DE69833118T2 - Immunoassay zum bestimmen von bnp - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Immuntest für das „natriuretische Peptid aus Gehirn" (BNP), welches ein Mitglied der natriuretischen Peptidfamilie ist, genauer gesagt betrifft es einen Immuntest für γ-BNP und Derivate davon.
  • STAND DER TECHNIK
  • Die natriuretische Peptidfamilie umfasst drei Mitglieder d.h. atriales natriuretisches Peptid (ANP), natriuretisches Peptid aus Gehirn (BNP) und natriuretisches Peptid vom Typ-C (CNP). Unter ihnen sind ANP und BNP Herzhormone, welche hauptsächlich vom Herz biosynthetisiert und davon abgesondert werden. ANP und BNP haben eine ähnliche Struktur. ANP ist ein Peptid von 28 Aminosäuren mit einer Ring (kreisförmigen)-Struktur, welche durch eine Disulfidbindung zwischen dem 7. und dem 23. Cysteinrest gebildet wird, während BNP ein Peptid von 32 Aminosäuren ist, mit einer Ringstruktur, welche durch eine Disulfidbindung zwischen dem 10. und 26. Cysteinrest gebildet wird. Von diesen reifen Peptiden aus 28 und 32 Aminosäuren wurde angenommen, dass sie aus entsprechenden Vorläufern erzeugt werden, wenn eine Leadersequenz intrazellulär oder zum Zeitpunkt der Sekretion abgespalten wird. Zumindest wurde berichtet, dass menschliches BNP in Myocardzellen zuerst als ein Präprohormon synthetisiert wird (nachstehend als Präpro-BNP bezeichnet), welches vor oder zum Zeitpunkt der Sekretion zwischen Ser26-His27 gespalten wird, um Pro-BNP (nachstehend als γ-BNP bezeichnet) zu ergeben und welches weiter zwischen Arg102-Ser103 gespalten wird, um BNP-32 (nachstehend als α-BNP bezeichnet) und BNP (1–76) zu ergeben und dass das Erstere die Aktivität aufweist. Es wurde angenommen, dass zumindest die Ringstruktur für die Expression der Aktivität erhalten bleiben muss.
  • Die Sekretion der Herzhormone, die durch verschiedene Herzerkrankungen stimuliert wird, spiegelt die Veränderung in den Herzfunktionen gut wider. Die Sekretion von ANP wird hauptsächlich beschleunigt, wenn das Atrium eine Belastung erleidet, während die Biosynthese und Sekretion von BNP stimuliert werden, wenn der Ventrikel eine Belastung erleidet. Demgemäß sind sowohl ANP als auch BNP als Indikatoren in der Diagnose von Herzerkrankungen nützlich. Mit Fortschritt der Untersuchungen in die in vivo-Rolle der betreffenden Hormone wurden die vorteilhaften Merkmale von BNP als ein Indikator für die Diagnose von Herzerkrankungen klar. Zum Beispiel ist die Konzentration von BNP im Blut einer normalen Testperson nur 1/6 derer von ANP, aber sie wird in Patienten mit Herzversagen oder ähnlichem höher als ANP; die Blutkonzentration von BNP erhöht sich im Falle von Herzversagen wie ANP und die Plasmakonzentration von BNP übersteigt oft jene von ANP, was die Schwere der Herzdysfunktion genauer widerspiegelt; die Plasmakonzentration von sowohl ANP als auch BNP erhöht sich im peripheren Blut und die Erhöhungsrate ist bei BNP höher. Darüber hinaus erhöht sich die BNP-Menge in Patienten mit Herzversagen manchmal um mehrere zehn- bis mehrere 100-mal gegenüber jener von normalen gesunden Testpersonen und die Veränderung von BNP im Falle von Herzversagen ist so ausgeprägt, dass keine anderen Hormone damit vergleichbar sind. Aus diesen Gründen ist die Nützlichkeit der BNP-Messung vorgeschlagen worden (Y. Saito et al., Mebio, 12(5), 28, 1995).
  • Unter den Bedingungen wurde ein Immuntest vorgeschlagen, der einen anti-BNP-Antikörper benützt und in der Diagnose von Herzinsuffizienz anwendbar ist. Die japanische Patentveröffentlichung (KOHYO) 7-507210 beschreibt ein Verfahren der Messung von γ-BNP (1–76), welches durch Bioabbau durch Protease oder ähnliche produziert wird. Dieses Verfahren ist jedoch auf γ-BNP (1–76) gerichtet, welchem der (die) für die Expression der Aktivität wesentliche Teil(e) fehl(en), wie die Ringstruktur, und daher kann die Hormonaktivität nicht direkt bestimmt werden.
  • Ein Test-Kit für die Messung von α-BNP, welches natriuretische Aktivität aufweist, ist vertrieben worden („BNP-32", Peninsula). Mit diesem Kit können auch Abbauprodukte von α-BNP im Blut gemessen werden, einschließlich Fragmente, welchen aufgrund der Deletion des C-terminalen Bereichs Aktivität fehlt. Unter Berücksichtigung der niedrigen Blutkonzentrationen von BNP können die Messungen, welche die Abbauprodukte beinhalten, nicht außer Acht gelassen werden. Demgemäß weist dieses Verfahren auf Nachteile hin, als dass es bei der Etablierung einer genauen Diagnose von Herzversagen ein Test für BNP sein könnte.
  • Als ein Kit für die Messung von BNP, der frei von den vorstehend erwähnten Nachteilen war, ist ein Kit vertrieben worden („SHIONORIA BNP", Shionogi), welcher charakteristischer Weise einen Antikörper verwendet, der die für die Expression der Aktivität wesentliche Struktur erkennt. Dieses Verfahren würde jedoch durch den Prozess zur Entnahme und Lagerung der Blutproben erheblich beeinträchtigt sein, da α-BNP in entnommenem Blut extrem instabil ist. Es wird daher empfohlen, dass die Probe spezifisch behandelt werden soll, um verlässliche Daten zu erhalten, zum Beispiel durch Hinzufügen eines Agens in ein Blutentnahmeröhrchen zur Hemmung des Abbaus oder indem die Probe bei niedriger Temperatur gehalten wird. Solche Verfahren können die umfassende klinische Anwendung dieses BNP Test-Kits behindern. In Hunt et al., (1997), Peptides, Bd. 18, Seiten 1475–1481 werden Antikörper offenbart, welche an den N-terminalen Teil von pro-BNP binden, und Antikörper, die an BNP-32 binden. Die vereinigte Verwendung dieser Antikörper in einem Immuntest, der spezifisch für pro-BNP ist, wird jedoch nicht offenbart.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die hier genannten Erfinder haben zum Zweck der Etablierung eines genauen Verfahrens zur Diagnose von Herzerkrankungen, die BNP umfassen, intensive Untersuchungen durchgeführt und herausgefunden, dass BNP im Blut in der Form von γ-BNP oder seines Abbauprodukts vorliegt, welches strukturell zumindest den α-BNP-Rest umfasst (nachstehend werden sie als „γ-BNP-Derivate" bezeichnet) und nicht in Form von α-BNP, welches bis jetzt als vorherrschend erachtet wurde. Die Erfinder haben auch herausgefunden, dass γ-BNP im Blut stabiler ist als α-BNP, was heißt, dass eine von vielen Funktionen der N-terminalen Struktur von γ-BNP die Stabilisierung von BNP wäre. Das vorstehend erwähnte weist darauf hin, dass ein Organismus mindestens 2 Arten an BNP-Molekülen biosynthetisiert, welche die BNP-Aktivität teilen, sich aber in der Halbwertszeit unterscheiden. Diese Ergebnisse führten dazu, dass die vorliegenden Erfinder zur Ansicht gelangten, dass es unerlässlich ist, ein Verfahren zu etablieren, welches nicht nur spezifisch für α-BNP, sondern auch für γ-BNP ist, um eine exakte Diagnose von Herzerkrankungen zu erreichen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Immuntest bereit, der spezifisch ist für Säugetier-γ-BNP-Derivate, gekennzeichnet dadurch, dass er den ersten Antikörper, welcher mit Säugetier-α-BNP reaktiv ist, und den zweiten Antikörper verwendet, welcher mit Säugetier-Präpro-BNP oder γ-BNP-Derivaten und nicht mit α-BNP reaktiv ist.
  • Der Begriff „Säugetier-α-BNP", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Peptid von niedrigem Molekulargewicht, welches natriuretische Aktivität aufweist und welches durch die Entfernung des N-terminalen Bereichs als ein Ergebnis der Prozessierung der Prozessierungssignale am Carboxyterminus von Säugetier-Präpro-BNP oder γ-BNP abgeleitet ist. Im Falle von menschlichem BNP ist α-BNP ein Peptid, welches aus 32 C-terminalen Aminosäuren (Nummern 103–134) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 besteht und welches eine Ringstruktur aufweist. Der Carboxyterminus der Prozessierungs-Signalsequenz auf dem Präpro-BNP-Molekül variiert leicht, abhängig von der Spezies. Zum Beispiel ist Nr. 102 im Falle von menschlichem BNP Arg, während es im Falle von Schweine- oder Hunde-BNP Aminosäure Nr. 100 ist.
  • Der Begriff „Säugetier-γ-BNP", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Pro-BNP, umfassend ein Teilpeptid von 32 Aminosäuren, welches dem carboxyterminalen Bereich von α-BNP entspricht. Im Falle von menschlichem γ-BNP ist es Pro-BNP aus 108 Aminosäuren von Nr. 27 His bis Nr. 143 His der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1. Der Begriff „Präpro-BNP" bezieht sich im Falle von Menschen auf ein Peptid aus 134 Aminosäuren von Nr. 1 Met bis Nr. 134 His der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1.
  • Der Begriff „Säugetier-γ-BNP-Derivat", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Peptidfragment, abgeleitet hauptsächlich von Säugetier-Präpro-BNP oder γ-BNP durch die in vivo Protease-Reaktion; dieses Fragment umfasst oder ist größer als α-BNP. Obwohl das γ-BNP-Derivat, verglichen mit γ-BNP im Allgemeinen, ein Molekül der gleichen oder kleineren Größe umfassen würde, kann es ein Molekül umfassen, das größer als γ-BNP ist. Wenn nicht ausdrücklich anders erwähnt, schließt der Begriff „γ-BNP-Derivat", wie hierin verwendet, γ-BNP selbst ein.
  • Der Begriff „stabil", wenn er hierin in Verbindung mit BNP verwendet wird, bedeutet, dass ein BNP-Molekül die C-terminale Ringstruktur einschließlich des C-Terminus von BNP und die natriuretische Aktivität nach Abbau durch eine Protease beibehält und dass diese Aktivität sogar 24 Stunden nach der Entnahme der Blutproben nicht wesentlich vermindert ist. Angesichts dieser Definition ist das γ-BNP-Derivat als die Zielsubstanz (Analyt) des vorliegenden Immuntests stabil.
  • Andererseits bedeutet der Begriff „instabil", dass eine BNP-Probe am C-terminalen Bereich Degeneration durch eine Protease erfährt und dass die natriuretische Aktivität 24 Stunden nach der Entnahme der Blutproben erheblich vermindert ist. Angesichts dieser Definition ist α-BNP instabil.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHUNGEN
  • 1 ist ein Chromatogramm, erhalten in einem α-BNP-Testsystem, wobei Gelfiltrations-HPLC unter Verwendung von Superdex 75 in einer Plasmaprobe durchgeführt wurde. In 1 bezeichnet A die Position der Elution von α-BNP.
  • 2 ist ein Chromatogramm, erhalten in einem α-BNP-Testsystem, wobei Gelfiltrations-HPLC unter Verwendung von Superdex 75 in einer Plasmaprobe durchgeführt wurde, die sich von der in 1 gezeigten unterscheidet. In 2 bezeichnet A die Position der Elution von α-BNP.
  • 3 ist ein Chromatogramm, erhalten in einem für γ-BNP spezifischen Immuntest, wobei Gelfiltrations-HPLC unter Verwendung von Superdex 75 in der gleichen wie jener in 2 gezeigten Plasmaprobe durchgeführt wurde. In 3 bezeichnet A die Position der Elution von α-BNP.
  • 4 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Lagerungszeit und der BNP-Immunreaktivität von γ-BNP zeigt, welches in menschlichem Plasma bei 25°C aufbewahrt wird.
  • 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Lagerungszeit und der BNP-Immunreaktivität von α-BNP zeigt, welches in menschlichem Plasma bei 4°C aufbewahrt wird.
  • BESTE METHODE ZUR DURCHFÜHRUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, welches zwei Antikörper verwendet, wobei der erste Antikörper mit Säugetier-α-BNP reaktiv ist und der zweite Antikörper mit Präpro-BNP oder mit γ-BNP-Derivaten und nicht mit α-BNP reaktiv ist.
  • Antikörper, die im vorliegenden Verfahren verwendet werden, können monoclonale oder polyclonale Antikörper sein. Der erste Antikörper kann gemäß einem im Fachgebiet bekannten Verfahren unter Verwendung von menschlichem α-BNP als Antigen, welches im Handel erhältlich oder chemisch synthetisiert ist, oder einem Teilpeptid davon hergestellt werden. Alternativ ist auch ein monoclonaler Antikörper verfügbar, welcher mit dem C-terminalen Bereich von α-BNP reaktiv ist, der einem im Handel erhältlichen α-BNP-Testsystem (Kit) zur Messung von α-BNP beigefügt ist („SHIONORIA", Shionogi).
  • Als der zweite Antikörper kann jeder Antikörper verwendet werden, vorausgesetzt dass er die vorstehenden Bedingungen erfüllt. Bevorzugte Beispiele eines solchen Antikörpers schließen jene ein, die für die Aminosäuresequenz, gezeigt durch die Aminosäurenummern 27–102 von SEQ ID NR: 1, oder Abbauzwischenprodukten davon spezifisch sind. Die γ-BNP-Derivate als ein zu messender Analyt des vorliegenden Verfahrens schließen im Fall von menschlichem BNP vorzugsweise zumindest die Teil-Aminosäuresequenz ein, gezeigt durch die Aminosäurenummern 27–134 von SEQ ID NO: 1. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird folglich vorzugsweise der Selektion eines Antigens zum Erhalt eines Antikörpers, der im Stande ist, die durch die Aminosäurenummern 27–102 gezeigte Aminosäuresequenz zu erkennen, besondere Beachtung geschenkt. Die Erzeugung eines solchen Antikörpers kann durch jedwede im Fachgebiet bekannte Verfahren durchgeführt werden. Das γ-BNP-Molekül kann theoretisch an Stellen, welche No. 47 (Arg), Nr. 53 (Lys) und Nr. 72 (Arg) in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1 entsprechen, durch Protease gespalten werden und ein Antikörper, welcher eine durch Aminosäurenummern 73–102 von SEQ ID NR: 1 gezeigte Aminosäuresequenz erkennt, kann daher als der zweite Antikörper verwendet werden.
  • Der Test der vorliegenden Erfindung kann entweder ein kompetitiver- oder ein Sandwichtest sein und ein zu verwendender Antikörper kann ein monoclonaler oder ein polyclonaler Antikörper sein.
  • Mindestens einer der ersten und zweiten Antikörper kann nachweisbar markiert oder auf einem festen Träger immobilisiert werden.
  • Das Verfahren zur Markierung oder Immobilisierung eines Antikörpers ist einem Fachmann bekannt. Beispiele von Markierungen schließen ohne Limitierung radioaktive Isotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen, lumineszierende Substanzen und Partikel ein. Die Markierung eines Antikörpers kann gemäß einem Verfahren durchgeführt werden, das einem Fachmann bekannt ist, zum Beispiel dem durch Kono et al. (Kaku-Igaku Gijutu, 13(1), 2, (1993)) beschriebenen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Kit für einen Immuntest bereit, der spezifisch für Säugetier-γ-BNP-Derivate ist, dadurch gekennzeichnet, dass er zwei Antikörper umfasst, wobei der erste Antikörper mit Säugetier-α-BNP reaktiv ist und der zweite Antikörper mit Säugetier-Präpro-BNP oder γ-BNP-Derivaten und nicht mit α-BNP reaktiv ist.
  • Der Kit, der vorliegenden Erfindung kann für kompetitive oder Sandwich-Tests sein und ein zu verwendender Antikörper kann ein monoclonaler oder ein polyclonaler Antikörper sein.
  • Mindestens einer der ersten und zweiten Antikörper kann mit einer nachweisbaren Markierung versehen oder auf einem festen Träger immobilisiert sein. Der Kit der vorliegenden Erfindung kann ferner Mittel zum Nachweis der Markierung enthalten. Beispiele von Markierungen schließen ohne Limitierung radioaktive Isotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen, lumineszierende Substanzen oder Partikel ein.
  • Die folgenden Beispiele und Testbeispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, ohne den Geltungsbereich davon einzuschränken.
  • Beispiel 1
  • Messung von γ-BNP-Derivaten durch Sandwich-IRMA
  • Überall in den folgenden Beispielen sind die verwendeten gebräuchlichen Reagenzien von besonderer Qualität, bereitgestellt durch Wako Pure Chemicals Industries, Ltd. oder Nacalai Tesque, Inc. Das Rinderserumalbumin (BSA) wurde von Sigma bezogen.
  • (1) Herstellung der Plasmaprobe
    • (1) Venöses Blut wurde von Patienten mit Herzerkrankung oder gesunden Freiwilligen in Blutentnahmeröhrchen abgenommen, welche EDTA und Aprotinin (500 KIU/l, Sigma) enthielten, das aus Rinderlunge stammte. Die Röhrchen wurden für 5 Minuten mit einer H-107RGA (Kokusan) zentrifugiert (x 2000 g bei 4°C), um Blutzellen abzutrennen. Die daraus resultierenden Plasmaproben wurden eingefroren und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
    • 2) Die vorstehend in 1) erzeugten Plasmaproben von Patienten mit Herzerkrankung oder gesunden Freiwilligen wurden durch das Gelfiltrations-HPLC-System LC10A (Shimadzu), ausgerüstet mit einer Superdex 75 10/30-Säule (Pharmacia), fraktioniert. Nach Äquilibrierung der Säule mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5, 0,3 M NaCl, 5 mM EDTA) bei einer Durchflussrate von 1 ml/min wurde 1 ml der Plasmaprobe injiziert und jeweils 1 ml des aus der Säule eluiertem Ausflusses wurde gesammelt. Jede Fraktion wurde, wie nachstehend in (2)-2) bzw. (2)-3) beschrieben, einer Messung durch Testsysteme zur Messung von α-BNP oder γ-BNP unterzogen.
  • (2) Konstruktion des Testsystems zur Messung von α-BNP oder γ-BNP-Derivat
    • 1) In dem Testsystem wurden die folgenden Peptide, Antikörper und Kits verwendet.
    • • Menschliches α-BNP (Peptide Institute)
    • • Antikörper gegen den aminoterminalen Bereich von γ-mBNP (Aminosäurenummern 27–64 von SEQ ID NO: 1) (Peptide Institute)
    • • Monoclonaler Antikörper gegen die carboxyterminale Struktur von α-BNP (BC203). BC203 ist ein immobiliserter Antikörper, der dem SIONORIA BNP-Kit (Shionogi) beigefügt ist, wobei ein monoclonaler Antikörper, der gegen die carboxyterminale Struktur von α-BNP gerichtet ist, auf Perlen immobilisiert ist.
    • • Monoclonaler Antikörper gegen die Ringstruktur von α-BNP (KYBNPII). KYBNPII ist ein monoclonaler Antikörper, welcher dem SIONORIA BNP-Kit (Shionogi) beigefügt ist und der gegen die Ringstruktur (112–128) von α-BNP gerichtet ist und mit 125I markiert ist.
  • 2) Messung der Plasmafraktion durch das Testsystem für α-BNP
  • Die Messung von α-BNP wurde durch den im Handel erhältlichen „SHIONORIA BNP-Kit" (Shionogi) durchgeführt. Der Test basiert auf einem Sandwich-IRMA (Immunoradiometrischer Test), der einen monoclonalen Antikörper KYBNPII verwendet, welcher für die Ringstruktur von α-BNP spezifisch ist, und einen anderen monoclonalen Antikörper BC203, welcher für die carboxyterminale Struktur von α-BNP spezifisch ist. Der Test wurde gemäß den Anweisungen des Lieferanten ausgeführt.
  • Das heißt jeweils 100 μl der zu testenden Proben oder Standardlösungen (0, 4, 10, 150, 600 oder 2000 pg/ml α-BNP-Lösung) wurden in ein Polystyrol-Teströhrchen gegeben. Zu dem Teströhrchen wurden 200 μl mit Jod markierter anti-BNP-Antikörper(125I)-Lösung hinzugefügt, gefolgt von einer Polystyrolperle, auf welcher anti-BC203-Antikörper immobilisiert worden war. Die Lösung wurde gerührt und durch Stehenlassen für 18 Stunden bei 4°C wurde eine Umsetzung ermöglicht. Nach zweimaligem Waschen mit 2 ml Waschlösung wurde die Radioaktivität auf einem ARC-600-γ-Counter (Aloka) gemessen.
  • Die Ergebnisse werden in den 1 und 2 gezeigt.
  • 3) Messung der Plasmafraktion durch das Testsystem für γ-BNP-Derivat
  • Ein Antikörper gegen den aminoterminalen Teil (Nummern 27–64) von γ-hBNP wurde zuerst mit 125I markiert.
  • IgG wurde unter Verwendung des MASPII-Kits (Bio-Rad) vom Antiserum (Peptide Institute) gereinigt, das gegen den aminoterminalen Teil (Aminosäurenummern 27–64 von SEQ ID NR: 1) von γ-mBNP erzeugt worden war, und mit 0,5 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5) unter Verwendung von Centricon 30 (Amicon) ersetzt. Die Markierung des Antikörpers wurde durch das Chloramin-T-Verfahren durchgeführt. In ein Glasröhrchen wurden 170 μl gereinigte IgG-Lösung (77,6 μg, IgG) dispensiert und 10 μl Na 125I-Lösung (34,2 MBq, Amersham) wurden hinzugefügt. Nach der Zugabe von 0,1% Chloramin-T-Lösung (20 μl) wurde das Gemisch bei Raumtemperatur für 30 Sekunden energisch gerührt. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 20 μl 0,25% Natrium-Pyrosulfitlösung und 20 μl 5% wässriger Kalium-Iodid-Lösung schnell beendet. Wenn das Reaktionsgemisch mit Ampure SA-Säule (Amersham) behandelt wurde, um nicht verbrauchtes 125I zu entfernen und zu entsalzen, wurde eine Lösung erhalten, die Antikörper markiert mit 125I enthielt.
  • Der Sandwich-IRMA wurde dann durch Verwendung des sich daraus ergebenden Antikörpers und Polystyrolperlen, auf welchen ein Antikörper gebunden war, der die carboxyterminale Struktur von α-BNP (BC203) erkannte, in Plasmafraktionen durchgeführt.
  • Je 100 μl der zu untersuchenden Proben wurden in ein Polystyrolröhrchen gegeben, gefolgt von 200 μl 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5, 0,3 M, 5 mM EDTA, 0,2% BSA und 500 KIU/l Rinderlungen-Aprotinin (Sigma)) und einer Polystyrolperle, auf welcher der BC203-Antikörper immobilisiert worden ist. Das Gemisch wurde gerührt und Umsetzung wurde durch Stehenlassen für 18 Stunden bei 4°C ermöglicht. Nach zweimaligem Waschen mit 2 ml Waschlösung wurden 300 μl mit 125I-markierte Antikörperlösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde gerührt und Umsetzung wurde durch Stehenlassen für 18 Stunden bei 4°C ermöglicht. Nach zweimaligem Waschen mit 2 ml Waschlösung wurde die Radioaktivität auf einem ARC-600-γ-Counter (Aloka) gemessen. Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt.
  • (3) Ergebnisse
  • 1, 2 und 3 zeigen die Chromatogramme der Gelfiltrations-HPLC von Plasmaproben, welche von Patienten erhalten wurden, wobei A die Position der Elution von α-BNP ist.
  • 1 zeigt die Ergebnisse von Messungen, die durch den in (2)-2) vorstehend beschriebenen α-BNP-Testkit durchgeführt wurden. In 1 stellt die vertikale Achse die Konzentration von BNP-ähnlichen Substanzen in jeder Fraktion dar und die horizontale Achse das Volumen des Ausflusses, der von der Säule eluiert wurde, wie durch den SHINORIA BNP-Kit gemessen. Das volle Dreieck, das leere Quadrat bzw. der leere Rhombus stellen die Messungen in den verschiedenen Plasmaproben dar.
  • 2 zeigt das Ergebnis der Messung, die durch den vorstehend in (2)-2) beschriebenen α-BNP-Testkit in Proben durchgeführt wurde, welche unterschiedlich von jenen in 1 gezeigten Proben sind. In 2 stellt die vertikale Achse die Konzentration von BNP-ähnlichen Substanzen in jeder Fraktion dar und die horizontale Achse das Volumen des Ausflusses, der von der Säule eluiert wurde, wie durch den SHINORIA BNP-Kit gemessen. Das volle Dreieck bzw. das volle Quadrat stellen die Messungen in verschiedenen Plasmaproben dar.
  • Von den 1 und 2 lässt sich erkennen, dass Substanzen mit einem größeren Molekulargewicht als α-BNP existieren und BNP-ähnliche Immunreaktivität im Plasma von Patienten mit Herzerkrankungen aufweisen und dass sie die Hauptsubstanzen sind, welche BNP-Immunreaktivität aufweisen.
  • 3 zeigt die Ergebnisse der Messung, die durch den vorstehend in (2)-3) beschriebenen γ-BNP-Testkit in den gleichen Proben wie jenen durchgeführt wurde, die in 2 gezeigt wurden. In 3 stellt die vertikale Achse die im γ-BNP-Immuntest-System gemessene Radioaktivität dar und die horizontale Achse das Volumen des Ausflusses, der von der Säule eluiert wurde. Der volle Kreis stellt die Messungen von α-BNP dar, welches nach Fraktionierung der menschlichen α-BNP-Lösung durch HPLC in ähnlicher Weise wie im Falle von Plasma beschrieben, erhalten wurde.
  • Von 3 lässt sich erkennen, dass für γ-BNP-Derivate spezifische Immuntest der vorliegenden Erfindung die Hauptsubstanzen mit BNP-Immunreaktivität erkennen kann, aber α-BNP überhaupt nicht.
  • Die vorstehenden Ergebnisse machen deutlich, dass der Immuntest der vorliegenden Erfindung für γ-BNP für α-BNP unempfindlich, aber für γ-BNP-Derivate spezifisch ist. Ferner wird auch deutlich gemacht, dass γ-BNP die Hauptsubstanz ist, welche BNP-Immunreaktivität aufweist.
  • Untersuchungsbeispiel 1
  • Stabilität der γ-BNP-Derivate und von α-BNP in Plasma
  • Fraktionen, von denen vermutet wurde, dass sie γ-BNP-Derivate enthalten, wurden von jenen gesammelt, die durch Behandlung von Plasmaproben, die von Patienten mit Herzerkrankung gesammelt wurden, erhalten wurden durch Gelfiltrations-HPLC. Venöses Blut wurde von gesunden Freiwilligen unter Verwendung von Blutentnahmeröhrchen, die EDTA enthielten, in der Abwesenheit von Rinderlungen-Aprotinin gesammelt. Plasmaproben (die minimale Nachweisgrenze von α-BNP < 4 pg/ml) wurden in einer ähnlichen Weise hergestellt, wie vorstehend in (1)-1) beschrieben. Der Plasmaprobe ließ man nach Hinzufügen der Fraktion für 0, 2, 6, 24 Stunden bei Raumtemperatur (25°C) stehen. Die Stabilität des BNP-Derivates wurde durch Bestimmung der BNP-Immunreaktivität in der Plasmaprobe mit Hilfe des SHIONORIA BNP-Kits zur Testung von α-BNP bewertet.
  • Die Stabilität von α-BNP wurde unter Verwendung einer Plasmaprobe, die durch Zugabe von chemisch synthetisiertem α-BNP zu von gesunden freiwilligen gesammeltem Plasma erhalten wurde, und Stehenlassen für 0, 2, 6 und 24 Stunden bei 4°C in der Abwesenheit von Rinderlungen-Aprotinin, wie vorstehend beschrieben, beurteilt. Die BNP-Immunreaktivität in der Plasmaprobe wurde in der gleichen Weise wie vorstehend durch den SHIONORIA BNP-Kit bestimmt.
  • Die Stabilität von γ-BNP-Derivaten und α-BNP in Plasmaproben wird in den 4 bzw. 5 gezeigt.
  • Von 4 wird deutlich, dass γ-BNP-Derivate die Immunreaktivität im Vergleich mit der anfänglichen Aktivität sogar nach 24-stündigem Stehen bei 25°C nicht wesentlich verlieren. Im Gegensatz dazu wird von 5 deutlich, dass α-BNP die Immunreaktivität bis auf etwa 40%, basierend auf der anfänglichen Aktivität, nach 24-stündigem Stehen bei 4°C verliert.
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass α-BNP verglichen mit γ-BNP-Derivat im Blut viel weniger stabil ist und dass das Letztere für die Diagnose von Herzerkrankungen viel geeigneter ist als das Erstere.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Wie vorstehend erwähnt, erhöht sich die BNP-Menge in Patienten mit Herzversagen manchmal um mehrere zehn- bis mehrere 100-mal im Vergleich mit dem von gesunden, normalen Testpersonen und die Veränderung von BNP in den Fällen von Herzversagen ist so ausgeprägt, dass keine anderen Hormone damit vergleichbar sind. Aus diesem Grund wurde die Nützlichkeit der BNP-Messung vorgeschlagen.
  • Der Immuntest der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, speziell γ-BNP-Derivate ohne Messung von α-BNP zu bestimmen. Demgemäß kann der vorliegende Immuntest ein klinisch bedeutungsvolles Mittel zur Diagnose und zur prognostischen Überwachung von Herzversagen sein, welches zu einem(r) Rückschluss/Beurteilung führt, die irgendwie unterschiedlich zu jenem/jener ist, der/die von einem herkömmlichen BNP-Test resultiert.
  • Ferner wird hierin zum ersten Mal offenbart, dass γ-BNP, welches eine zu untersuchende Zielsubstanz im vorliegenden Verfahren ist, im Blut stabil ist. Der Immuntest der vorliegenden Erfindung stellt daher stabile und zuverlässige klinische Daten bereit, ohne durch den Prozess der Entnahme oder Lagerung der Proben oder durch die Zeit von der Entnahme bis zur Messung beeinflusst zu sein. Ferner benötigt der Immuntest der vorliegenden Erfindung keine besonderen Vorbehandlungen der Blutprobe und ergibt daher bequem klinische Daten und trägt dadurch zur Etablierung einer höchst genauen Diagnose von Herzerkrankungen bei. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00140001
    Figure 00150001
    Figure 00160001

Claims (8)

  1. Immuntest, der spezifisch ist für Säugetier-γ-BNP-Derivate, dadurch gekennzeichnet, daß ein erster Antikörper, der mit Säugetier-α-BNP reaktiv ist, und ein zweiter Antikörper, der mit Säugetier-Präpro-BNP- oder γ-BNP-Derivaten und nicht α-BNP reaktiv ist, verwendet werden.
  2. Immuntest gemäß Anspruch 1, worin die γ-BNP-Derivate die durch die Aminosäuren der Nrn. 27-102 der SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen.
  3. Immuntest gemäß Anspruch 1, worin der zweite Antikörper spezifisch ist für die durch die Aminosäuren der Nrn. 27-102 der SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz.
  4. Immuntest gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin wenigstens einer der ersten und der zweiten Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung versehen oder immobilisiert ist.
  5. Immuntest gemäß einem Ansprüche 1 bis 3, worin die nachweisbare Markierung ein radioaktives Isotop, ein Enzym, eine fluoreszierende Substanz, eine lumineszente Substanz oder ein Partikel ist.
  6. Kit für einen Immuntest, der spezifisch ist für Säugetier-γ-BNP-Derivate, dadurch gekennzeichnet, daß ein erster Antikörper, der mit Säugetier-α-BNP reaktiv ist, und ein zweiter Antikörper, der mit Säugetier-Präpro-BNP- oder γ-BNP-Derivaten und nicht α-BNP reaktiv ist, verwendet werden.
  7. Kit gemäß Anspruch 6, worin wenigstens einer der erster und der zweiten Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung versehen oder immobilisiert ist.
  8. Kit gemäß Anspruch 7, der des weiteren ein Mittel zum Nachweis der Markierung umfaßt.
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