KR100375564B1 - N-펩티드의샌드위치면역학적측정법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 N-펩티드의 상이한 부분을 인식하는 두종류의 모노클로날 항체를 이용하여 N-펩티드를 신속하고 간편하게 측정하는 샌드위치 면역학적 측정법에 관한 것이다.
N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법은 시료 및 N-펩티드의 일부를 인식하는 제1모노클로날항체를 함유하는 혼합물을 인큐베이션하고; 혼합물에 N-펩티드의 일부를 인식하는 표지화된 제2모노클로날 항체를 가한다음, 추가로 인큐베이션하고; 그리고 얻어지는 항원-항체 복합체를 혼합물에서 검출하는 단계를 포함한다.
다르게는, 본 발명의 방법은 시료와 N-펩티드의 일부를 인식하는 제1모노클로날 항체 및 N-펩티드의 또 다른 부분을 인식하는 표지화된 제2모노클로날항체를 함유하는 혼합물을 인큐베이션하고; 그리고 얻어지는 항원-항체복합체를 혼합물에서 검출하는 단계를 포함한다.

Description

N-펩티드의 샌드위치 면역학적 측정법
본 발명은 심부전 및 만성신부전의 진단에 임상적으로 유용한 N-펩티드를 신속하고 간편하게 측정하는 방법과, 이 방법에 사용되는 모노클로날항체 및 이 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.
인간 심방성 나트륨 이뇨펩티드(hANP)는, hANP(126)( γ - hANP)로 지칭되는 126개의 아미노산을 포함하는 펩티드로서 생합성된다. 이 γ - hANP는 심방내 과립에 축적되며, 심방압력자극에 반응하여 분비된다. 이때, γ- hANP는 hANP(1-98)(N-펩티드)와 hANP(99-126)(α - hANP)로 쪼개짐과 동시에 혈액속으로 방출된다.
α - hANP의 혈중농도는 심부전증 및 만성 신부전증의 마커로서 심장상태를 반영하고, 따라서 이것의 면역학적 측정법(immunoassay)이 진단목적으로 널리 이용되고 있다. 그러나, 면역학적 측정은 몇가지 단점이 있다. 예를 들면, 측정에 소요되는 반응시간이 매우 길고(3일), 혈액중에서의 α - hANP의 불안정성으로 인해(참조, T. Tsuji et al., Clin. Chim. Acta225, 171-117(1994)) 시료의 채취 및 보존과정에서 α - hANP의 면역학적 활성이 현저하게 저하된다. 이와 대조적으로, N-펩티드는 α - hANP보다 더 안정하고 제거율이 더 낮으며, 순환 혈액중의 이것의 농도는 높다. 따라서, N-펩티드의 면역학적 측정법이 개발되었다.
상기한 γ - hANP의 N-말단 펩티드인 N-펩티드의 면역학적 측정이 심부전증및 만성 신부전증의 진단에 유용하다는 것은 이전부터 보고되었다(참조, J. A. Sundsfjoed et al., J. Clin. Endocrionol. Metab.,66, 605-610(1988); H. Itoh et al., J. Clin. Endocrinol.,67(3), 429-437(1988); M.G. Burckley et al., Clin. Sci.77, 573-579(1989); 및 M. G, Burckley et al., Clin. Chim. Acta,191, 1-14(1990)).
현재까지 보고된 N-펩티드의 면역학적 측정법들은 모두 한 종류의 항체를 사용하는 경합방사면역학적 측정법(경합 RIA)에 의존한다. 그 결과, 이 방법을 실시하기 위해서는 긴 시간(3 내지 4일)과, 제한된 온도조건(약 4℃), 및/또는 혈장을 전처리해야하는 복잡한 조작(즉, Sepak C-18 추출)이 필요하다(참조, J. A. Sundsfjoed등, 전게서; 및 M. G. Burckley등, (1990)전게서).
또한, 이들 면역학적 측정법들은 어느 것이나 정밀도가 낮고 재현성이 나쁘다는 등의 문제점이 있다. 따라서, N-펩티드를 신속하고 간편하게 측정할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있었다.
본 발명에 따른 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법은 시료 및 N-펩티드를 인식하는 제1 모노클로날항체의 혼합물을 인큐베이션하고; 상기 혼합물에 N-펩티드를 인식하는 표지화된 제2 모노클로날항체를 가한 다음, 추가로 인큐베이션하고; 그리고 얻어지는 항원-항체 복합체를 혼합물에서 검출하는 단계를 포함한다.
다르게는, 본 발명에 따른 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법은 시료, N-펩티드를 인식하는 제1 모노클로날항체 및 N-펩티드를 인식하는 표지화된 제2 모노클로날항체의 혼합물을 인큐베이션하고; 그리고 얻어지는 항원-항체 복합체를 혼합물에서 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 제1 또는 제2 모노클로날항체는 N-펩티드의 43위치에서부터 66위치까지의 아미노산 서열부분을 인식한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 제1 또는 제2 모노클로날항체는 7B6이다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 제1 및 제2 모노클로날항체 중의 하나는 7B6이고, 다른 하나는 N-펩티드의 아미노산 서열의 일부를 인식하며 인식부위가 7B6의 인식부위와는 다른 모노클로날항체이다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 제1 및 제2 모노클로날항체 중의 하나는 N-펩티드의 43위치에서부터 66위치까지의 아미노산 부분을 인식하고, 다른 하나는 N-펩티드의 1위치에서부터 25위치까지의 아미노산 서열부분을 인식한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 다른 하나의 모노클로날항체는 KY-ANP-III이다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 제1 모노클로날항체는 N-펩티드의 1위치에서부터 25위치까지의 아미노산서열부분을 인식하고, 제2 모노클로날항체는 N-펩티드의 43위치에서부터 66위치까지의 아미노산서열부분을 인식한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 제1 모노클로날항체는 KY-ANP-III이고, 제2 모노클로날항체는 7B6이다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 제2 모노클로날항체는 방사성 동위원소, 효소, 콜로이드금, 형광물질, 또는 발광물질로 표지화된다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 제2모노클로날항체는 방사성 동위원소 또는 효소로 표지화된다.
본 발명의 또 다른 면에 따르면, N-펩티드의 43위치에서부터 66위치까지의 아미노산 서열부분을 인식하는 모노클로날항체가 제공된다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 모노클로날항체는 7B6이다.
본 발명의 또 다른 면에 따르면, 상기 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마가 제공된다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 하이브리도마는 마우스 하이브리도마 7B6(FERM BP-4878)이다.
본 발명의 또 다른 면에 따르면, 상기 모노클로날항체를 포함하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체의 면역학적 측정 키드가 제공된다.
따라서, 여기에 기술한 본 발명은 (1) 심부전, 신부전 및 다른 순환질환의 진단에 아주 유용한, N-펩티드 또는 그것의 유사체의 샌드위치 면역학적 측정법을 제공하고; (2) 이 방법에 사용되는 모노클로날항체를 제공하고; (3) 이 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마를 제공하고; 그리고 (4) 이 모노클로날항체를 함유하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체의 면역학적 측정 키트를 제공하는 이점이 있다.
첨부도면을 참조하여 하기의 상세한 설명을 읽고 이해하면 본 발명의 상기 이점 및 다른 이점들은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 자명하다.
본 발명자들은 N-펩티드 및 그것의 전구체를 신속하고, 용이하고, 그리고 정밀하게 측정할 목적으로 수많은 연구를 수행하였다. 그 결과, N-펩티드를 인식하는 모노클로날항체를 생산하였고, 각각 N-펩티드의 상이한 에피토프를 인식하는 두 모노클로날항체를 조합하여 샌드위치 면역측정장치를 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 출원에서 사용하는 "N-펩티드"라는 용어는 γ - hANP의 N-말단 부위상의 1위치에서부터 98위치까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 지칭한다. γ - hANP는 생체내에서 분비될 때 N-펩티드와 α - hANP로 쪼개지며, α - hANP는 γ -hANP의 99위치에서부터 126위치까지의 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 "N-펩티드 전구체"라는 용어는 γ - hANP를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는, "N-펩티드(X-Y)"라는 용어는 N-펩티드의 X위치에서부터 Y위치까지의 아미노산 서열을 언급한다. 예를 들면, "N-펩티드(1-25)"는 N-펩티드의 1위치에서부터 25위치까지의 아미노산 서열을 지칭한다. "N-펩티드(43-66)"은 N-펩티드의 43위치에서부터 66위치자지의 아미노산 서열을 지칭하고, 그리고 "N-펩티드(43-67)"은 N-펩티드의 43위치에서부터 67위치까지의 아미노산 서열을 지칭한다. "N-펩티드(43-66)Cys"라는 용어는 N-펩티드(43-66)의 카르복실말단에 시스테인 잔기를 추가로 가진 아미노산 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된, "N-펩티드" 및 "N-펩티드 전구체"라는 용어는 각각 자연적으로 생기거나 또는 화학 합성된 N-펩티드 및 N-펩티드 전구체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "항체"라는 용어는 항체 및, 항체의 Fab, Fab', 및 F(ab)2와 같은 단편들을 포함하는, 항체의 단편들을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된, "KY-ANP-III 항체"란 나까오등에 의해 생산되었으며(일본 특허 공개번호 2-16997) γ - hANP의 1위치에서부터 25위치까지의 아미노산 서열인 N-펩티드(1-25)부분을 인식하는 모노클로날 항체를 지칭한다. 이 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마가 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 일본국, 이바라키-켄, 쯔쿠바시, 히가시 1-쵸메, 1-3 소재의 통상산업성 공업기술원 미생물공업기술연구소에 기탁되었다. 기탁은 1988년 5월 18일에 행해졌고 FERM BP-1887의기탁번호가 부여되었다.
기탁 미생물은 기탁시에 생존해 있었으며 만약 죽게될 경우에는 본 출원인에 의해 교체될 것이다.
이하, 본 발명의 방법을 단계별로 기술한다. N-펩티드를 인식하는 모노클로날항체의 생산 및 이 모노클로날항체를 사용하는 샌드위치 면역학적 측정법은 달리 언급이 없는 한, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적인 방법으로 실시할 수 있다.
(1) 면역접종
N-펩티드를 인식하는 모노클로날항체를 생산하기 위해, 동물을 적당한 항원을 사용하여 면역접종한다. 동물로는 마우스, 래트 따위를 사용할 수 있다. 항원으로는 N-펩티드의 일부인 아미노산 단편을 사용할 수 있다. 이 항원을 면역접종에 적당한 면역원으로 만든다. 이 항원을 면역원으로 사용하기 위해, 예를 들면, N-펩티드(43-66)Cys를 담체 단백질과 컨쥬게이션시킬 수 있다. 담체 단백질로는, 소 혈청 알부민(BSA), 헤모시아닌 및 소 티오글로불린(BTG)과 같은 고분자량 재료를 사용'할 수 있다. 컨쥬게이션에는 말레이미드 화합물 따위를 사용할 수 있다. 말레이미드 화합물은 2관능기 가교제(bifunctional crosslinker)로서, 이에는 숙신 이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS), 숙신이미딜 4-(P-말레이미도페닐)부티레이트(SMPB), 및 술포-MBS, 술포-SMCC등이 포함된다. 이 가교제들의 숙신이미딜기가 제1 아민과 반응하고 티올-반응성 말레이미드와 추가로반응하여 시스테인 잔기의 티올과 공유결합을 형성한다. 이렇게 하여 얻어진 면역원을 프로인트 완전 아주반트와 같은 적당한 아주반트에 유화하고 얻어지는 에멀젼을 동물에게 복강내 투여하여 면역접종을 실시한다. 바람직하게는, 수주 간격으로 수회에 걸쳐 동물을 면역원으로 복강, 피하, 또는 정맥을 통해 부스팅한다.
(2) 모노클로날항체의 생산
비장세포를 골수종세포와 융합함으로써 N-펩티드를 인식하는 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마를 생산할 수 있다. 비장세포는, 상기 항목(1)에서 면역 접종한 동물, 바람직하게는 마우스로부터 유래한다. 골수종 세포는 포유동물, 바람직하게는 마우스 골수종 세포로부터 유래한다. 세포 융합에 폴리에틸렌 글리콜등을 사용할 수 있다. 융합에 의해 얻어진 하이브리도마를 스크리닝하고 클로닝함으로써 원하는 하이브리도마를 얻을 수 있다.
모노클로날항체를 생산하기 위해, 상기 하이브리도마를 시험관내 또는 생체내에서 배양한다. 바람직하게는, 생체내에서 배양한다. 예를 들면, 하이브리도마를 마부스에 복강내 투여하여 모노클로날항체를 함유하는 복수를 생산한다. 모노클로날항체는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 복수로부터 용이하게 입수하여 정제할 수 있다.
본 발명의 모노클로날항체는 본 발명의 샌드위치 면역학적 측정법 및 경합적 면역학적 측정법과 같은 다른 면역학적 측정법 및 두가지 항체를 사용하는 또 다른 유형의 면역학적 측정법에 사용할 수 있다.
(3) 면역학적 측정법(immunoassay)
본 발명의 면역학적 측정법은 항체(제1 모노클로날항체)를 고상에 고정하고 고정된 제1 모노클로날항체를 항원을 함유하는 시료와 인큐베이션하고; 제1항체와 는 상이한 표지화된 제2 모노클로날항체를 가한 다음 얻어지는 혼합물을 인큐베이션하고; 그리고 생성된 표지화된 항원-항체 복합체를 혼합물중에서 검출하는 단계들을 포함하는 샌드위치 면역학적 측정법을 기초로 한다. 본 발명의 면역학적 측정법에서, 시료와 제1 모노클로날항체 및 표지화된 제2 모노클로날항체는 동시에 인큐베이션할 수도 있다.
검출방법의 면에서, 본 발명의 샌드위치 면역학적 측정법은 샌드위치 방사성 면역학적 측정법(RIA), 샌드위치 효소면역학적 측정법(EIA), 샌드위치 플루오르면역학적 측정법(FIA), 샌드위치 화학발광 면역학적 측정법(CLIA), 샌드위치 화학발광-효소 면역학적 측정법(CLEIA) 및 샌드위치 측정법을 기초로한 면역-크로마토그래피법을 포함한다. 바람직하게는 RIA및 EIA를 사용할 수 있다.
본 발명의 제1 모노클로날항체는 마이크로타이터 플레이트, 비드, 튜브, 멤브레인, 여과지, 또는 플라스틱컵과 같은 고상에 고정화할 수 있다. 특히, 바람직하게는 폴리스티렌 비드가 사용된다.
측정할 시료는 N-펩티드 및 이것의 전구체를 함유하는 시료일 수 있고, 여기에는 혈장, 혈청, 혈액, 오줌등이 포함된다.
본 발명의 제2 모노클로날항체는 방사성 동위원소, 효소, 형광물질, 또는 발광물질로 표지화할 수 있다. 표지화는 당해 기술분야에 알려진 어느 방법에 의해서든 가능하다. 표지화에 사용되는 방사성 동위원소의 예로는14C,3H,32P,125I 및131I가 있다. 특히, 바람직한 구체예에서는125I를 사용할 수 있다. 이 방사성 동위원소들은 클로르아민 T법, 퍼옥시다제법, 요오드겐법(Iodogen method), 또는 볼튼-헌터(Bolton-Hunter)법에 의해 모노클로날항체에 결합시킬수 있다.
표지화에 사용할 수 있는 효소의 예에는 β -갈라토시다제(β GAL), 알칼리 포스파타제(ALP), 및 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 포함된다. 이 효소들은 나까네법(Nakane method), 또는 이시카와법(PP. 75-127, in "Enzyme Immunoassay", by E. Ishikawa, et al., 3rd ed. 1987, Igakushoin)에 의해 모노클로날항체에 결합시킬 수 있다.
표지화에 사용할 수 있는 형광물질의 예에는 플루오레세인(fluorescein), 플루오레스카민(fluorescamine), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 및 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(tetramethylrhodamine isothiocyanate)가 포함된다.
표지화에 사용할 수 있는 발광물질의 예에는 루시페린, 루미놀유도체, 및 아크리디늄 에스테르가 포함된다.
표지화에 금콜로이드(colloidal gold)를 사용할 수 있다.
바람직한 구체예에서는, N-펩티드 샌드위치 RIA를 실시할 수 있다. 상세하게는 N-펩티드 샌드위치 RIA는 다음과 같이 수행한다. 제1 모노클로날항체가 고정화된 비드를 표준 N-펩티드 용액 또는 시료에 가하고, 얻어지는 혼합물을 4℃ 내지45℃의 온도에서, 바람직하게는 25℃ 내지 37℃에서 1-4시간, 바람직하게는 2시간 동안 인큐베이션한다. 이렇게 하여 제1 반응이 수행된다. 비드를 세정한 다음,125I와 같은 방사성동위원소로 표지화된 제2 모노클로날항체를 함유하는 용액을 비드에가한다. 얻어지는 혼합물을 4℃ 내지 45℃의 온도에서, 바람직하게는 25℃ 내지 37℃에서 1-4시간동안, 바람직하게는 2시간동안 인큐베이션한다. 이렇게 하여 제2반응이 수행된다. 비드를 세정한 다음, 비드상에 결합된 항원-항체 복합체의 방사능을 감마선 계측기로 검출하여 N-펩티드의 양을 결정한다.
N-펩티드는 α -hANP에 비해 더 안정하고 시료 수집과정중에 일어나는 면역학적 활성의 감소가 적어서, N-펩티드는 다음과 같은 비-RIA(non-RIA)에도 적용할 수 있다고 생각된다.
또 다른 바람직한 구체예에서는, N-펩티드 샌드위치 EIA를 실시할 수 있다. 상세하게는, N-펩티드 샌드위치 EIA는 다음과 같이 수행된다. 제1 모노클로날항체가 고정화된 비트를 표준 N-펩티드용액 또는 시료에 가하고, 얻어지는 혼합물을 4℃ 내지 45℃의 온도에서, 바람직하게는 25℃ 내지 37℃에서, 2시간동안 인큐베이션한다. 이렇게 하여 제1 반응이 수행된다. 비드를 세정한 다음, HRP와 같은 효소로 표지화된 제2 모노크로날항체를 함유하는 용액을 비드에 가한다. 얻어지는 혼합물을 4℃ 내지 45℃의 온도에서, 바람직하게는 25℃ 내지 37℃에서, 2시간동안 인큐베이션한다. 이렇게 하여, 제2 반응이 수행되어 비드상에 항체/N-펩티드/항체 복합체가 형성된다. 비드상에 보류된 효소활성은 특정 기질을 통해 비색정량되고, 그로부터 비드상에 포착된 N-펩티드의 양이 결정될 수 있다. 비색정량은 종래의 분광 광도계 따위로 할 수 있다.
상기한 바와같이, 본 발명의 면역학적 측정법은 상이한 에피토프를 인식하는 두 종류의 항체를 생산하는 샌드위치 면역학적 측정법이다. 따라서, 한 종류의 항체를 사용하는 종래의 경합적 측정방법과 비교할 때, 본 발명의 샌드위치 면역학적 측정법은 감도가 높고, 정밀도가 뛰어나고, 편리하고 신속하다.
실시예
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 상세하게 설명한다.
실시예 1: N-펩티드(43-66)Cys 부분을 인식하는 모노클로날항체의 생산 및 이 항체를 생산하는 하이브리도마의 제작
A. 면역원의 제조 및 면역접종
샌드위치 면역학적 측정법에 의해 N-펩티드를 측정할 목적으로, N-펩티드의 일부를 인식하며 공지 모노클로날항체 KY-ANP-III의 인식부위와는 인식부위가 상이한 모노클로날항체를 하기와 같이 생산하였다. N-펩티드(43-66)Cys를 항원으로 사용하였다.
먼저, 담체 단백질인 소 티오클로불린(BTG, Sigma사) 33.5mg을 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.0)(버퍼 A)5ml에 용해하였다, 그후, 술폭숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC, Pierce사) 10.5mg을 함유하는 버퍼 A 1.2ml를 가하였다. 얻어지는 혼합물을 30℃에서 1시간동안 반응하도록 방치하여, BTG의 말레이미드 유도체를 얻었다. 반응 혼합물을 0.1M 포스페이트 버퍼(pH6.0)(버퍼 B)로 평형화한 Sephadex G-25 컬럼(Pharmacid)에 로딩하고, 말레이미드-연결 BTG를 함유하는 보이드(void)분획을 수집하였다. 그후, N-펩티드(43-66)Cys(Peptide Institute, Inc.) 3.3mg과 2.5mM의 EDTA를 함유하는 버퍼 B 0.4ml를 BTG의 말레이미드 유도체 6mg을 함유하는 버퍼 B 2.6ml에 첨가하고, 이 혼합물을 4℃에서 20시간 반응하도록 두었다. 그후, 50mM N-에틸말레이미드 40㎕를 가하여 반응을 정지시켰다. 이렇게 하여 얻은 반응 혼합물을 버퍼 B로 평형화한 Sephadex G-50컬럼(Pharmacia)에 로딩하고, 변하지 않고 남아있는 펩티드를 제거하기 위해 보이드 분획을 수집하였다. 수집한 분획들은 4℃에서 하룻밤 물에 대해 투석하고 동결건조하였다. 그 결과, N-펩티드(43-66)Cys-BTG 컨쥬게이트 10.9mg(건조중량)을 얻어서 다음과 같이 면역원으로 사용하였다.
BALB/c 마우스당 상기 컨쥬게이트 100㎍을 복강내 투여함으로써 면역접종을 실시하였다. 3 또는 4주 간격으로 3회에 걸쳐 부스팅을 수행하였다. 제1 및 제2회의 면역접종에서는, 컨쥬게이트를 프로인트 완전 아주반트와 함께 투여하였다,
B.7B6 항체를 생산하는 하이브리도마의 생산 및 이 하이브리도마를 사용한 7B6 항체의 생산
최종 면역접종후 3일째 되는 날에 상기 항목 A에서 면역접종한 마우스로부터 얻은 비장세포(1.1× 108)를 50% 폴리에틸렌 글리콜 4000(Merck)를 사용하여 마우스 육종세포(P3-U1-X63-Ag8, Tokyo Shuryu Research Institute, 2.1× 107)와 융합시켰다. 융합에 의해 얻은 하이브리도마를 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 함유하는 선택배지를 사용하여 얻었다. 세포융합후 10일째 되는 날에, 특정항원을 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하였다. 스크리닝에 사용된 EIA는 다음과 같이 수행하였다. N-펩티드(43-67)(Peptide Institute, Inc,) 또는 N-펩티드(1-25)(Peptide Institute, Inc.) 1㎍을 함유하는 PBS(0.15M NaCl을 함유하는 포스페이트 버퍼(pH 7.4)) 50㎍을 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc)의 각 웰에 가하고 각 웰을 4℃에 하룻밤 둠으로써 웰상에 펩티드가 결합하도록 하였다. 그런 다음, 웰들은 25% Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.,Ltd.)를 함유하는 용액으로 한번 세정한 다음, 이 용액 300㎕를 각 웰에 가하여 블록킹을 수행하였다. 그런 다음, 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 웰을 3번 세정하고, 하이브리도마의 배양 상청액 50㎕을 각 웰에 가하고, 이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 반응하도록 하였다. 그런다음, 이 웰들을 3회 세정하고, HRP-표지된 항마우스 IgG 5㎍을 함유하는 25% Block Ace 용액 50㎕를 웰에 가하고, 이렇게 얻어진 혼합물을 실온에서 1시간 동안 반응하도록 하였다. 이 웰들을 3회 세정하고, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술포산)(ABTS, Boehringer-Mannheim) 4mM 및 H2O22mM을 함유하는 용액 50㎕을 웰들에 가하고, 웰중에서 HRP의 반응을 실온에서 15분 동안 수행하였다. 그런 다음, 0.002% NaN3용액 50㎕를 가하여 반응을 정지시켰다. 각 웰의 흡광도를 플레이트 리더(MTP-32, Corona)에 의해 415nm에서 측정하였다.
모노클로날항체의 양성생산의 나타낸 월중의 하이브리도마를 한계 희석법에 의해 3회 클로닝하여, N-펩티드(43-66)를 인식하는 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마를 얻었다,
하이브리도마에 의해 생산된 서브-글라스의 항체를 하이브리도마의 배양 상청액을 사용하여 결정하였다. 마우스 모노글로날항체 이소타이핑(isotyping)키트(Amersham Corp.)를 이 결정에 사용하였다. 새로이 얻은 모노클로날항체를 7B6으로 명명하였으며, 이것은 이소타입 IgG1(x)에 속한다.
공지의 모노클로날항체 KY-ANP-III(IgG1x) 및 새로운 모노클로날항체 7B6와 다양한 종류의 N-펩티드 단편들과의 반응성을 상기한 EIA법으로 확인하였다. KY-ANP-III로서, 하이브리도마 FERM BP-1887에 의해 생산된 모노클로날 항체를 사용 하였다. 그 결과를 제1도에 나타내었다. 이 그림에서, ○은 N-펩티드(1-25)와의 반응성을 나타내고 ●은 N-펩티드(43-67)과의 반응성을 나타낸다. KY-ANP-III항체는 N-펩티드(1-25)와 반응하였지만, N-펩티드(43-67)과는 반응하지 않았다(제 1A도). 대조적으로, 7B6 항체는 N-펩티드(43-67)과 반응했지만, N-펩티드(1-25)와는 반응하지 않았다(제 1B도). 따라서, 두 항체는 각각 N-펩티드의 상이한 부분을 인식하는 것이 확인되었다. 즉, KY-ANP-III항체는 N-펩티드의 1-25 아미노산 서열을 인식하고 7B6항체는 N-펩티드의 43-66부분을 인식한다.
본 발명의 모노클로날항체 7B6을 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 일본국 이바라키-켄 쯔구바-시 히가시 1-쵸메 1-3의 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁되었다. 기탁은 1994년 11월 9일에 이루어졌고, FERM BP-4878의 기탁번호가 부여되었다.
기탁 미생물은 기탁시에 생존에 있었으며 죽게될 경우에는 본 출원인에 의해 교체될 것이다.
실시예 2: 마우스의 복수로부터 모노클로날항체 7B6의 정제
프리스탄 0.5ml를 마우스(BALB/C)에 복강내 투여한 후 2주후에, 실시예 1에서 얻은 약 1× 107개의 하이브리도마를 각각의 마우스에 복강내 투여하였다. 투여후 제 7일 내지 제 10일에, 복수를 수집하고 10,000xg에서 20분 동안 원심분리하였다. 그런다음, 상청액을 PBS로 2배 희석한 후 프로테인 G 세파로오스 컬럼(Pharmacia)에 로딩하였다. 컬럼을 PBS로 세정하였다. 그런 다음, 컬럼을 0.2M 글리신-HCl 버피(pH 2.7)로 용출하고 용출물을 1M Tris 버퍼로 즉시 중화하였다. 용출물을 0℃에서 50% 포화 암모늄 설페이트로 염석하였다. 10,000xg에서 20분간 원심분리하여 침전물을 수집하였다. 이렇게 수집한 침전물을 PBS에 용해하고 4℃에서 PBS에 대해 하룻밤 투석하여 정제된 7B6 모노클로날항체를 얻었다.
실시예 3: KY-ANP-III 항체가 고정화된 비드의 생산
1% 글루타알데히드 수용액으로 사전에 처리한 폴리스티렌 비드(Immnochemical)을 0.05M 포스페이트 버퍼(pH 7.1)중의 KY-ANP-III 항체용액(1비드/200㎕) 25㎍/ml에 담갔다. N-펩티드(1-25)를 인식하는 모노클로날항체인 KY-ANP-III를 이 항체를 생산하는 하이브리도마(FERM BP-1887)을 배양하여 얻었다. 폴리스티렌 비드와 KY-ANP-III 항체의 혼합물을 25℃에서 3시간 진탕하고 추가로 4℃에서 적어도 19시간 이상 진탕했다. 수성부(aqueous portion)를 흡입에 의해 제거하고, 폴리스티렌 비드를 0.05M 포스페이트 버퍼(pH 7.1)로 세정하였다. 그런다음, 25% Block Ace를 함유하는 0.05M 포스페이트 버퍼(pH 7.1)를 4℃에서 적어도 40시간 동안 블록킹을 위해 비드에 가하여, KY-ANP-III항체가 고정화된 비드를 얻었다. 이렇게 하여 얻은 비드를 0.15M 염화나트륨, 0.1% BSA, 1mM EDTA, 및 0.1% 소디움아지드를 함유하는 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 보관하였다.
실시예 4: 방사성 요오드(125I)에 의한 7B6항체의 표지화
정제된 7B6 항체를 다음과 같이 클로로아민 T법에 의해125I로 표지화하였다. 먼저, 0.5M 포스페이트 버퍼(pH 7.5) 100㎕와 Na125I(Amersham Corp.)2mCi/20㎕를 유리관에 넣었다. 그런다음, PBS중의 3.3mg/ml 농도의 7B6 항체용액 60㎕와 0.5M 포스페이트 버퍼(pH 7.5)중의 1mg/ml 농도의 클로로아민 T용액 20㎕를 상기 유리관에 넣고 흔들었다. 이 혼합물을 실온에서 30초동안 반응하도록 하였다. 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.5)중의 2.5mg/ml 농도의 소디움 파이로설파이트 용액 20㎕를 가하여 반응을 정지시켰다. 그런다음, 50mg/ml 농도의 요오드화 칼륨 수용액 20㎕를 상기 반응 혼합물에 가하고, 이 혼합물을 Superose 12(1× 30cm)(pharmacia)에 로딩하고 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.0)로 용출하여125I로 표지화된 7B6 항체 분획을 얻었다.
실시예 5: 샌드위치 RIA
일련의 농도의 N-펩티드(1-67)(Peptide Institute, Inc.)를 함유하는 표준용액을 제조하였다. 상기 표준용액 또는 시료 50㎕를 소정수의 시험관 각각에 넣었다. 그런 다음, 0.15M 염화나트륨, 0.1% BSA, 1mM EDTA, 및 0.1% Kathon CG(Rohm and Haas)를 함유하는 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 6.5)인 버퍼 C 250㎕를 각 시험관에 가하였다. 시험관에 실시예 3에서 생산한 KY-ANP-III 항체로 코팅된 비드를 각기 하나씩 가했다. 각 시험관을 25℃에서 2시간동안 분당 200스트로크의 속도로 진탕하고(제 1반응), 각 시험관내의 용액을 흡입에 의해 없애고 버퍼 D 2ml(1mM EDTA, 0.0075% Tween 20, 및 0.1% Kathon CG를 함유하는 0.05M 포스페이트 버퍼(pH 6.5))로 시험관을 3회 세정하였다. 그런 다음, 제 2반응을 다음과 같이 수행하였다. 0.1% BSA를 함유하는 버퍼 D로 희석한125I로 표지화된 7B6 항체용액 300㎕(약 200,000cpm)을 각 시험관에 넣고, 시험관을 25℃에서 2시간동안 분당 200스트로크의 속도로 진탕하였다. 시험관내의 용액을 흡입에 의해 제거하고, 시험관을 버퍼 D 2ml로 3회 세정하였다. 각 시험관내의 비드상에 보류된 방사능을 감마선 계측기(ARC-600, Aroca)로 측정하였다.
상기한 샌드위치 RIA로부터 구한 표준곡선이 제 2도에 나와있다. 방사능은 0 내지 5000fmol/ml의 범위에서 N-펩티드(1-67)의 농도에 비례하였다. 탐지 가능한 최저감도는 40fmol/ml였다. 4종의 인간 혈장시료에 대해 재현성 시험을 행하였다. 재현성시험은 본 방법의 정밀도를 확인하기 위하여 행하였다. 여기에는 다음과 같이 2종류의 측정방법이 있다. 측정내(intra-assay)재현성 시험은 한 시험내의 단일 시료에 대한 측정값의 변동을 확인하기 위한 것이다. 그리고, 측정간(inter-assay)재현성 시험은 단일 시료에 대해 행해진 여러 시험들사이의 측정값의 변동을 확인하기 위한 것이다. 표1과 표2는 이 두 재현성 시험의 결과를 보여준다. 측정내 재현성 시험에서는, 변동계수(CV)가 1.5% 내지 2,2%(표1)이었고, 측정간 재현성 시험에서는, 변동계수가 4.1% 내지 5.6%(표2)였다.
표 1
샌드위치 RIA에 의한 측정내 재현성 시험
표 2
샌드위치 RIAa에 의한 측정간 재현성 시험
a : 7일간에 걸쳐 별개로 7회의 측정을 각 시료에 대해 3중 측정하였다.
다음으로, 인간 혈장을 사용하여 희석시험을 행하였다. 4종류의 인간혈장을, 버퍼 C를 사용하여 2배 계열 희석하여 다양한 농도를 가진 복수개의 측정용 시료를 얻었다. 얻어진 시료를 상기와 마찬가지로 샌드위치 RIA법으로 측정하였다. 결과를 제3도에 나타내었다. 어떤 농도에 있어서도 각 점은 대략 원점을 통하는 직선상에 있었다.
다음으로, 혈장중에 존재한다고 생각되는 성분이 샌드위치 RIA에 미치는 영향을 검토한 결과, 결합형 빌리루빈(0.15mg/ml), 유리형 빌리루빈(0.17mg/ml), 헤모글로빈(4.25mg/ml) 및 유상액(포르마진 탁도, 24도)의 영향은 관찰되지 않았고, 따라서 성분들은 아무런 영향을 미치지 않았다.
따라서, 본 발명의 샌드위치 RIA법은, 혈장중의 다른 성분의 영향을 받지 않고 정밀도가 양호하게 N-펩티드를 측정할 수 있다는 것을 확인하였다.
또한, 인간혈장을 사용하여 시험할 시료에 표준물질이 첨가되는 회수시험을 행하였다. 4종류의 인간혈장을, 250, 500 또는 1000fmol/ml 농도로 N-펩티드를 함유하는 표준 N-펩티드(1-67)용액을 사용하여 2배로 희석하였다. 얻어진 시료를 상기와 마찬가지로 샌드위치 RIA법으로 측정하였다. 결과를 표 3에 나타내었다. 첨가된 N-펩티드의 회수율은 88-134%였다. 따라서, 본 발명의 샌드위치 RIA법에서 인간 혈장중의 각종 N-펩티드와 표준 N-펩티드가 아주 유사한 반응성을 보인다는 것이 확인되었다.
표 3
샌드위치 RIA에 의한 첨가된 물질의 회수시험
a : 혈장중의 N-펩티드를 상회하여 증가한 값을 표시한다,
다음으로, 본 발명의 샌드위치 RIA법으로 건강한 사람 36명(남성 23, 여성 13)의 혈장중의 N-펩티드 농도를 측정한 결과, 평균값은 213fmol/ml이고, 표준편차는 90fmol/ml이었다.
실시예 6: 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 사용한 7B6 항체의 표지화
정제한 7B6 항체를 이시카와등(Ishikawa et al., supra)의 방법에 의해 HRP로 표지화하였다.
먼저, PBS중의 4.4mg/ml의 정제 7B6 항체용액 4.5ml에, 0.2M 시트레이트 버퍼(pH 4.0) 4.5ml와 0.02M 시트레이트 버퍼(pH 4.0)중의 2.2mg/ml의 펩신(Boehringer-Manuheim) 0.9ml를 가하고, 이 혼합물을 37℃에서 18시간동안 인큐베이션하였다. 혼합물 중의 얻어지는 소화물을 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.0)로 평형화한 울트로겔 ACA 44(2.6 × 84cm)(IBF biotechnics)로 분리하였다. F(ab)2를함유한 분획을 수집하고, Centricon 30(Amicon)으로 농축하였다.
그런다음, 얻어진 F(ab)2의 일부를 다음과 같이 환원하였다. 3.3mg의 F(ab)2를 함유한 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.0) 1.2ml에, 0.1M 2-메르캅토에틸아민과 5mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 6.0)를 1/10 용량 가하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 환원물을 함유하는 혼합물을, 5mM EDTA를 함유하는 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 6.0)으로 평형화한 Superose 12(1.5 × 50cm)(Pharmacia)로 분리하여, Fab를 함유하는 분획을 모으고, 이 분획을 Centricon 10(Amicon)으로 농축하였다.
한편, 2ml의 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.0)에 용해한 HRP(Sigma) 17.2mg에, 250㎕의 N,N-디메틸포름아미드에 용해한 ε-말레이미도카르복실숙신이미드(EMCS, Dojinkagaku)23.6mg을 가하고, 30℃에서 15분간 반응시켰다. 생성된 침전물을 원심 분리하여 제거하고, 상청액을 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 6.0)로 평형화한 PD-10(Pharmacia)를 통과시켜 저분자물질을 제거하여, HRP의 말레이미드 유도체를 얻었다.
HRP의 말레이미드 유도체를 함유한 얻어진 분획과 농축한 Fab를 HRP와 Fab의 몰비가 1 :1이 되도록 혼합하고, 30℃에서 1시간 반응시켰다. HRP로 표지화한 Fab를 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 6.5)로 평형화한 Superose 12(1.5 × 50cm)를 사용하여 표지되지 않은 물로부터 분리하여, HRP로 표지된 Fab 단편(0.62mg)을 얻었다.
실시예 7: 샌드위치 EIA
각 시험관에 표준 N-펩티드(1-67)용액 또는 시료를 50㎕씩 가하였다. 다음으로, 버퍼 C를 250㎕씩 첨가하고, 다시 상기 실시예 3에서 제조한 KY-ANP-III 항체를 코팅한 비드를 1개씩 가하였다. 수평진탕(200스트로크/분)을 25℃에서 2시간 행하고(제1 반응), 시험관내의 용액을 흡입제거한 후, 2ml의 버퍼 D로 3회 세정하였다. 다음으로, 제2 반응을 다음과 같이 수행하였다. 0.1% BSA를 함유한 버퍼 D로 희석한 HRP 표지 7B6 항체 용액 300㎕을 각 시험관에 가하고(200ng/시험관), 수평진탕(200스트로크/분)을 25℃에서 2시간 행하였다. 시험관내의 용액을 흡입제거한 후, 2ml의 버퍼 D로 5회 세정하였다. 다음으로, 기질용액으로서, 8.5mg/ml의 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조-티아졸린-6-술폰산)(ABTS, Boehringer-Mannheim) 및 2mM의 H2O2를 함유하는 0.01M 시트레이트 버퍼(pH 5.0)를 각 시험관에 300㎕씩 가하고, 25℃에서 정확히 30분간 정치한 후, 반응정지액을 2ml씩 가하였다. 얻어진 용액의 415nm에서의 흡광도를 분광광도계(UV-264, Shimadzu Corporation)을 사용하여 측정하였다. 증류수를 블랭크로 사용하였다.
상기한 샌드위치 EIA에 있어서의 표준곡선을 제4도에 나타내었다. 비드상에 보류된 효소활성은 0 내지 5000fmol/ml의 범위에서 N-펩티드(1-67)의 농도에 비례하였다. 최저 검출감도는 25fmol/ml이었다, 인간 혈장시표 3종을 사용하여 재현성 시험을 행한 결과를 표 4 및 표 5에 나타내었다. 측정내 재현성 시험에서는 CV는 1.2 - 4.6%이었고, 측정간 재현성 시험에서는 CV는 5.9-15.0%이었다.
표 4
샌드위치 EIA법의 측정내 재현성
표 5
샌드위치 EIAa법의 측정간 재현성
a : 4일간에 걸쳐 별개로 4회의 측정을 각 시료에 대해 2중 측정하였다.
다음으로, 인간 혈장을 사용하여 희석시험을 행하였다. 3종류의 인간혈장을 버퍼 C를 사용하여 2배 계열 희석하였다. 얻어진 시료를 실시예 7에서 기술한 것과 마찬가지로 샌드위치 EIA법으로 측정하였다. 결과를 제5도에 나타내었다. 어떤 농도에 있어서도 각 점은 대략 원점을 통하는 직선상에 있었다.
따라서, 본 발명의 샌드위치 EIA법은, 상기 실시예 5와 마찬가지로 혈장중의 다른 성분의 영향을 받지 않고 정밀도가 양호하게 N-펩티드를 측정할 수 있다는 것을 확인하였다.
또한, 인간혈장을 사용하여 첨가된 물질에 대한 회수시험을 행하였다. 3종류의 인간혈장을, 각 농도의 표준 N-펩티드(1-67)용액을 사용하여 2배로 희석하였다. 얻어진 시료를 상기와 마찬가지로 샌드위치 EIA법으로 측정하였다. 결과를 표 6에 나타내었다. 첨가된 N-펩티드의 회수율은 82-103%였다. 따라서, 본 발명의 샌드위치 EIA법에서 인간혈장중의 각종 N-펩티드와 표준 N-펩티드가 동등한 반응성을 보인다는 것이 확인되었다.
표 6
샌드위치 EIA법에 의한 첨가된 물질의 회수시험
a : 혈장중의 N-펩티드를 상회하여 증가한 값을 표시한다.
또, 샌드위치 RIA법에 의한 측정값(X)와 샌드위치 EIA법에 의한 측정값(Y)와의 상관관계를 인간혈장(14예)을 사용하여 검토한 결과, 상관관계식 Y=0.79X - 132(fmol/ml), 상관계수 R = 0.99였다.
본 발명의 범위 및 정신에서 벗어나지 않고도 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 그 밖의 다양한 변형이 자명하고 용이하게 창작할 수 있다. 따라서, 본 출원의 청구범위는 본 출원에 개시된 설명으로 한정돼서는 안되며, 청구범위는 넓게 해석되어야 한다.
제 1A도는 기존의 모노클로날항체 KY-ANP-III의 N-펩티드(1-25) 및 N-펩티드(43-67)와의 반응성을 보여준다.
제 1B도는 본 발명의 모노클로날항체 7B6의 N-펩티드(1-25) 및 N-펩티드(43-67)와의 반응성을 보여준다.
제 2도는 본 발명의 샌드위치 RIA법의 표준곡선을 보여준다.
제 3도는 본 발명의 샌드위치 RIA에 의해 임상시료로 시험한 희석곡선을 보여준다.
제 4도는 본 발명의 샌드위치 EIA의 표준곡선이다.
제 5도는 본 발명의 샌드위치 EIA에 의해 임상시료로 시험한 희석곡선을 보여준다.

Claims (16)

  1. 시료 및 N-펩티드를 인식하는 제1 모노클로날항체를 함유하는 혼합물을 인큐베이션하고;
    상기 혼합물에 N-펩티드를 인식하는 표지화된 제2 모노클로날항체를 가한 다음, 추가로 인큐베이션하고;
    그리고 얻어지는 항원-항체 복합체를 혼합물에서 검출하는 단계를 포함하는, N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  2. 시료와 N-펩티드를 인식하는 제1 모노클로날항체 및 N-펩티드를 인식하는 표지화된 제2 모노클로날항체를 함유하는 혼합물을 인큐베이션하고;
    그리고 얻어지는 항원-항체 복합체를 혼합물에서 검출하는 단계를 포함하는, N-2-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 제1 또는 제2 모노클로날항체가 N-펩티드의 43위치에서부터 66위치까지의 아미노산 서열부분을 인식하는 것을 특징으로 하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 제1 또는 제2 모노클로날항체가 7B6인 것을 특징으로 하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 제1 및 제2 모노클로날항체 중의 하나는 7B6이고, 다른 하나는 N-펩티드의 아미노산 서열의 일부를 인식하며 인식부위가 7B6의 인식부위와는 다른 모노클로날항체인 것을 특징으로 하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 제1 및 제2 모노클로날항체 중의 하나는 N-펩티드의 43위치에서부터 66위치까지의 아미노산부분을 인식하고, 다른 하나는 N-펩티드의 1위치에서부터 25위치까지의 아미노산 서열부분을 인식하는 것을 특징으로 하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 다른 하나의 모노클로날항체가 KY-ANP-III인 것을 특징으로 하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 제1 모노클로날항체는 N-펩티드의 1위치에서부터 25위치까지의 아미노산 서열부분을 인식하고, 제2 모노클로날항체는 N-펩티드의 43위치에서부터 66위치까지의 아미노산 서열부분을 인식하는 것을 특징으로 하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 제1 모노클로날항체는 KY-ANP-III이고, 제2 모노클로날항체는 7B6인 것을 특징으로 하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  10. 제 1 또는 제 2항에 있어서, 제2 모노클로날항체가 방사성 동위원소, 효소, 금콜로이드, 형광물질, 또는 발광물질로 표지화된 것을 특징으로 하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 제2 모노크로날항체가 방사성 동위원소 또는 효소로 표지화된 것을 특징으로 하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체를 측정하는 방법.
  12. N-펩티드의 43위치에서부저 66위치까지의 아미노산 서열부분을 인식하는 모글클로날항체.
  13. 제 12항에 있어서, 모노클로날항체가 7B6인 것을 특징으로 하는 모노클로날항체.
  14. 제 12항 또는 13항의 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마.
  15. 제 14항에 있어서, 하이브리도마가 마우스 하이브리도마 7B6(FERM BP-4878)인 것을 특징으로 하는 하이브리도마.
  16. 제 12항 또는 13항의 모노클로날항체를 포함하는 N-펩티드 또는 그것의 전구체의 면역학적 측정용 키트.
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