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Die gegenständliche Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Atrialem Natriuretischem Peptid (ANP) und weiters auf eine In-vitro diagnostische Nutzung spezifischer polyklonaler Antisera gegen das 98 Amminosäuren lange N-terminale Fragment (proANP 1-98) des humanen pro-Atrialen Natriuretischen Peptids (126 Aminosäuren) und seiner Analoga im Veterinärbereich.
Klinische Bedeutung Natriuretischer Peptide
Das Atnale Natriuretische Peptid (ANP), Brain Natriuretisches Peptid (BNP) und C-type natriuretisches Peptid (CNP) gehören zu einer Familie von Hormonen, die aus dem Herz-Vorhof, dem Ventrikel des Herzens und den vaskulären Endothelzellen sezerniert werden (1-3). ANP wird in den Myocyten als Prohormon mit einer Länge von 126 Aminosäuren gespeichert. Zum Zeitpunkt der Freisetzung wird das Prohormon in einen N-terminalen Teil von 98 Aminosäuren proANP (1-98) und das biologisch aktive a-ANP (1-28) zu gleichen Teilen gespalten (3). proANP hat eine deutlich längere Halbwertszeit im Plasma als a-ANP, das nur eine sehr kurze Halbwertszeit von 2,5 Minuten aufweist (2) und liegt in bis zu 50-fach höherer Plasmakonzentration als a-ANP vor (2-4).
Weil die zirkulierenden Konzentrationen von immunreaktivem proANP wenig sensitiv auf rasche biologische Fluktuationen von a-ANP reagieren, spiegeln sie die Gesamtmenge des sezernierten ANP wieder.
Es wurde bereits in der Literatur beschrieben, dass die natriuretischen Peptide den Organismus gegen Flüssigkeitsüberschuss und hohen Blutdruck schützen (5). Die biologische, biochemische und pathophysiologische Rolle der natriuretischen Peptide ist in Übersichtsarbeiten zusammengefasst (6,7).
Klinische Wertigkeit
Die Plasmakonzentration von proANP ist bei Patienten mit verschiedenen Formen des erworbenen Bluthochdrucks erhöht, besonders wenn der Blutdruck infolge einer Hypertrophie des linken Ventrikels sehr hoch ist. Nach einem Herzversagen steigt die Plasmakonzentration von proANP in Relation zum Ausmass der Schädigung des Herzens. Nach einem akuten Myokardinfarkt steigen die Konzentrationen aller natriuretischen Peptide schnell an
In all diesen erwähnten pathophysiologischen Zuständen sind die zirkulierenden Konzentrationen der natriuretischen Peptide erhöht. Dies ist ein Schutzmechanismus des Organismus gegen Gefässverengung und Natriumretention. Weiters wurde bewiesen, dass die Plasmakonzentration von proANP bei Patienten mit Herzfehlern in Relation zur Schwere des Herzfehlers erhöht ist und daher wesentlich zur Prognose beiträgt.
Von besonderem Interesse ist die Beobachtung in vielen Studien, dass die Plasmakonzentration von proANP sogar in asymptomatischen Patienten mit linksventrikulärer Dysfunktion signifikant erhöht ist und daher eine wichtige klinische Wertigkeit als nicht-invasiver Marker hat (9,10,11). Weiters ist eine deutliche Unterscheidung von gesunden Kontrollpersonen und NYHA Klasse I Patienten gezeigt worden (12). Daher ist die Entwicklung von Methoden zur spezifischen und exakten Messung der proANP Fragmente von höchstem medizinischem Interesse.
Stand der Technik
Die einzige kommerziell zur Verfügung stehende Messmethode zur Bestimmung von proANP (1-98) basiert auf einem Radioimmunoassay (RIA) der Fa. BIOTOP, der die üblichen Nachteile kompetitiver und radioaktiver Assays aufweist wie spezielle Räumlichkeiten für radioaktives Arbeiten, Entsorgungskosten und häufig auch schlechte Reproduzierbarkeit wegen hoher Anfälligkeit auf Variation der Probenmatrix. Eine Alternative zu oben genanntem RIA wurde von SHIONOGI & Co. LTD. präsentiert (EP 0 721 105 A1). Dabei wurden monoklonale Antikörper gegen die Positionen 1-25 und 43-66 hergestellt und zum Aufbau eines radioaktiven oder enzymatischen SandwichImmunoassays eingesetzt.
Die Verwendung monoklonaler Antikörper bedingt jedoch teure und methodisch aufwendige Zellkultur (Herstellung der Maus-Hybridoma oder in vitro Produktion) bzw. die Gewinnung der Antikörper aus dem Speichel von Mäusen nach intraperitonaler Verabreichung der Hybridoma, was die erzielbaren Antikörperausbeuten limitiert und die Methodik ebenfalls stark erteuert.
Daher war es nötig, eine Methodik zu entwickeln, welche die kostengünstige Produktion grosse-
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rer Antikörpermengen (polyklonal) bei zu monoklonalen Techniken gleichwertiger Spezifität zur Nutzung in einem Sandwich Immunoassay erlaubt.
Gemäss der Erfindung werden polyklonale Antikörper gegen Epitope des proANP (1-98) eingesetzt, die als Immunogene 1,2 und 3 definiert sind, und die diese Immunogene sowie rekombinantes proANP (1-98) spezifisch binden. Damit ist es möglich, einfach und zuverlässig ANP nachzuweisen und damit Herzerkrankungen bereits in frühem Stadium verlässlich zu diagnostizieren.
Zur leichten Auffindbarkeit werden die Antikörper mit einem Marker-Molekül versehen, wobei bevorzugt als Markermolekül eine fluoreszierende Substanz, ein Enzym oder ein Farbstoff eingesetzt wird.
Zum Nachweis von humanem oder tierischem proANP (1-98) kann Körperflüssigkeit mit einer Lösung, die einen der polyklonalen Antikörper gegen Immunogen 1,2 oder 3 enthält, zur Bildung eines Antikörper/proANP(1-98)-Komp!ex in Kontakt gebracht werden, wonach dann die Bildung des Komplexes nachgewiesen wird. Dabei kann der Nachweis des Antikörper/proANP(1-98)Komplex durch Reaktion mit einem der beiden anderen Antikörper in Form eines Sandwich-Assays durchgeführt werden. Besonders zuverlässig ist das erfindungsgemässe Verfahren, wenn ein primärer, gegen eines der Immunogene gerichteter Antikörper an einer Festphase immobilisiert wird, wobei zur Reaktion als sekundärer Antikörper einer der gegen eines der beiden übrigen Immunogene gerichteter Antikörper eingesetzt wird.
Die Immobilisierung des primären Antikörpers kann dabei an einer Mikrotiterplatte, einer Membrane oder Festkörperpartikeln erfolgen.
Ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann folgende Komponenten enthalten: a) einen immobilisierten primären Antikörper, b) rekombinantes proANP (1-98) als Standard, c) einen polyklonalen sekundären Antikörper oder einen markierten Detektionsantikörper, der spezifisch an den genannten polyklonalen sekundären Antikörper bindet.
Die Erfindung beinhaltet somit die Auswahl geeigneter Teilsequenzen des N-terminalen Fragmentes als Immunogene, die mittels numerischer Methoden hinsichtlich ihrer Antigenizität optimiert wurden und gleichzeitig minimale Kreuzreaktionen mit anderen physiologisch zirkulierenden N-terminalen Fragmenten (proANP (1-30), proANP (31-67)) aufweisen. Weiters die Entwicklung eines Sandwich Immunoassays für proANP (1-98) (Analyt) unter Verwendung immunaffinitätschromatographisch gereinigter polyklonaler Antikörper gegen Teilstrukturen des Analyten.
Die Methode zur Messung des Analyten beinhaltet folgende Schritte:
Inkubation der zu untersuchenden Probelösung mit einem gegen eine Teilstruktur des Analyten gerichteten polyklonalen Antikörper und einem markierten polyklonalen Zweitantikörper gegen eine andere Teilstruktur des Analyten und Detektion des gebildeten Antigen-Antikörper Komplexes.
Neben dem Einsatz polyklonaler Antisera gegen Teilsequenzen von proANP (1-98) und deren In-vitro diagnostische Nutzung sowie die Auswahl geeigneter Teilsequenzen des N-terminalen Fragmentes als Immunogene betrifft der vorliegende Gegenstand die chemische Synthese dieser Immunogene, sowie die Immunisierung von Trägertieren (vorzugsweise von Schafen). Des weiteren wurden die immunaffinitätschromatographische Reinigung der Rohseren, die Konjugation der gewonnen Antikörper mit einem Markermolekül (z. B. Enzyme, Biotin, kolloidales Gold, fluoreszierende oder lumineszierende Substanzen sowie Radioisotope) und das Austesten der geeignetsten Antikörper-Kombinationen zum Nachweis von proANP (1-98) als Sandwich Immunoassays durchgeführt.
Letzterer kann in folgenden Ausformungen durchgeführt werden:
Das polykolonale Erstserum enthält Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 8-27 und das Zweitserum Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 79-98 oder 31-67. Der Nachweis erfolgt durch Detektion des resultierenden Antigen-Antikörper Komplexes.
Das polykolonale Erstserum enthält Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 79-98 und das Zweitserum Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 8-27 oder 31-67. Der Nachweis erfolgt durch Detektion des resultierenden Antigen-Antikörper Komplexes.
Das polykolonale Erstserum enthält Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 31-67 und das Zweitserum Antikörper gegen Epitope der Teilsequenz 8-27 oder 79-98. Der Nachweis erfolgt durch Detektion des resultierenden Antigen-Antikörper Komplexes.
In einer weiteren Ausführung sind die Antikörper des jeweiligen Zweitserums mit einem Enzym,
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Biotin, kolloidalem Gold, einer fluoreszierenden oder lumineszierenden Substanzen oder Radioisotopen markiert.
Demgemäss stellt die die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise (1) eine Methode zur Herstellung polyklonaler Antisera gegen proANP (1-98) mit zu monoklonalen Antikörpern equivalenter Spezifität (2) einen Sandwich-Immunoassay für biologisch inaktives proANP (1-98) und (3) polyklonale Antisera gegen biologisch inaktives proANP (1-98) zum Einsatz in der Histologie und (4) einen Immunoasssay-Kit für biologisch inaktives proANP (1-98), der diese Antisera enthält, zur Verfügung.
Figur 1 zeigt eine typische Standardkurve eines Sandwich-ELISA für proANP (1-98)
Figur 2 zeigt die Bestimmung von proANP (1-98) Konzentrationen im Blut von Patientenproben mit unterschiedlich schwerer Herzerkrankung (NYHA I-IV)
Tabelle 1 zeigt die Kreuzreaktivität des proANP (1-98) ELISA mit anderen N-Terminalen natriuretischen Peptidfragmenten.
Auswahl und Herstellung der Immunogene-Immunisierung
Die geforderte hohe Spezifität und Avidität der gewünschten Antisera kann nur durch entsprechende Auswahl der für die Immunisierung von Trägertieren verwendeten Immunogene erzielt werden. Die zu lösenden Probleme liegen in : a) der Wahl eines ausreichenden Sequenz-Abstandes zwischen den zur Immunisierung verwendeten Peptiden, um Kreuzreaktivitäten mit anderen natürlich vorkommenden proANP-Fragmenten zu vermeiden b) die geeignetste Sequenz für optimale Immunantwort und Spezifität zu finden c) eine möglichst genaue Überwachung der Immunantwort der Trägertiere durchzuführen, um den geeignetsten Zeitpunkt für eine Nachimmunisierung zu bestimmen damit die produzierten Antisera optimale Avidität besitzen.
Daher wurden zur Analyse des Analyten proANP (1-98) numerische Methoden (Software: PeptiSearch von CoshiSoft Arizona USA), welche die Bestimmung der Antigeniziät (Algorythmen nach Jameson-Wolf und Welling) eingesetzt um polyklonale Antisera maximaler Avidität zu erhalten. Als Regionen höchster Antigenizität konnten die Sequenzen 14-24 (DFKNLLDHLEE) und 79-95 (SSDRSALLKSKLRALLT) identifiziert werden.
Davon ausgehend wurden folgende synthetischen Immunogene im Auftrag von BIOMEDICA bei Guildhay Lt., Walnut Tree Close, Guilford, Surrey GU14UG, ENGLAND zur Immunisierung von Schafen eingsetzt:
Immunogen 1. Aminosäuresequenz 8-27 bezogen auf proANP (SEQ.ID. Nr. 1)
Immunogen 2 : Aminosäuresequenz 31-64 bezogen auf proANP (SEQ.ID.Nr. 2)
Immunogen 3 :
Aminosäuresequenz 79-98 bezogen auf pro ANP (SEQ.ID.Nr.3)
Sequenzprotokoll: < 110 > Biomedica GmbH < 120 > Polyklonale Antisera zum Nachweis von proANP (1-98) < 140 > AT A 1618/98 < 141 > 29. 09.1999 < 160 > 3 < 210 > 1 < 211 > 20 < 212 > PRT < 213 > Homo Sapiens
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< 400 > Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn
1 5 10
Leu Leu Asp His Leu Glu Glu Lys Met Pro
15 20 < 210 > 2 < 211 > 34 < 212 > PRT < 213 > Homo Sapiens < 400 > Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser Glu
1 5 10
Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser
15 20
Pro Leu Pro Glu Val Pro Pro Trp Thr Gly
25 30
Glu Val Ser Pro < 210 > 3 < 211 > 20 < 212 > PRT < 213 > Homo Sapiens < 400 > Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser
1 5 10
Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg
15 20
Alle Peptide wurden durch organisch-chemische Schutzgruppen-Synthese nach dem Stand der Technik hergestellt und entweder
N-terminal oder C-terminal mit Thyreoglobulin als Trägerprotein gekoppelt. Als Kopplungsreagenzien können beispielsweise bifunktionelle Verbindungen wie 4-(NMaleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), Succinimidyl 4-(p-Maleimidophenyl)butyrate (SMPB) ebenso Sulfo-MBS, Sulfo-SMCC oder ähnliches eingesetzt werden.
Mit diesen Immunogenen wurden Schafe einer primären Immunisierung durch Verabreichung des Peptides in Mischung mit komplettem Freundschem Adjuvans unterzogen. Die Immunantwort wurde mittels eines Antikörper Capture ELISAs untersucht, bei dem mit dem zur Immunisierung verwendeten Trägerpeptid beschichte Microtiterplatten verwendet wurden. Verdünnungsreihen einer frisch gewonnenen Serumprobe der Schafe wurden mit diesen Microtiterplatten inkubiert und die spezifische Bindung der Antikörper mit einem Anti-Schaf-Peroxidase-tgG Konjugat quantifiziert.
Der Antikörper Titer der Schafe wurde monatlich überprüft und bei Absinken des Titers erfolgten entsprechende Nachimmunisierungen in jeweils optimalen Intervallen.
Gewinnung der polyklonalen Sera-Immunaffintiätschromatographie
Die aus den Schafen gewonnenen Rohsera wurden durch Affinitätschromatographie über HiTrap Minisäulen (PHARMACIA, Schweden) gereinigt. Etwa 0. 5 mg des entsprechenden zur Immunisierung verwendeten Peptides wurde entsprechend dem von Pharmacia mitgelieferten Protokolls an die Säulen gebunden. Nach Filtration der Rohsera durch ein 0.45 \im Millex-Filter (MILLIPORE, USA) wurden 10-20 ml Antiserum 1+2 (v/v) mit 50 mM Borat Puffer pH 7 verdünnt und bei Raumtemperatur mit einer Flussrate von 0.5 ml/min auf die Säule geladen. Die Elution der spezifisch gebundenen Antisera erfolgte mit 0.1 M Citrat-Puffer pH 1. 7 mit einer Flussrate von 1 ml/min.
Die Elution wurde mittels eines 280 nm UV-Detektors überwacht und Fraktionen zu 0. 5 ml Antiserum auf 0.5 ml vorgelegten 0. 5 M Boratpuffer pH 10 gesammelt, um eine sofortige Neutralisation des Eluates zu erreichen. Die Bestimmung der IgG-Konzentration des Eluates
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erfolgte mit einem handelsüblichen Protein Nachweis ( BCA von PIERCE, NL).
Als Standardmaterial wurde recombinantes proANP (1-98) exprimiert in E. Coli vom Institut für Mikrobiologie der Universität Wien verwendet.
Beispiele
Die beschriebenen polyklonalen Antisera gegen die Immunogene 1-3 der vorliegenden Erfindung können für alle bekannten Varianten von Immunoassays wie a) Ezyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) einschliesslich automatisierter Hybrid-Methoden (z. B : Verwendung von Polystyrol oder Latex-Beads) in Microtiterplatten oder auf Membranen b) Fluoreszenz Immunoassays (FIA) c) Diverse Teststrip-Methoden auf Trockenchemie-Basis d) Histologischem Nachweis auf unterschiedlichen Gewebepräparationen eingesetzt werden.
Einige Ausführungen werden im Folgenden durch Beispiele beschrieben : Beispiel 1 Sandwich ELISA für proANP (1-98)
Aliquote der gereinigten Sera gegen Immunogen 1,2 und 3 wurden mit Biotin unter Verwendung von Biotinamidocaproate-N-Hydroysuccinimmide Ester oder ähnlichem entsprechend Standardverfahren (8) markiert. Als Standardmaterial für den Immunoassay wurde recombinantes proANP (1-98) exprimiert in E. Coli vom Institut für Mikrobiologie der Universität Wien verwendet.
Folgendes Protokoll stellt einen typischen Assay-Vorgang dar:
Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorp High Binding, NUNC, Dänemark) werden über Nacht bei 4 C mit 200 l Antiserum-Verdünnung (Erstserum) gegen beispielsweise Immunogen 1 beschichtet.
Die unspezifischen Bindungsstellen werden blockiert und Standard oder Probe mit biotinmarkiertem Antiserum gegen z.B. Immunogen 3 im Well gemischt. Nach 2h bei 37 C werden die Wells gewaschen und Streptavidin-Peroxidase Konjugat zugesetzt. Nach einer weiteren Stunde Inkubation bei 37 C und einem weiteren Waschschritt wird Tetramethylbenzidin (TMB) zugesetzt und schliesslich die der proANP (1-98) Konzentration der Probe proportionale Farbentwicklung in einem Mikrotiterplatten-Photometer bestimmt.
Beispiel 2 Direkter Fluoreszenzimmunoassay für proANP (1-98)
In einer weiteren Ausführung der Erfindung können Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorescein, Rhodamin etc.) als Marker für beispielsweise das Antiserum gegen Immunogen 3 eingesetzt werden. Die Assaydurchführung kann dann analog Beispiel 1 ohne die Notwendigkeit einer Substratzugabe erfolgen. Weiters können die fluoreszenzmarkierten Antisera zu histochemischen Studien betreffend die proANP (1-98) - Verteilung in Geweben eingesetzt werden (Konfokale-Laser-Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie etc. ) Beispiel 3 Homogener Immunoassay für proANP (1-98)
In einer weiteren Ausführung der Erfindung werden die Antikörper des Erstserums an Kunstoffpartikel (Latex, Polystyrol etc. ) gebunden und gemeinsam mit dem markierten Zweitantikörper der Probe in homogener Lösung zugesetzt.
Nach einem Trennungschritt durch Filtration oder Zentrifugation wird die Menge an gebundenen Zweitantikörper durch Farbreaktion mit geeigneten Enzymsubstrat mit einem herkömmlichen Spektral-Photometer bestimmt
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TABELLE 1
EMI6.1
<tb>
<tb> Parameter <SEP> % <SEP> Signal <SEP> im <SEP> proANP <SEP> (1-98)
<tb> -Sandwich <SEP> ELISA
<tb> proANP <SEP> (1-98) <SEP> 100,00
<tb> proANP <SEP> (1-30) <SEP> <
<tb> proANP <SEP> (31-67) <SEP> < <SEP> 3 <SEP>
<tb> proBNP <SEP> (8-29) <SEP> <
<tb> proBNP <SEP> 32-57 <SEP> <
<tb> proCNP <SEP> 24-42 <SEP> <
<tb> proCNP <SEP> 53-73 <SEP> <
<tb> proCNP <SEP> (74-102) <SEP> <
<tb> a-ANP <SEP> (1-28) <SEP> < <SEP> 1
<tb>
7. Literatur 1. de Bold A.J. et al. (1981), Life Sci. 28 : 89-94 2 Yandle T. G. et al. (1986), Life Sci. 38: 1827-1833 3. Mathisen P. et al. (1991), Scand. J.
Clin.Lab. Invest. 53 : 41-49 4. Wie C.M. (1993), Circulation 88 : 1004-1009 5. Nicholls M. G. et al. (1996), J1FCC 8 : 159-160 6. Bonow R. et al. (1996), Circulation 93 : 1946-1950 7. Nakao K. et al. (1996), Current Opinion in Nephrology and Hypertension 5: 4-11 8. Francis G. S. et al. (1990), Circulation 82 : 1724-1729 9. Lerman A. et al. (1993), Lancet 341: 1105-1109 10. Rouleau J.L. et al. (1994), J. Am. Coll. Cardiol. 24: 583-591 11. Hall C. et al. (1994), Circulation 89: 1934-1942 12. Dagobatti et al. (1997), Cardiovascular Research 36 : 13. Hoffmann K. et al,. (1982) Biochemistry, 21: 978
PATENTANSPRÜCHE: 1.
Verfahren zur Bestimmung von Atrialem Natriuretischem Peptid (ANP), dadurch gekenn- zeichnet, dass polyklonale Antikörper gegen Epitope des proANP (1-98) eingesetzt werden, die als Immunogene 1,2 und 3 (SEQ.ID.Nr. 1,2 und 3) definiert sind, und die diese Immu- nogene sowie rekombinantes proANP (1-98) spezifisch binden.