、そして室温で１０分間９５％エタノールにより同定した。パパニコラウスの染色（ｐａｐａｎｉｃｏ−１ａｕ’ｓ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）をまた、悪性度を類別するために行なった。スライド上の固定された細胞を、室温で１０分間、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）により２度洗浄した。

免疫組織学的染色の特異性を高めるために、細胞上の非特異的結合部位を、室温で３０分間、希釈された（１０％）正常なマウス血清によりブロックした（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ”　ＡＢＣキット、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　Ｃａｔ、の成分）。抗−炭水化物抗体との反応（〜０．１〜１０μｇ／ｍｌ）を、湿気チャンバーにおいて４°Ｃで一晩行なった。−晩のインキュベーションの後、スライドを室温でｌＯ分間ＰＢＳにより２度洗浄した。いづれかの本質的なペルオキシダーゼ（すなわち細胞のペルオキシダーゼ）を、室温で３０分間、０．３％Ｈ２０ｔ　／メタノールによる処理によりブロックした。スライドを再び、ＩＯ分間ＰＢＳにより洗浄した。

スライドを、湿気チャンバー中において室温で２０分間、ビチオニル化された第２抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ”　ＡＢＣキット）と反応せしめた。

スライドを、室温で５分間、ＰＢＳにより３度、洗浄した。予備形成されたアビジンービチオニル化されたホースラデイシュベルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ”　ＡＢＣキット）を、湿気チャンノく一中において室温で３０分間にわたって添加した。スライドを再び、５分間ＰＢＳにより３度洗浄し、未反応複合体を除去した。

スライドを、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、ホースラデイシュペルオキシダーゼのための基質）及びＨＪｔ　（２０ｍｇのＤＡＢ、３０μｍのＨｔＯｔ。

６５ｍｇのＮａＮ５．　ｏ、　０５Ｍのトリスクロリド緩衝液、ｐＨ７，６，１００ｍ１の最終体ｆｊりを含む溶液に室温で５分間、含浸した。スライドを蒸留水により５分間、洗浄し、そして室温で２０秒間、希釈しないてＭｅｙｅｒ’　ｓＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｍｕｔｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｔｏｋｙｏ、　Ｊａｐａｎ）により逆染色した。

スライドを１０分間、水道水により洗浄し、そして次に、密封し、そして顕微鏡下で試験した（〜４０Ｘ−２００Ｘの倍率）。

Ｃ２染色結果検体の組織学的評価の結果は、下記表２に示される。

表２検体の組織学鱗状細胞癌　９　１２　９　３０腺癌　１３　８　９　３０小細胞癌０　２７ °カラスムギ細胞型６、中間細胞型１８、混合物された型３゜検体の細胞学的評価の結果を下記表３に示す。クラス“Ｂ″は正常又は良性を示し、“Ｃ”は境界の悪性を示し、そして“Ｄ”又は”Ｅ”は悪性を示す。

表３検体１の細胞学り又はＥ　３９ ”　５ｈｉｂａｔａ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ及びＨｅａｌｔｈ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｅｒ。

Ｎｉｉｇａｔａ、　Ｊａｐａｎから収集された。

抗−炭水化物ＭＡｂの結合の結果は図２（痰における細胞）及び表４（染色された肺癌組織断片）に示される。ＭＡｂ、　ＳＨＩ、　５ＮＨ３゜Ａｌ１．　ＴＫＨ２，ＴＫＨ６及びＣＡ３Ｆ４は、肺癌検体に対して最強の結合性を示した。

図２のＭＡｂにより陽性的に染色されたパラフィン固定された肺癌組織断片の評点を下記表４に示す。その基準範囲は、０から最大３．００である。

表４陽性的に染色された検体の評点（ｓ）　＝　Ｒ性染色の強さ：０、ナシ；１、弱い；２、中ぐらい；３、強い。

（ａ）＝陽性染色の領域　０、ナシ；Ｌｌ　〜１０％：２．１１〜５００６．３．５１〜１００％。

検体の数は表２に与えられる。評点は、３種の独立した試験体による評価の手段を示す。

ＭＡｈ及びクラスによる陽性染色細胞の出現率が下記表５に示される。クラス“ Ｃ”は境界の悪性を示し、そして“Ｄ″又は“Ｅ“は臨床的に診断された悪性を示す。

表５陽性染色された細胞の出現率０ＳＲ１５／１０　１５／４７　（３２％）　１４／３０　（４７％）ＳＨ２１／６　（１７％）ＳＮＨ３４／１０　１４／４５　（３１％）　７／１０　（７０％）Ａｌ１　６／１０　２６／４Ｂ　（５４％）　２８／３０　（９３％）ＴＫＨ２０／３　２／８　（２５％）　１２／２４　（５０％）ＴＫＨ５１／６　（１７％）ＴＫＨ６８／１０　１４／４６　（３０％）　６／１７（３５％）ＣＡ３Ｐ４　３／３　３／８　（３８％）　１６／１９　（８４％）３０次のカテゴリーを有するクラスＣニゲループ■：癌が追加の期間、後で検出された患者からの検体。

グループＩｌ：さらに追加の期間、癌の証拠は存在しない。

肺癌の臨床的に明白にされた症例を有する患者からの検体の反応性が下記表６に示される。あらゆる患者からの検体は、少なくとも１種の抗−炭水化物ＭＡｂによる陽性の染色を示した。

表６臨床的に明白にされた症例の特徴Ｎ／Ａ　・入手できない０　：検体上に細胞が存在しないＳｑ、鱗状細胞癌Ａｄ：腺癌Ｌａｒｙ　：喉頭癌Ｓｍ、小細胞癌抗−炭水化物ＭＡｂ　Ａｌ１．　ＴＫＨ２，５ＮＨ３，ＳＨＩ、　ＴＫ）１６及びＣＡ３Ｆ４の組合せは、臨床的表示の前、約１８か月まで肺癌を検出する。下記表７に示されるように、悪性細胞の陽性比は有意に高い（ｐ＜０．０５）。

陽性染色　少なくとも１つの抗体されない　による陽性染色癌　３　３５異常な変質形成”　１６　２６境界の悪性の５８症例を１８か月間、さらに追求した（表８）。染色が表６に列挙されるすべての６種ＭＡｂにより陰性である場合、患者は１８か月間、癌フリーを持続した。

例２腫瘍関連炭水化物抗原に対するＭＡｂの生成ＭＡｂを、サルモネラ　ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ）上に被覆された精製糖脂質抗原によるマウス免疫化により腫瘍関連炭水化物抗原に対して生成した（Ｙｏｕｎｇなど、　、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１５０　：　１００８〜１９゜１９７９）。ＭＡｂ　ＳＨ−１の調製のための方法は典型的である。

Ｌｅｗｉｓ”抗原（ＩＩＩ’　Ｆｕｃ　ｎＬｃ’）を、慢性癌から転移されたヒト肝臓腫瘍から精製する。腫瘍をイソプロパツール：へキサン：水において３度均質化し、そして濾過する。有機抽出物を蒸発し、乾燥せしめ、モしてＦｅ１ｃｈ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１９１：８１９．１９５１）の方法により３度、分割する。組合された上相を蒸発し、そして５ｐｅｃｔｒａｐｏｒｅ　３　（３５００分子量カットオフ）透析管において蒸留水に対して透析する。透析物を過剰のエタノールを用いて蒸発し、そしてＤＥＡＲ−３ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ　− ２５カラム（４Ｘ　５０ｃｍ）上でイオン交換クロマトグラフィー処理にゆだねる。サンプルをクロロホルム：メタノール：水（３０：６０：８）に適用する。

Ｌｅｗｓ”抗原を含む非結合性通過画分を集める。サンプルを蒸発し、そしてイソプロパツール：ヘキサン：水（５５：４０：５−−５５：　２５　：　２０）から成るイ第１・ロビーズシステム」−での高圧液体りＹ】７トグラフイー処理にゆだねる。

両分を、オルシノール−硫酸による染色に基づいてプールする。

漂準Ｈ，及びＩ４２糖脂質問を移動する糖脂質をプールし、そしてピリジン−無水酢ｍｔ−用いてアセチル化する。そのアセチル化された糖脂質を、分離ＴＬＣブレ〜　トに適用し、そしてジクロロエタノール：アセトン、水（４０：　６０　：　０．０３）において展開する。個々の単離されたバンドをＮＭＲ及び過メチル化分析により分析し、そして！、ｅ”バンドを集める。

Ｂａ１ｂ／　Ｃ７ウス（Ｂ、生後８週目）を、精製されたＬｅｗｓｘ抗原（ＩＩＩ″Ｆｕｅ　ｎＬｃ４）により感作する。抗原（４０μｇ／　１００．ｃｚ　１　エタノール）を、３７°Ｃで８００μｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に注入する。

その溶液をさらに、２５０μｇの酸処理されたＳ、ミネソタ（１ｍｇ／ｍｌ　ＰＢＳ）と共に混合する。その混合物を３７°Ｃで３０分間インキュベートし、そして凍結乾燥せしめる。その凍結乾燥された粉末を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁する。マウスを、１０〜１４日ごとに、ＰＢＳの抗原懸濁液２５０１１１の尾静脈注射により感作する。

最後の注射の３８後、動物を首の脱キュウにより殺害し、そして牌臓を無菌状態で取り出す。リンパ球を、マウス骨髄腫ＳＰ２細胞（５・１）によりポリエチレングリコールを用いて融合する。クローンを、融合の１１日後、スクリーンする。この段階でのクローンは小さい。クローンを、Ｐａｎｄｅｘ機械を用いてスクリーンし、ここで抗原は次微子ポリスチレン粒子上に被覆される。抗原被覆されたビーズを抗体上清液と共に混合し、次にＦＩＴＣ−ヤギ抗−マウスＩｇＧ及びＩｇＭを添加する。このアッセイ（”Ｐａｎｄｅｘアッセイ”）は、従来のラジオイムノアッセイ又はＥＬＩＳＡアッセイよりも２〜４倍より敏感であり、そして他のアッセイにおける５０〜１００　ｎｇ／ウェルに対してたった１０ｎｇの抗原／つ】−ルを必要とする。このスクリーニング方法は、Ｌｃｖｓ’に対する高アフィニティー抗体の選択をさらに促進せしめる。

陽性のクローンを単一細胞希釈によりクローン化し、そしてまた、ＴＬＣ免疫染色により試験する。ＭＡｂ　５ｌ（−１を生成し、Ｐａｎｄｅｘアッセイ及びＴＬＣ免疫染色において高い反応性を示すクローンを選択し、モして凍結する。

本明細書に言及されるすべての出版物及び特許は、引用により本明細書に組込まれる。

前述から、種々の変性が本発明の範囲内で行なわれ得る。前記例は例示目的であって、本発明を限定するものではない。

＜ａ疫組織化学的染色　ρｏｐｏｎｉｃｏｌｏｏｕ’ｓ染色Ｆｉｇｕｒｅ　１国際調査１１ｇ牛１．１１２１．Ｎ、　ρＣＴ／ＵＳ　９２１０５４２４国際調査報告フロントペ・−ジの続き（７２）発明者　ハコモリ　センイチロウアメリカ合衆国、ワシントン　９８０４０．マエイティース　２０２４（７２）発明者　キムテ　サトシアメリカ合衆国、ワシントン　９８１１９．シアトル、ウェスト　ロイ　ストリ −１へ２７５、アパートメント　＃３１５

Claims

【特許請求の範囲】

１．肺癌の検出方法であって、痰検体と３種又はそれ以上の抗体のパネルとを接触せしめ、ここでＬｅｘ、シアロシルＬｅｘ，Ｌｅｙ，Ｔｎ、シアロシルＴｎ及びＬｅ■から成る群から選択された３種の抗原の個々に対して特異的な少なくとも１種の抗体が存在し；そして前記抗体の個々による免疫複合体形成の存在又は不在を検吊し、それによって、いづれか１種の抗体による免疫複合体形成の存在が肺癌の存在の表示であることを含んで成る方法。
２．肺癌の検出方法であって、（ａ）温血動物から採取された痰検体の１又は複数のアリコートとＬｅｘに対して特異的な抗体とを、それらから免疫複合体を形成するのに十分な条件下で及び十分な時間、接触せしめ；（ｂ）前記抗体と前記アリコートとの間に形成される免疫複合体の存在又は不在を検出し；（ｃ）シアロシルＬｅｘに対して特異的な抗体により段階（ａ）及び（ｂ）をくり返し；（ｄ）Ｌｅｙに対して特異的な抗体により段階（ａ）及び（ｂ）をくり返し；（ｅ）Ｔｎに対して特異的な抗体により段階（ａ）及び（ｂ）をくり返し；（ｆ）シアロシルＴｎに対して特異的な抗体により段階（ａ）及び（ｂ）をくり返し；そして（ｇ）Ｌｅ■に対して特異的な抗体により段階（ａ）及び（ｂ）をくり返す段階を含んで成り；ここで段階（ａ）〜（ｇ）のいづれかにおいて生成される免疫複合体の存在が肺癌の存在の表示であることを特徴とする方法。
３．肺癌を有する混血動物における癌治療の有効性をモニターするための方法であって；治療の開始の前、混血動物から採取された第１の痰検体と３種又はそれ以上の抗体のパネルとを接触せしめ、ここでＬｅｘ、シアロシルＬｅｘ，Ｌｅｙ，Ｔｎ、シアロシルＴｎ及びＬｅ■から成る群から選択された３種の抗原の個々に対して特異的な少なくとも１積の抗体が存在し；前記抗体の個々による免疫複合体形成の存在又は不在を検出し、ここで、いづれか１種の抗体による免疫複合体形成の存在が肺癌の存在の表示であり；そして治療の開始に続いて前記動物から採取された第２の痰検体に対して前記接触及び前記検出をくり返し、それによって動物における治療の有効性をモニターすることを含んで成る方法。
４．肺癌を有する温血動物における癌治療の有効性をモニターするための方法であって；（ａ）治療の開始の前、温血動物から採取された第１の痰検体の１又は複数のアリコートとＬｅｘに対して特異的な抗体とを、それらから免疫複合体を形成するのに十分な条件下で及び十分な時間、接触せしめ；（ｂ）前記抗体と前記アリコートとの間に形成される免疫複合体の存在又は不在を検出し：（ｃ）シアロシルＬｅｘに対して特異的な抗体により段階（ａ）及び（ｂ）をくり返し；（ｄ）Ｌｅｙに対して特異的な抗体により段階（ａ）及び（ｂ）をくり返し；（ｅ）Ｔｎに対して特異的な抗体により段階（ａ）及び（ｂ）をくり返し；（ｆ）シアロシルＴｎに対して特異的な抗体により段階（ａ）及び（ｂ）をくり返し；そして（ｇ）Ｌｅ■に対して特異的な抗体により段階（ａ）及び（ｂ）をくり返し；ここで段階（ａ）〜（ｇ）のいづれかにおいて生成される免疫複合体の存在が肺癌の存在の表示であり；そして（ｈ）治療の開始に続いて温血動物から採取された第２の痰検体に対して段階（ａ）〜（ｇ）をくり返し、それによって動物における治療の有効性をモニターする段階を含んで成る方法。