-
Die
vorliegende Erfindung befasst sich mit Untersuchungen (Kits und
analytischen Verfahren) zum Nachweis oder Monitoring von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern.
-
Hyperthyreose,
die mit der Basedowschen Erkrankung assoziiert ist, ist bekannterweise
auf Autoantikörper
gegen den Schilddrüsenrezeptor
für Schilddrüsen-stimulierendes
Hormon (TSH) zurückzuführen. Die Autoantikörper binden
an den Rezeptor und imitieren die Aktivität des natürlichen Liganden (TSH) und
veranlassen dadurch die Drüse,
große
Mengen an Schilddrüsenhormonen
zu produzieren (wie beschrieben in Endocrine Reviews 1988, Bd. 9,
Nr. 1, Seiten 106 bis 117).
-
Der
Nachweis oder das Monitoring von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern (TRAB)
ist wichtig für
die Diagnose und das Management der Basedowschen Erkrankung, wobei
derzeit zwei Arten von Untersuchungen verwendet werden, nämlich:
- (a) kompetitive Bindungsassays, welche die
Fähigkeit
von TRAb messen, die Bindung von 125I-markiertem TSH
an TSH-Rezeptorpräparationen
zu inhibieren; und
- (b) Bioassays, welche die Fähigkeit
von TRAb messen, Schilddrüsenzellen
(oder andere Zellen, die mit dem TSH-Rezeptorgen transfiziert sind)
in Kultur zu stimulieren.
-
Gegenwärtig sind
kompetitive Bindungsassays (Typ (a) oben) weiter verbreitet, weil
Bioassays vom in (b) oben genannten Typ teuer sind, zeitintensiv
sind, hochqualifiziertes Personal erfordern, und für die breite Verwendung
in der Routine ungeeignet sind. In gegenwärtigen kompetitiven Bindungsassays
werden Testserumproben (50 μl) üblicherweise
mit gereinigtem solubilisiertem TSH-Rezeptor vom Schwein (50 μl) inkubiert. In
den Testseren vorhandene TRAb binden während dieser Inkubation an
den TSH-Rezeptor. 125I-markiertes TSH wird anschließend zugesetzt
und die Inkubation fortgesetzt. Während dieser zweiten Inkubation
bindet das markierte TSH an TSH-Rezeptoren, die noch nicht von TRAb
belegt sind. Schließlich
wird das an den Rezeptor gebundene 125I-markierte
TSH vom freien markierten TSH durch Zugabe von Polyethylenglykol
(PEG) abgetrennt, welches das Rezeptor-gebundene TSH, jedoch nicht
das freie TSH präzipitiert.
Die Radioaktivität in
den Präzipitaten
(abgetrennt durch Zentrifugation) wird anschließend gezählt. In diesem Assay inhibiert
das TRAb in den Testproben die Bindung von markiertem TSH an den
TSH- Rezeptor, und
dies resultiert in einem Abfall der Radioaktivität in den Präzipitaten. Assayergebnisse
können
als ein Inhibitionsindex der Bindung von markiertem TSH oder durch
Verwendung eines Satzes an Assay-Eichgeräten angegeben werden.
-
Die
Hauptbeschränkungen
dieser konventionellen Assays lauten wie folgt:
- (a)
Der Assay misst die Kompetition zwischen markiertem TSH und dem
TSH-Rezeptor, kann allerdings nicht die TRAb nachweisen, die zwar
sehr gut an den Rezeptor binden, jedoch auf solche Weise, dass sie die
TSH-Bindung nicht sehr stark inhibieren.
- (b) Der Assay verwendet Polyethylenglykol, um Rezeptor-gebundenes
und freiem markiertes TSH zu separieren. Dies resultiert in Kopräzipitation
von allen Serumimmunglobulinen und der Bildung eines verhältnismäßig großen Pellets.
Obwohl das Pellet auf Radioaktivität gezählt werden kann, stellt es
keine geeignete Präparation
dar, um TSH (oder andere Proteine oder Peptide) nachzuweisen, welche
mit nicht-radioaktiven Substanzen wie Enzymen oder chemilumineszierenden
Materialien markiert sind. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Serumkomponenten
im Pellet mit solchen Prozessen wie Lichtemission interferieren.
Zusätzlich
erfordert die Verwendung von PEG-Präzipitation die Verwendung von
Zentrifugation, und dies ist ein zeitaufwändiges und lästiges Verfahren,
ungeeignet für
die Automatisierung.
-
EP 0719858 A2 beschreibt
die Identifizierung einer Myelom-Zelllinie für die Expression von rekombinantem
humanen TSH-Rezeptor und die Verwendung von solchem rekombinanten
TSH-Rezeptor in Assays und Kits. Allerdings enthält
EP 0719858 A2 keine Offenbarung
oder Andeutung der Verwendung eines Antikörpers, welcher an einen Bereich
des TSH-Rezeptors binden würde,
der nicht in die Autoantikörperbindung involviert
ist. Darüber
hinaus sind keine speziellen Präparationstechniken
für die
Präparation
eines solchen Antikörpers
offenbart.
-
Des
Weiteren offenbart WO95/06258 ein Verfahren zum Bestimmen eines
Analyten in einem Volumen einer flüssigen Probe und insbesondere
zum Bestimmen von Anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern in einem Patientenserum.
WO95/06258 offenbart die Verwendung eines Antikörpers gegen eine Substanz,
der den TSH-Rezeptor eher bindet als ein Antikörper gegen den TSH-Rezeptor
selbst.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Kits für Untersuchungen
auf TRAb nach dem oben genannten kompetitiven Bindungstyp. Die Erfindung
betrifft ebenso Verfahren und Kits für TRAb-Assays des direkten
Bindungstyps, in denen eine direkte Interaktion zwischen dem Rezeptor
und TRAb verwendet wird.
-
Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren zum Durchmustern einer Probe einer Körperflüssigkeit auf Autoantikörper gegen
den Rezeptor für
Schilddrüsen-stimulierendes
Hormon (TSH) bereitgestellt, welche mit demselben Teil des TSH-Rezeptors
interagieren wie TSH, das
- (a) Bereitstellen
einer Quelle für
den TSH-Rezeptor;
- (b) Inkubieren des TSH-Rezeptors mit einer Probe einer Körperflüssigkeit,
um ein Inkubationsgemisch bereitzustellen;
- (c) qualitatives oder quantitatives Bestimmen von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern im
Inkubationgemisch von (b), die an den TSH-Rezeptor gebunden sind;
dadurch
gekennzeichnet, dass in dem Verfahren weiterhin mindestens ein Antikörper gegen
den TSH-Rezeptor oder ein Fragment dieses Antikörpers eingesetzt wird, welcher
den TSH-Rezeptor
an einer Stelle bindet, die verschieden von dem Teil des Rezeptors
ist, der TSH und TSH-Rezeptor-Autoantikörper bindet, wobei dieser mindestens
eine Antikörper
gegen den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers mit
dem TSH-Rezeptor von (a) in Kontakt gebracht wird und damit interagiert,
um entweder (i) den TSH-Rezeptor an einer festen Phase zu immobilisieren
und wobei der resultierende TSH-Rezeptor, der durch diesen mindestens einen
Antikörper
gegen den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers immobilisiert
wird, gleichzeitig TSH oder TSH-Rezeptor-Autoantikörper binden
kann, oder um (ii) Mittel zum Markieren des TSH-Rezeptors bereitzustellen
und wobei der resultierende TSH-Rezeptor, der durch diesen mindestens
einen Antikörper gegen
den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers markiert wird, gleichzeitig
TSH oder TSH-Rezeptor-Autoantikörper
binden kann.
-
Gemäß einer
bevorzugten Besonderheit der vorliegenden Erfindung umfasst die
Probe einer Körperflüssigkeit
Blut, Plasma oder Serum.
-
Die
Erfindung umfasst die Verwendung von Antikörpern, um einen TSH-Rezeptor
zu markieren oder zu immobilisieren, wobei der immobilisierte oder
markierte TSH-Rezeptor derart, dass er seine Fähigkeit, TSH und/oder TRAb
zu binden, beibehält.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft vorzugsweise die Verwendung eines
monoklonalen (oder polyklonalen) Antikörpers gegen den TSH-Rezeptor,
der von dem Rezeptor an einer Stelle stark gebunden wird, welche sich
von dem Teil des Rezeptors unterscheidet, der TSH und TRAB bindet.
Der Antikörper
kann gleichzeitig mit TSH oder TRAb stark an den Rezeptor binden
und kann verwendet werden, um viele der Beschränkungen der gegenwärtigen TRAb-Assayverfahren zu
mindern.
-
In
einer ersten Ausführungsform
der Erfindung kann der Antikörper
unter Verwendung von Standardverfahren an einer festen Phase (wie
einem Plastikröhrchen
oder einer Plastikplatte oder magnetischen oder nicht-magnetischen
Partikeln) immobilisiert werden. Diese feste Phase kann anschließend anstelle
von PEG verwendet werden, um markiertes TSH, das an den TSH-Rezeptor
gebunden ist, von freiem markiertem TSH abzutrennen. Das TSH (oder
gleichartige Liganden) kann mit isotopischen oder nicht-isotopischen
Markierungen markiert werden.
-
Für diese
Ausführungsform
existieren verschiedene Anwendungen, für welche Nachfolgendes schematische
Beispiele darstellt:
- (i)
- (ii)
- (iii) In obigem (i) und (iii) kann der Rezeptor Ab indirekt
an die feste Phase gebunden werden. Beispielsweise kann der Antikörper biotinyliert
und mit der festen Phase zur Reaktion gebracht werden, die Avidin
oder Streptavidin enthält.
- (a)
- (b)
-
In
einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform
kann der Antikörper
direkt mit einem Isotop wie 125I oder mit
einer nicht-isotopischen Markierung wie einem Enzym, Farbstoff oder
einer chemilumineszierenden Verbindung markiert werden. Alternativ
kann der Antikörper
unter Verwendung von beispielsweise dem Avidin-Biotin-System indirekt
markiert werden. Der markierte Antikörper kann anschließend verwendet
werden, um den TSH-Rezeptor selbst zu markieren, und dieser Komplex
aus Rezeptor und Antikörper
kann anschließend
verwendet werden, um TRAb (entweder qualitativ oder quantitativ)
nachzuweisen und/oder zu kontrollieren.
-
Beispiele
dieses Ansatzes sind wie folgt schematisch beschrieben:
-
In
diesem System werden ansteigende Mengen von TRAb in einer Probe
zu zunehmenden Mengen markierten Antikörpers im finalen Komplex führen.
- (ii) Dieses Beispiel hängt ab von der Kopplung von
TSH (oder einem ähnlichen
Liganden) direkt oder indirekt an einen Feste-Phase (⎕-TSH)-Rezeptor,
markiert mit dem Antikörper
(der selbst mit einer isotopischen oder nicht-isotopischen Markierung
markiert ist), welcher an dieses immobilisierte TSH (oder einen ähnlichen
Liganden) binden kann. Diese Bindung wird durch TRAb, wie nachstehend
illustriert, inhibiert werden:
-
Die
vorstehend mit Bezug auf die ersten und zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsformen
beschriebenen Schemen veranschaulichen bestimmte Vorteile der vorliegenden
Erfindung. Der immobilisierte Antikörper kann verwendet werden,
um den TSH-Rezeptor in einer Weise zu markieren oder zu immobilisieren,
dass der Rezeptor seine Fähigkeit,
TSH und/oder TRAb zu binden, beibehält. Alternativ kann der immobilisierte
Antikörper
zum Kontrollieren von TRAb (oder anderer Liganden, die mit dem TSH-Rezeptor
interagieren) in Patientenseren verwendet werden, oder zur Reinigung
des TSH-Rezeptors.
-
Die
Fähigkeit,
den TSH-Rezeptor unter Verwendung des Antikörpers zu markieren, erlaubt
insbesondere das Kontrollieren der direkten Interaktion von TRAb
mit dem TSH-Rezeptor wie in der vorstehend beschriebenen zweiten
erfindungsgemäßen Ausführungsform.
Ferner erlaubt die vorliegende Erfindung die Immobilisierung des
Rezeptors vor, während
oder nach der Interaktion mit TSH und TRAb. Diese Fähigkeit,
den Rezeptor zu immobilisieren, kann verwendet werden, um neue TRAb-Assays
zu entwerfen, die nicht von PEG und/oder isotopischen Markierungen
abhängen.
Solche Assays können
geeignet sein für
Automatisierungs- und immunchromatographische Systeme.
-
Der
TSH-Rezeptor (TSHR) ist in sehr geringer Anzahl auf der Oberfläche von
Thyreozyten vorhanden (etwa 103 Rezeptoren
pro Zelle), was die Reinigung des Rezeptors aus nativen Quellen
sehr schwierig gestaltet hat (wie beschrieben in "Bailliere's Clinical Endocrinology
and Metabolism",
1997, Bd. II, Seiten 451 bis 474 – Sanders).
-
Im
Gegensatz dazu kann rekombinanter TSHR in Säugerzellen (zum Beispiel in
Ovarzellen Chinesischer Hamster (CHO)-Zellen) in sehr viel größeren Mengen
von etwa 105–106 Rezeptoren
pro Zelle exprimiert werden (Sanders). Zudem sind rekombinante TSHR-Präparationen,
die in Nicht-Schilddrüsenzellen
produziert werden, nicht mit anderen Schilddrüsen-Autoantigenen wie Thyreoglobulin
oder Schilddrüsenperoxidase
kontaminiert (Springer Seminars in Immunopathology, 1993, Seiten
309–318 – Furmaniak).
-
Rekombinante
TSHR-Präparationen,
die in Säugerzellen
produziert wurden, sind die einzigen, die TSH- und TRAb-Bindungscharakteristika
zeigen, welche denen der nativen Rezeptoren ähnlich sind. Solche Bindungscharakteristika
werden nicht produziert zum Beispiel in Hefe, Insektenzellen oder
Bakterien. Dies ist auf die sehr komplexe Beziehung zwischen der
TSHR-Struktur und den TSH/TRAb-Bindungsstellen zurückzuführen. Die
posttranslationale Prozessierung von TSHR und die Faltung des "reifen" Proteins wird am
besten in der Säugerzellumgebung
erreicht (siehe Sanders).
-
Reinigung
von großen
Mengen rekombinanten TSHRs aus Säugetierzellen
mit seinen intakten TSH- und TRAb-Bindungsaktivitäten wurde
nicht berichtet. Eines der Hauptprobleme ist der Verlust der TSH/TRAb-Bindungsaktivität im Anschluss
an die Bindung mit Mausmonoklonalen Antikörpern, die mit dem extrazellulären Teil
von TSHR interagieren (Sanders). Außerdem war zu diesem Zeitpunkt
die Entwicklung von neuen und geeigneten Strategien zur Routinemessung
von TRAb nicht erfolgreich.
-
Bevorzugte
Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden illustriert durch
die nachfolgenden, jedoch keinesfalls einschränkend zu verstehenden, detaillierten
und durchgeführten
Beispiele.
-
BEISPIELE
-
1. Klonieren von Schweine-TSHR-cDNA
-
RNA
wurde extrahiert aus Schweine-Schilddrüsengewebe unter Anwendung der
Guanidin-Thiozyanat-Phenol-Chloroform-Methode
(Chromczynski und Sacchi, Anal. Biochem. Bd. 162, 1987, Seiten 156
bis 159). mRNA wurde aus Gesamt-RNA unter Verwendung eines Dynal
bead mRNA-Reinigungskits (Dynal, Wirral L62 SAZ UK) gereinigt. Diese
mRNA wurde benutzt, um unter Verwendung des ZapExpress cDNA Gigapack
Kloning Kit III (Stratagene Ltd., Cambridge, CB4 4DF UK) eine cDNA-Bibliothek
zu erstellen. Vier degenerierte Oligonukleotide wurden für die bekannten
TSHR-Sequenzen erzeugt (Maus, Ratte, Mensch, Hund und Rind) sowie
zwei Fragmente des unter Verwendung von PCR amplifizierten Schweine-TSHR.
Diese wurden sequenziert, um ihre Homologie mit TSHR-cDNA zu verifizieren
und verwendet, um die cDNA-Bibliothek auf full-length Schweine-TSHR-Klone zu screenen.
Drei full-length Klone wurden erhalten und vollständig sequenziert.
-
2. Expression des rekombinanten
TSHR-Proteins aus Schwein in CHO-Zellen
-
Ein
ATG-Startkodon im 5'-untranslatierten
Bereich (5'UTR)
der "full-length" pTSHR-cDNA wurde
durch PCR entfernt und die cDNA in pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen BV,
9351 NV Leek, Niederlande) kloniert. DNA, die für den "full-length" TSHR kodiert, wurde durch Elektroporation
in CHO-Zellen (CHO-KI von ECACC, Porton Down SP4 OJG UK) transfiziert.
TSHR-exprimierende Klone wurden unter Verwendung von 125I-TSH-Bindung direkt
auf den Zellen, die auf 24-Well-Platten wuchsen, nachgewiesen. Die
Klone, welche die stärkste TSH-Bindung
zeigten, wurden expandiert und zweimal durch limitierende Verdünnung rekloniert.
Eine stabile Zelle, die etwa 4 × 105 TSHR pro Zelle exprimierte, wurde zur Expansion
und Herstellung von rekombinantem TSHR ausgewählt.
-
3. Präparation von in Detergens solubilisiertem
rekombinantem Schweine-TSHR
-
TSHR-exprimierende
CHO-Zellen wurden bis zur Konfluenz kultiviert, von den Rollflaschen
abgelöst und
die Zellpellets mit eiskaltem 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,
enthaltend 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), gewaschen, anschließend im
gleichen Puffer homogenisiert. Die Zellmembranen wurden nach Zentrifugation
bei 12000 g für
30 Min. bei 4°C
im gleichen Puffer (4 ml Puffer für etwa 4 × 108 Zellen),
wie er für
die Homogenisierung verwendet wurde, mit Ausnahme des Zusatzes von
1% Triton X-100. Die solubilisierten Rezeptorpräparationen wurden bei 90000
g für zwei
Stunden bei 4°C
zentrifugiert und der Überstand bei –70°C gelagert.
-
4. Expression des C-terminalen
Endes des Schweine-TSHR-Proteins
-
Die
Expression in Escherichia coli als Fusionsprotein mit Glutathion
S-Transferase (GST) wurde unter Verwendung von Standardprotokollen
durchgeführt
(wie beschrieben im Journal of Molecoular Endocrinology (1998),
Bd. 20, Seiten 233–244 – Oda).
Das für
die letzten 160 Aminosäuren
kodierende 3'-Ende
der cDNA (1809 bis 2295 bp) wurde "in-frame" mit dem GST-Fusionsprotein in den pGEX2T-Vektor
kloniert (Pharmacia Biotech, St. Albans AL1 3AW UK). Eine Übernacht-Kultur
von E. coli (Stamm UT580), die mit pGEX-2T/TSHR-Plasmiden transformiert wurde, wurde
1:5 verdünnt
in 2 × YTG-Medium
(16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 20 g Glucose pro Liter,
pH 7,0) und für
3 Stunden bei 30°C
inkubiert. Daran anschließend
wurde Isopropyl-3-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) zugesetzt in einer
finalen Konzentration von 1 mM, um die Proteinexpression zu induzieren,
gefolgt von einer Inkubation für
weitere drei Stunden. Die Bakterienpellets wurden in PBS resuspendiert
(8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 und 0,24 g KH2PO4 pro Liter, pH 7,4), enthaltend 1% Triton
X-100, und wurden dreimal für
eine Minute auf Eis sonifiziert. Die Einschlusskörperchen (engl. Orig.: inclusion
bodies) wurden pelletiert, in 4 M Harnstoff gewaschen, in 8 M Harnstoff
solubilisiert und auf 9%igen Polyacrylamidgelen (SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese,
SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Die TSHR/GST-Fusionsproteine
(Molekulargewicht 44 kDa) wurden aus den Polyacrylamidgelstücken in
0,1 M NaHCO3 und 0,1% SDS pH 7,8 elektroeluiert,
gegen 50 mM Tris-HCl pH 8,0 dialysiert und in Aliquots bei –70°C gelagert.
-
5. Präparation und Reinigung von
monoklonalen Antikörpern
gegen Schweine-TSHR
-
Elektroeluiertes
TSHR/GST-Protein wurde verwendet, um BALB C-Mäuse zu immunisieren (50 μg pro Maus
je Injektion), bis der Titer der Antikörper gegen TSHR hoch war. Der
TSHR-Antikörperspiegel
in den Mausseren wurde getestet unter Verwendung eines Immunopräzipitationsassays,
der auf 35S-markiertem TSHR basierte, welches
in einem in vitro Transkriptions-/Translationssystem hergestellt
wurde (siehe das im Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism,
Bd. 82 (1997), Nr. 4, auf den Seiten 1288–1292 – Prentice beschriebene Verfahren).
-
Maus-Milzzellen
wurden fusioniert mit der Maus-Myelom-Zelllinie (X63-Ag8.653 von
ECACC) und unter Verwendung von Standardtechniken (Oda) kloniert,
um stabile, TSHR-Antikörper-sekretierende
Hybridomas zu produzieren. Für
den Antikörper
4E31 wurde gezeigt, dass er im Immunopräzipitationsassay 35S-TSHR präzipitiert
und in Western Blot Analysen sehr gut mit dem TSHR reagiert.
-
4E31
wurde durch Chromatographie über
eine Prosep-A-Säule
(Bioprocessing, Consett DH8 6TJ UK) aus Hybridomakulturüberständen gereinigt.
Fab2-Fragmente wurden im Anschluss an Verdau
mit Pepsin (Pepsinkonzentration von 1 mg/ml in 70 mM Natriumazetat,
50 mM NaCl pH 4,0, Verhältnis
IgG zu Enzym von 5:1) und Chromatographie über Prosep A, um intaktes IgG
zu adsorbieren, erhalten. 4E31-Fab2-Präparationen
von etwa 1 mg/ml wurden in Aliquots bei –70°C gelagert.
-
6. TSH-Rezeptor-Bindungscharakteristika
des 4E31-Antikörpers
-
Solubilisierter
rekombinanter Schweine-TSH-Rezeptor wurde mit
125I-markiertem
TSH inkubiert, um einen
125I-markierten
TSH-TSH-Rezeptorkomplex zu bilden. Das 4E31-IgG (oder Kontroll-IgG)
wurde immobilisiert, indem es an magnetische Latex-Beads gebunden
wurde und diese Beads (100 μl;
1 μg von
4E31) wurden inkubiert mit dem zuvor gebildeten
125I-markierten
TSH-TSH-Rezeptorkomplex (100 μl).
Nach 1 Std. bei 37°C
wurden die Beads mit einem Magneten abgetrennt, gewaschen und auf
125I gezählt.
Eine Probe des
125I-markierten TSH-TSH-Rezeptorkomplexes
wurde mit PEG präzipitiert,
um die Menge des vorhandenen freiem markierten TSH zu bestimmen.
Tabelle 1 zeigt die erzielten Ergebnisse: Tabelle
1
- (Als Kontroll-IgG wurde ein Maus-monoklonaler
Antikörper
gegen Glutaminsäuredecarboxylase
verwendet)
-
Diese
Untersuchungen zeigen deutlich, dass 4E31 gleichzeitig mit TSH an
den TSH-Rezeptor binden kann. Ferner kann 4E31, das an einen festen
Träger
gebunden ist, verwendet werden, um, mit Ergebnissen ähnlich wie
denjenigen, die mit PEG erzeugt werden, das an den TSH-Rezeptor gebundene
TSH von freiem TSH abzutrennen.
-
Tabelle
2 zeigt, dass in Anwesenheit einzelner gesunder Blutspenderseren
etwa 55% des zugesetzten markierten TSH an mit 4E31 und rekombinantem
Schweine-TSH-Rezeptor beschichtete Röhrchen band (gemäß der ersten
erfindungsgemäßen Ausführungsform,
Schema ii oben). Ähnliche
Bindung wurde im Falle der Seren von Patienten mit Hashimotos Schilddrüsenentzündung sowie
von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) beobachtet.
Dennoch zeigten die Seren der 5 Patienten mit Basedowscher Erkrankung merklich
weniger Bindung von markiertem TSH (etwa 35%). Alle 5 Seren beinhalteten
leicht detektierbare Mengen des TSH-Rezeptor-Autoantikörpers, wie
bei der Inhibierung von TSH-Bindung
an nativen Schweine-TSH-Rezeptor und bei Separation von Rezeptor-gebundenem
und freiem TSH mit PEG festgestellt. Tabelle
2 Bindung von markiertem TSH an Plastikröhrchen, beschichtet mit 4E31
(Fab)
2 und anschließend mit rekombinantem TSH-Rezeptor
aus Schwein – Effekt
verschiedener Seren
-
Tabelle
3 zeigt ähnliche
Ergebnisse mit Röhrchen,
die mit nativem (d. h. nichtrekombinantem) Schweine-TSH-Rezeptor
via 4E31 beschichtet waren. Abermals sind die Ergebnisse, die mit
dem Assay mit beschichteten Röhrchen
erzielt wurden, ähnlich
den mit dem PEG-Separationsverfahren erzielten. Tabelle
3 Bindung von markiertem TSH an Plastikröhrchen, beschichtet mit 4E31
(Fab)
2 und anschließend mit TSH-Rezeptor aus Schwein,
solubilisiert mit nativem Detergens
-
Der
in den Tabellen 2 und 3 gezeigte inhibierende Effekt auf
125I-TSH-Bindung war abhängig von der TRAb-Konzentration
im Serum. Wie in Tabelle 4 gezeigt, übten zunehmende Mengen von
TRAb-Standardpräparation
(Schilddrüsen-stimulierender
Antikörper
1. Internationaler Standard 90/672) einen Dosis-abhängigen Effekt
auf die Inhibierung der TSH-Bindung aus. Tabelle
4
-
Direkte Präzipitation
von 125I-4E31 Fab2-TSH-Komplexen
-
Ein
weiteres Beispiel der Erfindung (gemäß der zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform,
Schema (i) oben ist ein Assay, in dem 4E31 (Fab)
2 mit
125I markiert und mit dem TSH-Rezeptor zur
Reaktion gebracht wurde. Dieser Komplex wird anschließend mit
den in Patientenseren vorhandenen TSH-Rezeptor-Autoantikörpern inkubiert
und der daraus resultierende termolekulare Komplex durch Zugabe
des Feste-Phase-Proteins A präzipitiert.
Ein Beispiel ist in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle
5 Reaktion zwischen rekombinantem Schweine-TSH-Rezeptor, markiert
mit
125I-4E31
(Fab)
2 und TSH-Rezeptor-Autoantikörpern
-
Basedow-Seren
18 und 19 ergaben im PEG-Präzipitationsverfahren
unter Verwendung von nativem Schweine-TSH-Rezeptor TSH-Bindungs-Inhibitionswerte
von 31% beziehungsweise 73%.
-
4E31
kann mit Biotin markiert, an Streptavidin-beschichtete Röhrchen gebunden
und anschließend
mit Schweine-TSH-Rezeptor zur Reaktion gebracht werden – siehe
die erste erfindungsgemäße Ausführungsform,
Schema (iii) b. Rezeptor, der auf diese Weise immobilisiert wurde,
band
125I-markiertes TSH leicht und diese
Bindung wurde durch die in Patientenseren vorhandenen TSH-Rezeptor-Autoantikörper inhibiert.
Ein Beispiel ist in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle
6 Bindung von markiertem TSH an TSH-Rezeptor, gebunden an Streptavidinbeschichtete
Röhrchen via
biotinylierte 4E31 (Fab)
2 und Effekte von
TRAB.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die ausschließlich exemplarischen
Figuren illustriert.
-
1 illustriert
die Korrelation zwischen Ergebnissen unter Verwendung eines Verfahrens
zur Kontrolle von Autoantikörpern
gegen den Rezeptor für
Schilddrüsen-stimulierendes
Hormon unter Verwendung von TRAb-beschichteten Röhrchen und eines ein PEG-Präzipitationsassays
verwendendes Verfahrens, wobei beide Verfahren 125I-markiertes
bovines TSH verwenden. Ferner sind Ergebnisse in verschiedenen Patientengruppen
gezeigt, die mit dem Verfahren erzielt wurden, welches TRAb-beschichtete
Röhrchen
verwendet.
-
2 illustriert
Ergebnisse eines ELISA-Verfahrens, unter Verwendung von TSH-Rezeptorbeschichteten
Platten; 2a zeigt den Effekt von TRAb-Standard 90/672 auf Schweine-TSH-Bindung gegen Rezeptor-beschichtete
Platten; 2b zeigt einen Vergleich eines ELISA-Verfahrens und eines PEG-Präzipitationsassays;
und Ergebnisse in verschiedenen Patientengruppen, die mit einem
TRAb-ELISA-Verfahren unter Verwendung von bovinem TSH erzielt wurden,
sind in 2c dargestellt.
-
3 illustriert
die Korrelation zwischen einem üblicherweise
verwendeten TRAb-Assayverfahren
und einem erfindungsgemäßen direkten
Präzipitationsassayverfahren.
Ferner sind Ergebnisse in verschiedenen Patientengruppen mit einem
direkten TRAb-Assay gezeigt.