JPH01276068A - ヒト癌抗原の定量法 - Google Patents
ヒト癌抗原の定量法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は臨床診断の分野に係り、本願はヒト癌の臨床診
断に適用できる血清中の癌抗原の定量法を提供する。
断に適用できる血清中の癌抗原の定量法を提供する。
従来の技術
抗−ヒト肺腺癌モノクローナル抗体ＡＬＣ−１８６（以
下ＡＬＣ−１８６という）は本発明者らが作製したモノ
クローナル抗体で、これを用いる血清診断系における肺
腺癌の陽性率は４８％である（特開昭６２−８３８９８
）。
下ＡＬＣ−１８６という）は本発明者らが作製したモノ
クローナル抗体で、これを用いる血清診断系における肺
腺癌の陽性率は４８％である（特開昭６２−８３８９８
）。
抗−ヒト胃癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−４６２（以下
ＡＭＣ−４６２という）は本発明者らが作製したモノク
ローナル抗体で、これを用いる血清診断系における胃癌
の陽性率は、１８．６％である（特開昭６３−２１５６
２）。
ＡＭＣ−４６２という）は本発明者らが作製したモノク
ローナル抗体で、これを用いる血清診断系における胃癌
の陽性率は、１８．６％である（特開昭６３−２１５６
２）。
抗−ヒト肺扁平上皮癌モノクローナル抗体ＳＬＣ−４５
４（以下ＳＬＣ−４５４という）は本発明者が作製した
モノクローナル抗体で、これを用いる血清診断系におけ
る肺扁平上皮癌の陽性率は２７．５％である（特開昭６
３−１９５６１）。
４（以下ＳＬＣ−４５４という）は本発明者が作製した
モノクローナル抗体で、これを用いる血清診断系におけ
る肺扁平上皮癌の陽性率は２７．５％である（特開昭６
３−１９５６１）。
また、前立腺癌の複数の抗原を同一の系で検出する方法
は既に知られている（特開昭６Ｏ−２２８９６２）が、
他の癌抗原を同一の系で検出する方法については、まだ
知られていない。
は既に知られている（特開昭６Ｏ−２２８９６２）が、
他の癌抗原を同一の系で検出する方法については、まだ
知られていない。
発明が解決しようとする課題
上記、ＡＬＣ−１８６を用いる肺腺癌の血清診断系、Ａ
ＭＣ−４６２を用いる胃癌の血清診断系およびＳＬＣ−
４５４を用いる肺扁平上皮癌の血清診断系は、現状に右
いて臨床的価値は大きいが、血清を用いる癌の検診にふ
いては、さらに高い陽性率の得られる検診方法が要望さ
れている。
ＭＣ−４６２を用いる胃癌の血清診断系およびＳＬＣ−
４５４を用いる肺扁平上皮癌の血清診断系は、現状に右
いて臨床的価値は大きいが、血清を用いる癌の検診にふ
いては、さらに高い陽性率の得られる検診方法が要望さ
れている。
本発明者らは、特開昭６２−２３８４６５および特開昭
６２−２３８４６４１：おイテ、既にＡＬｃ−１８６と
抗−ヒト胃腺癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−３８２を第
一抗体とし、それらのペルオキシデースｍ識抗体を第二
抗体とする血清診断系及び、ＡＬＣ−１８６と抗−ヒト
肺扁平上皮癌モノクローナル抗体ＳＬＣ−１を第一抗体
とし、それらのペルオキシデース標識抗体を第二抗体と
する血清診断系をそれぞれ確立し、腺癌患者血清中の腺
癌抗原を効率よく定量でき、高い陽性率が得られること
を開示した。しかし、これらの系では、癌の陽性率は上
昇するが、一つの発色系で測定するため、どちらの抗体
による発色かの判別ができず、実際の臨床検査において
、癌種の特定が困難という欠点があった。
６２−２３８４６４１：おイテ、既にＡＬｃ−１８６と
抗−ヒト胃腺癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−３８２を第
一抗体とし、それらのペルオキシデースｍ識抗体を第二
抗体とする血清診断系及び、ＡＬＣ−１８６と抗−ヒト
肺扁平上皮癌モノクローナル抗体ＳＬＣ−１を第一抗体
とし、それらのペルオキシデース標識抗体を第二抗体と
する血清診断系をそれぞれ確立し、腺癌患者血清中の腺
癌抗原を効率よく定量でき、高い陽性率が得られること
を開示した。しかし、これらの系では、癌の陽性率は上
昇するが、一つの発色系で測定するため、どちらの抗体
による発色かの判別ができず、実際の臨床検査において
、癌種の特定が困難という欠点があった。
課題を解決する為の手段
本発明者らは、ＡＬＣ−１８６とＡＭＣ−４６２又は、
ＡＬＣ−１８６とＳＬＣ−４５４の混合物を第一抗体と
し、別々の二種類の酵素、即ちペルオキシデースで標識
したＡＬＣ−１８６とβ−ガラクトシデースで標識した
ＡＭＣ−４６２又は、ペルオキシデースで標識したＡＬ
Ｃ−１８６と、β−ガラクトシデースで標識したＳＬＣ
−４５４を第二抗体とし、β−ガラクトシデース基質を
加えて発色させ、その発色を測定後よく洗浄し、さらに
ペルオキシデース基質を加え発色させ、その発色を測定
することにより、それぞれのモノクローナル抗体を単独
で用いる系に比べ癌患者血清で顕著に高い陽性率が得ら
れ、しかもどちらの抗体による発色か判るため、癌種を
特定することも可能であることを見出し本発明を完成す
るに至った。
ＡＬＣ−１８６とＳＬＣ−４５４の混合物を第一抗体と
し、別々の二種類の酵素、即ちペルオキシデースで標識
したＡＬＣ−１８６とβ−ガラクトシデースで標識した
ＡＭＣ−４６２又は、ペルオキシデースで標識したＡＬ
Ｃ−１８６と、β−ガラクトシデースで標識したＳＬＣ
−４５４を第二抗体とし、β−ガラクトシデース基質を
加えて発色させ、その発色を測定後よく洗浄し、さらに
ペルオキシデース基質を加え発色させ、その発色を測定
することにより、それぞれのモノクローナル抗体を単独
で用いる系に比べ癌患者血清で顕著に高い陽性率が得ら
れ、しかもどちらの抗体による発色か判るため、癌種を
特定することも可能であることを見出し本発明を完成す
るに至った。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明によれば、ＡＬＣ−１８６とＡＭＣ−４６２との
混合物、あるいは、ＡＬＣ−１８６とＳＬＣ−４５４と
の混合物を第一抗体とし、これを固相化し、これにヒト
血清検体を反応させて癌抗原を結合させ、ついでペルオ
キシデースで標識したＡＬＣ−１８６と、β−ガラクト
シデースで標識したＡＭＣ−４６２の混合物あるいは、
ペルオキシデースで標識したＡＬＣ−１８６と、β−ガ
ラクトシデースで、標識したＳＬＣ−４５４の混合物を
第二抗体として、前記第一抗体に結合した癌抗原に結合
させ、結合した第二抗体の量をまず、β−ガラクトシデ
ース基質を加えて発色させその発色を測定後、よく洗浄
し、さらにペルオキシデース基質を加えて発色させ、そ
の発色を測定することにより、血清中の複数の癌抗原を
一つの系で測定することができる。ＡＬＣ−１８６゜Ａ
ＭＣ−４６２およびＳＬＣ−４５４は、本出願人が先に
特開昭６２−８３８９８．特開昭６３−２１５６２およ
び特開昭６３−１９５６１でそれぞれ開示したモノクロ
ーナル抗体であり、該モノクローナル抗体を産生ずるハ
イプリドーマ株ＡＬＣ−１８６株、ＡＭＣ−４６２株、
ＳＬＣ−４５４株をそれぞれ用いて次のとおり製造でき
る。ＡＬＣ−１８６株は、英国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕ
１ｔｕｒｅにＮＣＡＣＣ８５０８２９０３として、ＡＭ
Ｃ−４６２株及びＳＬＣ−４５４株は、英国εｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｃ
ｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅにＥＣＡＣＣ８６０５０８０１
及び８ＣＡＣＣ８６０７０３０６としてそれぞれ寄託し
である。
混合物、あるいは、ＡＬＣ−１８６とＳＬＣ−４５４と
の混合物を第一抗体とし、これを固相化し、これにヒト
血清検体を反応させて癌抗原を結合させ、ついでペルオ
キシデースで標識したＡＬＣ−１８６と、β−ガラクト
シデースで標識したＡＭＣ−４６２の混合物あるいは、
ペルオキシデースで標識したＡＬＣ−１８６と、β−ガ
ラクトシデースで、標識したＳＬＣ−４５４の混合物を
第二抗体として、前記第一抗体に結合した癌抗原に結合
させ、結合した第二抗体の量をまず、β−ガラクトシデ
ース基質を加えて発色させその発色を測定後、よく洗浄
し、さらにペルオキシデース基質を加えて発色させ、そ
の発色を測定することにより、血清中の複数の癌抗原を
一つの系で測定することができる。ＡＬＣ−１８６゜Ａ
ＭＣ−４６２およびＳＬＣ−４５４は、本出願人が先に
特開昭６２−８３８９８．特開昭６３−２１５６２およ
び特開昭６３−１９５６１でそれぞれ開示したモノクロ
ーナル抗体であり、該モノクローナル抗体を産生ずるハ
イプリドーマ株ＡＬＣ−１８６株、ＡＭＣ−４６２株、
ＳＬＣ−４５４株をそれぞれ用いて次のとおり製造でき
る。ＡＬＣ−１８６株は、英国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕ
１ｔｕｒｅにＮＣＡＣＣ８５０８２９０３として、ＡＭ
Ｃ−４６２株及びＳＬＣ−４５４株は、英国εｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｃ
ｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅにＥＣＡＣＣ８６０５０８０１
及び８ＣＡＣＣ８６０７０３０６としてそれぞれ寄託し
である。
プリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ） ０．５ｍｌを腹腔内
投与シ、１〜２週間飼育する〕した８〜１０週令のＢＡ
ＬＢ／Ｃあるいはヌードマウス（雌）に、ＡＬＣ−１８
６株、ＡＭＣ−４６２株またはＳＬＣ−４５４株の細胞
２〜４Ｘ１０Ｓ〜１細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜
２１日でハイブリドーマは復水癌化する。
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ） ０．５ｍｌを腹腔内
投与シ、１〜２週間飼育する〕した８〜１０週令のＢＡ
ＬＢ／Ｃあるいはヌードマウス（雌）に、ＡＬＣ−１８
６株、ＡＭＣ−４６２株またはＳＬＣ−４５４株の細胞
２〜４Ｘ１０Ｓ〜１細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜
２１日でハイブリドーマは復水癌化する。
１ｇＭクラスの抗体であるＡＬ−Ｃ−１８６゜ＳＬＣ−
４５４の場合は、このマウスから腹水を採取し、５％硫
酸アンモニウムにて塩析し、リン酸二ナトリウム１．８
３ｇ／ｉ、 リン酸−カリウム０．２１ｇ／ｊ！およ
び食塩７．６５ｇ／ｉからなる溶液（ｐＨ７，２）（以
下ＰＢＳと略す）に食塩０．５Ｍを加えた溶液で透析後
、セルロファインＧＣＬ−２０００（生化学工業社製）
（ペット・ポリニーム７５０ｍ１）のカラムに流速１５
１１１１／時で通塔し、ＩｇＭ画分を集め精製モノクロ
ーナル抗体とする。
４５４の場合は、このマウスから腹水を採取し、５％硫
酸アンモニウムにて塩析し、リン酸二ナトリウム１．８
３ｇ／ｉ、 リン酸−カリウム０．２１ｇ／ｊ！およ
び食塩７．６５ｇ／ｉからなる溶液（ｐＨ７，２）（以
下ＰＢＳと略す）に食塩０．５Ｍを加えた溶液で透析後
、セルロファインＧＣＬ−２０００（生化学工業社製）
（ペット・ポリニーム７５０ｍ１）のカラムに流速１５
１１１１／時で通塔し、ＩｇＭ画分を集め精製モノクロ
ーナル抗体とする。
ＩｇＧｔ クラスの抗体であるＡＭＣ−４６２の場合は
、マウスから腹水を採取し、遠心分離（３，００Ｏｒｐ
ｍ、 ５分）して固形分を除去後、５０％硫酸アンモニ
ウムにて塩析し、０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０
，０，０３Ｍ ＮａＣ１を含む）で透析後、ＤＥ ５
２ （ｌｌｈａｔｍａｎ社製）のカラムニ通塔し、■ｇ
Ｇ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
、マウスから腹水を採取し、遠心分離（３，００Ｏｒｐ
ｍ、 ５分）して固形分を除去後、５０％硫酸アンモニ
ウムにて塩析し、０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０
，０，０３Ｍ ＮａＣ１を含む）で透析後、ＤＥ ５
２ （ｌｌｈａｔｍａｎ社製）のカラムニ通塔し、■ｇ
Ｇ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度（１，０（ＯＤ＊ｓｏ）ζイムノグロ、プリン１■
／ｍ１〕より算出する。
光度（１，０（ＯＤ＊ｓｏ）ζイムノグロ、プリン１■
／ｍ１〕より算出する。
得られたモノクローナル抗体の特異性の決定は複数の検
体から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは、
腫瘍組織あるいはその膜成分との反応性、各種のヒト正
常あるいは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株も
しくはそれらの膜成分との反応性、従来から知られてい
る癌胎児抗原（例えばＣＥＡ）との反応性、正常、各種
患者血清との反応性などを、酵素免疫測定法、蛍光抗体
法、免疫組織学的判定法（ＰＡＰ法）などにより測定す
ることにより行う。
体から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは、
腫瘍組織あるいはその膜成分との反応性、各種のヒト正
常あるいは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株も
しくはそれらの膜成分との反応性、従来から知られてい
る癌胎児抗原（例えばＣＥＡ）との反応性、正常、各種
患者血清との反応性などを、酵素免疫測定法、蛍光抗体
法、免疫組織学的判定法（ＰＡＰ法）などにより測定す
ることにより行う。
モノクローナル抗体ＡＬＣ−１８６の酵素標識は、酵素
としてペルオキシデース、ＡＭＣ−４６２とＳＬＣ−４
５４の酵素標識は、β−ガラクトシデースなどを用い、
過ヨウ素酸架橋法〔ジャーナル・オブ・ヒストケミスト
リイー・アンド・サイトケミストリイ（Ｊ、Ｈｉｓｔｏ
ｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）、 ２２゜１０８４〜
１０９１． （１９７１））に従って行う。
としてペルオキシデース、ＡＭＣ−４６２とＳＬＣ−４
５４の酵素標識は、β−ガラクトシデースなどを用い、
過ヨウ素酸架橋法〔ジャーナル・オブ・ヒストケミスト
リイー・アンド・サイトケミストリイ（Ｊ、Ｈｉｓｔｏ
ｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）、 ２２゜１０８４〜
１０９１． （１９７１））に従って行う。
ペルオキシデースを用いる過ヨウ素酸架橋法は、たとえ
ば次のとふり行う。
ば次のとふり行う。
ペルオキシデースを０．３Ｍ重炭酸ソーダｔＩＩ衝液（
ｐＨ８，１）１ｍｌに溶かし、７）ｋ第１：ｌ−２，４
−ジニトロベンゼン（ＤＮＰ）エタノール１％ｍ液０．
１ｍｌを加え、これに０．０６Ｍ過ヨウ素酸１ｍｌを加
え、室温で３０分間反応させる。これをｐ Ｈ９，５の
０．０１Ｍ炭酸バッファーで透析してＤＮＰ化したアル
デヒド基がついたペルオキシデースを含む透析液を得る
。この透析後の溶液に５ｍｇの抗体を加え、室温で２時
間反応させ、ｐ Ｈ７，２の０．０１Ｍリン酸バッファ
ーで透析し、透析後の溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ０１００
カラムクロマトグラフイーにかけゲル濾過する。活性画
分を酵素標識抗体として使う。
ｐＨ８，１）１ｍｌに溶かし、７）ｋ第１：ｌ−２，４
−ジニトロベンゼン（ＤＮＰ）エタノール１％ｍ液０．
１ｍｌを加え、これに０．０６Ｍ過ヨウ素酸１ｍｌを加
え、室温で３０分間反応させる。これをｐ Ｈ９，５の
０．０１Ｍ炭酸バッファーで透析してＤＮＰ化したアル
デヒド基がついたペルオキシデースを含む透析液を得る
。この透析後の溶液に５ｍｇの抗体を加え、室温で２時
間反応させ、ｐ Ｈ７，２の０．０１Ｍリン酸バッファ
ーで透析し、透析後の溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ０１００
カラムクロマトグラフイーにかけゲル濾過する。活性画
分を酵素標識抗体として使う。
ペルオキシデースの基質としては、ＡＢＴＳ基質液（２
，２’−アジノピス（３−エチルベンツチアゾリン−６
−スルホン酸）ニアンモニウム５５０■を０．１ Ｍク
エン酸緩衝液（ｐＨ４，２）Ｉｉに溶かした溶液に、使
用直前に過酸化水素１ＪｔＩ／ｍｌを加えた溶液〕を用
い、発色を０Ｄｓｒｓ□の吸光度で測定する。
，２’−アジノピス（３−エチルベンツチアゾリン−６
−スルホン酸）ニアンモニウム５５０■を０．１ Ｍク
エン酸緩衝液（ｐＨ４，２）Ｉｉに溶かした溶液に、使
用直前に過酸化水素１ＪｔＩ／ｍｌを加えた溶液〕を用
い、発色を０Ｄｓｒｓ□の吸光度で測定する。
β−ガラクトシデースの基質としては、０−二トロフェ
ノールーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド５■を２ｍＭのＭ
ｇＣｌ１１ と０．１ ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン
を含むリン酸緩衝液１ｍｌに溶かした溶液を用い、発色
をＯＤ ４１ ｓ工の吸光度で測定する。
ノールーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド５■を２ｍＭのＭ
ｇＣｌ１１ と０．１ ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン
を含むリン酸緩衝液１ｍｌに溶かした溶液を用い、発色
をＯＤ ４１ ｓ工の吸光度で測定する。
血清診断は次のとおり行う。
９６穴ＥＩＡ用プレートに、第一抗体として、ＡＬＣ−
１８６１０〜１００趨／ａ＋１とＡＭＣ−４６２１０〜
１００廂／ｍｌの混合物、あるいは、ＡＬＣ−１８６１
０〜１００■７ｍ１とＳＬＣ−４５４°１０〜１００■
／ｍｌの混合物を５０〜１００ｍ／穴づつ分注し、４℃
〜室温で２時間〜２晩放置する。
１８６１０〜１００趨／ａ＋１とＡＭＣ−４６２１０〜
１００廂／ｍｌの混合物、あるいは、ＡＬＣ−１８６１
０〜１００■７ｍ１とＳＬＣ−４５４°１０〜１００■
／ｍｌの混合物を５０〜１００ｍ／穴づつ分注し、４℃
〜室温で２時間〜２晩放置する。
ＰＢＳで洗浄後、１％牛血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ）
−ＰＢＳ ２００ＡＩ！／穴を加え、さらに４℃〜室
温で２時間〜１晩放置する。このプレートをＰＢＳでよ
く洗浄後、各式に、血清検体を１〜１００倍希釈で、５
０〜１００屑加える。４℃〜室温で２時間〜１晩放置後
、ＰＢＳでよく洗浄する。
−ＰＢＳ ２００ＡＩ！／穴を加え、さらに４℃〜室
温で２時間〜１晩放置する。このプレートをＰＢＳでよ
く洗浄後、各式に、血清検体を１〜１００倍希釈で、５
０〜１００屑加える。４℃〜室温で２時間〜１晩放置後
、ＰＢＳでよく洗浄する。
次に、ペルオキシデースで標識したＡＬＣ−１８６１０
〜１００ｇ／ｍｌとβ−ガラクトシデースで標識したＡ
ＭＣ−４６２１０〜１００■／ｍｌの混合物又はペルオ
キシデースで標識したＡＬＣ−１８６１０〜１００ ｇ
／ｍｌとβ−ガラクトシデースで標識したＳＬＣ−４５
４１０〜１００ ｇ／ｍｌの混合物を５０〜１００ｍ／
穴加え、室温で１０〜３０分間放置し、よく洗浄後、β
−ガラクトシデース基質を加え発色させ、各式のＯＤ、
、、、、値を測定し、その発色度より、血清検体中のｉ
ｔの抗原量を算出する。次に、このプレートをよく洗浄
後、ペルオキシデース基質を加え発色させ、再び各式の
０Ｄｉｔｓ＋ａｍ値を測定し、その発色度より、第２の
抗原量を算出する。このようにして得られた健常人血清
中の抗原量と癌患者血清中の抗原量を比較することによ
り、正常値を決定し、その正常値を超えるものを隔隔性
とする。
〜１００ｇ／ｍｌとβ−ガラクトシデースで標識したＡ
ＭＣ−４６２１０〜１００■／ｍｌの混合物又はペルオ
キシデースで標識したＡＬＣ−１８６１０〜１００ ｇ
／ｍｌとβ−ガラクトシデースで標識したＳＬＣ−４５
４１０〜１００ ｇ／ｍｌの混合物を５０〜１００ｍ／
穴加え、室温で１０〜３０分間放置し、よく洗浄後、β
−ガラクトシデース基質を加え発色させ、各式のＯＤ、
、、、、値を測定し、その発色度より、血清検体中のｉ
ｔの抗原量を算出する。次に、このプレートをよく洗浄
後、ペルオキシデース基質を加え発色させ、再び各式の
０Ｄｉｔｓ＋ａｍ値を測定し、その発色度より、第２の
抗原量を算出する。このようにして得られた健常人血清
中の抗原量と癌患者血清中の抗原量を比較することによ
り、正常値を決定し、その正常値を超えるものを隔隔性
とする。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１゜
９６穴ＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Ｆ
ｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ＡＬＣ
−１８６１０ｘ／ｍｌとＡＭＣ−４６２１０ｘ／ｍｌの
等量混合物１００ＪＩＩＩ／穴を第一抗体として加え、
４℃で１晩放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ ２００ｍ／穴加え４℃で１晩放置し、ＰＢＳでよ
く洗浄したプレートに、健常人血清（２０検体）および
肺癌患者血清（２３検体）。
ｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ＡＬＣ
−１８６１０ｘ／ｍｌとＡＭＣ−４６２１０ｘ／ｍｌの
等量混合物１００ＪＩＩＩ／穴を第一抗体として加え、
４℃で１晩放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ ２００ｍ／穴加え４℃で１晩放置し、ＰＢＳでよ
く洗浄したプレートに、健常人血清（２０検体）および
肺癌患者血清（２３検体）。
胃癌患者血清（２０検体）、乳癌患者血清（ｌ検体）、
悪性リンパ腫患者血清（１検体）の１０倍希釈液を５０
縛／穴加え、４℃で１晩放置後、ＰＢＳでよく洗浄した
。ペルオキシデースで標識したＡＬＣ−１８６（１０河
／ｍｌ）とβ−ガラクトシデースで標識したＡＭＣ−４
６２（１０屑／ｍｌ）の等量混合物１０’Ｏｄ／穴を第
二抗体として加え、４℃で１晩放置し、ＰＢＳでよく洗
浄した。
悪性リンパ腫患者血清（１検体）の１０倍希釈液を５０
縛／穴加え、４℃で１晩放置後、ＰＢＳでよく洗浄した
。ペルオキシデースで標識したＡＬＣ−１８６（１０河
／ｍｌ）とβ−ガラクトシデースで標識したＡＭＣ−４
６２（１０屑／ｍｌ）の等量混合物１０’Ｏｄ／穴を第
二抗体として加え、４℃で１晩放置し、ＰＢＳでよく洗
浄した。
β−ガラクトシデース基質液５０ｔｔｌｌ穴を加え、室
温で３０分間反応させ、各式の発色を吸光度計（ＯＤ４
１５−−）で測定することにより、ＡＭＣ−４６２の認
識する癌抗原量を算出した。
温で３０分間反応させ、各式の発色を吸光度計（ＯＤ４
１５−−）で測定することにより、ＡＭＣ−４６２の認
識する癌抗原量を算出した。
次いで、このプレートをよく洗浄後、ペルオキシデース
基質５０ρ／穴を加え、３０分間反応させ、各人の発色
を吸光度計（ＯＤ＊＋ｓ、、−）で測定することにより
、ＡＬＣ−１８６の認識する癌抗原量を算出した。その
結果を第１表に示した。
基質５０ρ／穴を加え、３０分間反応させ、各人の発色
を吸光度計（ＯＤ＊＋ｓ、、−）で測定することにより
、ＡＬＣ−１８６の認識する癌抗原量を算出した。その
結果を第１表に示した。
なお、量測定に右けるカットオフ値は、それぞれの測定
での健常人２０検体のＯＤ、、、、、値の平均値＋２３
Ｄ（標準偏差）とした。ペルオキシデース系か、β−ガ
ラクトシデース系のどちらか一方で反応す・れば陽性と
する系をコンビネーションアッセイ系とした。本系によ
り、ＡＬＣ−１８６の認識する癌抗原とＡＭＣ−４６２
の認識する癌抗原のコンビネーションアッセイが１枚の
プレート上で可能となり、第１表に示したように、コン
ビネーションアッセイ系において、癌全般、特に肺腺癌
、胃癌などで著しく高い陽性率が得られた。
での健常人２０検体のＯＤ、、、、、値の平均値＋２３
Ｄ（標準偏差）とした。ペルオキシデース系か、β−ガ
ラクトシデース系のどちらか一方で反応す・れば陽性と
する系をコンビネーションアッセイ系とした。本系によ
り、ＡＬＣ−１８６の認識する癌抗原とＡＭＣ−４６２
の認識する癌抗原のコンビネーションアッセイが１枚の
プレート上で可能となり、第１表に示したように、コン
ビネーションアッセイ系において、癌全般、特に肺腺癌
、胃癌などで著しく高い陽性率が得られた。
さらに、ペルオキシデース系で発色しているか、β−ガ
ラクトシデース系で発色しているかを見ることにより、
癌種を限定することも可能となった。
ラクトシデース系で発色しているかを見ることにより、
癌種を限定することも可能となった。
実施例２゜
９６穴ＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Ｆ
ｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ＡＬＣ
−１８６１０■／ωｌとＡＭＣ−４５４１０ｇ／ｍ１の
等量混合物１００■／穴を第一抗体として加え、４℃で
１晩放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ
２００ｍ／穴加え４℃で１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄
したプレートに、健常人血ａ（２０検体）および肺癌患
者血清（２３検体）。
ｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ＡＬＣ
−１８６１０■／ωｌとＡＭＣ−４５４１０ｇ／ｍ１の
等量混合物１００■／穴を第一抗体として加え、４℃で
１晩放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ
２００ｍ／穴加え４℃で１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄
したプレートに、健常人血ａ（２０検体）および肺癌患
者血清（２３検体）。
胃癌患者血清（２０検体）、乳癌患者血清（１検体）、
悪性リンパ腫患者血清（ｌ検体）の１０倍希釈液を５０
ｔｄ／穴加え、４℃で１晩放匿後、ＰＢＳでよく洗浄し
た。ペルオキシデース標識ＡＬＣ−１８６（１０■／ｍ
ｌ）とβ−ガラクトシデース標識ＡＭＣ−４５４（ｌ
ｔｂｃｇ／＋１）の等量混合物１００ｍ／穴を第二抗体
として加え、４℃で１晩放冒し、ＰＢＳでよく洗浄した
。
悪性リンパ腫患者血清（ｌ検体）の１０倍希釈液を５０
ｔｄ／穴加え、４℃で１晩放匿後、ＰＢＳでよく洗浄し
た。ペルオキシデース標識ＡＬＣ−１８６（１０■／ｍ
ｌ）とβ−ガラクトシデース標識ＡＭＣ−４５４（ｌ
ｔｂｃｇ／＋１）の等量混合物１００ｍ／穴を第二抗体
として加え、４℃で１晩放冒し、ＰＢＳでよく洗浄した
。
β−ガラクトシデース基質液５０ａ１／穴を加え、室温
で３０分間反応させ、各人の発色を吸光度計（ＯＤＡ１
５−−）で測定することにより、ＡＭＣ−４５４の認識
する癌抗原量を算出した。
で３０分間反応させ、各人の発色を吸光度計（ＯＤＡ１
５−−）で測定することにより、ＡＭＣ−４５４の認識
する癌抗原量を算出した。
次いで、このプレートをよく洗浄後、ペルオキシデース
基質５０ρ／穴を加え、３０分間反応させ、多穴の発色
を吸光度計（ＯＤａ＋ｓ−）で測定することにより、Ａ
ＬＣ−１８６の認識する癌抗原量を算出した。その結果
を第２表に示した。
基質５０ρ／穴を加え、３０分間反応させ、多穴の発色
を吸光度計（ＯＤａ＋ｓ−）で測定することにより、Ａ
ＬＣ−１８６の認識する癌抗原量を算出した。その結果
を第２表に示した。
なお、面測定におけるカットオフ値は、それぞれの測定
での健常人２０検体のＯＤ４＋ｓｈａ値の平均値＋２３
Ｄ（標準偏差）とした。
での健常人２０検体のＯＤ４＋ｓｈａ値の平均値＋２３
Ｄ（標準偏差）とした。
水系により、ＡＬＣ−１８６の認識する癌抗原とＡＭＣ
−４５４の認識する癌抗原のコンビネーションアッセイ
が１枚のプレート上で可能となり第２表に示したように
、コンビネーションアッセイ系にふいて、癌全般、特に
肺癌、肺腺癌などで著しく高い陽性率かえられた。さら
に、ペルオキシデース系で発色しているか、β−ガラク
トシデース系で発色しているかを見ることにより、癌種
を限定することが可能となった。
−４５４の認識する癌抗原のコンビネーションアッセイ
が１枚のプレート上で可能となり第２表に示したように
、コンビネーションアッセイ系にふいて、癌全般、特に
肺癌、肺腺癌などで著しく高い陽性率かえられた。さら
に、ペルオキシデース系で発色しているか、β−ガラク
トシデース系で発色しているかを見ることにより、癌種
を限定することが可能となった。
発明の効果
本発明によれば、ヒト癌の血清診断を簡便に効率よく行
うことができる。
うことができる。
Claims (1)
- 抗−ヒト肺腺癌モノクローナル抗体ＡＬＣ−１８６と抗
−ヒト胃癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−４６２との混合
物、あるいは、抗−ヒト肺腺癌モノクローナル抗体ＡＬ
Ｃ−１８６と抗−ヒト肺扁平上皮癌モノクローナル抗体
ＳＬＣ−４５４との混合物を第一抗体とし、これを固相
化し、これにヒト血清検体を反応させて血清中の癌抗原
を結合させ、ついでペルオキシデースで標識した抗−ヒ
ト肺腺癌モノクローナル抗体ＡＬＣ−１８６とβ−ガラ
クトシデースで標識した抗−ヒト胃癌モノクローナル抗
体ＡＭＣ−４６２又はβ−ガラクトシデースで標識した
抗−ヒト肺扁平上皮癌モノクローナル抗体ＳＬＣ−４５
４を第二抗体として前記癌抗原に結合させ、結合したβ
−ガラクトシデースで標識した第二抗体の量をβ−ガラ
クトシデース基質を加えて、酵素活性を測定して定量し
、次いで、ペルオキシデース基質を加えて酵素活性を測
定して、結合したペルオキシデースで標識した第二抗体
を定量することを特徴とする血清検体中のヒト癌抗原の
定量法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10559888A JPH01276068A (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | ヒト癌抗原の定量法 |
| EP19890107622 EP0339632A3 (en) | 1988-04-28 | 1989-04-27 | Method of assaying human cancer antigens |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10559888A JPH01276068A (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | ヒト癌抗原の定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01276068A true JPH01276068A (ja) | 1989-11-06 |
Family
ID=14411931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10559888A Pending JPH01276068A (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | ヒト癌抗原の定量法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0339632A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01276068A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3919810A1 (de) * | 1989-06-16 | 1990-12-20 | Biochrom Beteiligungs Gmbh & C | Festphasenimmunoassay und testbesteck zur bestimmung von antigenen und antikoerpern |
| JP3115587B2 (ja) * | 1990-11-07 | 2000-12-11 | 第一化学薬品株式会社 | モノクローナル抗体及びマロンジアルデヒド化低比重リポタンパクの測定法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4690890A (en) * | 1984-04-04 | 1987-09-01 | Cetus Corporation | Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay |
| JPS62238465A (ja) * | 1986-04-09 | 1987-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 腺癌抗原の定量法 |
| JPS6319561A (ja) * | 1986-07-11 | 1988-01-27 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト肺癌単クロ−ン性抗体 |
| JPH0673470B2 (ja) * | 1986-07-15 | 1994-09-21 | 協和醗酵工業株式会社 | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ |
-
1988
- 1988-04-28 JP JP10559888A patent/JPH01276068A/ja active Pending
-
1989
- 1989-04-27 EP EP19890107622 patent/EP0339632A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0339632A3 (en) | 1990-09-19 |
| EP0339632A2 (en) | 1989-11-02 |
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