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Die vorliegende Erfindung betrifft monoclonale Antikörper, die mit
Krebs des Verdauungssystems reagieren und die nützlich bei der
Diagnose von Krebs des Verdauungssystems sind.
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Carcinoembryonales Antigen (CEA) ist ein bekannter Marker für Krebs
des Verdauungssystems und Verfahren zum Nachweis von Krebs des
Verdauungssystems unter Verwendung sowohl von anti-CEA-Serum
(polyclonaler Antikörper) als auch von monoclonalen anti-CEA-Antikörpern
sind vorgeschlagen worden. Jedoch beträgt die positive Rate bei
Verwendung der CEA-Messung 30 bis 60%, was für das erfolgreiche Screening
von Patienten mit Krebs des Verdauungssystems zu gering ist.
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Kürzlich hat die Serodiagnostik unter Verwendung des monoclonalen
Antikörpers NS19-9, der mit einer Zellinie des Kolon-Rektumkrebs
reagiert, eine positive Rate von annähernd 80% für Pankreaskrebs und
Gallengangkrebs erreicht, während die Serodiagnostik unter Verwendung des
monoclonalen Antikörpers DuPan-2 eine positive Rate für Pankreaskrebs
von 60 bis 70% (Chiryogaku 15 (1985), 484) erreicht. Selbst so bleiben
negative Ergebnisse, was nicht zufriedenstellend ist und einen Bedarf für
monoclonale Antikörper übrigläßt, die diese 20% abdecken.
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Andere monoclonale Antikörper, die spezifisch für Carcinome des
Verdauungssystems sind, werden in EP-A-0161941 und EP-A-0180413
offenbart.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung sind andere monoclonale Antikörper
hergestellt worden, die starke Reaktivität mit dem Krebs des
Verdauungssystems, speziell mit Pankreaskrebs zeigen und die in der Lage sind,
das Vorliegen von Krebs des Verdauungssystems nachzuweisen in Bezug
auf Proben, die negative Ergebnisse bei der Serodiagnostik unter
Verwendung des monclonalen Antikörpers NS19-9 oder DuPan-2 ergeben. Die
erfindungsgemäßen monclonalen Antikörper sind von der IgG&sub1;-Klasse
und sind in der Lage, sialylierte Glycoproteine und Glycolipide als
Antigene zu erkennen.
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In spezieller Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung deshalb einen
monoclonalen Antikörper der Klasse IgG&sub1; bereit, der in der Lage ist, mit
dem Krebs des Verdauungssystems zu reagieren und nicht mit normalem
Magengewebe reagiert und sialylierte Glycoproteine oder Glycolipide als
das Antigen erkennt, wobei der Antikörper von der Hybridomzellinie
AMC-462 (ECACC 86050801) erhältlich ist.
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Die Erfindung erstreckt sich auch auf diese Zellinie und Zellinien, die
davon abstammen, wobei diese Zellinien in der Lage sind, diesen
Antikörper zu produzieren.
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In allgemeinerer Hinsicht stellt die Erfindung bereit:
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a) ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von Krebs des
menschlichen Verdauungssystems bei einem Patienten, umfassend die
Durchführung eines Immunoassays an einer Serumprobe des Patienten mit einem
monoclonalem Antikörper und Prüfen der Probe auf das Vorliegen einer
positiven Reaktion; und
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b) ein immunhistochemisches Färbeverfahren zum Nachweis von Krebs
des menschlichen Verdauungssystems bei einem Patienten, umfassend
das Aufbringen eines monclonalen Antikörpers auf eine Gewebeprobe aus
dem Verdauungssystem des Patienten und den Nachweis der selektiven
Reaktion des Antikörpers mit in der Probe vorliegenden Krebszellen des
menschlichen Verdauungssystems durch Differentialfärbung. Die
Differentialfärbung unterscheidet zwischen den Zellen mit dem reagierenden
Antikörper und normalem menschlichen Magengewebe oder Zellen, die
nicht reaktiv sind und deshalb den Antikörper nicht enthalten;
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wobei beide Verfahren als den Antikörper einen monoclonalen
Antikörper der Klasse IgG&sub1; verwenden, der in der Lage ist, mit dem Krebs des
Verdauungssystems zu reagieren und nicht mit normalem Magengewebe
reagiert, und welcher sialylierte Glycoproteine oder Glycolipide als
Antigene erkennt, wobei der Antikörper von der Hybridomzellinie AMC-462
(ECACC 86050 801) erhältlich ist.
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Eine detaillierte Versuchsbeschreibung für die Produktion eines
erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers ist wie folgt:
(1) Immunisierung des Tieres und Herstellung der
Antikörper-produzierenden Zellen
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3 bis 10 Wochen alte, vorzugsweise 8 Wochen alte Mäuse werden mit
menschlichen Magenkrebszellen, Geweben oder Membranpräparationen
die aus solchen Geweben stammen, immunisiert, um Mäuse zu
veranlassen, Antikörper-produzierende Zellen in der Milz, den Lymphknoten und
im peripheren Blut zu erzeugen. Mäuse, die immunologische Toleranz als
Ergebnis einer Vorbehandlung mit normalen menschlichen Magenzellen
haben, sollten vorzugsweise verwendet werden. Die Immunisierung
erfolgt im allgemeinen durch subcutane, intravenöse oder intraperitoneale
Verabreichung von menschlichen Magenkrebszellen (10&sub6; bis 10&sub7; Zellen
pro Tier), menschlichem Magenkrebs gewebe, Membranfragmenten von
solchen Geweben (10 bis 500 ug pro Tier) zusammen mit einem geeigneten
Adjuvans (z. B. Freund's komplettes Adjuvans, oder
Aluminiumhydroxidgel plus B. pertussis-Impfstoff) an die Tiere. Danach wird die
Antigenverabreichung 2 bis 5mal in Intervallen von 1 bis 2 Wochen wiederholt.
Drei bis sieben Tage nach jeder Immunisierung werden Blutproben aus
dem venösen Plexus des Augenhintergrunds entnommen und das Serum
jeder Probe wird darauf getestet, ob es mit menschlichem Magenkrebs
mittels der Enzymimmunoassaytechnik die unten wiedergegeben ist
[(Enzym-gekoppelter Immunoassay) (ELISA), der von Igaku Shoin, Tokyo
1976 veröffentlicht ist)] , reagiert.
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Die eingesetzten normalen menschlichen und Tumorgewebe können aus
Autopsien oder chirurgischen Operationen erhalten werden. Die Gewebe
werden sofort eingefroren und bei -80ºC aufbewahrt. Um eine
Suspension von Membranfragmenten dieses Gewebes zu erhalten, wird das Gewebe
bei 4ºC in PBS, das 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthält,
aufgetaut. Nach dem Zerkleinern werden die Gewebezellen mit einem
Ultradisperser (LK-21 Yamato Tokyo, Japan) aufgebrochen und mit einem
Teflon-Glas-Homogenisator (Teflon ist ein eingetragenes Warenzeichen)
homogenisiert. Das Homogenat wird bei 100000·g zentrifugiert, und
dann das Pellet zu 1 mg Protein in 1 ml PBS resuspendiert und bei -80ºC
aufbewahrt.
Enzymimmunoassay-Technik
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Suspensionen, die Membranfragmente aus normalen oder Tumorzellen
oder-Gewebe enthalten, die 10 bis 1,000 ug Protein pro ml enthalten,
werden zunächst auf die Vertiefungen einer EIA-Platte (Produkt von
Flow Laboratories) mit 96 Vertiefungen (100 bis 200 ul pro Vertiefung)
verteilt. Nachdem die Suspensionen zwei Nächte über Nacht bei 4ºC in
den Vertiefungen stehengelassen wurden, wird der Überstand aus der
Platte entfernt und dann die Platte mit entionisiertem Wasser oder
Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; 1,83 g Dinatriumphosphat, 0,21 g
Kaliummonophosphat und 7,65 g Natriumchlorid in einem Liter
destilliertem Wasser, pH 7,2) gewaschen. Dann wird 1%iges BSA
(Rinderserumalbumin)-PHS auf die Vertiefungen (100 bis 200 ul pro Vertiefung) verteilt
und die Protein-Bindungsstellen, die in jeder Vertiefung bleiben, werden
blockiert, indem man die Platte zwei Nächte bei 4ºC über Nacht stehen
läßt. Nach dem Entfernen von BSA-PBS werden die Vertiefungen gut mit
entionisiertem Wasser oder PBS gewaschen. Proben (Mausseren,
tiberstände der Hybridomkulturen oder grob gereinigte monclonale
Antikörper; jeweils als erster Antikörper) werden dann mit BSA-PBS verdünnt
und die Verdünnungen werden auf die Vertiefungen (100 ul pro
Vertiefung) verteilt und anschließend bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Nach
dem einmaligen Waschen der Vertiefungen mit entionisiertem Wasser und
dann 6mal mit 2 M NaCl-Lösung, wird eine 100fache Verdünnung des
anti-Maus-Immunoglobulin-IgG-Peroxidase-Konjugats (Erzeugnis von
DAKO und von Kyowa Medex vertrieben; als zweiter Antikörper
verwendet) aus Kaninchen auf die Vertiefungen verteilt. Die Platte wird dann 2
Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
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Nach gründlichem Waschen mit PBS wird eine ABTS-Substrat-Lösung
[hergestellt durch Lösen von 550 mg 2,2'-Azinobis-
(3-Ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)diammoniumsalz
in 1 Liter 0,1 M Citratpuffer (pH
4,2) und Hinzufügen von Wasserstoffperoxid bis zu einer Konzentration
von 1 ul/ml direkt vor Gebrauch] aufgetragen und die Farbe, die sich
entwickelt, wird mit Hilfe der Absorption bei OD415nm gemessen. Jene
Mäuse, deren Proben stark mit den Magenkrebszellen, Geweben oder
Membranpräparationen daraus reagieren, werden als mit menschlichen
Magenkrebs immunisierte Mäuse verwendet, nämlich als Quelle für die
Bereitstellung von Antikörper-produzierenden Zellen für die
Hybridomproduktion.
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Wenn Zellen als solche als Antigen beim Ausführen eines
Enzymimmunoassays verwendet werden, werden die Zielzellen auf einer Falcon
3072-Platte gezüchtet, 0,25%iges Glutaraldehyd-PBS wird hinzugefügt
und, nachdem sie 1-2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen wurde,
wird die Platte gründlich mit PBS gewaschen. Dann werden 100-200
1%ige BSA-PBS pro Vertiefung hinzugefügt, und nach zweistündigem
Stehenlassen wird die Platte gründlich mit entionisiertem Wasser oder
PBS gewaschen und einer Antikörpertiterbestimmung unterzogen, die in
der gleichen Weise ausgeführt wird wie in dem Fall, in dem eine
gewöhnliche Antigen-beschichtete Platte verwendet wird.
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Um sie einer Zellfusion zu unterziehen, werden Zellen, Gewebe oder
Membranpräparationen aus menschlichem Magenkrebs intraperitoneal
den immunisierten Mäusen in einer Dosis von 2 bis 5·10&sub6; Zellen pro Tier
oder 20 bis 400 ug pro Tier, 3-4 Tage vor der Fusionsbehandlung
verabreicht. Die Milz wird exstirpiert, in MEM (Erzeugnis von Nissui
Pharmaceutical) in Fragmente geschnitten, mit einer Pinzette zerkleinert und
5 Minuten bei 1.200 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen
und das Sediment mit Tris-Ammoniumchloridpuffer (pH 7,65) 1-2 Minuten
behandelt, um eventuell vorhandene Erythrocyten zu entfernen. Die
Erythrocyten-freien Zellen werden dann dreimal mit MEM gewaschen,
fertig zum Gebrauch für den Fusionsprozeß zur Hybridombildung.
(2) Herstellung von Myelomzellen
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Eine Myelomzellinie, die aus der Maus stammt, wird vorzugsweise
verwendet.
Verwendbare Beispiele einer solchen Zellinie umfassen die
8-Azaguanin-resistente Maus- (von BALB/c abstammend)
Myelomzellinien P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and
Immunology-1], P3-NSI/1-Ag4.1 (NS-1) [European J. Immunology 6 (1976), 511-519]
SP2/0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276 (1978) 269-270], P3-X63-Ag8 653 (653) [J.
Immunolgy, 123 (1979) 1548-1550] und P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256
(1975) 495-497]. Gezüchtet werden diese Zellinien in
8-Azaguanin-Medium [normales Medium, hergestellt durch Hinzufügen von RPMI-1640-
Medium, Glutamin (1,5 mM), 2-Mercaptoethanol (5·10&supmin;&sup5;M) , Gentamycin
(10 ug/ml) und fetalem Kälberserum (FCS; Erzeugnis von CSL) (10%) mit
weiterer Ergänzung durch 8-Azaguanin (15 ug/ml)]. Die Zellinie, die für
die Zellfusion ausgewählt worden ist, wird 3-4 Tage vor der Fusion in ein
normales Medium gebracht, um eine Zellzahl von nicht weniger als 2·10&sup7;
am Tag der Fusion sicherzustellen.
(3) Zellfusion
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Milzzellen, die, wie in (1) beschrieben, hergestellt wurden, und
Myelomzellen, die wie in (2) beschrieben, erhalten wurden, werden mit MEM oder
PBS gründlich gewaschen, in einem Zellzahlverhältnis von Milzzellen:
Myelomzellen = 5 bis 10:1 gemischt und dann zentrifugiert (1.200 Upm, 5
Minuten) gemischt. Der Überstand wird verworfen und das Zellsediment
wird aufgebrochen. Ein Gemisch von 2 g Polyethylenglykol 1000
(PEG-1000), 2 ml MEM und 0,7 ml Dimethylsulfoxid wird dem
aufgebrochenem Sediment in einer Menge von 0,2-1 ml pro 1()- Milzzellen
hinzugefügt und dabei bei 37ºC gerührt. MEM wird dann in einer steigenden
Menge in einer Rate von 1-2 ml MEM in 1- bis 2-Minuten-Intervallen
hinzugefügt, bis ein Gesamtvolumen von 50 ml erreicht ist. Nach der
Zentrifugation (900 Upm, 5 Minuten) wird der Überstand verworfen und
das Zellsediment vorsichtig aufgebrochen. Den Zellen wird dann 100 ml
normales Medium (RPMI-1640 mit 10% FCS) hinzugefügt und die Zellen in
dem Medium bei leichtem Rühren suspendiert.
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Die erhaltene Suspension wird aus einer Meßpipette in 1 ml-Portionen in
Vertiefungen einer Inkubationsplatte mit 24 Vertiefungen verteilt.
Inkubiert wird in einem 5%-CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC 24 Stunden. HAT-Medium
[normales Medium, ergänzt mit Hypoxanthin (10&supmin;&sup4;M), Thymidin (1-5·10&supmin;&sup5;SM)
und Aminopterin (4·10&supmin;&sup7;M)] wird der Inkubationsplatte
hinzugefügt (1 ml pro Vertiefung) und es wird für weitere 24 Stunden
inkubiert. Danach wird 1 ml Kulturüberstand verworfen und dasselbe
Volumen frischen HAT-Mediums in 24-Stunden-Intervallen 2 Tage
hinzugefügt. Die Inkubation im CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC wird für 10-14 Tage
fortgesetzt.
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Aus den Vertiefungen in denen fusionierte, koloniebildende gewachsene
Zellen gefunden werden, wird 1 ml Überstand verworfen und dasselbe
Volumen HT-Medium (HAT-Medium ohne Aminopterin) hinzugefügt und
dann das Medium mit frischen Portionen HT-Medium in
24-Stunden-Intervallen 2 Tage lang ersetzt.
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Nach 3-4 Tagen Züchtung im HT-Medium wird ein Teil des
Kulturüberstands gesammelt und auf den Antikörpertiter bezogen auf
menschlichen Magenkrebs durch die oben-erwähnte Enzymimmunoass aytechnik
untersucht. Gleichzeitig wird unter anderem auch die Reaktivität mit
normalen menschlichen Zellen oder Geweben und Membranpräparationen
daraus mit einem ähnlichen Verfahren bestimmt, und jene Vertiefungen,
für die die selektive Reaktivität mit menschlichen Magenkrebszellen oder
Geweben oder Membranpräparationen daraus gezeigt ist, werden
ausgewählt. Für die Vertiefungen, die starke Reaktivität mit menschlichen
Magenkrebszellen oder Geweben oder Membranpräparationen daraus
zeigen, aber unter anderem keine Reaktivität mit normalen menschlichen
Zellen oder Geweben oder Membranpräparationen daraus zeigen, wird das
Clonieren zweimal durch die begrenzende Verdünnungstechnik
wiederholt. Auf diese Weise werden die Clone, für die hohe, stabile
Antikörpertiterwerte gegen menschliche Magenkrebszellen oder gegen Gewebe oder
Membranpräparationen, die daraus hergestellt wurden, erhalten wurden,
als die monoclonale Antikörper-produzierenden Hybridomzellinien. die
gegen menschlichen Magenkrebs gerichtet sind, ausgewählt.
(4) Herstellung von monoclonalen Antikörpern
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Acht bis zehn Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen, die
intraperitoneal mit 0,5 ml 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan (Pristan) über einen
Zeitraum von 2 Wochen behandelt worden sind, werden intraperitoneal
monoclonale Antikörper-produzierende Hybridomzellen, die gegen
menschlichen Magenkrebs gerichtet sind und im Verfahren (3) oben
erhalten wurden, in einer Dosis von 2-4·10&sup6; Zellen pro Tier injiziert. Nach
10-21 Tagen wird die Ascitesflüssigkeit aus den Mäusen gesammelt,
zentrifugiert (3.000 Upm, 5 Minuten), um die Feststoffe zu entfernen,
mit 40%igem Ammoniumsulfat ausgesalzt, gegen 0,04 M Phosphatpuffer
(pH 8,0), der mit 0,03 M NaCl ergänzt ist, dialysiert und über eine
DE52- (Erzeugnis von Whatman)-Säule geleitet. Die gesammelte
IgG&sub1;-Fraktion ist der gereinigte monoclonale Antikörper.
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Der Isotyp des Antikörpers wird nach dem Verfahren von Ouchterlony
(doppelte Immunodiffusion) bestimmt [Seibutsukagaku Jikkenho
(Methods in Experimental Biochemistry), vol. 15, Introduction to
Experimental Immunology, p. 74, Gakkai Shuppan Center, 1981]
Die Menge an Protein wird nach dem Folin-Verfahren bestimmt und
danach auf der Basis der Absorption bei 280 nm [1,4 (OD&sub2;&sub8;&sub0;) entspricht
ungefähr 1 mg Immunoglobulin pro ml] berechnet.
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Der so erhaltene monoclonale Antikörper wird auf
Spezifitätseigenschaften geprüft auf der Basis von (1) seiner Reaktivität mit normalen und
Tumorgeweben und Membranpräparationen daraus, die aus einer Auswahl
von Organen von einer Vielzahl von Patienten stammen, (2) seiner
Reaktivität mit einer Auswahl von normalen menschlichen oder
Tumorzellinien oder menschlichen fetalen Zellinien oder Membranpräparationen,
die daraus stammen, (3) seiner Reaktivität mit dem bisher bekannten
carcinoembryonalen Antigen (CEA) und (4) seiner Reaktivität mit Seren
aus Gesunden und Patienten. Diese werden alle durch ein geeignetes
Testverfahren, wie dem Enzymimmunoassay, dem fluoreszierenden
Antikörpertest
oder dem immunohistologischen Färben (ABC) bestimmt. Jene
monoclonalen Antikörper, die mit menschlichem Magenkrebs reagieren
und keine Reaktivität mit anderen Antigenen in irgendeinem
Bewertungstest zeigen, werden ausgewählt.
(5) Serodiagnostik
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Die Serodiagnostik wird wie folgt ausgeführt:
Eine erste Antikörperpräparation (10-100 ug/ml) wird auf die
Vertiefungen einer EIA- Platte mit 96 Vertiefungen (50-200 ul pro Vertiefung)
aufgeteilt. Die Platte wird bei 4ºC für zwei Nächte über Nacht oder bei
Raumtemperatur für 2 Stunden stehengelassen. Nach dem Waschen mit
PBS werden 200 ul BSA-PBSin jede Vertiefung gegeben und anschließend
über Nacht bei 4ºC oder 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Die Platte wird gründlich mit PBS gewaschen und 50-100 ul einer 1- bis
100fachen Verdünnung einer Serumprobe in jede Vertiefung gegeben.
Nachdem man sie bei 4ºC über Nacht oder bei Raumtemperatur 2 Stunden
stehen ließ, wird die Platte gründlich mit PBS gewaschen. Dann wird ein
zweiter, mit Biotin oder Peroxidase markierter Antikörper (10-100 ug/ul)
in die Vertiefungen (50-100 ul pro Vertiefung) gegeben und die Platte
über Nacht bei 4ºC oder 2-4 Stunden lang bei Raumtemperatur
stehengelassen. Wenn ein mit Biotin markierter Antikörper als zweiter Antikörper
verwendet wird, wird die Platte mit PBS gewaschen, Avidin-Peroxidase
oder Avidin-Biotin-Peroxidase (10 ug/ml) in die Vertiefungen (50-100 ul
pro Vertiefung) gegeben und die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur
stehengelassen und dann mit PBS gründlich gewaschen. Dann wird eine
ABTS-Substratlösung in einer Menge von 50-100 ul pro Vertiefung
hinzugefügt. Nachdem man die Platte 10-30 Minuten bei Raumtemperatur
stehen ließ, wird die Reaktion durch Zugabe von 5%iger SDS-Lösung in
einer Menge von 50-100 ul pro Vertiefung beendet. Der OD&sub4;&sub1;&sub5;-Wert wird
für jede Vertiefung gemessen und die Antigenmenge in der Serumprobe
auf der Grundlage der Intensität der entwickelten Farbe berechnet. Durch
Vergleich der Antigenspiegel in den Seren von Gesunden mit den Seren
von Patienten mit verschiedenen Krebsarten, wird der normale Bereich
der Antigenspiegel definiert. Wenn der fragliche Antigenspiegel solch
einen vorbestimmten Bereich überschreitet, wird der Test als positiv
angesehen.
(6) Antigenanalyse
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Wenn man den vorstehend erwähnten Enzymimmunoassay, das
immunohistochemische Färben oder die Serodiagnostik ausführt, werden die
Antigene (Membranpräparationen aus Magenkrebs, gezüchtete Magenkrebs-
Zellinien. Magenkrebsgewebe) mit Reagentien, wie Enzymen (z. B.
Neuraminidase, Protease) oder Perjodsäure vorbehandelt und dann mit
monoclonalen Antikörpern umgesetzt. Der folgende Vergleich von
Unterschieden in der Reaktivität mit den monoclonalen Antikörpern zwischen den
ursprünglichen Antigenen ohne solch eine Vorbehandlung und den
Antigenen, die in der obengenannten Art und Weise vorbehandelt wurden,
kann die chemischen Eigenschaften der antigenen Bindungsstellen, die
die monoclonalen Antikörper erkennen, erläutern. Das heißt, wenn die
Antigenität bei Behandlung mit Neuraminidase verschwindet, nimmt man
an, daß die Sialinsäuren mit den antigenen Determinanten verbunden sind.
Wenn die Antigenität bei Behandlung mit Protease verschwindet, nimmt
man an, daß Proteine mit den antigenen Determinanten verbunden sind.
Wenn die Antigenität bei Behandlung mit Perjodsäure verschwindet, sind
vermutlich Zuckerketten mit den antigenen Determinanten verbunden.
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Die Produktion der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper wird
ausführlich in den folgenden Beispielen beschrieben, und mit Bezug auf
die begleitenden Zeichnungen, in denen:
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Fig. 1 ein Streuungsdiagramm ist, das die Ergebnisse der Serodiagnostik
verschiedener Patienten unter Verwendung von AMC-462 zeigt;
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Fig. 2 ein Diagramm ist, das den Vergleich der Menge an CA19-9 in
Seren zeigt, die von Patienten mit Pankreaskrebs stammen, mit denen von
Antigenen, die durch AMC-462 nachgewiesen werden;
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Fig. 3 ein Diagramm ist, das den Vergleich der Menge an DuPan-2 in
Seren zeigt, die von Patienten mit Pankreaskrebs stammen, mit denen von
Antigenen, die durch AMC-462 nachgewiesen werden;
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Fig. 4 Diagramme sind, die die Ergebnisse von Hemmtests von AMC-462
und NS19-9 zeigen.
Beispiel 1
(1) Herstellung von Antikörper-poduzierenden Zellen
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Normale menschliche Membranpräparationen aus Magengewebe wurden
intravenös neugeborenen C57BL/6- Mäusen (gekauft von Shizuoka
Agricultural Cooperative Association for Laboratory Animals) innerhalb von
24 Stunden nach der Geburt in einer Dosis von 1 mg Protein pro Tier
verabreicht. Nach 8 Wochen wurden den Mäusen intraperitoneal
Membranpräparationen aus menschlichen Magenkrebs (100 ug Proteine pro Tier)
verabreicht, zusammen mit Aluminiumhydroxidgel (2 mg pro Tier) und
Impfstoff aus abgetötetem B. pertussis (1·10&sup9; pro Tier), und anschließend
wurde 3 bis 5mal mit dem gleichen Antigen ohne Adjuvans in einer
Dosis von 100 ug pro Tier auf Proteinbasis in Intervallen von 1 bis 2
Wochen immunisiert. Von diesen immunisierten Mäusen wurden jene Mäuse,
deren Antiseren intensiv mit menschlichen Magenkrebszellen oder
Geweben oder Membranpräparationen, die daraus stammten, reagierten
ausgewählt, und Milzzellen wurden von solchen Mäusen gewonnen und der
Zellfusion unterzogen.
(2) Herstellung von Myelomzellen
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Die Mäuse-Myelomzellinie P3-U1, die gegen 8-Azaguanin resistent ist,
wurde in normalem Medium gezüchtet, um sicherzustellen, daß nicht
mehr als 2·10&sup7; Zellen zur Zeit der Zellfusion vorhanden sind, und für
die Zellfusion als Ausgangsstamm verwendet.
(3) Hybridomproduktion
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Die Milz- und Myelomzellen, die in (1) bzw. (2) erhalten wurden, wurden
in einem Verhältnis von 5:1 verwendet und nach dem vorstehend
erwähnten Verfahren fusioniert. Nach Züchtung in HAT-Medium bei 37ºC unter
5% CO&sub2; für 14 Tage wurden die fusionierten Zellen ausgewählt und die
Züchtung wurde nach Wechsel des Mediums zu HT-Medium fortgesetzt.
Basierend auf den Ergebnissen der Antikörpertiterbestimmung gegen
menschlichen Magenkrebs wurden die aktiven Vertiefungen ausgewählt
und nach Wechsel des Mediums zu normalem Medium wurde das
Clonieren zweimal wiederholt. Die Hybridomzellinie AMC-462, die keine
Reaktivität mit normalen menschlichen Zellen oder Geweben oder anderen
Krebsarten aufweist und die spezifische Reaktivität mit menschlichem
Magenkrebs hat, wie durch verschiedene Testverfahren bestimmt, wurde
auf diese Weise ausgewählt.
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Die Hybridomzellinie AMC-462 ist unter den Bestimmungen des
Budapester Vertrags bei der European Collection of Animal Cell Cultures,
Großbritannien, am 8. Mai 1986, mit der ECACC-Hinterlegungs-Nr.
86050801 hinterlegt worden.
(4) Reinigung des monoclonalen Antikörpers
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Mit Pristan behandelten, 8 Wochen alten weiblichen C57BL/6- Mäusen
wurde intraperitoneal die Hybridomzellinie AMC-462, die in (3) erhalten
wurde, in einer Dosis von 4·10&sup6; Zellen pro Tier injiziert. Nach 10-21
Tagen wurde die Ascitesflüssigkeit aus den Mäusen (5-10 ml pro Tier)
gesammelt, bei 3.000 Upm 5 Minuten zentrifugiert, um die Feststoffe
abzutrennen. Anschließend wurde der Überstand mit 40% Ammoniumsulfat
ausgesalzt, gegen 0,04 M Phosphatpuffer (pH 8,0), der mit NaCl (0,03 M)
ergänzt war, dialysiert und über eine DE52-(Erzeugnis von
Whatman)Säule (Bettvolumen 50 ml) bei einer Fließgeschwindigkeit von 20-30 ml/hr
geleitet, um den gereinigten IgG&sub1;-Antikörper zu gewinnen.
(5) Spezifität von AMC-462
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Die Ergebnisse der Tests des so erhaltenen monoclonalen Antikörpers
AMC-462, der gegen menschlichen Magenkrebs reagiert, bezüglich der
Reaktionsspezifität, ausgedrückt als ein Bruchteil der positiven
Reaktionen über die Zahl der ausgeführten Tests, sind nachstehend in Tabelle 1
zusammengefaßt.
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Die Messung wurde durch Enzym-gekoppelten Immunoassay (ELISA) wie
folgt ausgeführt.
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Im Falle von Membranpräparationen aus Geweben als Ziel wurde eine
Lösung von Membranpräparationen (0,1 mg/ml) aus Geweben in 50-ul-
Portionen in die Vertiefungen einer Platte für EIA mit 96
Vertiefungen
(gekauft von Limbro) verteilt. Nachdem die Platte für 2 Stunden bei
4ºC über Nacht stehengelassen worden war, wurde die Platte, in der die
Membranpräparationen aus Geweben fixiert worden waren, mit PBS
gewaschen. Dann wurde das PBS, das mit 10%igem fetalem Kälberserum
ergänzt war, auf die Vertiefungen (100 ul pro Vertiefung) verteilt. Die
Platte, auf der die aktiven Reste der fixierten Membranpräparationen aus
Geweben geschützt worden waren, wurde mit PBS gewaschen. Der erste
Antikörper (AMC-462) wurde auf die Vertiefungen (50 ul pro Vertiefung)
verteilt und dann wurde die Platte für 1-2 Stunden bei 37ºC oder über
Nacht bei 4ºC stehengelassen, so daß die Reaktion zwischen dem Ziel und
dem Antikörper ablaufen konnte.
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Nach fünfmaligem Waschen mit PBS, das mit 0,05% Tween-20 (gekauft
von Wako Pure Chemicals) ergänzt war, zur Entfernung der
nicht-reaktiven Antikörper wurde Peroxidase- markiertes Kaninchen-anti-
Maus-Immunoglobulin (gekauft von Miles-Yeda, 200fache Verdünnung) als
zweiter Antikörper auf die Vertiefungen (50 ul pro Vertiefung) verteilt, und
die Reaktion wurde 1 Stunde bei 37ºC ablaufen gelassen. Nach
fünfmaligem Waschen mit PBS, das mit 0,05% Tween-20 ergänzt war, und
dreimaligem Waschen mit entlonisiertem Wasser, wurde die
ABTS-Substrat-Lösung (50 ul pro Vertiefung) hinzugefügt und die Reaktion wurde
fortgesetzt und dann durch Zugabe von 5% Natriumdodecylsulfat-Lösung (50 ul
pro Vertiefung) beendet.
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Im Fall von gezüchteten Zellinien als Ziel wurden die Zellinien in den
Vertiefungen einer Anzuchtplatte mit 96 Vertiefungen (gekauft von
Limbro) gezüchtet. Nachdem die Zellen in der Platte konfluent waren, wurde
die Immunreaktion in ähnlicher Weise wie im Fall der
Membranpräparationen aus Geweben, die vorstehend beschrieben ist, fortgesetzt außer daß
die Reaktionen des ersten Antikörpers bzw. des zweiten betroffenen
Antikörpers 30 Minuten bei Raumtemperatur ausgeführt wurden. Nach
der Farbentwicklung wurde die Farbreaktion durch Transferieren des
Reaktionsgemisches in eine Analysen-Platte mit 96 Vertiefungen beendet.
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Im Fall von CEA wurde die Immunreaktion in ähnlicher Weise wie im Fall
der Membranpräparationen aus Geweben ausgeführt, außer daß CEA statt
Membranpräparationen aus den Geweben verwendet wurde.
Für jeden Fall wurde die Absorption bei 415 nm gemessen und dabei die
Absorption bei 490 nm als Kontrolle genommen.
Tabelle 1
Antikörper AMC-462 Membranpräparationen aus Geweben Magenkrebs Pankreaskrebs Kolon-Rektum-Krebs Gewebe aus normalem Magen Bindungsaktivität (ELISA) Zellinien Magenkrebs Pankreaskrebs Kolon-Rektum-Krebs Lungenkrebs Fetale Haut Antigen CEA
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Wie in Tabelle 1 gezeigt, reagiert AMC-462 nicht nur mit Magenkrebs'
sondern auch mit Krebs des Verdauungssystems, wie Pankreaskrebs. Ko-
Ion- Rektum- Krebs,etc. Aber da AMC-462 nicht mit CEA reagiert
unterscheidet sich AMC-462 vom anti-CEA-Antikörper. Die Ergebnisse deuten
darauf hin, daß es möglich ist eine pathologische Diagnose des Krebses
des Verdauungssystems durch immunohistochemisches Färben unter
Verwendung von AMC-462 zu machen.
Beispiel 2
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Eine Suspension von AMC-462 (10 ug/ml) wurde in 50-ul Portionen in die
Vertiefungen einer Elisa-Platte mit 96 Vertiefungen (gekauft von Flow
Laboratories) verteilt. Nachdem man sie über Nacht bei 4ºC stehen ließ
wurde die Platte mit PBS gewaschen. Dann wurde 1%iges BSA-PBS
hinzugefügt (200 ul pro Vertiefung). Nachdem man sie über Nacht stehen ließ,
wurde die Platte gründlich mit PBS gewaschen. Auf die Platte wurden
5fach-Verdünnungen von Seren von Gesunden (85 Proben), Seren von
Patienten mit Magenkrebs (86 Proben), Seren von Patienten mit
Pankreaskrebs (22 Proben), Seren von Patienten mit Hepatomen (15 Proben),
Seren von Patienten mit Kolonkrebs (16 Proben), Seren von Patienten mit
Rektum-Krebs (12 Proben), Seren von Patienten mit Gallenblasenkrebs
(20 Proben), Seren von Patienten mit Brustkrebs (3 Proben), Seren von
Patienten mit einer gutartigen gastrointestinalen Erkrankung (21 Proben),
Seren von Patienten mit einer gutartigen pankreatischen Erkrankung (38
Proben), Seren von Patienten mit einer gutartigen
Gallenblasenerkrankung (11 Proben) oder Seren von Patienten mit Leberzirrhose (3 Proben) in
einer Menge von 50 ul pro Vertiefung gegeben. Nachdem die Platte über
Nacht bei 4ºC stehengelassen wurde, wurde sie gründlich mit PBS
gewaschen. Dann wurde ein mit Biotin markierter, gegen Magenkrebs
gerichteter monoclonaler Antikörper AMC-462 (10 ug/ml) als zweiter
Antikörper (100 ul pro Vertiefung) zugegeben. Die Platte wurde über Nacht bei
4ºC stehengelassen und dann gründlich mit PBS gewaschen.
Avidin-Biotin-Peroxidase (Erzeugnis von Vector) (10 ug/ml) wurde in 100
ul-Poftionen auf die Vertiefungen verteilt und die Platte wurde 1 Stunde bei
Raumtemperatur stehengelassen und dann mit PBS gewaschen. Danach
wurde die ABTS-Substrat-Lösung in einer Menge von 100 ul pro
Vertiefung hinzugefügt und die Reaktion wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur
ablaufen gelassen und dann durch Zugabe von 5% SDS-Lösung (100 ul pro
Vertiefung) beendet. Für jede Vertiefung wurde die Farbentwicklung mit
einem Absorptionsmeßgerät (OD&sub4;&sub1;&sub5;) gemessen. Wie in Fig. 1 gezeigt,
wurde kein positives Ergebnis (OD&sub4;&sub1;&sub5;) (OD&sub4;&sub1;&sub5;, cut-off-Wert ±7 SD) für
die 85 Serumproben (0%) von gesunden Probanden, wohingegen bei den
Serumproben von Patienten mit Magenkrebs 16 von 86 Proben (18,6%)
positive Ergebnisse ergaben, bei den Serumproben von Patienten mit
Pankreaskrebs 18 von 22 Patienten (81,8%) positive Ergebnisse ergaben,
bei den Serumproben von Hepatompatienten 5 von 15 Proben (33,3%)
positive Ergebnisse ergaben, bei den Serumproben von Patienten mit
Kolonkrebs 1 von 16 Proben (6,7%) positive Ergebnisse ergab, bei den
Serumproben von Patienten mitRektum- Krebs keine der 12 Proben (0%), bei den
Serumproben von Patienten mit Gallenblasenkrebs 8 von 20 Proben (40%),
bei den Serumproben von Patienten mit Brustkrebs 1 von 3 Proben
(33,3%). In Bezug auf die Patienten mit gutartigen Erkrankungen ergab
keine der 21 Serumproben von Patienten mit gastrointestinaler
Erkrankung positive Ergebnisse (0%), bei den Serumproben von Patienten mit
gutartiger pankreatischer Erkrankung eine von 38 Proben (2,6%), bei den
Serumproben von Patienten mit gutartiger Gallenblasenerkrankung keine
der 11 Proben (0%) und bei den Serumproben von Patienten mit
Leberzirrhose keine der 3 Proben (0%). So war die positive Rate extrem niedrig.
Dieses Ergebnis zeigt, daß das vorliegende Serodiagnostiksystem unter
Verwendung von AMC-462 hoch effektiv bei der Serodiagnostik von
Krebs des Verdauungssystems , besonders des Pankreaskrebses, ist.
Beispiel 3
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Die Mengen an CA19-9 (das NS19-9-Antigen) und DuPan-2 (das Du-
Pan-2-Antigen), die bekannte Marker des Pankreaskrebses sind, wurde in
den gleichen Serumproben wie jene, die aus Patienten mit Pankreaskrebs
stammen und in Beispiel 2 verwendet werden, gemessen.
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Fig. 2 zeigt den Vergleich der Menge an CA19-9 mit der Menge des
Antigens, das durch den erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper
AMC-462 in den gleichen Serumproben gebunden wird.
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Fig. 3 zeigt den Vergleich zwischen der Menge an dem Antigen, das durch
DuPan-2 gebunden wird, und der Menge an dem Antigen, das durch
AMC-462 in den gleichen Serumproben gebunden ist.
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Wie aus Fig. 2 ersichtlich, korreliert die Menge an dem Antigen in den
Serumproben aus Patienten mit Pankreaskrebs, die durch das
Serodiagnostiksystem unter Verwendung des erfindungsgemäßen AMC-462
bestimmt wurde, im hohen Maße mit der Menge an CA19-9. Aber 5% der
Proben, die negative Ergebnisse für CA19-9 liefern, ergeben positive
Ergebnisse in dem Serodiagnostik-System bei Verwendung von AMC-462.
Fig. 3 weist darauf hin, daß die Menge an Krebsantigen, die durch den
erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper gebunden wird, wenig mit
der Menge an DuPan-2 korreliert. Unter dem Gesichtspunkt der positiven
Rate kann AMC-462 für die Serodiagnostik von Pankreaskrebs effektiver
sein als DuPan-2.
Beispiel 4
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Die in den Beispielen 1 und 3 erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin,
daß das Antigen, das in dem Serodiagnostik-System unter Verwendung
von AMC-462 nachweisbar ist, sich von CEA und DuPan-2 unterscheidet,
die bekannte Tumormarker des Krebses des Verdauungssystems,
besonders des Pankreaskrebses, sind. Um den Unterschied zu CA19-9
vollständiger zu untersuchen, wurde der Bindungstest unter Verwendung einer
Sandwich-ELI SA-Technik ausgeführt.
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Zu diesem Zweck wurden Suspensionen von AMC-462 und NS19-9 (10 ug/
ml) als erster Antikörper in die Vertiefungen einer EIA-Platte mit 96
Vertiefungen (50 ul/Vertiefung) verteilt und am Boden der Vertiefung
fixiert. Die Platte wurde mit 1%igem BSA-PBS blockiert und dann wurden
die Serumproben von Patienten mit Pankreaskrebs, die sowohl das
CA19-9-Antigen als auch das AMC-462-Antigen enthielten, in einer
Menge von 50 ul pro Vertiefung hinzugefügt. Nach gründlichem Waschen
jeder Vertiefung wurde der monclonale Antikörper NS19-9 bzw. AMC-462
(0,1-50 ug/ml) als hemmender Antikörper hinzugefügt und die Platte
wieder gewaschen. Ein mit Biotin markierter monoclonaler Antikörper
NS19-9 oder ein mit Biotin markierter monoclonaler Antikörper AMC-462
wurde dann als zweiter Antikörper hinzugefügt und die Platte wieder
gewaschen Avidin-Biotin-Peroxidase wurde dann auf die Vertiefungen
verteilt und die Platte wurde wieder gewaschen. Danach wurde eine ABTS-
Substratlösung hinzugefügt und die Enzymreaktion wurde weiter
ablaufen gelassen und dann durch Zugabe einer SDS-Lösung beendet. Die
Absorption jeder Vertiefung bei 415 nm wurde dann gemessen.
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Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. In Fig. 4 bedeuten Fall A, B, C, D,
E und F die folgenden Kombinationen.
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A) erster Antikörper: AMC-462 (10 ug(ml)
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zweiter Antikörper: mit Biotin markierten AMC-462
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(0,1-50 ug/ml)
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hemmender Antikörper: keiner
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B) erster Antikörper: AMC-462 (10 ug/ml)
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zweiter Antikörper: mit Biotin markierter AMC-462
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(10 ug/ml)
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hemmender Antikörper: AMC-462 (0,1-50 ug/ml)
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C) erster Antikörper: AMC-462 (10 ug/ml)
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zweiter Antikörper: mit Biotin markierter AMC-462
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(10 ug/ml)
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hemmender Antikörper: NS19-9 (0,1-50 ug/ml)
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D) erster Antikörper: NS19-9 (10 ug/ml)
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zweiter Antikörper: mit Biotin markierter NS19-9
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(0,1-50 ug/ml)
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hemmender Antikörper: keiner
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E) erster Antikörper: NS19-9 (10 ug/ml)
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zweiter Antikörper: mit Biotin markierter NS19-9
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(10 ug/ml)
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hemmender Antikörper: NS19-9 (0,1-50 ug/ml)
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F) erster Antikörper: NS19-9 (10 ug/ml)
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zweiter Antikörper: mit Biotin markierter NS19-9
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(10 ug/ml)
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hemmender Antikörper: AMC-462 (0,1-50 ug/ml).
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Wie aus Fig. 4 hervorgeht, wird die Reaktivität von NS19-9 und AMC-462
durch NS19-9 bzw. AMC-462 vollständig gehemmt, während weder die von
NS19-9 durch AMC-462 noch die von AMC-462 durch NS19-9 gehemmt
wird. Deshalb nimmt man an, daß die Antigene, die von AMC-462 erkannt
werden, verschieden von denen sind, die von NS19-9 erkannt werden.
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Während die Erfindung im Detail und unter Beachtung spezifischer
Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird es für einen Fachmann
offensichtlich sein, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen
darin gemacht werden können, ohne von ihrem Geist und Rahmen
abzuweichen.