JPH0667319B2

JPH0667319B2 - Ａｎｐのｃ端側を認識するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH0667319B2
Application number: JP1099620A
Authority: JP
Inventors: 敦司三崎; 晃山内; 昌雄河野; 憲一伊賀野; 健井上
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1989-04-19
Filing date: 1989-04-19
Publication date: 1994-08-31
Anticipated expiration: 2009-08-31
Also published as: EP0393640A1; CA2012740A1; KR960009014B1; DE69021921T2; JPH02276591A; KR900016464A; ES2078918T3; GR3017268T3; DE69021921D1; CA2012740C; DK0393640T3; ATE127158T1; EP0393640B1

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はANPを認識するモノクローナル抗体および該モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関し、さ
らに詳しくは、α−ANPのＣ端側の配列、即ち、α−ANP
［17−28］断片に含まれる部分を認識するモノクローナ
ル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマに関する。さらに本発明は、ANPのＣ端側を認識
するモノクローナル抗体と、ANPのＮ端側を認識する抗
体で、ANPをサンドイッチすることを特徴とする、ANPの
エンザイムイムノアッセイ（以下、EIAと略記）および
ラジオイムノアッセイ（以下、RIAと略記）に関する。

従来の技術心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（atrial natriure
tic polypeptide,ANP）は、心房筋細胞により産生され
顆粒中に含まれる、強い利尿作用およびナトリウム排泄
作用を有するポリペプチドである。このようなポリペプ
チドはヒトのみならずラットにおいても見出されてお
り、それぞれhANP、rANPと呼ばれる。hANPおよびrANPは
さらにα、β、γの３つのタイプに分類される。α−hA
NPは28アミノ酸残基からなり、Ｎ端から７番目のCys
［７］と23番目のCys［23］がジスルフィド結合してお
り、その間の配列がリング状構造をなしている（Bioche
m.Biophys.Res.Commun.（以下BBRCと略記する）118、13
1−139、1984）（第７図参照）。α−hANPではＮ端から
12番目の残基がMetであるのに対し、α−rANPではIleで
ある点でのみ異なっている。（BBRC117、859−865、198
3）。β−hANPは、α−hANPの逆平行二量体である（特
開昭60−184098）。γ−hANPは126アミノ酸残基からな
り、そのＣ端の99〜126アミノ酸がα−hANPに相当す
る。

ANPの測定法としては既に抗血清を用いたラジオイムノ
アッセイが確立されている（Science228,323−325、198
5:Nature314、264−266、1985:BBRC124,815−821、198
4:BBRC124、663−668、1984:BBRC125、315−323、198
4）。このうち、抗血清CR−３はANPのＣ末端断片［17−
28］を認識することが知られている。

また、最近ANPに対して、様々な特異性を有するモノク
ローナル抗体が報告されている（Life Sci.38,1991−1
997,1986;Mol.Immunol.24,127−132,1987;Endocrinolog
y121,843−852,1987;Hybridoma６,433−440,1987）。特
に、ANPのＮ端部を認識するモノクローナル抗体として
は、［７−16］を認識するKY−ANP−Ｉ（特開昭64−615
00）が知られており、さらに、このKY−ANP−ＩとＣ端
側を認識する抗血清を用いたα−ANPの免疫測定法も既
に確立されている（特開昭64−61500）。

しかし、ANPのＣ端側を認識するモノクローナル抗体を
全く得られていなかった。

発明が解決しようとする課題従来のANPのイムノアッセイにおいては、試料からANPを
抽出する必要があり、抽出の必要がない高感度のアッセ
イを可能にする親和性の高いモノクローナル抗体が待望
されていた。また、上記のKY−ANP−Ｉはα−ANPのＮ端
側を認識するので、Ｃ端側を認識するモノクローナル抗
体が得られれば、Ｎ端側を認識するモノクローナル抗体
とＣ端側を認識するモノクローナル抗体によるサンドイ
ッチイムノアッセイが可能になる。

また、Ｃ端側断片を特異的に認識する抗体としては、抗
血清CR−３が知られているが、該抗体はポリクローナル
抗体であり、そのため安定な供給ができない。均一な特
異性が得られない等の点でモノクローナル抗体より劣
る。

従って、以上の理由によりANPのＣ端側断片を特異的に
認識する親和性の高いモノクローナル抗体が待望されて
いた。

課題を解決するための手段本発明者らはANPのＣ端側断片を特異的に認識する親和
性の高いモノクローナル抗体を創製すべく鋭意研究を行
なった結果、ANPのＣ端側を認識するモノクローナル抗
体を得、それを利用するANPの高感度測定法を完成する
に至った。

（１）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製 α−hANPは28アミノ酸残基からなるポリペプチドであ
り、比較的低分子であるため抗体の産生を誘起する能力
（免疫原性）が低い。そのため、抗原として用いるため
には牛血清アルブミン、牛チログロブリンなどと結合さ
れる。得られた複合体は、フロイントの完全アジュバン
ト等の適当なアジュバントに乳濁し、マウスの免疫に用
いる。

免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔、皮下
または静脈に数回繰り返し接種することにより行なう。
最終免疫後３日ないし５日後に脾臓を取り出し、抗体産
生細胞として使用する。この時同時に抗体産生細胞と融
合させてハイブリドーマを得るための親細胞として、ヒ
ポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ欠損（HGPRT^-）あるいはチミジンキナーゼ欠損
（TK^-）の様な適切なマーカーを持つミエローマ細胞株
を用意し、これと抗体産生細胞とを融合させてハイブリ
ドーマを作製する。

ハイブリドーマ作製における培地として、イーグルME
M、ダルベツコ変法培地、RPMI−1640などの通常良く使
用されているものに、適宜約10〜30％の牛胎児血清（FC
S、fetal calf serum）を加えて用いる。

まず、親細胞であるミエローマと脾細胞を約1:5の割合
で用意する。融合剤としてはポリエチレングリコール
（PEG）を50％濃度で用いるのが融合率が高いとされて
いる。融合株はHAT選択法により選択する。生じるハイ
ブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、膜螢光
抗体法、ELISA法（Enzyme Linked Immunosorbent As
say）、免疫組織染色法など既知の方法により行ない、
目的の免疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマの
クローンを選択する。ハイブリドーマの単一性を吟味す
るため、96穴のマイクロウエルにフイーダーレイヤー
（feeder layer）として正常な脾細胞を蒔いた上にハ
イブリドーマを１穴に１個より多くならないように蒔
き、生育してくるクローンについて再びスクリーニング
を行なう。このサブクローイングを繰り返すことによ
り、単一性のハイブリドーマを得る。

（２）モノクローナル抗体の産生次に、本発明のモノクローナル抗体を製造するために、
上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（in vitr
o）または動物体内（in vivo）で培養する。in vitro
系で培養する場合、培地は先に述べた通常培地にFCSを
添加したものでよく、この培地で３から５日培養の後、
培養上清からモノクローナル抗体を得る。in vivo系の
培養では、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔に接種し、
７ないし14日後に腹水を採取し、これよりモノクローナ
ル抗体を得る。in vivo系での培養の場合、in vitro
系での培養に比べて遥かに大量の抗体を効率的に取得し
うるので好ましい。

こうして得られた培養上清または腹水からのモノクロー
ナル抗体の精製は、硫安分画、DEAEセファロースカラム
等の既知の方法を適宜組み合わせて、例えば後記実施例
に記載したようにして行なうことが出来る。

本発明で得られたモノクローナル抗体AN111およびAN117
は、後記実施例に示される通り、α−ANPおよびβ−ANP
を認識する。そのエピトープはα−ANPのＣ端側、詳細
にはAla［17］からTyr［28］に含まれる部分を認識して
いるものと考えられる。また、このAla［17］からTyr
［28］に含まれる部分は、γ−ANPにも共通な部分であ
るので、本発明の抗体は当然γ−ANPも認識する。従っ
て、本発明の抗体はα、βおよびγの全てのタイプのAN
Pを認識する。

本発明の抗体は、後記表１に示すとおり、 α−hANP［７−27］、 α−hANP［17−22］、 α−hANP［17−20］、 α−hANP［21−26］二量体、 α−hANP［７−23］に殆ど反応性を示さない。即ち、 α−ANP［28］、 α−ANP［23−28］、 α−ANP［21−28］、 α−ANP［27−28］、 α−ANP［24−28］の欠除により反応性が無くなったものと考えられる。従
って、本発明の抗体はこれらの断片に含まれる部分を認
識しているものと推定される。従って、α−ANP［17−2
8］を免疫原として用いたことを考慮すれば、本発明の
抗体は、 α−ANP［ｎ−28］（但し、ｎは17〜28の整数を示す。）に含まれる部分を認識していると言える。ｎとしては、
上記から明らかな様に、17、21、23、24、27、28が例示
される。

本明細書において、例えばα−hANP［17−28］とは、α
−hANPの17番目のAlaから28番目のTyrまでの断片を意味
する。

また、本抗体はα−ANPに対して高い親和性（AN111が1.
7×10⁹M^-1、AN117が2.3×10⁹M^-1）を示した。第１図に
示すα−ANPの標準曲線から、90％阻害濃度（IC₉₀）はA
N111が6.2ng／ml、AN117が4.4ng／mlであった。

本発明のモノクローナル抗体AN111およびAN117を産生す
るハイブリドーマAN111およびAN117は1988年12月20日か
ら日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号30
5）に、それぞれ受託番号FERM BP−2197およびFERM B
P−2198としてブタペスト条約に基づき寄託されてい
る。

（３）抗体と担体との結合抗体を固定化する固相としては、通常の免疫測定法に使
用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスま
たは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボ
ール）、チューブ、プレートなどを用いることができ
る。これらの担体に、α−hANPのＮ端側またはＣ端側を
認識する抗体を吸着せしめる。吸着は通常リン酸バッフ
ァー中、pH6〜10、好ましくは中性付近で室温下に一夜
放置することにより行なう。抗体を吸着した担体は、ア
ジ化ナトリウムなどの防腐剤の存在下、冷所に保存す
る。

モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体につい
て、同様の処理で担体に結合せしめることができる。

（４）酵素標識抗体の調製 Fab′断片の調製 IgG画分をペプシンで消化してＦ（ab′）_２断片とし、
更にこれを２−メルカプトエチルアミンで還元すれば、
目的のFeb′が得られる。IgGからFab′の調製について
は、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ［J.Immunoassa
y］、４、209〜327（1983）に詳細な説明があり、本発
明においても、同様の手法を利用することができる。

抗体の酵素標識抗体の標識酵素としては、アルカリ性ホスファターゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼなどが利用可能であるが、本発明にお
いては、特に西洋わさびペルオキシダーゼが好ましく用
いられる。また、架橋剤としては、N,N′−ｏ−フェニ
レンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マレ
イミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシンイ
ミドエステル、4,4′−ジチオジピリジン、その他公知
の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素およ
び抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて、
既知の方法に従って行なえばよい。また、抗体として
は、場合によっては、そのフラグメント、例えばFa
b′、Fab、Ｆ（ab′）_２を用いる。本発明においては、
架橋剤として４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン酸・Ｎ−スクシンイミドエステルを用いるのが好ま
しい。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体
にかかわらず同様の処理により酵素標識抗体を得ること
ができる。

このようにして得られる酵素標識抗体は、好ましくは、
アフィニティ・クロマトグラフィーにより精製すれば、
更に感度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素
標識抗体は、安定剤としてチメロサールなどを加えて、
あるいは凍結乾燥して冷暗所に保存する。

（５）放射性同位元素標識抗体の調製クロラミンＴ法など公知の方法に従って、¹²⁵Iなどによ
り、抗体を標識する。

（６）ANPの測定上記で調製された免疫学的測定試薬を用いてANPを測定
する際の抗体の組合わせとしては、ANPのＮ端側を認識
する抗体を固定化した場合にはＣ端側を認識する抗体を
標識抗体とし、Ｃ端側を認識する抗体を固定化した場合
にはＮ端側を認識する抗体を標識抗体とすればよい。一
般には、固定化には比較的大量の抗体が必要であるため
安定的に大量の抗体が得られるモノクローナル抗体（例
えば、本発明のAN111およびAN117）が固定化に適してい
るが、抗血清から得られるポリクローナル抗体も不都合
なく使用できる。標識する抗体は、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、固定化した
抗体が認識するのとは異なる部位を認識するものであれ
ばよい。

例えば、固定化抗体として本発明のAN111またはAN117を
用いた場合には標識抗体としてKY−ANP−Ｉが適用で
き、またこの逆の組合わせでもよい。当然、α−ANPの
Ｎ端側を認識する抗血清も本発明に適用できる。

上記の様に本発明の抗体とKY−ANP−Ｉを組み合わせれ
ば、実施例に示すとおり、α−ANPおよびβ−ANPを測定
することができる。従って、本発明の抗体はKY−ANP−
Ｉとのサンドイッチ免疫測定法に適したモノクローナル
抗体である。また、ANPのＮ端側を認識する抗体とし
て、γ−ANPのＮ端側を認識する抗体を用いれば、γ−A
NPを特異的に測定することも可能である。

実施例１抗α−hANPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作
製と抗体の産生（１）免疫用コンジュゲートの作製ウシチログロブリン水溶液（64.4mg／2.4ml）とα−hAN
P［17−28］水溶液（11.8mg／1.7ml）を混和し、さらに
１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩水溶液（136mg／3.4ml）を加えた後、０
℃で２時間撹拌して反応させた。反応液を蒸留水に対し
て４℃で２日間透析し、遠心で沈殿を除いた後、凍結乾
燥した。以上の方法でα−hANP［17−28］−ウシチログ
ロブリンコンジュゲート39.7mgを得た。結合比はウシチ
ログロブリン１分子当りα−hANP［17−28］29分子であ
った。

（２）免疫実施例１（１）に記載したα−hANP［17−28］−ウシチ
ログロブリンコンジュゲートの生理食塩水懸濁液（コン
ジュゲート濃度1.82mg／ml）とフロイントの完全アジュ
バンドを等量ずつ混合して乳濁液として、これをBALB／
Ｃマウス（雌,8週令）の背部皮下に0.1mlずつ３週間隔
で４回注射した。マウス１匹１回当りのコンジュゲート
投与量は91μｇ、ハブテンのα−hANP［17−28］として
の投与量は５μｇである。さらに、第４回免疫の３週間
後に、ブースター免疫としてα−hANP［17−28］−ウシ
チログロブリンコンジュゲート181μｇ（ハブテン量10
μｇ）を懸濁した生理食塩水0.1mlを２日連続して腹腔
内に投与した。

（３）細胞融合ブースター免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、そ
の細胞を0.17M塩化アンモニウム溶液中に氷冷下５分間
置いて赤血球を破壊した。残った細胞をRPMI−1640倍地
に懸濁して細胞融合に用いる脾リンパ球とした。次に同
じくRPMI−1640培地に懸濁した８−アザグアニン耐性ミ
エローマ細胞（NS−１）2.4×10⁷個の脾リンパ球1.2×1
0⁸個を混合して、遠心後、上清を除去した。細胞沈殿物
にRPMI−1640倍地に溶かした50％ポリエチレングリコー
ル（分子量4000,メルク社）0.8mlを１分間かけてピペッ
トの先で撹拌しながら加え、さら1.5分間撹拌した。そ
の後、2mlのRPMI−1640を２分間かけて次に2mlを１分間
かけて撹拌しながら加えた。さらに18mlのRPMI−1640を
穏やかに撹拌しながら除々に滴加した。遠心後、上清を
除去し沈殿した細胞をHAT培地（１×10^-4Mヒポキサンチ
ン、４×10^-7アミノプテリン、1.6×10^-5Mチミジンを含
む20％FCS−RPMI1640培地）100mlに懸濁し、96ウエル細
胞培養プレート（コースター社）10枚の各ウエルに0.1m
lずつ分注した。細胞培養プレートには前もって栄養細
胞としてマウス脾臓細胞のHAT培地懸濁液を５×10⁴個／
0.1ml／ウエルずつ入れておいた。以後、２〜３日に１
度ずつHAT培地を半量ずつ新しいものと入れ替えた。約1
0日後にはハイブリドーマの増殖が認められた。ハイブ
リドーマが増殖してきたウエルは全部で951ウエル（99
％）であった。

（４）ハイブリドーマの選択ハイブリドーマの増殖してきたウエルについて培養上清
を用いて、抗α−hANP抗体産生の有無をラジオイムノア
ッセイで検定した。チューブ内で培養上清50μ、２％
ウシガンマグロブリンを含むアッセイ用緩衝液（実施例
５に記載）100μおよびアッセイ用緩衝液で希釈した
¹²⁵I標識α−hANP（約30000cpm／ml,Amersham社製）100
μを混合し、室温で２時間インキュベートした。次
に、25％ポリエチレングリコール6000水溶液250μを
加えて直ちに撹拌し、遠心（3000rpm,20分）後、上清を
除去して沈殿の放射能をガンマカウンター（アロカARC
−600型）で測定した。1000CPM以上の放射能を与えるも
のを抗体陽性とした。全部で９ウエルが抗体陽性として
選択された。

（５）モノクローン化実施例１（４）によって、選択されたハイブリドーマを
直ちに限界希釈法でクローニングした。96ウエル細胞培
養プレートにハイブリドーマを１個／200μ／ウエル
の濃度で培養し、ハイブリドーマが増殖してきたウエル
の培養上清について実施例１（４）のラジオイムノアッ
セイを行ない、抗体陽性のウエルのハイブリドーマを培
養拡大した。このクローニング操作を２〜３回繰り返
し、後記のサンドイッチイムノアッセイに適した抗α−
hANP抗体産生ハイブリドーマ細胞株AN111およびAN117を
確立した。

（６）腹水抗体液の作製確立したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、抗体
濃度の高い腹水を作製した。マウス（BALB／Ｃ雌、10日
後にプリスタン0.5mlを腹腔内投与）にRPMI−1640に懸
濁したハイブリドーマ約１×10⁷個を腹腔内に投与し
た。１〜３週目に適宜腹水を採取し、細胞を遠心分離し
た後、上清にアジ化ナトリウム0.1％を加えて凍結保存
した。この方法でハイブリドーマAN111およびAN117の産
生するモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水AN111Aお
よびAN117Aを得た。

（７）モノクローナル抗体の精製アフィゲルプロテインＡ MAPS−IIキット（バイオラッ
ド社）を用いて、腹水AN111AおよびAN117Aより抗体を精
製した。ゲル1.2mlを用いて、腹水それぞれ1mlをキット
の操作手順に従って精製したところ、AN111Aから4.3m
g、AN117Aから2.5mgの抗体を得ることができた。抗体の
純度の確認には、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動を
用いた。精製した抗体画分を２−メルカプトエタノール
で還元した後、12.5％ポリアクリルアミドゲルで泳動を
行なった。その結果、分子量約52,000前後にＨ鎖、約2
8,000前後にＬ鎖の２つのバンドが認められた。

実施例２モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの決定ハイブリドーマが産生する免疫グロブリンのクラス・サ
ブクラスの決定はマウスイムノグロブリン各クラス・サ
ブクラスに特異的な抗体（Serotec社，マウスモノクロ
ーナル抗体タイピング用キット）を用いて、免疫拡散法
によって行なった。その結果、腹水AN111A、AN117Aとも
抗IgG₁抗体との間にのみ沈降線が認められ、両抗体とも
IgG₁に属することがわかった。

実施例３モノクローナル抗体の親和性（結合定数）の測定実施例５に準じて、α−hANPの標準曲線作成の操作を行
ない、α−hANP各濃度についてスキャッチャード法に基
づいて縦軸に沈殿の放射能／上清の放射能、横軸に抗体
に結合したα−hANPの濃度をプロットし、得られた直線
の傾きから、抗体の結合定数を測定した。その結果、AN
111が1.7×10⁹M^-1、AN117が2.3×10⁹M^-1と求められた。

実施例４モノクローナル抗体の特異性実施例５のα−hANPのラジオイムノアッセイにおける試
料として、α−hANP関連ペプチドおよびペプチドフラグ
メントを用いて、抗体との交差性を求めた。その結果を
表１に示す。この結果からAN111、AN117ともにα−hANP
のＣ末端部を認識することがわかった。

実施例５モノクローナル抗体を用いたラジオイムノアッセイ［試薬］アッセイ用緩衝液１中にエチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム塩0.37
2g、シスチン・２塩酸塩0.063g、ε−アミノカプロン酸
0.262g、アジ化ナトリウム0.1gおよびウシ血清アルブミ
ン1gを含む0.1Mリン酸緩衝液pH7.0 腹水希釈液 AN111A（アッセイ用緩衝液で11万倍希釈したもの）また
はAN117A（アッセイ用緩衝液で6.2万倍希釈したもの） α−hANP標準液アッセイ用緩衝液にα−hANPを3.13〜100ng／mlの範囲
で２倍きざみの濃度で含むもの¹²⁵ I標識α−hANP Amersham社製のものを約0.1μCi／mlになるようにアッ
セイ用緩衝液で希釈したもの１％ウシガンマグロブリンアッセイ用緩衝液に溶解したもの 37.5％ポリエチレングリコールポリエチレングリコール6000をウシ血清アルブミンを除
いたアッセイ用緩衝液に溶解したもの［方法］チューブにα−hANP標準液または試料100μをとり、
¹²⁵I標識α−hANP100μ、腹水希釈液100μおよび１
％ウシガンマグロブリン200μを加えて混和した後、
４℃で１晩インキュベートした。次いで、４℃に冷却し
た37.5％ポリエチレングリコール250μを加え、直ち
に15秒間撹拌した後４℃で3000rpm、20分間遠心した。
上清を除去した後、沈殿の放射能をガンマカウンター
（アロカARC−600型）で測定した。

［標準曲線］ラジオイムノアッセイの標準曲線を第１図に示す。感度
（90％阻害濃度）はAN111が6.2ng／ml、AN117が4.4ng／
mlであった。

実施例６ α−hANPのサンドイッチラジオイムノアッセイ固相抗体には、前記のハイブリドーマクローンAN111あ
るいはAN117が産生する抗α−ANP−［17−28］モノクロ
ーナル抗体（以後、「AN111あるいはAN117」と略す）を
ポリスチレンビーズに固相化したものを、また標識抗体
には、ハイブリドーマクローンKY−ANP−Ｉ（特開昭64
−61500,ECACC87082001）が産生する抗α−hANP［１−2
8］モノクローナル抗体（以後、「KY−ANP−Ｉ」と略
す。）を¹²⁵Iで標識したものをそれぞれ用いて、α−hA
NPのサンドイッチラジオイムノアッセイを確立した。ハ
イブリドーマクローンKY−ANP−Ｉは1987年10月15日か
らPHLS CAMR,Porton Down,Salisbury,Wilts,United
KingdomにあるECACC（European Collection of Anim
al Cell Cultures）に受託番号87082001としてブダペ
スト条約に基づき寄託されている。

1.腹水の精製 AN111、AN117およびKY−ANP−Ｉから得た腹水をAffi−g
el Protein Ａ MAPS−II（バイオラッド社製）によ
り精製した。すなわち、腹水1mlに結合緩衝液1mlを加
え、これをあらかじめ結合緩衝液で平衡化したAffi−ge
l Protein Ａカラム（0.7×2cm）に加え、結合緩衝液
30mlで洗浄した。次いで、溶出緩衝液10mlで展開して溶
出液1ml毎に分取し、吸光度（280nm）が0.1以上の画分
を蒸留水に対して透折してIgG画分を得た。

2.固相化抗体の作製上記１で得たAN111AあるいはAN117AのIgG画分（100μｇ
／ml）を含む0.05Mリン酸緩衝液（pH7.4）にポリスチレ
ンビーズ（イチゴ社製、直径3.2mm）を浸漬し、４℃で2
0時間静置した。次いで、RIA用緩衝液［0.1％牛血清ア
ルブミン（crystal,Sigma社製、以後、「BSA」と略
す。）、1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以
後、「EDTA」と略す。）、0.2mMシスチンおよび0.1％ア
ジ化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0］で十
分に洗浄したのち、同緩衝液中に４℃で保存した。

3.¹²⁵I標識抗体の作製上記１で得たKY−ANP−ＩのIgG画分10μｇに0.5Mリン酸
緩衝液（pH7.5）50μｌとNa¹²⁵I（Amersham社製）0.5mC
iを加え混和した後、0.2％クロラミンＴ溶液10μｌを加
え、30秒間撹拌した。次いで、１％メタ重亜硫酸ナトリ
ウム溶液10μｌを加え混和後、10％ヨウ化カリウムおよ
び１％BSA溶液をそれぞれ10μｌずつ加え、これをゲル
濾過［Sephadex Ｇ−25（Pharmacia社製、Fine）:0.9
×25cm、0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4］して¹²⁵I標識抗体3
00μCiを得た。

4.測定法 a.2段階法上記２の固相化抗体ビーズ１個をポリスチレンチューブ
にとり、これに標準α−hANP溶液（10〜2000pg／ml）あ
るいはヒト血漿試料50μｌおよびRIA用緩衝液10μｌを
加えて、４℃で24時間インキュベーションした。上清を
吸引除去し、洗浄液（0.1％Tween80および0.9％塩化ナ
トリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液、pH7.0）1mlで３回
洗浄したのち、¹²⁵I標識抗体溶液1.2×10⁶dpm／ml）150
μｌを加えて、４℃で24時間インキュベーションした。
上清を吸引除去し、洗浄液1mlで３回洗浄したのち、固
相に結合した¹²⁵I標識抗体の放射能をガンマカウンター
で計測した。

b.1段階法上記２の固相化抗体ビーズ１個をポリスチレンチューブ
にとり、これに標準α−hANP溶液（10〜2000pg／ml）あ
るいはヒト血漿試料50μｌおよび¹²⁵I標識抗体溶液（1.
8×10⁶dpm／ml）100μｌを加え、４℃で24時間インキュ
ベーションした。上清を吸引除去し、洗浄液1mlで３回
洗浄して固相に結合した¹²⁵I標識抗体の放射能をガンマ
カウンターで計測した。

標準曲線は標準α−hANPの濃度を横軸に、計測した放射
能を縦軸にプロットして作成し、血漿ANP濃度は血漿試
料の放射能を標準曲線に対応させて求めた。

なお、以下の結果は特記しないかぎり、固相抗体にAN11
1を用いて１段階法により測定したものである。

5.標準曲線上記の測定法４−ａおよび−ｂの標準曲線は、それぞれ
第２図に示すとおりであった。最小検出感度は、ともに
0.5pg／tubeであった。

6.交差反応性 ANP関連化合物の交差反応性は第３図および表２に示す
とおりで、Ｃ端部が欠落したもの（α−hANP［７−2
7］）やα−rANPはほとんど交差しなかった。

7.ヒト血漿の希釈曲線健康成人２例の血漿にα−hANPを添加した試料の希釈曲
線は、標準曲線と良い平行性を示し（第４図）、血漿量
と測定値の間の関係は原点に収束する直線性を示した
（第５図）。

8.血漿α−hANPの回収試験健康成人２例の血漿に添加したα−hANPの平均回収率
は、表３に示すように107.5±7.6％であった。

9.血漿α−hANP濃度健康成人５例の血漿中濃度を測定したところ、表４に示
すように平均9.6±6.5pg／mlであった。

実施例７ α−hANPのサンドイッチエンザイムイムノアッセイ固相抗体は、前記のラジオイムノアッセイと同じもの
を、また標識抗体には、KY−ANP−Ｉをマレイミド法
（E.Ishikawa et al.;J.Immunoassay,4,209−327（19
83））によりペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来、Sigm
a社製、以後、HRPと略す。）で標識したものをそれぞれ
用いて、α−hANPのサンドイッチエンザイムイムノアッ
セイを確立した。

1.HRP標識抗体の作製 a.KY−ANP−IFab′の作製前記で得たKY−ANP−ＩのIgG画分5mgを0.1M塩化ナトリ
ウム含有0.1M酢酸緩衝液（pH4.2）に、ペプシン（ブタ
胃粘膜由来、Sigma社製）0.2mgを加えて溶かし、37℃で
16時間インキュベーションした。2Mトリス塩酸緩衝液
（pH8.0）でpHを７に調整したのち、ゲル濾過［カラム:
Ultrogel AcA44（LKB社製）1.5×45cm,展開液;5mM ED
TA含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）］してＦ（ab′）_２
画分を分取した。

次いで、Ｆ（ab′）_２画分をCentricon30（Amicon社
製）で濃縮し（2mg／0.4ml）、これに0.1M2−メルカプ
トエチルアミン溶液0.05mlを加えて、37℃で1.5時間イ
ンキュベーションした。反応液をゲル濾過［カラム;Sep
hadex Ｇ−25（Pharmacia社製）0.9×45cm,展開液;5mM
EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）］して過剰の試
薬を除去したのち、分取したFab′画分をCentricon30で
濃縮した。

b.マレイミド化HRPの作製 HRP2mgを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）0.3mlに４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン酸・Ｎ−スク
シンイミドエステルのジメチルホルムアミド溶液（10mg
／ml）30μｌを加え、30℃で１時間撹拌した。これを遠
心（2000×g,5min）し、上清を上記１−ａ（Sephadex
Ｇ−25）と同じ手順でゲル濾過して過剰の試薬を除去し
たのち、マレイミド化HRP画分をCentricon30で濃縮した
（1.8mg／500μｌ）。

c.KY−ANP−IFab′のHRP標識上記１−ａのKY−ANP−IFab′溶液（4mg／ml）500μｌ
に、上記１−ｂのマレイミド化HRP溶液（3.6mg／ml）50
0μｌを加え混合後、４℃で20時間インキュベーション
した。次いで0.1M Ｎ−エチルマレイミド溶液0.1mlを
加えて、30℃で１時間インキュベーションしたのち、上
記１−ａ（Ultrogel AcA44）と同じ手順でゲル濾過し
てHRP標識抗体を得た。

2.測定法 a.エンザイムイムノアッセイ（２段階法）前記の固相化抗体ビーズ１個をオリスチレンチューブに
とり、これに標準α−hANP溶液（６−2000pg／ml）ある
いはヒト血漿試料0.05mlおよびEIA用緩衝液（0.1％BSA,
1mM EDTA,0.2mMシスチン,0.3M塩化ナトリウムおよび10
00KIU／mlアプロチニン（Sigma社製）を含む0.01Mリン
酸緩衝液,pH7.0）100μｌを加えて４℃で24時間インキ
ュベーションした。上清を吸引除去し、洗浄液（0.1M塩
化ナトリムウを含む10mMリン酸緩衝液、pH7.0）2mlで２
回洗浄したのち、HRP標識抗体溶液（0.33μｇ／ml）150
μｌを加え、４℃で24時間インキュベーションした。上
清を吸引除去し、洗浄液2mlで２回洗浄したのち、下記
ｂの手順に従って固相に結合したHRP標識抗体の酵素活
性を測定した。

b.酵素活性の測定固相抗体ビーズを別のポリスチレンチューブに移し、0.
6％３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（Ald
rich社製）を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）100μｌ、
次いで0.015％過酸化水素水50μｌを加え、30℃で１時
間インキュベーションした。0.1Mグリシン緩衝液（pH1
0.3）2.5mlを加えて反応を停止し、螢光強度（励起波
長;320nm,螢光波長;405nm）を測定した。螢光強度は、
キニーネの50mM硫酸溶液（0.2μｇ／ml）の螢光強度を1
00としたときの相対螢光強度で表わした。

標準曲線は、標準α−hANP溶液の濃度を横軸に、螢光強
度を縦軸にプロットして作成した。

3.標準曲線固相抗体にAN111およびAN117を用いたときの標準曲線は
第６図に示すとおりで、最小検出感度は、ともに0.1pg
／tubeであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はAN111およびAN117を用いたα−hANPの標準曲線
を示す。第２図は１段階および２段階サンドイッチラジ
オイムノアッセイにおけるα−hANPの標準曲線を示す。
第３図はANP関連ペプチドの交差反応性を示す。第４図
はα−hANPの標準曲線と血漿希釈曲線を示す。第５図は
血漿の希釈試験の結果を示す。第６図はサンドイッチエ
ンザイムイムノアッセイ（２段階法）におけるα−hANP
の標準曲線を示す。第７図はα−hANPの構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献特開昭61−53299（ＪＰ，Ａ) 特開平１−61500（ＪＰ，Ａ) ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，38 （22），1991−1997（1986) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，124（３），815〜 821（1984)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マウスハイブリドーマAN111（FERM BP−2
197）により産生されるモノクローナル抗体AN111および
マウスハイブリドーマAN117（FERM BP−2198）により
産生されるモノクローナル抗体AN117からなる群から選
ばれる、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（ANP）の
Ｃ端側を認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】固相に固定化した抗体である請求項１に記
載のモノクローナル抗体。
【請求項３】該固相がパリスチレンビーズである請求項
２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】ANPで免疫されたマウスの脾細胞と、ヒポ
キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ欠損またはチミジンキナーゼ欠損を持つミエローマ
細胞を融合することにより得られる、マウスハイブリド
ーマAN111（FERM BP−2197）およびマウスハイブリド
ーマAN117（FERM BP−2198）からなる群から選ばれ
る、請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ。
【請求項５】請求項１〜３のいずれかに記載のANPのＣ
端側を認識するモノクローナル抗体とANPのＮ端側を認
識する抗体でANPをサンドイッチすることを特徴とするA
NPの免疫測定法。
【請求項６】該ANPのＣ端測を認識するモノクローナル
抗体を固相化抗体とし、該ANPのＮ端側を認識する抗体
を酵素または放射性同位元素標識抗体として用いること
を特徴とする請求項５に記載の測定法。
【請求項７】該ANPのＮ端側を認識する抗体がモノクロ
ーナル抗体であることを特徴とする請求項５または６に
記載の測定法。
【請求項８】該ANPのＮ端側を認識する抗体がハイブリ
ドーマKY−ANP−Ｉ（ECACC 87082001）により産生され
るモノクローナル抗体KY−ANP−Ｉであることを特徴と
する請求項７に記載の測定法。