DE3688638T2

DE3688638T2 - Monoklonale Antikörper für humane Lungenkarzinome des "Nicht-kleine-Zellen"-Typs.

Info

Publication number: DE3688638T2
Application number: DE86107066T
Authority: DE
Inventors: Joseph P Brown; Ingegerd Heilstrom; Karl Erik Hellstrom; Diana Horn; Peter Linsley
Original assignee: Oncogen LP
Current assignee: Oncogen LP
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1986-05-23
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2006-05-24
Also published as: PH25996A; NZ216214A; FI862242A0; DK166682B1; JP2555028B2; JP2655830B2; DK247486D0; HUT41067A; FI87578B; HU208041B; NO168311C; NO862097L; IE861396L; ES8707863A1; GB8611982D0; YU88586A; JPS6236198A; OA08331A; EP0203552A3; DK247486A

Description

1. Gebiet der Erfindung

Humane Lungenkarzinome sind verantwortlich für die meisten Krebstodesfälle bei Männern und sind dabei, Brustkarzinome als häufigste Krebstodesursache bei Frauen zu übertreffen (Cancer Facts and Figures, 1983). Diese Krankheit kann in 4 histologische Haupttypen unterteilt werden, das sind epidermoide Karzinome (30%), Adenokarzinome (35%), undifferenzierte Karzinome vom Große-Zellen-Typ (15%) und Karzinome vom Kleine-Zellen-Typ (20%). Die meisten Fälle von Lungenkarzinomen sind unheilbar durch Chemotherapie und Bestrahlungstherapie. Bei Lungenkarzinomen vom Kleine-Zellen-Typ kann Chemotherapie und Bestrahlungstherapie zu einer Größenverringerung, jedoch nicht zu einer vollständigen Heilung führen. Die vollständige chirurgische Entfernung des Tumors scheint die einzig wirksame Therapie zu sein. Leider haben jedoch weniger als 30% von Lungenkarzinompatienten Tumore, die bei der Diagnose total resiziert werden können, und von diesen überleben weniger als ein Drittel 5 Jahre nach anscheinend vollständiger chirurgischer Entfernung von allem Tumorgewebe. Es besteht daher ein großer Bedarf an Methoden, welche eine frühzeitigere Diagnose von Lungenkarzinomen, eine bessere Definition des Grades der Karzinomausbreitung und eine wirksamere Therapie ermöglichen.
Monoklonale Antikörper können für alle diese Zwecke verwendet werden. Eine Vorbedingung ist jedoch, daß man Antikörper für Antigene findet, die in Lungenkarzinomen stärker exprimiert werden als in normalen Geweben von Erwachsenen. Im Hinblick auf die bekannte Heterogenität von Tumorzellen- Populationen, das Vorhandensein von mehreren Determinanten am gleichen Antigenmolekül, die vorraussichtlichen Unterschiede zwischen Antigenen hinsichtlich ihrer Eignung als diagnostische Markierer im Vergleich zu therapeutischen Targets, und die verschiedenen biologischen Charakteristika von verschiedenen Antikörpern zum gleichen Antigen kann eine Anzahl verschiedener Antikörper benötigt werden.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Humane monoklonale Antikörper für Lungenkarzinom-Antigene werden beschrieben von Sikora et al., Br. J. Cancer (1981) 43 : 696-700. Monoklonale Antikörper, welche Spezifität für mehrere Typen von humanen Lungenkarzinomen zeigen, werden beschrieben von Cuttitta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1981) 78 : 4591-4595. Antigene, die mit einem humanen Lungen-Adenokarzinom assoziiert sind, das durch monoklonale Antikörper definiert wird, werden beschrieben von Varki et al, Cancer Research (1984) 44 : 681-687.
Monoklonale Antikörper der Maus für Glycolipid Lx-Antigene werden beschrieben von Hakomori et al., in Biochemical and Biophysical Research Communications (1981) 100 : 1578-1586; Brockhaus et al., Arch. Biochem. Biophys. (1982) 217 : 647; Fukushi et al., J. Bio. Chem. (1984) 259 : 4681; Fukushi et al., J. Exp. Med. (1984) 159 : 506; Chia et al., Cancer Res. (1985) 45 : 435. Antikörper für LeY-Antigene sind beschrieben worden von Abe et al., J. Biol. Chem (1983) 258 : 11793; Lloyd et al., Immunogenetics (1983) 17 : 537; Brown et al., Biosci. Rep. (1983) 3 : 163.
Kontinuierliche Kulturen von fusionierten Zellen, welche Antikörper einer vorgegebenen Spezifität ausscheiden, werden beschrieben von Köhler et al., Nature (1975) 265 : 495-497.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft neuartige monoklonale Antikörper, welche determinante Plätze an Kohlenhydrat-(Glykolipid)Antigenen definieren, die mit Zellen des humanen Lungenkarzinoms vom "Nicht-Kleine-Zellen-Typ" (NSCLC) assoziiert sind. Der Ausdruck "NSCLC"-Zellen schließt ein epidermoide Karzinomzellen, Adenokarzinomzellen und undifferenzierte Karzinomzellen vom "Große-Zellen-Typ". Der Determinantenplatz kann auch gefunden werden bei Antigenen von einigen anderen Karzinomen, z. B. einigen Karzinomen der Brust, und daher binden die erfindungsgemäßen Antikörper auch an diese anderen Karzinomzellen.
Die gegenwärtigen monoklonalen Antikörper binden in viel geringerem Grad an normale erwachsene Zellen als an Tumorzellen. Der Ausdruck "binden in viel geringerem Grad" bedeutet, daß die Bindung durch immunohistologische Methoden nicht feststellbar ist und daß eine viel schwächere Bindung an normale Zellen als an Tumorzellen vorliegt. Die monoklonalen Antikörper werden von murinen Hybridomen ausgeschieden. Die Erfindung umfaßt auch Methoden zur Feststellung der Anwesenheit eines malignen Zustands in der Lunge durch Untersuchung von Lungengewebe und anderem humanen Gewebe auf Anwesenheit eines Antigens, das die Charakteristika von Lex oder Ley hat. Das Lex-Antigen wurde beschrieben von Hakomori et al., oben, Brockhaus et al., oben; Fukushi et al., oben und Chia et al., oben. Das Lex&supmin;Antigen wurde beschrieben von Abe et al., oben, Lloyd et al., oben und Brown et al ., oben.
Beispielsweise kann Gewebe von einem Subjekt mit einem Antikörper in Berührung gebracht werden, der einen determinanten Platz an einer Zelle zu einem assoziierten Kohlehydrat-Antigen definiert, das Ley oder Lex ist oder die Charakteristika von Ley oder Lex hat oder ein funktional es Äquivalent oder Fragment eines solchen Antikörpers ist.
So betrifft die Erfindung bestimmte diagnostische Methoden, welche die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper verwenden. Eine solche Methode beinhaltet die Bestimmung der Gegenwart von NSCLC-Zellen in einer Probe, von der man vermutet, daß sie solche Zellen enthält. Diese Probe wird mit dem monoklonalen Antikörper kontaktiert, der solche Zellen von anderen Zelltypen unterscheiden kann, welche in der Probe vorhanden sein können. Der Kontakt wird unter solchen Bedingungen ausgeführt, daß der Antikörper an solche Zellen bindet. Nach dem Kontakt wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Bindung des Antikörpers an die Zellen der Probe bestimmt. Diese Bindung steht in Beziehung zur An- oder Abwesenheit von NSCLC-Zellen in der Probe. Im allgemeinen wird die Probe mit einem markierten spezifischen Bindungspartner für den monoklonalen Antikörper kontaktiert. Diese Markierung kann ein meßbares Signal liefern. Eine andere diagnostische Methode umfaßt die Lokalisierung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die geeignet markiert wurden (z. B. mit einem Radioisotop) und die anschließend Patienten injiziert wurden, an einen Tumor. Diese Methode kann bessere Wege liefern, Karzinompatienten im Hinblick auf das Ausmaß der Krankheit einzustufen und Veränderungen in Folge von Therapie zu verfolgen.
Die Erfindung hat auch therapeutische Anwendungen. Die Antikörper können mit dem einen oder anderen oder beiden der oben erwähnten Antigene reagieren, die an der Tumorzellen- Oberfläche in hohen Konzentrationen exprimiert sind. Sie können als Träger verschiedener Agentien verwendet werden, die einen Anti-Tumor-Effekt haben, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf chemotherapeutische Arzneimittel und Radioisotope.

BESCHREIBUNG BESONDERER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Erfindung betrifft neue Antikörper, welche an ein Antigen oder humane NSCLC-Zellen binden, und bestimmte diagnostische und therapeutische Methoden, welche diese Antikörper verwenden. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können nach den Standardmethoden von Köhler und Milstein, oben, hergestellt werden. Beispielsweise werden humane Lungenkarzinomzellen von pluralen Effusionen oder kultivierte Zellen von humanen Lungenkarzinomen vom "Nicht-Kleine-Zellen- Typ" oder Zellen von einer normalen fötalen Lunge als das Immunogen verwendet. Diese Zellen werden einer Maus injiziert und nach einer genügend langen Zeit wird die Maus geopfert und es werden Milzzellen gewonnen. Die Milzzellen-Chromosomen, welche die gewünschten Immunoglobuline kodieren, werden unbegrenzt am Leben erhalten, indem man sie mit Myelom-Zellen oder Lymphom-Zellen fusioniert, im allgemeinen in Gegenwart von Polyethylenglycol. Man läßt die erhaltenen Zellen, welche die fusionierten Hybridome enthalten, in einem Selektionsmedium wachsen, wie HAT-Medium, und die überlebenden Zellen werden in einem solchen Medium unter Verwendung begrenzender Verdünnungsbedingungen kultiviert. Man läßt die Zellen in einem geeigneten Gefäß wachsen, z. B. Mikrotiter-Löchern, und die überstehende Flüssigkeit wird auf monoklonale Antikörper mit der gewünschten Spezifität geprüft.
Es gibt verschiedene Methoden zur Erhöhung der Ausbeuten an monoklonalen Antikörpern, wie Injektion der Hybridom-Zellen in die Bauchhöhle eines Säugetierwirts, der die Zellen annimmt, und Ernten der Ascites-Flüssigkeit. Wenn sich eine ungenügende Menge des monoklonalen Antikörpers in der Ascites-Flüssigkeit ansammelt, wird der Antikörper aus dem Blut des Wirts geerntet. Es gibt verschiedene übliche Wege zur Isolation und Reinigung der monoklonalen Antikörper, um sie von anderen Proteinen und anderen Verunreinigungen zu befreien (siehe Köhler und Milstein, oben).
Ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper wird mit L15 bezeichnet. Er definiert ein Zell-Oberflächen-Kohlenhydrat- Antigen, das ein Ley-Antigen ist, oder dessen Charakteristika hat. Wir haben dieses Antigen als charakteristisch für humane NSCLC-Zellen und Zellen bestimmter anderer humaner Karzinome identifiziert. Dieser Antikörper ist vom IgM-Isotyp. Er bindet nicht erkennbar an normale Zellen wie Fibroblasten, endotheliale Zellen oder epitheliale Zellen in den Hauptorganen. Der L15-Antikörper wird vom L15-Murin-Hybridom produziert.
Ein anderer erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper wird mit L17 bezeichnet. Er definiert einen Zelloberflächen-Kohlehydrat-Determinanten, der ein Lex -Antigen ist oder dessen Charakteristika hat. Wir haben auch dieses Antigen als charakteristisch für humane NSCLC-Zellen und Zellen bestimmter anderer humaner Karzinome identifiziert. Dieser Antikörper ist vom IgM-Isotyp. Er bindet weniger an normale Zellen, -wie Fibroblasten, endotheliale Zellen oder epitheliale Zellen in den Hauptorganen als an Tumorzellen. Der L17-Antikörper wird vom L17-Murin-Hybridom produziert.
Der Antikörper L15 erkennt das Antigen Ley, das die nachstehend angegebene Struktur hat:
Fucα1→ 2Galβ1→ 4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→R
Eine Reihe von Glycolipiden mit verschiedenen Kettenlängen kann durch diesen Antikörper erfaßt werden.
Der Antikörper L17 reagiert mit einer Reihe von Glycolipid-Antigenen, welche alle am Ende Lex tragen, d. h.:
R kann verschiedene Längen der Kette des Blutgruppentyps 2 sein (Galβ1→4GlcANcβ1→3Galβ1→4GlcNacβ1→3). Der Antikörper reagiert auch mit der Trifucosyl Y-Struktur, wie im folgenden gezeigt:
Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glc
Die Erfindung umfaßt auch brauchbare bindende Fragmente der obigen monoklonalen Antikörper, wie Fab, F(ab')&sub2;, Fv Fragmente usw. Die Antikörper-Fragmente werden durch übliche Methoden erhalten. Beispielsweise können brauchbare Fragmente hergestellt werden durch Peptidase-Verdauung des Antikörpers unter Verwendung von Papain oder Pepsin.
Die Erfindung umfaßt auch bei der Erkennung und Behandlung von NSCLC-Karzinoma beim Menschen die diagnostische und therapeutische Verwendung von Ley- oder Lex-Antigen oder Antigenen, welche die Charakteristika von Lex- und Ley-Antigenen haben, d. h. Antigenen, die mit Ley oder Lex verwandt, jedoch nicht identisch sind und welche von einem Antikörper erkannt werden, der auch Ley oder Lex erkennt. Das Antigen kann nach üblichen Methoden gereinigt werden, wie sie von Hakomori et al., oben und vom Abe et al., oben beschrieben wurden.
Eine Methode der Erfindung umfaßt die Bestimmung des Vorliegens eines malignen Zustands in der Lunge eines Subjekts durch Untersuchung von Lungengewebe oder anderem Gewebe des Subjekts auf Anwesenheit eines Kohlenhydrat-Antigens, das Ley oder Lex ist oder die Charakteristika von Ley oder Lex hat. Der Ausdruck "Gewebe" bezeichnet herausgeschnittene Zellen, exfoliative Zellen, Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Urin usw. und dergleichen. Der Ausdruck "maligner Zustand" bezieht sich auf die Anwesenheit von dysplastischen Zellen, einschließlich Karzinom in situ, neoplastischen, malignen oder Tumorzellen oder dergleichen. Beispielsweise kann die Probe mit einem monoklonalen Antikörper kontaktiert oder kombiniert werden, der einen determinanten Platz an Ley oder Lex erkennt, wie ein monoklonaler Antikörper der Erfindung z. B. wie ein L15 oder L17-Antikörper oder ein Antikörper mit ähnlichen Charakteristika, wie beispielsweise die Antikörper, die beschrieben wurden von Hakomori et al., oben, Fukushi et al., oben, Chia et al., oben, Abe et al., oben, Lloyd et al., oben, und Brown et al., oben.
Der Kontakt wird unter Bedingungen durchgeführt, die das Binden des Antikörpers an die malignen Zellen gestatten. Nach dem Kontakt wird das Vorhandensein von Bindung des Antikörpers an die malignen Zellen in der Probe beobachtet. Das heißt, die Probe wird auf Immunkompleexe des Antikörpers und des Antigenplatzes untersucht. Diese Immunkomplexbildung steht in Beziehung zur Gegenwart von malignen Zellen in der Probe.
Ein besonderes Beispiel zur Erläuterung, aber nicht Begrenzung einer erfindungsgemäßen Methode ist eine Methode zum Nachweis von Tumorzellen in herausgeschnittenem Gewebe. Diese Methode wird angewandt auf eine Probe, die ein Schnitt des Tumors ist, der nach Entfernung des Tumors erhalten wurde. Der herausgeschnittene Tumor wird behandelt, um Schnitte zu erhalten, was zunächst das Einfrieren des Tumors oder Gewebes, normalerweise unmittelbar nach dem Herausschneiden erfordert. Das gefrorene Gewebe wird dann unter Verwendung beispielsweise eines Cryostats in die gewünschten Schnitte zerschnitten.
Diese Schnitte des Tumors werden mit einem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper kontaktiert und dann mit einem zweiten Antikörper, der gegen den obigen monoklonalen Antikörper gerichtet ist, wobei der zweite Antikörper meßbar markiert ist.
Die ausgeschnittene Probe, z. B. der Schnitt des Tumors, wird mit dem ersten monoklonalen Antikörper unter Bedingungen für die Bindung des Antikörpers an die malignen Zellen kontaktiert. Die Inkubation wird im allgemeinen in einem wäßrigen Medium, wie z. B. phosphatgepufferte Salzlösung, die eine kleine Menge Natriumazid enthält, in einem geeigneten Behälter, z. B. einer Petri-Glasschale während einer Zeitdauer von etwa 15 bis 30 Minuten bei einer Temperatur von etwa 20 bis 30ºC vorgenommen. Die verwendete Menge an Antikörper ist gewöhnlich ausreichend, um eine meßbare Bindung zu liefern, d. h. eine meßbare Zahl von Immunkomplexen zwischen dem Antikörper und dem fraglichen Determinanten oder Antigenplatz.
Nach der Inkubation wird der Schnitt gewaschen, um unspezifisch gebundene Antikörper zu verringern oder zu beseitigen, und wird dann untersucht, um die oben erwähnten Komplexe zu beobachten, welche aus der Bindung des monoklonalen Antikörpers an die Zellen der Probe, welche den Antigenplatz aufweisen, resultieren. Die Bindung steht in Bezug zur Gegenwart von malignen Zellen im Schnitt. Entsprechen wird die Bindung beispielsweise bestimmt, indem man die Probe mit einem markierten spezifischen Bindungspartner für den monoklonalen Antikörper kontaktiert. Die Markierung liefert ein meßbares Signal und kann eine radioaktive Markierung, ein Chromophor sowie eine fluoreszierende Substanz, ein Enzym oder dergleichen sein.
Ein Beispiel einer Technik, welche den obigen Weg verwendet, ist die Immunofluoreszenzfärbung. Bei dieser Methode werden gefrorene Schnitte des Tumors auf einem Objektträger aus Glas mit Aceton fixiert und mit dem monoklonalen Antikörper in beispielsweise einer Petri-Schale inkubiert. Nach dem Waschen mit einem geeigneten Puffer, wie z. B. phosphatgepufferte Salzlösung, wird der Schnitt auf eine Petri-Schale gelegt und mit dem markierten spezifischen Bindungspartner für den monoklonalen Antikörper kontaktiert, der beispielsweise ein für den verwendeten monoklonalen Antikörper spezifischer markierter Antikörper sein kann. Da der monoklonale Antikörper meist von einer murinen Quelle abgeleitet ist, kann ein markiertes Anti-Maus-Immunoglobulin verwendet werden, das für den monoklonalen Antikörper spezifisch ist. Solche Immunoglobuline können nach -Standardmethoden herangezogen werden, indem man einem geeigneten Wirt murinen Antikörper injiziert, eine angemessene Zeit wartet und die Anti-Maus-Immunoglobuline aus dem Blut des injizierten Wirtes erntet.
Nach einem zweiten Waschen des Objektträgers mit z. B. einem wäßrigen Puffer können die Schnitte mit einem Präparierfluid für fluoreszierende Antikörper und einem Deckglas bedeckt und dann mit einem Fluoreszenz-Mikroskop untersucht werden, um die Bindung des monoklonalen Antikörpers an den Schnitt zu bestimmen. Die Bestimmung der Bindung kann auch eine Identifizierung des Ortes einer solchen Bindung in der Probe umfassen.
Die Bindung des monoklonalen Antikörpers an die Probe kann auch bestimmt werden durch Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der kovalent mit einer Markierung konjugiert wird, die ein meßbares Signal erzeugt, wie eine radioaktive Einheit, ein Chromophor, einschließlich Farbstoffe und fluoreszierende Substanzen, oder ein Enzym. Die Anzahl von Markierungen, die pro Antikörper verwendet wird, wird im allgemeinen durch die Anforderungen der diagnostischen Methode bestimmt, in welcher der markierte Antikörper verwendet wird, und durch die Verfügbarkeit von Plätzen zur Verbindung der Markierung mit dem Antikörper.
Methoden zur Konjugierung von Markierungen an Antikörpern und Antikörperfragmenten sind bekannt und beispielsweise beschrieben in den USA-Patenten Nr. 4 220 450; 4 235 869; 3 935 074 und 3 996 345.
Ein anderes Beispiel einer Technik, bei der die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper verwendet werden können, ist die Erfassung von Molekülen, welche die Lex- und Ley-Determinanten tragen, in Körperflüssigkeiten, einschließlich Plasma und Serum. Für diesen Zweck kann der erfindungsgemäße Antikörper allein oder in Verbindung mit einem anderen, gegen einen getrennten Determinanten gerichteten Antikörper verwendet werden.
Noch ein weiteres Beispiel einer Methode, in welcher der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper verwendet werden kann, ist die Immunoperoxidase-Markierung (Sternberger, Immunocytochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1979, pp.104-169, modifiziert nach Garrigues et al., Int. J. Cancer (1982) 29 : 511-515). Das zu prüfende Gewebe wird mit einem geeigneten Lösungsmittel wie Aceton, auf einem Träger, wie einem Glas-Objektträger fixiert. Dann wird das Gewebe mit dem monoklonalen Antikörper inkubiert und anschließend durch Wäschen von ungebundenem Antikörper befreit. Das Gewebe wird dann mit Kaninchen-anti-Maus-IgG inkubiert, gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen, mit dem Maus-Peroxydase-Antiperoxydase-Komplex kombiniert, zur Entfernung von ungebundenem Konjugat gewaschen und dann mit Substrat für das Enzym behandelt. Nach dieser Behandlung wird der Objektträger auf ein meßbares Signal untersucht.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können verwendet werden in einem Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens eines malignen Zustands z. B. in einer exfoliativen Zellprobe von der Lunge, wie Sputum oder in einem Cervix-Abstrich. Mit dem Ausdruck "exfoliativ" ist gemeint, daß die Probe isolierte Zellen oder Zellklumpen enthält, die durch Schaben oder Waschen der Oberfläche des Gewebes erhalten wurden, wobei diese Zellen einzeln oder in Schuppen oder Schichten entfernt werden. Die exfoliative Zellprobe ist zu unterscheiden von ausgeschnittenem Gewebe, wie es durch Biopsie erhalten wird. Der Kontakt zwischen der Probe und dem Antikörper wird unter Bedingungen für die Bindung des Antikörpers an den Antigenplatz hergestellt. Nach dem Kontakt wird das Vorliegen oder die Abwesenheit von Bindung des Antikörpers an den Antigenplatz bestimmt, die in Beziehung steht zur Vorliegen eines malignen Zustands in der Lunge.
Um das Vorliegen eines malignen Zustands in der Lunge zu bestimmen, würde eine Sputumprobe die in der Methode zu verwendende exfoliative Zellprobe liefern. Die Methode kann Anwendung finden in der Erfassung eines malignen Zustands in exfoliativen Zellproben vom Bronchus, gastro-intestinalen Trakt, einschließlich oralem Pharynx, Mund, usw.
Die exfoliative Zellprobe wird dann mit den erwähnten Antikörpern unter Bedingungen zur Bindung des Antikörpers an den spezifischen Antigenplatz in der Probe kontaktiert, um Antigen- Antikörperkomplexe zu bilden. Dieser Antigenplatz kann an Zellen oder Zellfragmenten in der Probe vorhanden sein. Im allgemeinen wird die Probe auf einen geeigneten Träger, beispielsweise auf einen Objektträger, gewöhnlich aus Glas oder einem anderen geeigneten Material gebracht. Die exfoliative Zellprobe wird im allgemeinen auf den Objektträger gestrichen, um eine dünne Schicht der Probe auf der Oberfläche des Objektträgers zu liefern. Der Kontakt zwischen dem Antikörper und der Probe wird im allgemeinen in einem wäßrigen gepufferten Medium durchgeführt. Zu den verwendbaren Puffern gehören Phosphat, Tris, Bicarbonat usw. Der pH steht in Beziehung zu der Art der Probe und des Antikörpers und liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 5 bis 8. Das wäßrige Medium kann zusätzlich organische polare Lösungsmittel in einer Menge von etwa 0 bis 40% enthalten. Die organischen polaren Lösungsmittel sind wasserlöslich und haben im allgemeinen von 1 bis 10 Kohlenstoffatome und von etwa 1 bis 4 Sauerstoffatome. Der Antikörper liegt im wäßrigen Medium in einer Konzentration von etwa 1 bis 100 ug/ml, vorzugsweise von etwa 10 bis 20 ug/ml vor. Die Temperatur während des Kontakt der Probe mit dem Antikörper liegt gewöhnlich bei etwa 4 bis 40ºC, vorzugsweise etwa 10 bis 30ºC. Die Kontaktdauer beträgt gewöhnlich etwa 15 bis 120 Minuten, vorzugsweise etwa 30 bis 60 Minuten.
Nach der Kontaktzeit zwischen der Probe und dem Antikörper wird der Träger im allgemeinen behandelt, um nicht umgesetzten Antikörper zu entfernen. Normalerweise erfolgt das durch Waschen des Trägers mit einem wäßrigen, gewöhnlich gepufferten Medium. Im allgemeinen sollte die Menge der Waschlösung ausreichen, um den nicht umgesetzten Antikörper zu entfernen.
Als nächstes wird die Anwesenheit von an den Antigenplatz an der Probe gebundenen Antikörper bestimmt, wobei diese Bindung mit dem Vorliegen eines malignen Zustands am Ort in Beziehung steht. Das heißt, die Probe wird untersucht, um die Anzahl der gebildeten Antigen-Antikörper-(Immun)komplexe zu bestimmen. Es sei bemerkt, daß in manchen Fällen in den exfoliativen Zellproben eine sehr kleine Zahl der fraglichen Antigenplätze gefunden werden kann. Jedoch wird bei einem malignen Zustand eine große Zahl der Antigenplätze vorhanden sein und dieser letztere Zustand ist nach dieser Methode leicht unterscheidbar von einem nicht malignen Zustand, da eine große Zahl von Antigen-Antikörper-Komplexen gemessen werden kann, wo ein maligner Zustand besteht. Um die Bestimmung des Vorliegens der Bindung durchzuführen, werden im Testsystem Maßnahmen zur Erzeugung eines meßbaren Signals vorgesehen. Beispielsweise kann man den im Test verwendeten Antikörper mit einer Markierung konjugieren, die ein meßbares Signal liefern kann. Die Markierung kann eine radioaktive Einheit, ein Chromophor, einschließlich Farbstoffe und fluoreszierende Substanzen, ein Enzym oder dergleichen sein. Die Zahl der für den Antikörper verwendeten Markierungen wird im allgemeinen bestimmt durch die Forderungen der Methode und die Verfügbarkeit von Plätzen zur Verbindung der Markierung mit dem Antikörper.
Statt dessen kann man den gewaschenen Objektträger mit einem markierten spezifischen Bindungspartner für den Antikörper kontaktieren, beispielsweise ein für den verwendeten Antikörper spezifischer markierter Antikörper. Wenn der monoklonale Antikörper von muriner Herkunft ist, kann ein für den in der Methode verwendeten Antikörper spezifisches markiertes Anti- Maus-Immunoglobulin verwendet werden. Solche Immunoglobuline können nach Standardmethoden herangezogen werden, indem man einem geeigneten Wirt den monoklonalen Antikörper injiziert, eine angemessene Zeit wartet und die Anti-Maus-Immunoglobuline vom Blut des injizierten Wirtes erntet. Wenn ein markierter spezifischer Bindungspartner für den Antikörper verwendet wird, muß der Objektträger vor seiner Untersuchung auf Fluoreszenz wiederum mit einem wäßrigen Medium gewaschen werden.
Um das Vorliegen der Bindung zwischen dem Antikörper und der Zellprobe bei Verwendung einer fluoreszierenden Substanz als Markierer zu bestimmen, wird gewöhnlich ein Fluoreszenz-Mikroskop verwendet. Wo eine andere Markierung als eine fluoreszierende Substanz verwendet wird, kann man den Objektträger oder die Probe auf die Bildung einer Ausfällung, einer Färbung oder dergleichen untersuchen. Die obige Beschreibung ist in erster Linie auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper in Immunofluoreszenzmethoden gerichtet. Die erfindungsgemäßen Antikörper können jedoch in den meisten Tests verwendet werden, welche Antigen-Antikörper-Reaktionen umfassen. Diese Tests können homogen oder heterogen sein. In einem homogenen Test kann die Probe eine biologische Flüssigkeit, wie Serum, Urin oder dergleichen sein oder einer Lyse und Klärung unterworfen worden sein, um Trümmer zu entfernen. Die immunologische Reaktion umfaßt gewöhnlich den spezifischen Antikörper, einen markierten Analyten und die interessierende Probe. Das von der Markierung gelieferte Signal wird direkt oder indirekt beim Binden des Antikörpers an den markierten Analyten modifiziert. Sowohl die immunologische Reaktion als auch die Messung von deren Ausmaß werden in einer homogenen Lösung durchgeführt. Zu verwendbaren immunochemischen Markierungen gehören freie Radikale, fluoreszierende Farbstoffe, Enzyme, Bakteriophagen, Co-Enzyme usw.
Bei einem heterogenen Test sind die Reagenzien gewöhnlich die Probe, der spezifische Antikörper und Maßnahmen zur Erzeugung eines meßbaren Signals. Die Probe wird im allgemeinen auf einen Träger gebracht, wie eine Platte oder einen Objektträger, und mit dem Antikörper in einer flüssigen Phase kontaktiert. Der Träger wird dann von der flüssigen Phase getrennt, und entweder die Trägerphase oder die flüssige Phase wird unter Anwendung der Maßnahmen zur Erzeugung eines solchen Signals auf ein meßbares Signal hin untersucht. Das Signal steht in Beziehung zur Anwesenheit des Analyten in der Probe. Zu Maßnahmen zur Erzeugung eines meßbaren Signals gehören die Verwendung von radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden Substanzen, Enzymen usw. Beispiele von heterogenen Immunotests sind der Radio-Immunotest, Immuno-Fluoreszenzmethoden, mit Enzymen arbeitende Immunotest und dergleichen. Eine weitergehende Diskussion der erwähnten Immunotest-Methoden findet sich in "Enzyme-Immunoassay" von Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Siehe auch beispielsweise die USA-Patente Nr. 3 690 834; 3 791 932; 3 817 837; 3 850 578; 3 853 987; 3 867 517; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345 und 4 098 876, wobei diese Aufzählung nicht als erschöpfend anzusehen ist.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch verwendet werden, um metastatische Abscheidungen in menschlichen Patienten mit NSCLC abzubilden, in einer Weise analog wie für maligne Melanome in J. Nucl. Med. (1983) 24 : 123-129 und in J. Clin. Invest. (1983) 72 : 2101-2114 beschrieben. Der Antikörper oder dessen Fragmente werden radio-markiert und einem Patienten intravenös verabreicht, von dem anschließend Abbildungen gewonnen werden, beispielsweise unter Verwendung einer Gamma-Kamera oder dergleichen.
Während die obigen spezifischen Beispiele von Methoden gemäß der vorliegenden Erfindung Antikörper verwenden, welche an spezifischen. Determinanten-Plätzen an den jeweiligen Antigenen binden und zu den IgM Sub-Klassen von einer murinen Quelle gehören, soll das keine Begrenzung sein. Die obigen Antikörper und solche Antikörper, die zu ihnen funktional äquivalent sind, ob von einer murinen Quelle, einer anderen Säugetierquelle, einschließlich menschlichen Quelle oder anderen Quellen oder Kombinationen davon, können in der erfindungsgemäßen Methode verwendet werden, ebenso wie andere Isotypen. Mit dem Ausdruck "funktionell äquivalent" ist gemeint, daß der Antikörper an beide der jeweiligen oben beschriebenen determinanten Plätze oder einen von beiden binden kann und mit einem bestimmten erfindungsgemäßen Antikörper um einen solchen Platz in Konkurrenz treten kann. Das heißt, ein solcher Antikörper, wenn er mit einer eine Zelle oder ein Zellfragment oder ein ausgeschiedenes Antigen mit einem solchen determinanten Platz enthaltenden Probe kombiniert, bindet sich an einen solchen determinanten Platz und blockiert die Bindung eines erfindungsgemäßen Antikörpers an einen solchen Platz. Weiterhin, da die Ley- und Lex-Antigene mehr als einen determinanten Platz haben können, schließt die erfindungsgemäße Methode die Verwendung von monoklonalen Antikörpern ein, welche andere determinante Plätze definieren als die durch die oben erwähnten monoklonalen Antikörper definierten determinanten Plätze.
Die Erfindung umfaßt auch Diagnosekits zur Durchführung der oben beschriebenen Methoden. In einer Ausführungsform enthält der Diagnosekit (a) einen oben genauer definierten monoklonalen Antikörper und (b) ein Konjugat eines spezifischen Bindungspartners für den obigen monoklonalen Antikörper und eine Markierung, die ein meßbares Signal liefern kann. Die Reagenzien können auch Hilfsreagenzien umfassen, wie Puffermittel und Proteinstabilisatoren, z. B. Polysaccharide und dergleichen. Der Diagnosekit kann weiterhin, falls erforderlich andere Mitglieder des signalerzeugenden Systems einschließen, von dem die Markierung ein Mitglied ist, sowie Mittel zur Verringerung der Hintergrundstörung in einem Test, Kontrollreagenzien, Geräte zur Durchführung eines Tests und dergleichen. In einer anderen Ausführungsform enthält der Diagnosekit ein Konjugat eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers und eine Markierung, die ein meßbares Signal erzeugen kann. Zusätzliche Hilfs-Reagenzien wie oben erwähnt können auch vorhanden sein.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können therapeutisch verwendet werden. Antikörper mit geeigneten biologischen Eigenschaften können unmittelbar als therapeutische Mittel brauchbar sein: Sears, et al., Contrl. Oncol. Karger, Basel, (1984) 19 : 180-192. Weiterhin können die Antikörper gebunden sein an ein Toxin, um ein Immunotoxin zu bilden, oder an ein radioaktives Material oder Arzneimittel, um ein radiopharmazeutisches oder pharmazeutisches Material zu bilden. Methoden zur Erzeugung von Immunotoxinen und Radio-Medikamenten von Antikörpern sind bekannt (siehe z. B. Cancer Treatment Reports (1984) 68 : 317-328).
Eine weitere therapeutische Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper ist die Immunisierung eines Patienten mit einem anti-idiotypischen Antikörper, der durch Verwendung eines der vorliegenden monoklonalen Antikörper als ein Immunogen herangezogen wurde. Eine solche Immunisierung kann eine aktive Anti-Tumor-Aktivität induzieren (siehe z. B. Nepom et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1984) 81 : 2864-2867. Auf einem ähnlichen Weg kann der Patient mit dem jeweiligen Antigen in gereinigter Form oder mit einer modifizierten Form der jeweiligen Antigene immunisiert werden.
Ein interessanter Aspekt der Erfindung ist, daß die vorliegenden Antikörper mit anderen Antikörpern für NSCLC kombiniert werden können, wie diejenigen, die in den USA-Patentanmeldungen Ser.No. 667 521 und 684 759, Anmeldetag 2. November 1984 bzw. 21. Dezember 1984 beschrieben sind. Die Kombination ist wirksam zur Erfassung von wenigstens den vier oben erwähnten Typen von Lungenkarzinom, nämlich Lungenkarzinome vom Typ "Große undifferenzierte Zellen", Lungenkarzinome vom Typ "Kleine Zellen", Adenokarzinome und Epidermoidkarzinome.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper definieren auch determinante Plätze an Antigenen, die mit anderen Karzinomen, wie Brustkarzinomen, assoziiert sind. Demgemäß können die erfindungsgemäßen Antikörper auch in diagnostischen und therapeutischen Produkten Anwendung finden, die gegen solche Karzinome gerichtet sind.

Beispiele

Die Erfindung wird weiter erläutert durch die folgenden Beispiele. Zunächst wird eine Anzahl der verwendeten Verfahren beschrieben.

Immunohistologische Methode

Für immunohistologische Untersuchungen von gefrorenen Schnitten wurde die mit unmarkierten Antikörpern arbeitende Methode von Sternberger in Immunochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1979, pp: 104-169, modifiziert von Garrigues et al. in Int. J. Cancer (1982) 29 : 511-515 verwendet. Die Zielgewebe (Target) für diese Tests wurden bei chirurgischen Eingriffen erhalten und innerhalb 4 Stunden nach der Entnahme in Isopentan eingefroren, das in flüssigem Stickstoff vorgekühlt worden war. Die Gewebe wurden dann in flüssigem Stickstoff oder bei -70ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Kaninchen-Anti-Maus-IgG (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) wurde in einer Verdünnung von 1/50 verwendet. Maus-Peroxidase-Antiperoxidase-Komplex (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) mit einem Gehalt von 2 mg/ml von spezifisch gereinigtem PAP wurde in einer Verdünnung von 1/80 verwendet. Gefrorene Schnitte wurden hergestellt, getrocknet, mit Aceton behandelt und getrocknet (Garrigues et al., 1982). Schnitte zur Verwendung für histologische Bewertung wurden mit Hämatoxylin gefärbt. Zur Verringerung des unspezifischen Hintergrunds wurden die Schnitte mit normalen Humanserum in der Verdünnung 1/5 prä-inkubiert (Garrigues et al., 1982). Maus-Antikörper, Ziegen-Anti-Maus-IgG und Maus-PAP wurden in einer Lösung von 10% normalem Humanserum und 3% Kaninchenserum verdünnt.
Die Färbeprozedur bestand darin, Reihenschnitte mit entweder spezifischen oder Kontroll-Antikörpern während 2,5 Stunden zu behandeln, 30 Minuten mit Kaninchen-Anti-Maus-IgG in der Verdünnung 1/50 zu inkubieren und 30 Minuten Maus-PAP-Komplex in der Verdünnung 1/80 auszusetzen. Nach jeder Behandlung mit Antikörpern wurden die Objektträger zweimal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Die immunohistochemische Reaktion wurde entwickelt mit frisch hergestelltem 0,05% 3,3'-Diaminobenzidin-tetrahydochlorid (Sigma, St. Louis, MO) und 0,01% Wasserstoffperoxid und 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6 während 8 Minuten. Weitere Behandlung in einer 1% OsO&sub4;-Lösung in destilliertem Wasser während 20 Minuten verstärkte die Färbung. Die Schnitte wurden mit Wasser gespült, in Alkohol entwässert, in Xylol geklärt und auf Objektträger aufgebracht.
Die Objektträger wurden jeder unter Code gelesen und codierte Proben wurden von unabhängigen Untersuchern geprüft. Typische Objektträger wurden unter Verwendung von Differential- Interferenz-Kontrast-Optik (Zeiss-Nomarski) fotografiert. Der Grad von Antikörperfärbung wurde bewertet mit 0 (keine Reaktivität), + (wenige positive Zellen), ++ ( wenigstens ein Drittel der Zellen positiv), +++ (die meisten Zellen positiv), ++++ (fast alle Zellen stark positiv). Da die Unterschiede zwischen + und O-Färbung weniger deutlich waren als zwischen ++ und + Färbung, wurde entschieden, als "positiv" einen Färbungsgrad von ++ oder darüber zu zählen. Sowohl neoplastische als auch Stromazellen wurden in Tumorproben beobachtet; die aufgezeichnete Färbung bezog sich auf die der Tumorzellen, da die Stromazellen überhaupt nicht oder schwächer als die Tumorzellen gefärbt wurden.

Bestimmung des Antigenortes

Die subzellulare Ortung von Antigenen wurde durchgeführt durch Messung der Antikörperbindung an Zellen vor oder nach Permeabilisierung mit nicht-ionischem Netzmittel. Antikörper, die an die Zelloberfläche von intakten kultivierten Zellen binden, wurden entweder durch direkte Bindetests mit ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper (Brown et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1981) 78 : 539-543) oder durch indirekte Fluoreszenz unter Verwendung des (FACS) II Zellsortierers identifiziert. Antikörper, welche an intrazellulare Orte binden, wurden durch direkte Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper an Zellen und anschließende Fixierung mit Paraformaldehyd und anschließende Permeabilisierung mit nicht-ionischem Netzmittel NP-40 bestimmt.

Bindetests

a) Für Bindetests, die unter Verwendung von radiomarkierten Antikörpern durchgeführt wurden (Brown et al., oben), wurden kultivierte Zellen (10&sup6;) bei 4ºC 30 Minuten mit 10&sup6; cpm von ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper in 100 ul von wärmeaktiviertem (30 Minuten bei 56ºC) fötalem Kälberserum im Kulturmedium inkubiert. Nach Zugabe von 5 ml PBS wurden die Zellen durch Zentrifugieren während 10 Minuten bei 250 · g pelletiert. Die Überstehende Flüssigkeit wurde abgesaugt und das Pellet wurde auf ¹²&sup5;I gezählt. Um nicht spezifisches Binden zu bemessen, wurden parallele Inkubierungen mit 10 ug unmarkiertem Antikörper als Konkurrent durchgeführt (Brown et al., oben). In einigen Fällen wurden Bindetests in einer analogen Weise an in einer Schicht an Kunststoff-Kulturschalen haftenden Zellen durchgeführt.
b) Für Bindetests, die mit dem FACS II Zellsortierer durchgeführt wurden, wurden Zellen von ihren Substraten unter Verwendung von PBS mit einem Gehalt von 5 mM Ethylendiamintetra-essigsäure (EDTA) entfernt. Proben, die 1 · 10&sup5; Zellen enthielten, wurden zunächst mit monoklonalem Antikörper in einer Konzentration von 2 ug/ml inkubiert und dann mit Fluoreszein-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Antikörper mit einer Verdünnung von 1 : 200. Die Zellen wurden dann gewaschen und in Kulturmedium re-suspendiert. Unmittelbar vor der FACS-Analyse wurde Propidium-Iodid auf eine Endkonzentration von 1 ug/ml zugefügt, um unbrauchbare Zellen zu färben.
Während der FACS-Analyse wurden rot fluoreszierende Zellen elektronisch abgetrennt, so daß nur brauchbare Zellen untersucht wurden. Die mittlere Intensität von Fluoreszein-Fluoreszenz wurde dann für jeden Antikörper bestimmt. Negative Kontrollen bestanden aus Proben, bei denen monoklonaler Antikörper weggelassen war. Positive Kontrollen bestanden aus monoklonalen Antikörpern für HLA-Typ 1 Histokompatibilität-Antigene. Die Färbung wurde als positiv angesehen, wenn das Mittelkanal-Fluoreszein wenigstens dem dreifachen Hintergrund entsprach.

Bestimmung der Reaktivität von Antikörpern gegenüber Glycolipiden

Antikörper wurden auf Reaktivität an Glykolipid-Antigenen getestet durch Inkubation mit gereinigten Glykolipiden, die an Mikrotiterlöchern absorbiert waren (zusammen mit Cholesterol und Lecithin), und mit Dünnschicht-Chromatographieplatten, auf denen Glycolipide fraktioniert worden waren. Gebundener Antikörper wurde erfaßt durch Inkubation mit Antiserum für Maus-Immunoglobulin und mit Radio-Iod-markiertem Protein A.

Isotyp-Bestimmung

a) Ouchterlony Immunodiffusion

Ein Aliquot von überstehender Flüssigkeit von bestimmten Hybridom-Zellen wurde in das Mittelloch einer 2% Agarplatte gegeben. Monospezifische Kaninchen-Anti-Maus-Ig-Isotyp-Antikörper (Meloy) wurden in die äußeren Löcher gegeben und die Platte wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur und über Nacht bei 4ºC inkubiert.
b) Flexible Polyvinylchlorid 96 Lochplatten (Costar) wurden mit 0,1 mg/ml Ziegen-Anti-Maus-Ig-Antikörpern zwei Stunden bei 37ºC beschichtet und während zwei Stunden bei 37ºC gegenbeschichtet mit einer 3%- BSA-Lösung. Der Hybridom-Überstand wurde dann bei 37ºC zwei Stunden inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden Rinderserum-Albumin (BSA)-Platten zwei Stunden bei 37ºC mit monospezifischen Kaninchen-Anti-Maus-Ig- Isotyp-Antikörpern gekoppelt an Peroxidase (Zymed) inkubiert. Nach dem raschen wurden die Platten mit 1 mg/ml Orthophenylendiamin und 0,03% H&sub2;O&sub2;in 0,1 M Citratpuffer pH 4,5 inkubiert. Die optische Dichte bei 630 nm wurde mit einem Dynatec ELISA Plattenlesegerät bestimmt.

Staphylokokkenprotein A-Bindetest

Mikrotiterlöcher wurden mit 5% FCS ind PBS plus 0,02% NaN&sub3; inkubiert und der Überstand wurde angesaugt. 25 ul einer Suspension von Tumorzellen (2 · 10&sup7; Zellen/ml) wurden zu jedem Loch zugefügt und mit 25 ul eines bestimmten Antikörpers 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden mit 1200 Upm 7 Minuten zentrifugiert, zwei mal mit 50% NCS/PBS/NaN&sub3; gewaschen, und 25 ul ¹²&sup5;I-Staphylokokkenprotein A (etwa 50.000 cpm/25 l) wurden zugefügt. Die Platten wurden 1 Stunde bei 25ºC inkubiert, zweimal mit 5% NCS/PBS/NaN&sub3; gewaschen und getrocknet. Die Böden der Löcher wurden abgeschnitten und in einem Gammazähler gezählt.

BEISPIEL

Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Monoklonale Antikörper wurden hergestellt durch Immunisieren von 3 Monate alten BALB/c-Mäusen mit Zellen von pleuralen Effusionen von Patienten mit metastatischen Lungenkarzinomen vom "Nicht-kleine-Zellen-Typ". Die Immunisierungen wurden vorgenommen, indem man den Mäusen intraperitoneal 3-4 mal etwa 10&sup7; Zellen injizierte. Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Milze entfernt, in Kulturmedium suspendiert und dann mit NS1 Maus-Myelom-Zellen (Köhler und Milstein, oben) fusioniert. Die Mischungen wurden ausgesät, um Kulturen niedriger Dichte zu bilden, die von einzelnen verschmolzenen Zellen (Klonen) ausgingen. Die für die Hybridisierung verwendeten Techniken wurden zuvor beschrieben von Yeh, et al., Int. J. Cancer (1979) 29 : 269-275.
Überstände von Hybridzellen wurden der Reihenuntersuchung unterworfen unter Verwendung sowohl eines ELISA-Tests als auch eines autoradiographischen indirekten ¹²&sup5;I-markierten Protein A-Tests (Brown et al., J. Immunol. Meth. (1979) 31 : 201-209) gegen Extrakte von den zur Immunisierung verwendeten Tumoren, die unter anderem Zellmembranen enthielten. Diese Extrakte wurden hergestellt unter Anwendung eines modifizierten Verfahrens von Colcher et al., Cancer Res., (1981) 42 : 1451-1459; Yeh et al., oben. Dafür wurden Gewebe mit PBS gewaschen und suspendiert, was für intakte Tumore vorgenommen wurden, indem man sie durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl preßte. Danach wurde 1 mM NaHCO3t mit einem Gehalt von 1 mM Phylmethylsulfonylfluorid (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA) zugefügt, und das Material wurde dann auf Eis mit 50 Streichen des B-Pistills eines Dounce Homogenisators homogenisiert. Nach 15 Minuten Zentrifugieren bei 27.000 · g wurde der Überstand entfernt und das Pellet in PBS resuspendiert, eine Minute mit Schall bestrahlt und bei -70ºC gelagert.
Hybridome, welche an die Zellmembranextrakte bindende Antikörper produzierten, wurden geklont, in vitro expandiert und weiter auf Antikörperspezifität getestet. Dieses Testen wurde durchgeführt unter Verwendung der oben beschriebenen immunohistologischen Methode, wobei die Fähigkeit der Antikörper, an gefrorene Schnitte von Lungenkarzinomen, anderen Tumoren und normalem Humangewebe zu binden, getestet wurde. Diejenigen Hybridome, welche Antikörper von anscheinender Spezifität für humanes Lungenkarzinom entwickelten, wurden wieder geklont, expandiert und in Pristan-vorbehandelte 3 Monate alte BALB/c-Mäuse injiziert, wo sie als Ascites-Tumoren wuchsen.
In die Ascites ausgeschiedene Antikörper wurden an Protein- A Sepharose (Ey et al., Immunochemistry (1978) 15 : 429) oder durch Gelfiltration in Sephacryl S-300 gereinigt. Gereinigte Antikörper wurden verwendet zur weiteren Charakterisierung, wozu zusätzliche Spezifitätsteste durch Immunohistologie, Bindetests an intakten Zellen, um zu bestimmen, welche Antikörper an die Zelloberfläche binden, und die oben beschriebenen Radio-Immuno- Fällungstests gehörten.
Monoklonale Antikörper L15 und L17 wurden aus dem entsprechenden Hybridom wie oben beschrieben hergestellt. Diese Antikörper zeigten die in dieser Beschreibung oben angegebenen Eigenschaften.
Die Antikörper L15 und L17 wurden der oben beschriebenen immunohistologischen Methode unterworfen.
Der Antikörper L15 band stark an NSCLC-Zellen und band nicht an die folgenden Zellen: Colonkarzinom, Brustkarzinom, normales Herz, Leukozyten, Hirn, Cplon, Niere, Milz, Haut und Leber.
Der Antikörper L17 band stark an NSCLC-Zellen, Colon Karzinom-Zellen und Brustkarzinom-Zellen. L17 zeigte schwache Bindung mit Leukozyten und keine Bindung mit den folgenden Zellen: normales Herz, Gehirn, Colon, Niere, Milz, Haut, Leber.
Die mit L15 und L17 bezeichneten Zell-Linien wurden beide am 1. März 1985 bei A.T.C.C. hinterlegt und erhielten die Zugangsnummern HB8738 bzw. HB8739.
Die Erfindung wurde im einzelnen mit besonderem Bezug auf die obigen Ausführungsformen beschrieben. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß Veränderungen und Abwandlungen im Sinn und Rahmen der Erfindung vorgenommen werden können.

Claims

1. Ein monoklonaler Antikörper mit der Bezeichnung L15 erzeugt von der Hybridoma-Zell-Linie HB 8738, die bei der ATCC hinterlegt ist, dessen Antigen-Kombinationsplatz Ley ein Oberflächen-Kohlenhydrat Antigen definiert, das für humane Lungenkarzinome des "Nicht-Kleine-Zellen"-Typs charakteristisch ist, sowie Fab-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragmente des monoklonalen Antikörpers, die konjugiert werden können mit einer Markierung, die ein meßbares Signal liefern kann-.

2. Ein Fab-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragment des monoklonalen Antikörpers des Anspruchs 1 , das mit einer Markierung konjugiert werden kann, die ein meßbares Signal liefert.

3. Das monoklanale Antikörper-Fragment nach Anspruch 2, worin die Markierung eine fluoreszierende Substanz, eine Radiomarkierung, ein Chromophor oder ein Enzym ist.

4. Ein monoklonaler Antikörper mit der Bezeichnung L17 erzeugt von der Hybridoma-Zell-Linie HB 8739, die bei der ATCC hinterlegt ist, dessen Antigen-Kombinationsplatz Lex ein Oberflächen-Kohlenhydrat-Antigen definiert, das für humane Lungenkarzinome des "Nicht-Kleine-Zellen"-Typs charakteristisch ist, sowie Fab-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragmente des monoklonalen Antikörpers, die konjugiert werden können mit einer Markierung, die ein meßbares Signal liefern kann.

5. Ein Fab-, F(ab')&sub2; oder Fv-Fragment des monoklonalen Antikörpers von Anspruch 4, die konjugiert werden können mit einer Markierung, die ein meßbares Signal liefern kann.

6. Das monoklonale Antikörperfragment von Anspruch 5, in der die Markierung eine fluoreszierende Substanz, eine Radiomarkierung, ein Chromophor oder ein Enzym ist.

7. Die bei der ATCC hinterlegte Hybridoma-Zell-Linie, welche die Zugangsnummer HB 8738 erhalten hat.

8. Die bei der ATCC hinterlegte Hybridoma-Zell-Linie, welche die Zugangsnummer HB 8739 erhalten hat.

9. Ein Diagnose-Kit enthaltend ein Konjugat von (1) einer Markierung, die ein Mitglied eines ein Signal liefernden Systems ist, und (2) den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder 4 oder ein Fab-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragment desselben.

10. Ein Diagnose-Kit enthaltend (1) den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder 4 oder dessen Fab-, F(ab')&sub2; - oder Fv-Fragment und (2) einen markierten Antikörper , der für den obigen monoklonalen Antikörper (1) spezifisch ist.

11. Diagnose-Kit nach Anspruch 9 oder 10, worin die Markierung ein Enzym ist.

12. Diagnose-Kit nach Anspruch 9 oder 10, worin die Markierung eine fluoreszierende Substanz ist.