JPS62259064A - ヒト乳ガンの分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はガンの診断と監視の分野にある。特に。

血清のような体液中のある抗原の量を定量的免疫分析に
より測定することにより、乳ガンを診断したりまたは乳
ガン患者の乳ガンの状態を監視する方法に関するもので
ある。

（従来の技術） 悪性疾患の進行は、ある場合には適当な腫瘍マーカーの
血清レベルを測ることにより監視できる。

血液中の腫瘍抗原の検出のための多くの免疫学的分析が
開発され、そしてこれらのうちで最も有用なものは２つ
の広い群に分けられる。第１群はα−フェトプロティン
および前立腺特異的抗原のような活発に分泌されるタン
パクまたは糖タンパク抗原に基づくものであり、そして
第２は２種々の腫瘍型から未知の機構により遊離する９
発ガン胎児抗原またはムチン様抗原のような、多く糖付
加された高分子量抗原に基づくものである。

乳ガン、それは女性の悪性疾患の最大のクラスの一つで
ある。のようなガンのいくつかの変種は既存の血清学的
試験では容易に監視できない。乳ガンに対するい−くつ
かの可能性のある血清マーカーが文献に述べられている
。Ｃｅｒｉａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、　ＰＮＡＳ（１９８２
）　　頚：　５４２０−５４２４は進行性乳ガンの患者
の血清中に乳腺上皮細胞抗原が明らがＷ上昇しているこ
とを述べている。Ｂｕｒｃｈｅｌｌ、　Ｊ、、　ｅｔ　
ａｔ、ユ旦Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　（１９８４）　３４　：
　７６３−７６８は患者の血清中に上昇している高分子
量ムチン様抗原を検出するモノクローナルがＷを報告し
た。Ｈａｙｅｓ、　Ｄ’、Ｆ、＋　Ｊ　Ｃ１１ｎＩｎｖ
ｅｓｔ　（１９８５）　７５　：　１６７１−１６７８
はまた乳ガン患者の血禁中に高分子量の乳腺上皮細胞抗
原が多量存在することを認識するモノクローナルがＷを
報告した。　Ｐａｐｓｉｄｅｒｏ、　Ｌ、Ｄ、、　ｅｔ
　ａｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　（１９８４）４４　
：　４６５３−４６５７　；　ＴａｙｌｏｒＰａｐａｄ
ｉｍｉｔｒｉｏｕ、　Ｊ、、　ｅｔａｌ、　Ｉｎｔ　Ｊ
　Ｃａｎｃｅｒ　（１９８１）　２Ｂ　：　１７−２８
．　ａｎｄ　Ｕ、Ｓ。

Ｐａｔ、　Ｎｏ、　４．５２２，９１８．をまた参照、
これらのがＷにより認識されるエピトープに対する構造
のデータがないので、それらと本発明で用いるがＷの関
係を決定するのは不可能である。いずれの事象において
も、既述のがＷのいずれも臨床分析に広く受は入れられ
る基礎としては用いられない。

共同出願であるヨーロッパ特許出願第８５．３００８７
７．９号（１９８５年２月８日提出）、公開第０１５３
１ｉ４号（１９８５年１０月９日公開）は一連の杭孔ガ
ンモノクローナルがＷを述べている。これらのがＷは、
ヒト乳ガン細胞に選択的に結合する能力、およびレシン
Ａ鎖と組合せた時の乳ガンに対する免疫毒性としての有
効性に基づき同定された。本発明の方法に用いられるモ
ノクローナルがＷはそれらの一連のものに含まれる。本
出願はこのがＷが乳ガンを検出または監視するための免
疫分析に用いられるであろうことを述べる。そこで述べ
る特異的分析は血清学的であるよりむしろ細胞性のもの
である。

本出願は、このがＷにより認識されるいずれの抗原も血
液中の乳ガンマーカーであるかもしれないということは
示唆していない０本発明は１本出願で述べられるがＷの
２つが乳ガン患者の血清に上昇している同一抗原または
関連した抗原を認識するという発見に基づいている。

（発明が解決しようとする問題点および解決するための
手段） 本発明の一面はヒト患者の乳ガンを検出する方法であっ
て、以下の工程を含有する： （ａ）　Ｗ　１抗原と一９抗原から成るグループから選
ばれた抗原の該患者の体液中の量を、該抗原に対するモ
ノクローナルがＷを用いた定量免疫分析により決定する
工程；および （ｂ）工程（ａｌで決定された量と正常ヒト検体の対応
する体液に存在する該抗原の標準量とを比較して。

工程（ａｌで決定された量が正常ヒト検体の対応する体
液中の存在量に対して実質的に上昇しているかどうかを
決定する工程であって、該実質的な上昇が乳ガンの指標
となる工程。

本発明の他の面はヒト患者の乳ガンの状況の監視法であ
って、以下の工程を含有する：（ａ）患者の体液のサン
プルを所定時間間隔にわたり定期的に取得すること； （ｂ）Ｗ　ｌ抗原とｌ抗原から成るグループから選ばれ
た抗原のサンプル中の量を、該抗原に対するモノクロー
ナルを用ｊＳた定量的免疫分析により決定すること；お
よび （ｃ）この量を比較することで、ここで量の上昇は腫瘍
の病状の進行の指標となり、量の低下は腫瘍の病状の退
行の指標となる。

本発明の他の面はヒト患者の乳ガンの臨床的段階決定の
方法であって、以下の工程を含有する：（ａ）Ｗ　１抗
原とｌ抗原から成るグループから選ばれた抗原の該患者
の体液中の量を、該抗原に対するモノクローナルを用い
た定量的免疫分析により決定すること；および （ｂ）工程（ａ）で決定された量を、病状の種々段階の
ヒト乳ガン患者の対応する体液に存在する該抗原の前も
って決定された量と比較すること。

以下に本発明の詳細な説明する。

ここで用いる用語“モノクローナル”は均一ながＷ集団
を有するがＷ組成物を意味する。がＷの種または起源、
またはその作り方に関しては限定しない。この用語は免
疫グロブリン全体と共に抗原結合断片（例えばＦａｂ、
　　Ｆ（ａｂ’）ｚ、　Ｆｖ）を含むものである。

例証されるネズミモノクローナル抗ヒト乳ガンがＷに関
してここで用いる用語“機能的等価物”は、結合阻害実
験で決定されるような例証されるがＷと同一のエピトー
プに結合するモノクローナルを表す。

ヒト検体を述べるのにここで用いられる用語“正常”は
、検出できるガンを有しないヒト検体を表す。

本分析で用いる体液は典型的には血清である。

他の血液画分（例えば血漿）、または乳汁、浸出液（例
えば尿または唾液）などの体液は転移疾患の検出に有用
であろう。

理論上、いかなるヒト以外の哺乳類種のモノクローナル
をも本発明に用いることが出来るが、実際上このがＷは
、モノクローナルを生産するハイブリッドセルライン（
ハイプリドーマ）を作るのに用いるネズミおよびラット
のセルラインが利用しやすいので、典型的にはラットあ
るいはネズミ起源のものである。これらのハイプリドー
マは。

特異的乳ガン抗原に対するがＷを生じる細胞、典型的に
は肺臓細胞と、永続腫瘍セルラインとから。

にｏｈｌｅｒ、　Ｂ、とＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，、Ｎ
ａｔｕｒｅ　（１９７５）　２５６　：４９５−４９７
の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技術により作
られる。

ハイブリダイゼーションに用いられるがＷ産生融合相手
は、宿主１例えばマウスを化ヒト乳ガン細胞またはその
膜抽出物で感作することにより生ずる。動物の腹膜内に
細胞または抽出物を免疫源量投与し９次いで同量の免疫
源をブースター投与する。最終のブースター投与の数日
後、免疫された動物の肺臓を集め、そしてそれらから融
合に用いる細胞懸濁液を調製する。５ａｌｋ　Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅ、　Ｃｅ１ｌＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃ
ｅｎｔｅｒ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ＋　Ｃａ１ｉｆｏｒ
ｎｉａ。

ＵＳＡのもののような、入手可能なネズミミエローマラ
インを、ハイブリダイゼーションで腫瘍融合相手に用い
る。基本的には、この技術は、ポリエチレングリコール
のような融合促進剤を用いて腫瘍細胞と肺臓細胞とを融
合させることを含む、融合後、細胞を融合培地から分離
し、そしてＨＡＴ培地のような選択増殖培地で、増殖さ
せて、ハイブリダイズしなかった親細胞を除く、必要な
らば。

ハイブリドーマを増やし、そして上清の抗ヒト乳ガン活
性を従来の免疫分析手順により分析する。

ここで抗町および抗日として同定されたがＷを調製し、
まず選択性について選別し、そして前記米国特許出願第
６９０．７５０号（この開示を、それがこれらがＷに関
係するので、ここで引用文献として採用する）に示され
ている手順により特徴づける。

これらの特定のがＷは前記特許出願に示されている乳ガ
ン選別がＷのグループから、正常血清プールに比較して
Ｍｌ瘍血清プールによる。固定した標的細胞（乳ガン細
胞）へのモノクローナル結合の阻害を測定する分析でそ
れらを調べることにより。

同定された。この方法で、このグループ中の、乳ガン患
者の血清中に上昇した抗原を認識するこれらがＷを同定
した。

抗Ａ１および抗日を用い、それらが認識する抗原を血清
からアフィニティークロマトグラフィーで精製し、そし
てドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）とウエスタングロソティン
グにより特性を明らがＷした。

このがＷにより認識される抗原が血清から共に精製され
、そして見掛は分子量が２６０，０００から３４０．０
００であることが５ＯＳ−ＰＡＧＥで決定された。この
抗原の精製特性は、それらが同一の抗原か、密接に関連
したまたは関係した分子であることを示す。

血清サンプル中のＷｌおよび同抗原の量は、当業者に入
手可能な拮抗または非拮抗、直接または間接の分析方法
を用いて決定される。ラジオイムノアッセイ、酵素分析
、および蛍光分析が最も普通である０個々の患者により
、この定量は乳ガンの検出、疾患の段階の判定、または
疾患の進行の監視に用いられる。現在までに試された分
析様式は。

第■期および第１期のガン以上のガンの状態の検出に良
好であった。乳ガンの検出に用いる場合。

その量は正常人の血清に通常存在する抗原の量と比較さ
れるであろう、これに関して、正常人の量は典型的には
ｌ−あたり約５０アフセイ単位（以下の実施例で述べら
れる二重決定分析（ＤＤＩＡ）により測定）を下まわり
、一方、ガン患者では、この量は１−あたり約５０アツ
セイ単位を上まわる。病状段階を判定するのに用いる場
合は、その量を種々の病状段階の典型的な場合の量と比
較すればよい。これに関して、各病状段階の典型的な量
は次の通りである：第■期から第■期は約１００アフセ
イ単位／−を下まわり、第■期は約１００ア７セイ単位
／　ｔｎｌを上まわる。病状の進行を監視する場合。

・　血清サンプルを患者から定期的（期間の長さは患者
により、また患者の病歴と処理による）に取り。

そして抗原の量を互いに比較する。量の上昇は腫瘍状況
の進行を示し、低下は腫瘍状況の退行を示す。

以下の実施例はさらに本発明を記述しそして例示する。

これらの実施例は本発明を何らかの型に限定するもので
はない。

（実施例） 孟ノ」と９：ＺＬ上 米国特許出願第６９０　、７５０号に述べられているが
Ｗのパネルを評価に用いた。正常肝臓と肺臓の抗原を認
識するパネルのがＷは、これらの器官に存在する抗原の
正常血清レベルが高いことが期待されるので、評価しな
かった。乳ガンに高い割合で存在する抗原を認識するが
Ｗを評価に選んだ。パネルから１３個のがＷを９間接お
よび直接拮抗放射測定細胞結合分析での評価に選んだ。

これらのがＷ、米国特許出願第６９０，７５０号でのそ
れらの命名。

同型、および認識される抗原を下の表１に挙げる。

簡便のため、認識される抗原をがＷに使われるのと同一
の現在の命名で表す、従って、−例として。

同抗原はモノクローナル引により認識され結合される分
子を表す。

（以下余白） 表１ ＋１ＭＷ　＝高分子ｉｔ：　ＮＤ−決定していない。分
子量は乳ガンセルラインで同定された抗原の大きさを示
す。

■皇猪金立捉 豊胞 ＭＣＦ７細胞はＤｒ、　Ｍａｒｃ　Ｌｉｐｍａｎｎ、　
ＮＩＨ，から得。

１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）と０．６μｓ／ａｄインシ
ユリンを含むダルベツコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ
）で維持した。Ｃａ１ｕ−１細胞はＡＴＣＣから得、　
１０％ＦＣ３を含むＤＭＥＭで維持した。大部分の実験
については。

ＦＡＣＳでの繰り返し選別によるＣａ１ｕ−１由来のセ
ルラインを用いた。これらのラインはｌＩ４１．　Ｗ５
およびＷ９がＷの上昇した量と結合し、そして−ＩＳ４
．　Ｗ５Ｓ４゜−９Ｓ４およびＷ３Ｃ１６と名付ける。

賀５Ｃ１６は郷Ｓ４に由来するクローンラインであった
。これらの派生セルラインは親のＣａ１ｕ−１細胞に比
べ５倍を上まわる１！Ｓ１−標識−１および％１５がＷ
と、そして５０倍を上まわるＩ！５１１９がＷと結合し
た。

１症 細胞をトリプシン処理で集め、マルチウェルプラスチッ
ク皿（４８または９６ウエル）に３−１８Ｘ１０’細胞
／−で植え１分析開始前に３７℃で１８時間維持した。

単層を洗い、がＷを加える前に０．５％パラホルムアル
デヒドでもとの位置に固定し、そしてＭａｒｑｕａｒｄ
ｔ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｔｏｄａｒｏ、　ｃ、↑＋ｌ　Ｊ　
Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８２）　　肛：　５２２０−
５２２５に述べられているように結合緩衝液でブロック
した。

血液を個々から取り、２３℃、　１０−９０分間凝固さ
せた。サンプルを４℃−６℃で０．５−５時間保ち。

臨床用遠心機で遠心分Ｍ　（１６，０ＯＯｘ　ｇ）　し
た。血清を凝固物から分離し、小分けし一７０℃で凍結
させた。

間接分析には、５人の健常人（ＮＤ５）と５人の進行乳
ガン患者（ＢＨＳ）のプールした血清を用いた。

直接分析には２合計１４９検体から血清を集めた。

これらのうち、３４人は乳ガンを有していると診断され
た。血清採取時のこれら検体の病状の臨床的段階は以下
のように表現した：第！期は初期腫瘍が確認されている
がそれを含むリンパ節はない場合、第■期と第■期は腫
瘍細胞を含むリンパ節が存在する場合、第■期は転移を
転移を生じている場合である。乳ガン以外の型のガンを
有している８２検体の血清を調べた。約２１人が大腸直
腸ガンを有していた。５０人が前立腺ガン、１０人が肺
ガン。

５人が膀胱ガン、４人が卵巣ガン、そして残りは他の型
のガンであった。７人の健常ボランティアと２６人の非
悪性疾患で入院中の患者の血清を対照として用いた。

１１痘企分捉王皿 ＋２Ｓ■−標識Ｗｌ、　Ｗ５または四がＷ（比活性は約
ＩＸ　１０’ｃｐｍ／ｎｍｏｌｅ）を拮抗溶液の存在ま
たは不在下で、定めた濃度でＣａ１ｕ−１細胞のホルマ
リン固定単層に加えた。結合反応を１時間、２３℃で進
行させ。

単層を結合緩衝液で洗い、　０．５Ｎ　ＮａＯＨで可溶
化し。

ガンマカウンターで測定した。非特異的がＷ結合を５０
倍過剰の標識していないがＷの存在下で測定し、そして
それは一般に全結合の１０％より低かった。

皿１鎧金立捉王皿 固定した細胞単層を、結合緩衝液０．５μｇ／−の標識
していないモノクローナルおよびＮｌｌ５またはＢＨ５
血清と同時に、１時間、２３℃で保温した。次いで単層
を洗い　ＩｔＳｌ−標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（
比活性１−２　Ｘ　ｌＯ”ｃｐｓ／ｎｎ＋ｏｌｅ）と、
さらに１時間、２３℃で保温した。最後に、単層を結合
緩衝液で２回洗い、　Ｎａ０ＩＩで可溶化し、細胞結合
放射活性をガンマカウンターで測定した。

猪栗工 ■孜姑査光近 表１に挙げた１３個の杭孔ガンがＷを、各実験で異なる
血清プールを用い、３回分析した。結果を下の表２に示
す。ＭＣＦ−’？細胞を実験■で示す実験で用いた。モ
ノクローナルを実験Ｉと■では０．５μｇ／ｄ、そして
実験■では０．４μｇ／−で用いた。

１２５■−ヤギ抗マウスＩｇを実験Ｉでは０．５μｓ／
ＩＩｄｌ。

実験■と■ではｌμｇ７ｍｌで加えた。結合したがＷの
値を非特異的１２Ｓ■−がＷ結合（モノクローナル不在
下での結合がＷ）に対し補正した。補正は実験１．ｎお
よび■に対し、それぞれ１３０ｐｇ、　１１００ｐおよ
び１８０ｐｇであった。

（以下余白） 表２ 正常および腫瘍血清プールによるがＷ結合の阻害遺」（
町 １・　１０’細胞あたり結合した１２５！−がＷのｐｇ
ｅ２°　ｌＮｌｌ５で結合した”’Ｉ−ＢＣＳで結合し
た１、ｚ、ｓｌｌ／Ｎｌｌ５で結合したＴＳＩ 表２に示すように、がＷ旧と−９のいずれかのセルライ
ンとの結合は、健常人の血清によるより。

腫瘍患者の血清により、実質的にかなりの程度（＜５０
％）阻害された。がＷ郷の結合は、用いた特定の血清プ
ールに依存して、腫瘍血清により実質的に阻害されるこ
とがあった。調べた他のすべてのがＷの結合は、腫瘍患
者の血清により、有意に高い程度（２２５％）再現性よ
く阻害されることはなかった。

がＷ−１，Ｗ５およびＷ９により認識されるエピトープ
が相関しているかどうかを決定するために、各がＷの、
他のがＷの結合に対する拮抗能力を比較した。各がＷを
１１５１で放射能標識し、そして標識したがＷの一定濃
度を標識していないがＷの量を増加させ、標的細胞に個
々に加えた。各放射能標識されたがＷの結合は、対応す
る標識していないがＷの添加により用量依存性に阻害さ
れ、測定された結合は特異的であることを示す。標識さ
れていない四がＷは、標識されたがＷに対し、標識され
ていないがＷが５０倍過剰でも　ｌ！Ｓｔ−ｗｌの結合
を阻害しなかった。標識されていない四の低濃度では、
　Ｗｌの結合は実際わずがＷ、しかし再現性良く上昇し
た。逆に、標識されていない一１がＷは１２５（−一９
の結合に対し高濃度で拮抗しなかったが、低濃度では実
際結合が促進された。

（以下余白） 罰と四はお互い結合に拮抗しないので、それらは異なる
エピトープを認識すると結論された。

イ５により認識されるエピトープの挙動はもつとＭｌ雑
である。−５は−１または四の結合に拮抗しないが、逆
の実験では、　Ｗｌと四双方とも−５の結合に拮抗し得
る。これらの結果は、全体の一５がＷ（１ｇＭ同型）の
結合は他のがＷの結合により阻害されるが、おそらく別
のエピトープに結合することを示唆する。この議論はさ
らに、　Ｗ５がＷが免疫組織学により調べた乳ガンのか
なりわずかのものに結合するという発見により支持され
る。要約すると。

がＷ−１，朽および−９は異なるエピトープを認識する
らしい。

直■光捉 健常ボランティアと乳ガン患者のいずれの血清も、この
分析では　１２８１−ラベルがＷ−１，Ｗ５およびＷ９
の標的細胞への結合を用量依存性に阻害した。

乳ガン患者の血清は一般に、正常血清より有意に高い稀
釈でかなりのレベルの阻害を示した。これらの結果は間
接阻害分析の結果を確証し、そして３つの全てのがＷは
乳ガン患者の血清中に高いレベルで存在する抗原を認識
することを示した。−−−−一高い抗原レベルを有する
進行乳ガン患者の割合はＷ５に対してよりＷｌとＷ９に
対してより高かった。

抗原の上昇の程度および高い抗原レベルを示す血清のパ
ーセントの両者は、　Ｗ５に対しては他の２つのがＷに
対してより低く、これは前者が血清試験にあまり有効で
ないことを示した。

高い−１とＷ９レベルを有する患者の数を正確に示すた
め、計１４７個体の血清サンプルについて、この直接阻
害分析を用いて、これら抗原レベルの試験を行なった。

これらサンプルのうち、３４個は進行乳ガン患者、８２
個は乳ガン以外の他の腫瘍患者。

８個は健常人、そして２３個は非悪性疾患の入院患者の
ものであった。測定において実験的偏向をなくすため、
サンプルを二重盲検法で無差別に分析した。サンプルを
１血清濃度（最終血清濃度−１については６．２５％、
−９については１２．５％）で分析し。

そして結合阻害の観察度合を、対照血清で決定した阻害
曲線との比較により、その抗原の任意の単位に変換した
。匈１と四決定に用いた血清濃度は。

阻害値の観測された範囲の平均がほぼ対照曲線の中点に
一致するように選んだ。この理由は測定値の極端な値は
あまり正確でないためである。測定した値を第１図と第
２図にグラフで示す。ＭｌまたはＷ９抗原の高いレベル
を有する種々腫瘍型の個体数の要約を下の表３に示す。

（以下余白） 表３ 高い抗原レベルを有する個体２の要約 乳ガン　（３４）　’　　　　　　５３　　　　　７４
大腸、直腸ガン（２１）　　　　５　　　　　２９前立
腺ガン　　（１５）　　　　１３　　　　　３３肺ガン
　　　　（１０）　　　　２０　　　　　５０膀胱ガン
　　　（５）　　　　４０　　　　　４０卵巣ガン　　
　（４）　　　　２５　　　　　４０その他のガン　（
２７）　　　　２２　　　　　１５し非履牲戻五 疾患　　　　　（２６）　　　　＜１　　　　１２（健
常　　　　　（７）　　　　　＜１　　　　　　＜１２
．５０単位／分析と２単位／分析の切捨て値をそれぞれ
−１と四に用いた。

第１図に示すように、乳ガンを有する個体のかなりの割
合で、讐１と賀９両者の循環レベルが正常値より上昇し
ていることが解った。賀１分析では、非ｌＩ瘍患者で得
られた最高値は約５０単位であった：乳ガンを有する個
体の５３％（１８／３４）と他の悪性の個体の１７％（
１５／８２）がこの値より高い一１抗原の循環レベルを
有していた。

Ｗ９については、腫瘍患者と健常人の血清で求めた値に
はかなりのオーバーランプがあった。この場合、非悪性
患者と対照健常人の大部分の血清は約１単位／分析あた
りに集まる値を示した。非悪性疾患を有する個体の１２
％（４／３４）が主集合値より有意に高い（〉２単位）
−９抗原のレベルを有していた。乳ガン患者の７４％（
２５／３４）と非乳ガン患者の約２９％（２４／８２）
が正常集合より高いｌ抗原の血清レベルの上昇を示した
。質１とｌ抗原の血清レベルと１年齢、性別、エストロ
ゲンまたはプロゲステロン受容体レベル、または治療法
との間には明白な相関は認められなかった。

健常人、乳ガン患者および非悪性疾患患者のＷｌとＷ９
抗原の血清レベルの測定値を第２図で比較する。この図
のデータはまた血清採取時の病状の臨床段階に従い区別
される。このデータの表示からいくつかの点が明らかと
なる。第１に、　ＫｌとＷ９について得られた値はお互
いに一般に相関し、同一患者で得られた−１とＷ９の値
の間には直線関係がある。掻端な値はお互いあまり相関
しないが、これはこれらの値の測定が不正確であること
を反映しているのであろう、また高いＭ９レベルを有す
る４人の非ガン患者は高い一ルベルと相関せず、それゆ
え彼らは大部分の乳ガン患者と区別されることが明らか
である。最後に、栃１と日双方のレベルは−ａに病状の
臨床段階と相関し、明らがＷ転移期（第■期）の患者は
、最高の−ｌと一９値をもつ傾向にあった。すなわち第
■期の患者の８６％（１８／２１）が明らがＷ正常な範
囲外（−１では〉５０単位、　Ｗ９では＞２１１位）に
ある旧と一９値を有していた。

乳ガン以外の腫瘍型を有する患者のうち、高いＷｌと一
９抗原レベルを有する個体の数にある明白な差があった
（表３）、全ての場合で、四に陽性の同一の血清サンプ
ルの数は一１抗原に陽性の数に等しいかそれ以上であっ
た。これらの結果は、旧とｌ抗原の高いレベルが乳ガン
患者の大部分の血清に見出されたことを示す。これらの
がＷにより認識される抗原は次の項で特徴づけられる。

五互鬼豆激仕鉄 全血清中に存在する−１とｌ抗原の特徴づけは。

血清に存在する抗原が低濃度でタンパク量が多いので困
難である。−１と一９がＷにより認識される抗原の性質
を調べるために、　Ｍｌ抗原をイムノアフィニティーク
ロマトグラフィーにより部芽精製した。

簡潔に述べると、血清を１４７．０００　ｘ　ｇで６０
分間遠心分離により清澄液にし９次いで−１の結合した
セファロース４１３（５■がＷ／−樹脂）と４：１（血
清：樹脂）の容量比で混ぜた。混合物を４℃で一晩回転
攪拌し、ガラスウールで栓をした使い捨て注射器に入れ
、洗浄した。結合抗原の溶出は７５１１Ｍトリエチルア
ミンの添加により行なった。カラムの通過液には検出で
きる賀１抗原は含まれていなかったが、アルカリｐｉで
溶出したカラム洗浄液には初発の抗原の約７７％（”’
Ｉ−Ｗｌ結合を５０％阻害するのに必要な量として判定
）が回収された。溶出液にはサンプル中の初発の約０．
５７％のタンパク・が含まれており、全体の抗原の精製
度は１３０倍であた。イムノアフィニティーで精製した
Ｍｌ抗原標品を５Ｏ８−ＰＡＧＩＥにかけウェスタンブ
ロッティングを行い、Ｍｒｘ約２６０．０００−３４０
．０００ダルトンの２つの免疫反応性成分を認めた。

同じ血清サンプルをｌ抗原について分析した。

−１アフイニテイーカラムの通過液は初発四活性の１２
％を下まわる活性しか含んでおらず、−１抗原の除去は
またｌ抗原の除去にもなることを示す。−９活性は５０
％の収率でカラムから溶出され、これはｌ抗原の全体の
精製度約８８倍に相当する。精製同抗原を５ＯＳ−ＰＡ
ＧＥとウェスタンブロッティングにかけ、ｌ抗原により
認識されるものと同じ移動度を有する免疫反応性成分が
観察された。これらのデータは、−１と一９抗原は血清
から同時に精製され。

そして密接に関連しているかまたは相関している分子で
あるらしいことを示す。

第１図と第２図に示す結果は一般に、−１がＷでの二重
決定分析（ＤＤＩＡ）を用いて確認された。７８人の乳
ガン患者と７５人の健常人の゛血清を調べた。

ＤＤＩＡで用いた手順を以下に示す。

９６ウエルのプラスチック皿（Ｉ＋ｍｍｕｌｏｎ　Ｉｆ
　）をｌがＷの溶液（０，０５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐ＋１
８．０の０．０５ｄ容量に０．５μｇがＷ）で１時間コ
ートした。このプレートを次に同じ緩衝液中の１％ゼラ
チンでさらに１時間ブロックした。０．０５ｙｄ容量の
血清（０，０５Ｍ　Ｔｒｉｓ。

ｐＨ８，０中の５％（Ｗ：Ｖ）、０．１％（Ｗ：Ｖ）　
ＮａＮ５溶液にｌ：２００で稀釈）を各試験ウェルに加
え、プレートを約１６時間保温した。ウェルを次にＩ！
ｓ！−標識ＷｌがＷ（０，０５−容量に１５ｎｇ）と３
０分間保温し、　　ＰＢＳで３回洗った。結合したｌ！
Ｊ　　ｗ１がＷを０．５Ｎ　ＮａＯＨで可溶化し、放射
活性をガンマカウンターで測定した。各血清で得られた
値を、乳ガン患者の対照血清の種々稀釈で得られた標準
曲線との比較により、単位に変換した。全ての保温は２
３℃で行なった。

上述のＷｌとＷ９モノクローナルを生産するハイブリド
ーマサンプルをＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　　（＾ＴＣＣ）、１２３
０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２
−１７７６、０．Ｓ、Ａ、に寄託した。これら寄託物の
寄託日付および受理番号を下に示す。

２Ｇ３　　　　　目　　１９８４年１月２７日　１１Ｂ
−８４９１２４５Ｅ７　　　　日　　１９８４年１月２
７日　ＨＢ−８４８９これらの寄託物はブタペスト条約
の規定に準じ。

それに従い保存されるであろう。

本発明に関連する当業者に明らかな本発明の方法の修飾
は特許請求の範囲の展望に折り込まれている。

４、ヌ「の　　な曾゛■ 第１図と第２図は、実施例で述べられている分析の結果
のグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト患者の乳ガンの検出方法であって、以下の工程
   ： （ａ）該患者の体液におけるＷ１抗原とＷ９抗原から成
   るグループから選ばれた抗原の量を、該抗原に対するモ
   ノクローナルを用いた定量免疫分析により決定する工程
   ；および （ｂ）工程（ａ）で決定された量と正常ヒト検体の対応
   する体液に存在する該抗原量とを比較して、工程（ａ）
   で決定された量が正常ヒト検体の対応する体液に存在す
   る量に比べて上昇しているかどうかを決定する工程であ
   って、実質的な上昇が乳ガンの指標となる工程、 を包含する方法。 ２、前記体液が血清である特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ３、前記抗原がＷ１抗原であり、そして前記モノクロー
   ナルがＷ１またはその機能的等価物である特許請求の範
   囲第２項に記載の方法。 ４、前記抗原がＷ９抗原であり、そして前記モノクロー
   ナルがＷ９またはその機能的等価物である特許請求の範
   囲第２項に記載の方法。 ５、ヒト患者の乳ガンの状態を監視する方法であって、
   以下の工程： （ａ）患者の体液のサンプルを所定時間間隔にわたり定
   期的に採取する工程； （ｂ）Ｗ１抗原とＷ９抗原から成るグループから選ばれ
   た抗原のサンプル中の量を、各サンプル中の該抗原に対
   するモノクローナルを用いた定量免疫分析により決定す
   る工程；および （ｃ）該量を比較する工程で、ここで量の上昇は腫瘍症
   状の進行の指標となり、そして低下は腫瘍症状の退行の
   指標となる工程、 を包含する方法。 ６、前記体液が血清である特許請求の範囲第５項に記載
   の方法。 ７、前記抗原がＷ１抗原であり、そして前記モノクロー
   ナルがＷ１またはその機能的等価物である特許請求の範
   囲第６項に記載の方法。 ８、前記抗原がＷ９抗原であり、そして前記モノクロー
   ナルがＷ９またはその機能的等価物である特許請求の範
   囲第６項に記載の方法。 ９、ヒト患者の乳ガンの臨床的段階の決定方法であって
   、以下の工程： （ａ）該患者の体液におけるＷ１抗原とＷ９抗原から成
   るグループから選ばれた抗原の量を、該抗原に対するモ
   ノクローナルを用いた定量的免疫分析により決定する工
   程；および （ｂ）工程（ａ）で決定された量を、該疾患のいくつか
   の段階のヒト乳ガン患者の対応する体液に存在する該抗
   原の既に決定された量と比較する工程、を包含する方法
   。 １０、前記体液が血清である特許請求の範囲第９項に記
   載の方法。 １１、前記抗原がＷ１抗原であり、そして前記モノクロ
   ーナルがＷ１またはその機能的等価物である特許請求の
   範囲第１０項に記載の方法。 １２、前記抗原がＷ９抗原であり、そして前記モノクロ
   ーナルがＷ９またはその機能的等価物である特許請求の
   範囲第１０項に記載の方法。