JPH0843398A - 癌の診断方法 - Google Patents
癌の診断方法Info
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- JPH0843398A JPH0843398A JP20150194A JP20150194A JPH0843398A JP H0843398 A JPH0843398 A JP H0843398A JP 20150194 A JP20150194 A JP 20150194A JP 20150194 A JP20150194 A JP 20150194A JP H0843398 A JPH0843398 A JP H0843398A
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- vpf
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規な癌の診断方法を提供することを目的と
する。 【構成】 血清中の血管透過性因子の存在量を、血管透
過性因子に対する抗体を用い、化学発光法による酵素免
疫測定法により測定し、その測定値に基づいて癌の診断
を行う。 【効果】 従来の診断方法に比して極めて高い陽性率が
得られる。
する。 【構成】 血清中の血管透過性因子の存在量を、血管透
過性因子に対する抗体を用い、化学発光法による酵素免
疫測定法により測定し、その測定値に基づいて癌の診断
を行う。 【効果】 従来の診断方法に比して極めて高い陽性率が
得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血清中の血管透過性因
子（以下ＶＰＦという）の存在量を測定し、その測定値
に基づいて診断することを特徴とする癌の診断方法に関
するものである。血清中のＶＰＦの存在量を測定するこ
とによる本発明の癌診断は、既知の各種腫瘍マーカーや
便の潜血反応を用いた場合よりも非常に高率で癌患者を
検出することができ臨床上非常に有用なものであるた
め、本発明は医薬、特に診断薬業界で有用なものであ
り、それらの業界で広く利用されるものである。
子（以下ＶＰＦという）の存在量を測定し、その測定値
に基づいて診断することを特徴とする癌の診断方法に関
するものである。血清中のＶＰＦの存在量を測定するこ
とによる本発明の癌診断は、既知の各種腫瘍マーカーや
便の潜血反応を用いた場合よりも非常に高率で癌患者を
検出することができ臨床上非常に有用なものであるた
め、本発明は医薬、特に診断薬業界で有用なものであ
り、それらの業界で広く利用されるものである。
【０００２】
【従来の技術】現在、日本において癌患者は年々増加し
ており、早期発見のための診断方法が強く求められてい
る。臨床診断における測定法としては放射性同位元素を
利用したラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が古くから用
いられている。この方法は高感度で特異性が高く、分析
操作が簡単であるが、放射性物質を用いるため取り扱い
に制限があり、装置や設備が高価で、使用後の廃棄が面
倒である。そこで最近では非放射性物質を標識に用いる
非放射性イムノアッセイが開発されてきている。特に酵
素の増幅作用を利用する酵素イムノアッセイは高感度で
広く利用されている。この方法は一般に酵素免疫測定法
と言われているがこの方法において用いられている検出
法は大きく比色法、蛍光法、化学発光法に分けることが
できる。これらの方法の検出感度を比較すると、比色
法、蛍光法、化学発光法の順に高感度であると言われて
いる。酵素免疫測定法を構築する際には試料中に含まれ
る抗原量、使用する抗体の親和性および測定系により最
も適当な検出法が選択されるため、測定する物質により
測定方法は様々であり、各々の物質に対して個々に測定
方法を構築していく必要がある。一方、癌の診断には、
各種の腫瘍マーカーが利用されているが、いずれもその
陽性率は満足出来るものではない。たとえば、大腸癌の
診断に用いられる腫瘍マーカーとして Carcinoembryoni
cantigen(ＣＥＡ）、ＣＡ１９-９、ＮＣＣ-ＳＴ-４３
９、ＳＴＮなどがあげられ、治療効果の判定や再発のモ
ニターとして用いられているが、病期別腫瘍マーカー陽
性率は治癒切除可能なDukes C においてもＣＥＡ、ＣＡ
１９-９、ＮＣＣ-ＳＴ-４３９、ＳＴＮで各々３６％、
３０％、３５％、２１％にすぎず、早期大腸癌の発見に
関して十分な腫瘍マーカーであるとは言えないのである
（大倉久直他．大腸がんの腫瘍マーカー．ＣＲＣ１(4)
，４２-４７（１９９２））。
ており、早期発見のための診断方法が強く求められてい
る。臨床診断における測定法としては放射性同位元素を
利用したラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が古くから用
いられている。この方法は高感度で特異性が高く、分析
操作が簡単であるが、放射性物質を用いるため取り扱い
に制限があり、装置や設備が高価で、使用後の廃棄が面
倒である。そこで最近では非放射性物質を標識に用いる
非放射性イムノアッセイが開発されてきている。特に酵
素の増幅作用を利用する酵素イムノアッセイは高感度で
広く利用されている。この方法は一般に酵素免疫測定法
と言われているがこの方法において用いられている検出
法は大きく比色法、蛍光法、化学発光法に分けることが
できる。これらの方法の検出感度を比較すると、比色
法、蛍光法、化学発光法の順に高感度であると言われて
いる。酵素免疫測定法を構築する際には試料中に含まれ
る抗原量、使用する抗体の親和性および測定系により最
も適当な検出法が選択されるため、測定する物質により
測定方法は様々であり、各々の物質に対して個々に測定
方法を構築していく必要がある。一方、癌の診断には、
各種の腫瘍マーカーが利用されているが、いずれもその
陽性率は満足出来るものではない。たとえば、大腸癌の
診断に用いられる腫瘍マーカーとして Carcinoembryoni
cantigen(ＣＥＡ）、ＣＡ１９-９、ＮＣＣ-ＳＴ-４３
９、ＳＴＮなどがあげられ、治療効果の判定や再発のモ
ニターとして用いられているが、病期別腫瘍マーカー陽
性率は治癒切除可能なDukes C においてもＣＥＡ、ＣＡ
１９-９、ＮＣＣ-ＳＴ-４３９、ＳＴＮで各々３６％、
３０％、３５％、２１％にすぎず、早期大腸癌の発見に
関して十分な腫瘍マーカーであるとは言えないのである
（大倉久直他．大腸がんの腫瘍マーカー．ＣＲＣ１(4)
，４２-４７（１９９２））。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、従来の
方法に比して非常に高い陽性率で癌患者、特に早期癌患
者を検出することができる診断方法を見出すべく鋭意検
討を行ったのである。
方法に比して非常に高い陽性率で癌患者、特に早期癌患
者を検出することができる診断方法を見出すべく鋭意検
討を行ったのである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、種々検討
した結果、癌患者と健常人との間で血清中のＶＰＦの存
在量に顕著な差異があることを見出し、血清中のＶＰＦ
の存在量に基づいて癌の診断を行なえば、またその測定
を化学発光検出系を用いる酵素免疫測定法によれば、非
常に高い陽性率で各種の癌の診断が可能になることを見
い出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、血清
中のＶＰＦの存在量を、ＶＰＦに対する抗体を用い、化
学発光法による酵素免疫測定法により測定し、当該測定
値に基づいて診断することを特徴とする癌の診断方法に
関する発明、さらには該ＶＰＦがヒトＶＰＦである癌の
診断方法に関するものである。
した結果、癌患者と健常人との間で血清中のＶＰＦの存
在量に顕著な差異があることを見出し、血清中のＶＰＦ
の存在量に基づいて癌の診断を行なえば、またその測定
を化学発光検出系を用いる酵素免疫測定法によれば、非
常に高い陽性率で各種の癌の診断が可能になることを見
い出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、血清
中のＶＰＦの存在量を、ＶＰＦに対する抗体を用い、化
学発光法による酵素免疫測定法により測定し、当該測定
値に基づいて診断することを特徴とする癌の診断方法に
関する発明、さらには該ＶＰＦがヒトＶＰＦである癌の
診断方法に関するものである。
【０００５】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明は、血清中のＶＰＦの存在量を、ＶＰＦに対する抗
体、特にはヒトＶＰＦに対する抗体を用い、化学発光法
による酵素免疫測定法により測定し、その量に基づいて
癌の診断を行うというものであり、ＶＰＦ、即ち血管透
過性因子(vascular permeability factor)とは、血管内
皮細胞増殖因子(vascular endothelial cell growth fa
ctor,ＶＥＧＦ)と呼ばれているものと同じ因子であり、
下記の因子と同様に、血管新生を誘導する因子として知
られているものの一つである。すなわち、ＶＰＦ以外に
血管新生を誘導する因子として知られているものには、
直接的に血管内皮細胞に作用する物質としての塩基性線
維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor, b
ＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibroblast
growth factor, aＦＧＦ）、血小板由来内皮細胞増殖
因子(platelet-derived endothelial cell growth fact
or, ＰＤ-ＥＣＧＦ）等であり、また間接的に血管内皮
細胞に作用する物質としてのtransforming growth fact
or-α(ＴＧＦ-α)、transforming growth factor-β(Ｔ
ＧＦ-β)、angiogenin、tumor necrosis factor-α(Ｔ
ＮＦ-α)等がある[Folkman,J. & Shing,Y.,J.Biol.Che
m.,267:10931(1992)]。これらの因子は血管新生の誘
導、すなわち、毛細血管内皮細胞の増殖、移動および組
織への浸潤によって、胎児の生長、創傷治癒、癌細胞の
増殖などの生理的または病理的現象において重要な役割
を果たしていることが知られている[(Folkman,J.,Cance
r Res.46:467(1986)]。
発明は、血清中のＶＰＦの存在量を、ＶＰＦに対する抗
体、特にはヒトＶＰＦに対する抗体を用い、化学発光法
による酵素免疫測定法により測定し、その量に基づいて
癌の診断を行うというものであり、ＶＰＦ、即ち血管透
過性因子(vascular permeability factor)とは、血管内
皮細胞増殖因子(vascular endothelial cell growth fa
ctor,ＶＥＧＦ)と呼ばれているものと同じ因子であり、
下記の因子と同様に、血管新生を誘導する因子として知
られているものの一つである。すなわち、ＶＰＦ以外に
血管新生を誘導する因子として知られているものには、
直接的に血管内皮細胞に作用する物質としての塩基性線
維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor, b
ＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibroblast
growth factor, aＦＧＦ）、血小板由来内皮細胞増殖
因子(platelet-derived endothelial cell growth fact
or, ＰＤ-ＥＣＧＦ）等であり、また間接的に血管内皮
細胞に作用する物質としてのtransforming growth fact
or-α(ＴＧＦ-α)、transforming growth factor-β(Ｔ
ＧＦ-β)、angiogenin、tumor necrosis factor-α(Ｔ
ＮＦ-α)等がある[Folkman,J. & Shing,Y.,J.Biol.Che
m.,267:10931(1992)]。これらの因子は血管新生の誘
導、すなわち、毛細血管内皮細胞の増殖、移動および組
織への浸潤によって、胎児の生長、創傷治癒、癌細胞の
増殖などの生理的または病理的現象において重要な役割
を果たしていることが知られている[(Folkman,J.,Cance
r Res.46:467(1986)]。
【０００６】これらの血管新生を誘導する因子の内、Ｖ
ＰＦに関しては、マウス、ラット、モルモット、ウシお
よびヒトの正常または腫瘍細胞株で分泌されており、ま
た組織別では脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在することが
明らかにされている[(Ferrara,N., et.al. Endocrine R
eviews 13:18(1992)]。さらにヒトＶＰＦに関しては、
乳癌の血管新生と転移[Weider,N, et.al. N.Engl.J.Me
d. 324:1(1991)]や腎細胞癌の血管新生[医学のあゆみ,1
68:231(1994)]、あるいは網膜疾患における血管新生[Ad
amis,A.P. et.al., Biochem.Biophys.Res.Comm.,193:63
1(1993)]に関与していることが報告されている。また、
ＶＰＦは標的細胞表面に存在する受容体（flt, fms-lik
e tyrosine kinase)と結合することにより細胞内へシグ
ナルを伝達することも明らかにされているが[De Vies,
C. et. al. Science,255:989(1992)]、ＶＰＦとその受
容体との相互作用機構やシグナル伝達機構については詳
細には解明されていない。
ＰＦに関しては、マウス、ラット、モルモット、ウシお
よびヒトの正常または腫瘍細胞株で分泌されており、ま
た組織別では脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在することが
明らかにされている[(Ferrara,N., et.al. Endocrine R
eviews 13:18(1992)]。さらにヒトＶＰＦに関しては、
乳癌の血管新生と転移[Weider,N, et.al. N.Engl.J.Me
d. 324:1(1991)]や腎細胞癌の血管新生[医学のあゆみ,1
68:231(1994)]、あるいは網膜疾患における血管新生[Ad
amis,A.P. et.al., Biochem.Biophys.Res.Comm.,193:63
1(1993)]に関与していることが報告されている。また、
ＶＰＦは標的細胞表面に存在する受容体（flt, fms-lik
e tyrosine kinase)と結合することにより細胞内へシグ
ナルを伝達することも明らかにされているが[De Vies,
C. et. al. Science,255:989(1992)]、ＶＰＦとその受
容体との相互作用機構やシグナル伝達機構については詳
細には解明されていない。
【０００７】ヒトＶＰＦ遺伝子についてはその cＤＮＡ
がすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列
も推定されている。この遺伝子は１つの遺伝子からアミ
ノ酸残基数の異なる４種類の蛋白（アミノ酸残基数が１
２１個、１６５個、１８９個、２０６個の４種類）が作
られ、それらの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの
（以下ＶＰＦ121 といい他のものも同様にする）とＶＰ
Ｆ165 が成熟蛋白であると言われている[(Ferrara,N.,
et.al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ＶＰＦ121
はＶＰＦ165 のカルボキシル末端の４４個のアミノ酸が
欠損したものであるが、ＶＰＦ121 とＶＰＦ165 の間
に、血管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうかに
ついては明らかにされてはいない。
がすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列
も推定されている。この遺伝子は１つの遺伝子からアミ
ノ酸残基数の異なる４種類の蛋白（アミノ酸残基数が１
２１個、１６５個、１８９個、２０６個の４種類）が作
られ、それらの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの
（以下ＶＰＦ121 といい他のものも同様にする）とＶＰ
Ｆ165 が成熟蛋白であると言われている[(Ferrara,N.,
et.al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ＶＰＦ121
はＶＰＦ165 のカルボキシル末端の４４個のアミノ酸が
欠損したものであるが、ＶＰＦ121 とＶＰＦ165 の間
に、血管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうかに
ついては明らかにされてはいない。
【０００８】血清中のＶＰＦ量の測定は、公知であるＶ
ＰＦに対するモノクローナル抗体等を用い、たとえばモ
ノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いたサンド
イッチ法などによる比色法、蛍光法、化学発光法などの
検出手段による酵素免疫測定法等により行うことができ
るが、高い陽性率を得るためには化学発光法による酵素
免疫測定法が適用され、それに用いられるＶＰＦに対す
る抗体も公知の方法で作製することができ、またＶＰＦ
の抗体を得たとの報告も少なくない(K. Jin Kim 他 NAT
URE VOL362 29 APRIL 1993 841-844) 。本発明者等も、
ヒトＶＰＦ121 に対するモノクローナル抗体を数種取得
し、また、それらのモノクローナル抗体およびヒトＶＰ
Ｆ121 に対するポリクローナル抗体を用い酵素免疫測定
法によりＶＰＦが測定できることを、本発明者等は明ら
かにしている（平成６年６月１０日付け特許出願；発明
の名称「ペプチド及びモノクローナル抗体」他）。
ＰＦに対するモノクローナル抗体等を用い、たとえばモ
ノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いたサンド
イッチ法などによる比色法、蛍光法、化学発光法などの
検出手段による酵素免疫測定法等により行うことができ
るが、高い陽性率を得るためには化学発光法による酵素
免疫測定法が適用され、それに用いられるＶＰＦに対す
る抗体も公知の方法で作製することができ、またＶＰＦ
の抗体を得たとの報告も少なくない(K. Jin Kim 他 NAT
URE VOL362 29 APRIL 1993 841-844) 。本発明者等も、
ヒトＶＰＦ121 に対するモノクローナル抗体を数種取得
し、また、それらのモノクローナル抗体およびヒトＶＰ
Ｆ121 に対するポリクローナル抗体を用い酵素免疫測定
法によりＶＰＦが測定できることを、本発明者等は明ら
かにしている（平成６年６月１０日付け特許出願；発明
の名称「ペプチド及びモノクローナル抗体」他）。
【０００９】
【作用】上記した様に、血管新生にかかわる因子は、癌
細胞の増殖において重要な役割を果たしていることが知
られており、さらにヒトＶＰＦに関しては、乳癌の血管
新生と転移や腎細胞癌の血管新生に関与していることが
知られているが、ＶＰＦは、マウス、ラット、モルモッ
ト、ウシおよびヒトの正常および腫瘍細胞株のいずれに
おいても分泌されているものであり、癌患者と健常人と
の間で血清中のＶＰＦの存在量に何故かくも特異的に差
異があるのか不明であるうえ、化学発光法による酵素免
疫測定法が何故ＶＰＦの測定に適しているのかも不明で
あるが、血清中のＶＰＦ量をＶＰＦに対する抗体を用
い、化学発光法による酵素免疫測定法により測定するこ
とにより行なわれる本発明の癌の診断方法は、非常に高
い陽性率で、癌の診断が出来るものであり、本方法によ
る癌の診断は臨床上非常に有用である。
細胞の増殖において重要な役割を果たしていることが知
られており、さらにヒトＶＰＦに関しては、乳癌の血管
新生と転移や腎細胞癌の血管新生に関与していることが
知られているが、ＶＰＦは、マウス、ラット、モルモッ
ト、ウシおよびヒトの正常および腫瘍細胞株のいずれに
おいても分泌されているものであり、癌患者と健常人と
の間で血清中のＶＰＦの存在量に何故かくも特異的に差
異があるのか不明であるうえ、化学発光法による酵素免
疫測定法が何故ＶＰＦの測定に適しているのかも不明で
あるが、血清中のＶＰＦ量をＶＰＦに対する抗体を用
い、化学発光法による酵素免疫測定法により測定するこ
とにより行なわれる本発明の癌の診断方法は、非常に高
い陽性率で、癌の診断が出来るものであり、本方法によ
る癌の診断は臨床上非常に有用である。
【００１０】
【実施例】以下実施例に基づいて更に詳細に説明する。 実施例１ （１）ＶＰＦモノクローナル抗体の作製 ＶＰＦモノクローナル抗体は、単離したヒトＶＰＦ cＤ
ＮＡをグルタチオン S-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)と
の融合蛋白(ＧＳＴ−ＶＰＦ)として大腸菌で産生させ、
得られた蛋白を抗原として常法に従ってマウスモノクロ
ーナル抗体を作製した。すなわちＧＳＴ−ＶＰＦ(１０
０μｇ)をフロイント完全アジュバントと等量混合し、
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に０日、１４日後、２５日
後の３回投与することにより免疫したマウスの脾細胞と
マウスミエローマ細胞(ＳＰ2)をポリエチレングリコー
ル(ＰＥＧ)存在下で、１分間インキュベーションするこ
とにより細胞融合させた。得られた細胞をＨＡＴ培地
〔組成：ヒポキサンチン(１×１０-4Ｍ)、アミノプテリ
ン(４×１０-7Ｍ)、チミジン(１.６×１０-5Ｍ)、ペニ
シリン(１００単位／ml)、牛胎児血清(２０％)、ストレ
プトマイシン(１００μｇ／ml)、2-メルカプトエタノー
ル(２×１０-5Ｍ)を含むＲＰＭＩ１６４０培地〕中で培
養することによりハイブリドーマを選別した。得られた
ハイブリドーマは限界希釈法によりクローニングした。
一方ＶＰＦを産生する酵母を、単離したＶＰＦ cＤＮＡ
を含む環状ＤＮＡを酢酸リチウム法で酵母Ｓaccharomyc
es cerevisiae に導入することにより作成し、この酵母
の培養液中から陽イオン交換クロマトグラフィー（東ソ
ー株式会社製ＴＳＫ−ＳＰ６５０）、硫安沈澱及びゲル
濾過クロマトグラフィー（ファルマシア社製Ｓuperdex-
７５）を用いて酵母由来のヒトＶＰＦ（以下ＹＶＰＦと
する）を調製した（特許出願；特願平０５−２００１８
１）。なお、上記ＶＰＦを産生する酵母は、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、寄託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１３７３０およびＦＥＲＭ Ｐ−１３
７３１が付与されている。このＹＶＰＦとクローン化し
たハイブリドーマの培養上清の反応性を酵素免疫測定法
により調べ、ＹＶＰＦと反応するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを選択した。得られたモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマは、通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、寄託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４３４５、ＦＥＲＭ Ｐ−１４３４６
およびＦＥＲＭ Ｐ−１４３４７が付与されている。
ＮＡをグルタチオン S-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)と
の融合蛋白(ＧＳＴ−ＶＰＦ)として大腸菌で産生させ、
得られた蛋白を抗原として常法に従ってマウスモノクロ
ーナル抗体を作製した。すなわちＧＳＴ−ＶＰＦ(１０
０μｇ)をフロイント完全アジュバントと等量混合し、
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に０日、１４日後、２５日
後の３回投与することにより免疫したマウスの脾細胞と
マウスミエローマ細胞(ＳＰ2)をポリエチレングリコー
ル(ＰＥＧ)存在下で、１分間インキュベーションするこ
とにより細胞融合させた。得られた細胞をＨＡＴ培地
〔組成：ヒポキサンチン(１×１０-4Ｍ)、アミノプテリ
ン(４×１０-7Ｍ)、チミジン(１.６×１０-5Ｍ)、ペニ
シリン(１００単位／ml)、牛胎児血清(２０％)、ストレ
プトマイシン(１００μｇ／ml)、2-メルカプトエタノー
ル(２×１０-5Ｍ)を含むＲＰＭＩ１６４０培地〕中で培
養することによりハイブリドーマを選別した。得られた
ハイブリドーマは限界希釈法によりクローニングした。
一方ＶＰＦを産生する酵母を、単離したＶＰＦ cＤＮＡ
を含む環状ＤＮＡを酢酸リチウム法で酵母Ｓaccharomyc
es cerevisiae に導入することにより作成し、この酵母
の培養液中から陽イオン交換クロマトグラフィー（東ソ
ー株式会社製ＴＳＫ−ＳＰ６５０）、硫安沈澱及びゲル
濾過クロマトグラフィー（ファルマシア社製Ｓuperdex-
７５）を用いて酵母由来のヒトＶＰＦ（以下ＹＶＰＦと
する）を調製した（特許出願；特願平０５−２００１８
１）。なお、上記ＶＰＦを産生する酵母は、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、寄託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１３７３０およびＦＥＲＭ Ｐ−１３
７３１が付与されている。このＹＶＰＦとクローン化し
たハイブリドーマの培養上清の反応性を酵素免疫測定法
により調べ、ＹＶＰＦと反応するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを選択した。得られたモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマは、通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、寄託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４３４５、ＦＥＲＭ Ｐ−１４３４６
およびＦＥＲＭ Ｐ−１４３４７が付与されている。
【００１１】（２）ＶＰＦモノクローナル抗体の調製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
得られた腹水をプロテインＧアフィニティーカラム(MAb
Trap GII、ファルマシア社製)で処理することにより精
製したモノクローナル抗体を取得し、その中の一つのモ
ノクローナル抗体を、ＭＶ303 と命名し、以下の実験に
使用した。該ＭＶ303 抗体のクラスを抗マウス免疫グロ
ブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定法に
より調べた結果、ＩgＧ2aであった。このモノクローナ
ル抗体ＭＶ303 は、ＶＰＦのアミノ酸配列の一部を示す
配列番号１および配列番号２で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドを認識するものであった。
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
得られた腹水をプロテインＧアフィニティーカラム(MAb
Trap GII、ファルマシア社製)で処理することにより精
製したモノクローナル抗体を取得し、その中の一つのモ
ノクローナル抗体を、ＭＶ303 と命名し、以下の実験に
使用した。該ＭＶ303 抗体のクラスを抗マウス免疫グロ
ブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定法に
より調べた結果、ＩgＧ2aであった。このモノクローナ
ル抗体ＭＶ303 は、ＶＰＦのアミノ酸配列の一部を示す
配列番号１および配列番号２で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドを認識するものであった。
【００１２】（３）抗ＶＰＦポリクローナル抗体の作製 ＧＳＴ−ＶＰＦを抗原として常法によりウサギを免疫し
た。抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィーで処理することによりウ
サギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体のＩgＧ画分を得た。
ＩgＧ画分の一部をペプシンで消化してＦ(ab')2を調製
し、マレイミド法によりペルオキシダーゼと結合させ、
ペルオキシダーゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリクローナ
ル抗体を得た。
た。抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィーで処理することによりウ
サギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体のＩgＧ画分を得た。
ＩgＧ画分の一部をペプシンで消化してＦ(ab')2を調製
し、マレイミド法によりペルオキシダーゼと結合させ、
ペルオキシダーゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリクローナ
ル抗体を得た。
【００１３】（４）酵素免疫測定法による大腸癌患者血
清中のＶＰＦ量の測定 １）比色法による測定 ウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体およびＭＶ303 抗体
を用いて血清中のＶＰＦ量を測定する方法を構築した。
すなわち、５μg/mlの抗ＶＰＦポリクローナル抗体を96
穴の酵素免疫測定用プレートに１００μlずつ入れ４℃
で一晩放置することにより抗ＶＰＦポリクローナル抗体
をプレートに吸着させた。０.１％ウシ血清アルブミン
を含むリン酸緩衝化生理的食塩水(以下ウシ血清アルブ
ミンをＢＳＡ、リン酸緩衝化生理的食塩水をＰＢＳ、ウ
シ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理的食塩水をＢ
ＳＡ／ＰＢＳといいＢＳＡの濃度を語頭に示す即ち０.
１％ＢＳＡ／ＰＢＳとする)でプレートの穴を６回洗浄
した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを穴一杯に入れ室温で１時
間放置した。穴から１％ＢＳＡ／ＰＢＳを除いた後、Ｐ
ＢＳで２倍に希釈した血清を入れ室温で１時間放置し
た。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで６回洗浄後５μg/mlのＭ
Ｖ303 抗体（０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を１００μl
ずつ入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ溶液で６回洗浄後ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マ
ウス免疫グロブリン（０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を
入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで
６回洗浄後０.２mg/mlオルトフェニレンジアミンおよび
０.０１５％過酸化水素を含む０.１５Ｍクエン酸緩衝液
(pH=５.0)を入れて発色させた。反応は１０％硫酸を加
えて停止させた後、吸光度(ＯＤ490/650)を測定した。
また、同様に健常人血清中のＶＰＦ量も測定し、大腸癌
患者の結果と比較した。以上の結果をグラフにプロット
し図１に示したところ、健常人と大腸癌患者との間に明
白に有意差がみられた。さらに測定結果をステージ別に
解析して図２に示したが、その図から明らかな様にステ
ージに関係なくＶＰＦ量の高い患者がみられた。このこ
とから血清中ＶＰＦ量を測定することによりあらゆるス
テージの大腸癌患者を診断できることが明らかになっ
た。健常人測定値の平均値＋標準偏差の２倍の値をカッ
トオフ値として診断の陽性率を求め表１および表２に示
した。それらの表から明らかな様に、比色法による陽性
率は、６８％であり、ステージ別癌患者検体の陽性率は
５９％〜１００％であった。
清中のＶＰＦ量の測定 １）比色法による測定 ウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体およびＭＶ303 抗体
を用いて血清中のＶＰＦ量を測定する方法を構築した。
すなわち、５μg/mlの抗ＶＰＦポリクローナル抗体を96
穴の酵素免疫測定用プレートに１００μlずつ入れ４℃
で一晩放置することにより抗ＶＰＦポリクローナル抗体
をプレートに吸着させた。０.１％ウシ血清アルブミン
を含むリン酸緩衝化生理的食塩水(以下ウシ血清アルブ
ミンをＢＳＡ、リン酸緩衝化生理的食塩水をＰＢＳ、ウ
シ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理的食塩水をＢ
ＳＡ／ＰＢＳといいＢＳＡの濃度を語頭に示す即ち０.
１％ＢＳＡ／ＰＢＳとする)でプレートの穴を６回洗浄
した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを穴一杯に入れ室温で１時
間放置した。穴から１％ＢＳＡ／ＰＢＳを除いた後、Ｐ
ＢＳで２倍に希釈した血清を入れ室温で１時間放置し
た。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで６回洗浄後５μg/mlのＭ
Ｖ303 抗体（０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を１００μl
ずつ入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ溶液で６回洗浄後ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マ
ウス免疫グロブリン（０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を
入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで
６回洗浄後０.２mg/mlオルトフェニレンジアミンおよび
０.０１５％過酸化水素を含む０.１５Ｍクエン酸緩衝液
(pH=５.0)を入れて発色させた。反応は１０％硫酸を加
えて停止させた後、吸光度(ＯＤ490/650)を測定した。
また、同様に健常人血清中のＶＰＦ量も測定し、大腸癌
患者の結果と比較した。以上の結果をグラフにプロット
し図１に示したところ、健常人と大腸癌患者との間に明
白に有意差がみられた。さらに測定結果をステージ別に
解析して図２に示したが、その図から明らかな様にステ
ージに関係なくＶＰＦ量の高い患者がみられた。このこ
とから血清中ＶＰＦ量を測定することによりあらゆるス
テージの大腸癌患者を診断できることが明らかになっ
た。健常人測定値の平均値＋標準偏差の２倍の値をカッ
トオフ値として診断の陽性率を求め表１および表２に示
した。それらの表から明らかな様に、比色法による陽性
率は、６８％であり、ステージ別癌患者検体の陽性率は
５９％〜１００％であった。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【表２】
【００１６】２）発光法による測定 ＶＰＦポリクローナル抗体（５μg/ml）を１００μl/we
llずつ９６穴プレートにまき４℃で一晩放置した後、
０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄した。１％ＢＳＡ／
ＰＢＳでブロッキング（室温で１時間）した後、大腸癌
患者および健常者血清（ＰＢＳで２倍希釈したもの）を
加え室温で１時間反応させた。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ
で４回洗浄後、ＭＶ303抗体（５μg/mlの０.１％ＢＳＡ
／ＰＢＳ溶液）を１００μl/wellずつ入れ室温で１時間
反応させた。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄後、ア
ルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩgＧ（０.１％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳで１０００倍希釈したもの）を１００μl/
wellずつ入れ室温で１時間反応させた。０.１％ＢＳＡ
／ＰＢＳで４回洗浄した後、０.１５mg/ml AMPPD (4-Me
thoxy-4-(3-phosphatephenyl)spiro[1,2-dioxetane-3,
2'-adamantane],disodium salt)の５０mM炭酸緩衝液(pH
=９.5)を１００μl/wellずつ入れ、室温で２０分間放置
後、発光強度を測定した。以上の方法で測定した結果を
グラフにプロットし図３に示し、比色法の場合と同様
に、測定結果をステージ別に解析して図４に示したが、
図から明らかな様にステージに関係なく極めてＶＰＦ量
の高い患者がみられた。大腸癌患者血清検体のＶＰＦ測
定値は健常人血清検体に比べて有意に高い測定結果とな
った。 このことから血清中ＶＰＦ量を発光法で測定す
ることによりあらゆるステージの大腸癌患者を診断でき
ることが明らかになった。健常人測定値の平均値＋標準
偏差の２倍の値をカットオフ値として、比色法の場合と
同じく、診断の陽性率を求め表１および表２に示した。
それらの表から明らかな様に、本発明方法による陽性率
は、比色法の６８％に比して９５％という高い値を示
し、ステージ別癌患者検体の陽性率は８２％〜１００％
であり、比色法よりも発光法の方が高率に大腸癌を診断
できることがわかった。
llずつ９６穴プレートにまき４℃で一晩放置した後、
０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄した。１％ＢＳＡ／
ＰＢＳでブロッキング（室温で１時間）した後、大腸癌
患者および健常者血清（ＰＢＳで２倍希釈したもの）を
加え室温で１時間反応させた。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ
で４回洗浄後、ＭＶ303抗体（５μg/mlの０.１％ＢＳＡ
／ＰＢＳ溶液）を１００μl/wellずつ入れ室温で１時間
反応させた。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄後、ア
ルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩgＧ（０.１％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳで１０００倍希釈したもの）を１００μl/
wellずつ入れ室温で１時間反応させた。０.１％ＢＳＡ
／ＰＢＳで４回洗浄した後、０.１５mg/ml AMPPD (4-Me
thoxy-4-(3-phosphatephenyl)spiro[1,2-dioxetane-3,
2'-adamantane],disodium salt)の５０mM炭酸緩衝液(pH
=９.5)を１００μl/wellずつ入れ、室温で２０分間放置
後、発光強度を測定した。以上の方法で測定した結果を
グラフにプロットし図３に示し、比色法の場合と同様
に、測定結果をステージ別に解析して図４に示したが、
図から明らかな様にステージに関係なく極めてＶＰＦ量
の高い患者がみられた。大腸癌患者血清検体のＶＰＦ測
定値は健常人血清検体に比べて有意に高い測定結果とな
った。 このことから血清中ＶＰＦ量を発光法で測定す
ることによりあらゆるステージの大腸癌患者を診断でき
ることが明らかになった。健常人測定値の平均値＋標準
偏差の２倍の値をカットオフ値として、比色法の場合と
同じく、診断の陽性率を求め表１および表２に示した。
それらの表から明らかな様に、本発明方法による陽性率
は、比色法の６８％に比して９５％という高い値を示
し、ステージ別癌患者検体の陽性率は８２％〜１００％
であり、比色法よりも発光法の方が高率に大腸癌を診断
できることがわかった。
【００１７】実施例２ 実施例１と同様にして、子宮頸癌患者および卵巣癌患者
の血清中のＶＰＦ量を測定し以下の表３に示したが、そ
れらから明らかな様に、いずれの患者においても、発光
法は比色法よりも遙かに高い陽性率を示した。なお、健
常人の中に２人、異常に高いＶＰＦ量を示したものがい
たが、その数値から考えて、何らかの他の原因があると
推定されるので検体からは除外した。
の血清中のＶＰＦ量を測定し以下の表３に示したが、そ
れらから明らかな様に、いずれの患者においても、発光
法は比色法よりも遙かに高い陽性率を示した。なお、健
常人の中に２人、異常に高いＶＰＦ量を示したものがい
たが、その数値から考えて、何らかの他の原因があると
推定されるので検体からは除外した。
【００１８】
【表３】
【００１９】
【発明の効果】ヒトＶＰＦ121 に対するモノクローナル
抗体およびヒトＶＰＦ121 に対するポリクローナル抗体
を用い発光法による酵素免疫測定法を用いて血清中ＶＰ
Ｆ量を測定することによりステージに関係なく、従来の
腫瘍マーカーを用いた場合よりも非常な高い陽性率で癌
患者を診断できるという優れた効果が奏され、血清中の
ＶＰＦ量に基づく診断という本発明は、癌の早期発見、
癌の病態の進行や治療効果の判定、再発の予測などに巾
広く利用できるという優れたものである。
抗体およびヒトＶＰＦ121 に対するポリクローナル抗体
を用い発光法による酵素免疫測定法を用いて血清中ＶＰ
Ｆ量を測定することによりステージに関係なく、従来の
腫瘍マーカーを用いた場合よりも非常な高い陽性率で癌
患者を診断できるという優れた効果が奏され、血清中の
ＶＰＦ量に基づく診断という本発明は、癌の早期発見、
癌の病態の進行や治療効果の判定、再発の予測などに巾
広く利用できるという優れたものである。
【００２０】
配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列番号：２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：
【図１】酵素免疫測定法（発色法）により大腸癌患者お
よび健常人の血清中VPF量を測定した結果を示す図であ
る。
よび健常人の血清中VPF量を測定した結果を示す図であ
る。
【図２】図１の結果をステージ別大腸癌患者毎に解析し
た図である。
た図である。
【図３】酵素免疫測定法（発光法）により大腸癌患者お
よび健常人血清中VPF量を測定した結果を示す図であ
る。
よび健常人血清中VPF量を測定した結果を示す図であ
る。
【図４】図３の結果をステージ別大腸癌患者毎に解析し
た図である。
た図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 血清中の血管透過性因子の存在量を、血
管透過性因子に対する抗体を用い、化学発光法による酵
素免疫測定法により測定し、当該測定値に基づいて診断
することを特徴とする癌の診断方法。 - 【請求項２】 血管透過性因子がヒト血管透過性因子で
あることを特徴とする請求項１記載の癌の診断方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20150194A JPH0843398A (ja) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | 癌の診断方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20150194A JPH0843398A (ja) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | 癌の診断方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0843398A true JPH0843398A (ja) | 1996-02-16 |
Family
ID=16442105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20150194A Pending JPH0843398A (ja) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | 癌の診断方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0843398A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998005960A1 (fr) * | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Toagosei Co. Ltd. | Methode et reactifs pour detecter le cancer du colon |
-
1994
- 1994-08-03 JP JP20150194A patent/JPH0843398A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998005960A1 (fr) * | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Toagosei Co. Ltd. | Methode et reactifs pour detecter le cancer du colon |
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