ES2270601T3 - Ensayos para anticuerpos del receptor de tsh. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para seleccionar una muestra de fluido corporal respecto de los autoanticuerpos del receptor de la hormona estimuladora del tiroides (TSH), que interactúa con la misma parte del receptor de la TSH que la TSH, cuyo procedimiento comprende: (a) proporcionar una fuente del receptor de la TSH; (b) incubar el receptor de la TSH con una muestra de fluido corporal con el fin de proporcionar una mezcla de incubación: (c) detectar de manera cualitativa o cuantitativa los autoanticuerpos del receptor de la TSH enlazados con dicho receptor de la TSH en dicha mezcla de incubación de (b); Caracterizado porque en dicho procedimiento se emplea de manera adicional al menos un anticuerpo del receptor de la TSH, o fragmento de dicho anticuerpo, que enlaza dicho receptor de la TSH en un emplazamiento distinto de la parte del receptor que enlaza la TSH y los autoanticuerpos del receptor de la TSH, en el que dicho al menos un anticuerpo del receptor de la TSH, o fragmento de dicho anticuerpo, se pone en contacto con dicho receptor de la TSH de (a) e interactúa con el mismo de tal manera que o bien (i) inmoviliza dicho receptor de la TSH en una fase sólida por lo cual el receptor de la TSH resultante inmovilizado por dicho al menos un anticuerpo en el receptor de la TSH, o fragmento de dicho anticuerpo, puede enlazar de manera concurrente la TSH o los autoanticuerpos del receptor de la TSH, o (ii) proporcionar medios de marcado para dicho receptor de la TSH por lo cual el receptor de la TSH resultante marcado por dicho al menos un anticuerpo en el receptor de la TSH o fragmento de dicho anticuerpo puede enlazar de manera concurrente la TSH o los autoanticuerpos del receptor de la TSH.
Description
Ensayos para anticuerpos del receptor de
TSH.
Esta invención tiene que ver con los ensayos
(kits y procedimientos analíticos) para detectar o monitorizar los
Autoanticuerpos del Receptor de la TSH.
Se sabe que el hipertiroidismo que se asocia con
la enfermedad de Graves se debe a los autoanticuerpos del receptor
tiroideo respecto de la hormona estimuladora del tiroides (TSH). Los
autoanticuerpos se enlazan con el receptor y mimetizan las acciones
del ligando natural (TSH), haciendo por tanto que la glándula
produzca altos niveles de hormonas tiroideas (tal como se describe
en Endocrine Reviews 1988, Vol 9, Nº 1, páginas 106 a 117).
La detección o monitorización de los
autoanticuerpos del receptor de la TSH (TRAb) es importante en la
diagnosis y gestión de la enfermedad de Graves, y se usan
actualmente dos tipos de ensayos, a saber:
- (a)
- los ensayos de enlace competitivo, que miden la capacidad de los TRAb para inhibir el enlace de la TSH marcada con ^{125}I en las preparaciones del receptor de la TSH; y
- (b)
- los bioensayos, que miden la capacidad de los TRAb para estimular las células del tiroides (u otras células transfectadas con el gen del receptor de la TSH) en el cultivo.
En la actualidad, se usan de manera más amplia
los ensayos de enlace competitivo (tipo (a) más arriba) debido a
que los bioensayos del tipo mencionado en (b) más arriba son caros,
consumen tiempo, requieren un personal muy especializado y no son
adecuados para un uso rutinario amplio. En los ensayos de enlace
competitivo actuales, se incuban por lo general muestras del suero
de ensayo (50 \mul) con receptor de la TSH porcina solubilizado
con detergente (50 \mul). Los TRAb presentes en el suero de ensayo
se enlazan con el receptor de la TSH durante esta incubación. A
continuación, se añade la TSH marcada con ^{125}I y la incubación
continúa. Durante esta segunda incubación, la TSH marcada se enlaza
con los receptores de la TSH que no estén ya ocupados por los TRAb.
Finalmente, la TSH marcada con ^{125}I enlazada con el receptor se
separa de la TSH marcada libre mediante la adición de polietilén
glicol (PEG), que precipita la TSH enlazada con el receptor pero no
la TSH libre. A continuación se cuenta la radioactividad del
precipitado (separado por centrifugación). En el ensayo, los TRAb de
las muestras de ensayo inhiben el enlace de la TSH marcada con el
receptor de la TSH, y esto da como resultado una disminución de la
radioactividad en el precipitado. Se pueden expresar los resultados
del ensayo en forma de un índice de inhibición del enlace de la TSH
marcada o mediante el uso de un conjunto de calibradores de
ensayo.
Las principales limitaciones de este ensayo
convencional son las que siguen:
- (a)
- las medidas del ensayo de competición entre la TSH marcada y el receptor de la TSH pueden no detectar los TRAb que se enlazan bien con el receptor pero en una manera que no inhiba fuertemente el enlace con la TSH.
- (b)
- El ensayo usa polietilén glicol para separar el receptor enlazado y la TSH marcada libre. Esto da como resultado la coprecipitación de todas las inmunoglobulinas del suero y la formación de un residuo relativamente grande. Aunque se pueda medir la radioactividad del residuo, esta no es una preparación adecuada para detectar la TSH (u otras proteínas o péptidos) marcada con sustancias no radioactivas tales como enzimas o materiales quimioluminiscentes. Esto es debido a que los componentes del suero en el residuo interfieren con procesos tales como los de emisión de luz. De manera adicional, el uso de la precipitación PEG necesita del uso de la centrifugación y este es un procedimiento incómodo y que consume tiempo inadecuado para la automatización.
El Documento EP 0719858A2 describe la
identificación de una línea de células de mieloma que expresan el
receptor de la TSH humana recombinante y para el uso de dicho
receptor de TSH recombinante en los ensayos y kits. No existe, sin
embargo descripción o sugerencia en el Documento EP 0719858A2 del
uso de un anticuerpo que enlazaría con una región del receptor de
la TSH no implicada en el enlace del autoanticuerpo. Además, no se
describen técnicas preparatorias específicas para la preparación de
dicho anticuerpo.
De manera adicional, el Documento WO 95/06258,
describe un procedimiento para determinar un analito en un volumen
de muestra de fluido, y en concreto para determinar los
autoanticuerpos del receptor de la anti TSH en un suero de
paciente. El Documento WO 95/06258 describe el uso de un anticuerpo
respecto de una sustancia que se enlaza con el receptor de la TSH
en lugar de un anticuerpo respecto del propio receptor de la
TSH.
La presente invención tiene que ver con los
procedimientos y kits para los ensayos de los TRAb del tipo de
enlace competitivo mencionado más arriba. La invención tiene que ver
también con los procedimientos y kits para los ensayos de los TRAb
del tipo de enlace directo, en los que se usa una interacción
directa entre el receptor y los TRAb.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un procedimiento para seleccionar una muestra de fluido
corporal respecto de los autoanticuerpos del receptor de la hormona
estimuladora del tiroides (TSH) que interactúan con la misma parte
del receptor de la TSH que la TSH, dicho procedimiento
comprende:
- (a)
- proporcionar una fuente del receptor de la TSH;
- (b)
- incubar el receptor de la TSH con una muestra de fluido corporal con el fin de proporcionar una mezcla de incubación;
- (c)
- detectar de manera cualitativa o cuantitativa los autoanticuerpos del receptor de la TSH enlazados con dicho receptor de la TSH en dicha mezcla de incubación de (b);
caracterizado en que se emplea de
manera adicional en dicho procedimiento al menos un anticuerpo para
el receptor de la TSH, o fragmento de dicho anticuerpo, que enlaza
dicho receptor de la TSH en un emplazamiento diferente de la parte
del receptor que enlaza la TSH y los autoanticuerpos del receptor de
la TSH, en el que al menos dicho un anticuerpo respecto del
receptor de la TSH, o fragmento de dicho anticuerpo, se pone en
contacto con dicho receptor de la TSH de (a) e interactúa con el
mismo de tal manera que o bien (i) inmoviliza dicho receptor de la
TSH en una fase sólida y por lo cual el receptor de la TSH
resultante inmovilizado por dicho al menos un anticuerpo respecto
del receptor de la TSH, o fragmento de dicho anticuerpo, puede
enlazar de manera concurrente la TSH o los autoanticuerpos del
receptor de la TSH, o bien (ii) proporciona medios de marcado para
dicho receptor de la TSH y por lo cual el receptor de la TSH
resultante marcado por dicho al menos un anticuerpo respecto del
receptor de la TSH o fragmento de dicho anticuerpo puede enlazar de
manera concurrente la TSH o los autoanticuerpos del receptor de la
TSH.
De acuerdo con una característica preferida de
la presente invención, la muestra de fluido corporal comprende
sangre, plasma o suero.
La invención comprende el uso de anticuerpos con
el fin de marcar o inmovilizar un receptor de la TSH, quedando el
receptor de la TSH inmovilizado o marcado de manera que retenga su
capacidad para enlazar la TSH y/o los TRAb.
La presente invención tiene que ver de manera
preferible con el uso de un anticuerpo monoclonal (o policlonal)
respecto del receptor de la TSH, que se enlaza fuertemente con el
receptor en un emplazamiento distinto de la parte del receptor que
enlaza la TSH y los TRAb. El anticuerpo se puede enlazar
fuertemente con el receptor en el mismo momento que la TSH o los
TRAb, y se puede usar para aliviar muchas de las limitaciones del
procedimiento de ensayo actual de los TRAb.
En una primera forma de realización de la
invención, se puede inmovilizar el anticuerpo en una fase sólida
(tal como un tubo de plástico o placa de plástico, o partículas
magnéticas o no magnéticas) usando procedimientos estándar. A
continuación se puede usar esta fase sólida en vez del PEG para
separar la TSH marcada enlazada con el receptor de la TSH de la
TSH marcada libre. Se puede marcar la TSH (o ligando similar) con
marcas isotópicas o no isotópicas.
Existen diversas aplicaciones de esta primera
forma de realización, de la cual los siguientes son ejemplos
esquemáticos:
\vskip1.000000\baselineskip
- (iii)
- En (i) e (ii) anteriores, se puede enlazar el receptor Ab de manera indirecta con la fase sólida, se puede biotinilar el Ab y hacerlo reaccionar con la fase sólida que contiene avidita o estreptavidina:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En una segunda forma de realización de la
invención, se puede marcar el anticuerpo de manera directa con una
marca isotópica tal como ^{125}I, o con una marca no isotópica tal
como un enzima, tinte, o compuesto quimioluminiscente. De manera
alternativa, se puede marcar el anticuerpo de manera indirecta
usando, por ejemplo, el sistema avidina-biotina. Se
puede usar a continuación el anticuerpo marcado para marcar el
propio receptor de la TSH, y se puede usar este complejo del
receptor y el anticuerpo para detectar y/o monitorizar los TRAb
(bien de manera cualitativa o cuantitativa).
Se describen de manera esquemática tal como
sigue los ejemplos de esta hipótesis:
En este sistema, el incremento de las cantidades
de los TRAb en una muestra de ensayo dará como resultado un aumento
de las cantidades de Ab marcada en el complejo final.
(ii) Este ejemplo depende del acoplamiento
de la TSH (o ligando similar) directa o indirectamente a un
receptor en fase sólida (\square-TSH) marcado con
el anticuerpo (que está él mismo marcado con una marca isotópica o
no isotópica), que se puede enlazar con esta TSH inmovilizada (o
ligando similar). Este enlace se inhibirá por los TRAb, tal como se
ilustra a continuación:
Los esquemas descritos más arriba con referencia
a la primera y segunda formas de realización de la invención
ilustran algunas de las ventajas de la presente invención. Se puede
usar el anticuerpo inmovilizado para marcar o inmovilizar el
receptor de la TSH de manera tal que el receptor retenga su
capacidad para enlazar la TSH y/o los TRAb. De manera alternativa,
se puede usar el anticuerpo inmovilizado para la monitorización de
los TRAb (u otros ligandos que interactúan con el receptor de la
TSH) en el suero del paciente, o para la purificación del receptor
de la TSH.
De manera particular, la capacidad para marcar
el receptor de la TSH usando el anticuerpo permite la monitorización
de la interacción directa de los TRAb con el receptor de la TSH,
como en la segunda forma de realización descrita más arriba. Además,
la presente invención permite la inmovilización del receptor antes,
durante o después de la interacción con la TSH y los TRAb. Se puede
usar esta capacidad para inmovilizar el receptor para crear nuevos
ensayos de los TRAb que no dependan del PEG y/o de las marcas
isotópicas. Dichos ensayos pueden ser adecuados para la
automatización y los sistemas inmunocromatográficos.
El receptor de la TSH (TSHR) está presente en
muy bajas cantidades sobre la superficie de los tirocitos
(aproximadamente 10^{3} por célula), lo que ha hecho que el
receptor sea muy difícil de purificar a partir de fuentes nativas
(tal como se describe en "Baillière's Clinical Endocrinology and
Metabolism", 1997, Vol II, páginas 451 a 474 - Sanders).
Por contra, se puede expresar la TSHR
recombinante en células de mamíferos (por ejemplo, en células de
ovario de hámster Chino (CHO) a niveles mucho mayores de
aproximadamente 10^{5} - 10^{6} receptores por célula (Sanders).
De manera adicional, las preparaciones de TSHR recombinante
producidas en células no tiroideas no están contaminadas con otros
autoantígenos tiroideos tales como tiroglobulina o peroxidasa
tiroidea (Springer Seminars in Immunopathology, 1993, páginas
309-318 - Furmaniak).
Las preparaciones de TSHR recombinante
producidas en células de mamíferos son las únicas que muestran
características de enlace entre la TSH y los TRAb similares a las
de los receptores nativos. Dichas características de enlace no se
producen, por ejemplo, en levaduras, células de insectos o
bacterias. Esto es debido a una relación muy compleja entre la
estructura de los TSHR y los emplazamientos de enlace de TSH/TRAb.
Se consigue mejor el procesamiento post-traducción
de los TSHR y el plegado de la proteína "madura" en el ambiente
de una célula de mamífero (véase Sanders).
No se ha informado de la purificación de grandes
cantidades de TSHR recombinante de células de mamíferos con sus
actividades de enlace de la TSH y los TRAb intactas. Uno de los
problemas principales es la pérdida de actividad del enlace TSH
/TRAb que sigue al enlace con anticuerpos monoclonales de ratón que
interactúan con la parte extracelular de los TSHR (Sanders).
También, hasta la fecha, no ha sido satisfactorio el desarrollo de
estrategias nuevas y convenientes para la medida rutinaria de los
TRAb.
Se ilustran mediante los siguientes ejemplos de
trabajo detallado no limitantes las características preferidas de la
presente invención.
Se extrajo ARN de tejido de tiroides porcino
usando el procedimiento del tiocianato de guanidina - fenol
cloroformo (Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem. Vol 162. 1987,
páginas 156 a 159). Se purificó el ARNm a partir del ARN total
usando un kit de purificación de ARNm con perlas Dynal (Dynal,
Wirral L62 SAZ UK). Se usó este ARNm para fabricar una biblioteca
de ADNc usando el ZapExpress cDNA Gigapack Cloning Kit III
(Stratagene Ltd., Cambridge CB4 4DF UK). Se produjeron cuatro
oligonucleótidos degenerados para las secuencias de TSHR conocidas
(ratón, rata, humana, perro y bovina) y se amplificaron dos
fragmentos de TSHR porcino usando PCR. Se secuenciaron estos para
verificar su homología con el ADNc de TSHR y se usaron para
seleccionar la biblioteca de ADNc para los clones de TSHR porcino
de longitud completa. Se obtuvieron tres clones de longitud completa
y se secuenciaron completamente.
Se eliminó un codón de inicio ATG en la región
5' no traducida (5'UTR) del ADNc del pTSHR de longitud completa
mediante la PCR, y se clonó el ADNc en ADNpc 3.1 (+) (Invitrogen BV,
9351 NV Leek, Países Bajos). Se transfectó el ADN que codifica el
TSHR de longitud completa en las células CHO (CHO-KI
de ECACC, Porton Down SP4 OJG UK) mediante electroporación. Se
detectaron los clones que expresaban TSHR usando el enlace
^{125}I-TSH de manera directa en células que
crecen en placas de 24 pocillos. Los clones que mostraron el enlace
de la TSH más alto se expandieron y se volvieron a clonar dos veces
mediante dilución limitante. Se escogió para la expansión y
producción del TSHR recombinante una línea de células estable que
expresaba aproximadamente 4 x 10^{5} TSHR por célula.
Se hicieron crecer células CHO que expresaban
TSHR hasta confluencia, se despegaron de botellas cilíndricas y el
residuo celular se lavó con tampón NaCl 50 mM,
TRIS-HCl 10 mM pH 7,5 que contenía
fenilmetilsulfonilfluor (PMSF), enfriado en hielo, y a continuación
se homogeneizó en el mismo tampón. Se solubilizaron las membranas
celulares tras la centrifugación a 12.000 g durante 30 min a 4ºC en
el mismo tampón (4 ml de tampón para aproximadamente 4 x 10^{8}
células) tal como se usaron para la homogeneización excepto por la
adición de Triton X-100 al 1%. Se centrifugaron las
preparaciones del receptor solubilizado a 90.000 g durante dos
horas a 4ºC y se almacenó el sobrenadante a -70ºC.
Se llevó a cabo la expresión en Escherichia
coli en forma de una proteína de fusión con la glutatión
S-transferasa (GST) usando protocolos estándar (tal
como se describe en el Journal of Molecular Endocrinology (1988) Vol
20, páginas 233-244 - Oda). Se clonó en marco el
extremo 3' del ADNc (1809 a 2295 bp) que codificaba los últimos 160
aminoácidos con la proteína de fusión GST en el vector pGEX2T
(Pharmacia Biotech, St. Albans ALI 3AW UK). Un cultivo de toda la
noche de E. coli (cepa UT580) transformado con los plásmidos
pGEX-2T/TSHR se diluyó 1/5 en medio YTG (16 g de
tristona, 10 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 20 g de glucosa
por litro, pH 7,0), y se incubó durante h a 30ºC. Después de eso,
se añadió
isopropil-3-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) hasta una concentración final de 1 mM con el fin de inducir
la expresión de la proteína, seguido por la incubación durante tres
horas más. Se volvieron a suspender los residuos bacterianos en PBS
(8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na_{2}HPO_{4} y 0,24 g de
KH_{2}PO_{4} por litro, pH 7,4) que contenía Triton
X-100 al 1% y se sonicaron tres veces durante un
minuto en hielo. Se trituraron los cuerpos de inclusión, se lavaron
en urea 4 M, se solubilizaron en urea 8 M y se separaron en geles de
poliacrilamida al 9% (electroforesis
SDS-poliacrilamida, SDS-PAGE) en
condiciones reductoras. Se electrocoeluyeron las proteínas de fusión
TSHR/GST (mol. Peso 44 kDA) en placas de gel de poliacrilamida en
NaHCO_{3} 0,1 M y SDS al 0,1% pH 7,8, se dializaron frente a
Tris-HCl 50 mM pH 8,0 y se almacenaron en alícuotas
a -70ºC.
Se usó la proteína de TSHR/GST electroeluida
para inmunizar ratones BALB C (50 \mug por ratón por inyección)
hasta que el título del anticuerpo en el TSHR fue alto. Se ensayó el
nivel de anticuerpo del TSHR en los sueros de ratón usando el ensayo
de inmunoprecipitación basado en el TSHR marcado con ^{35}S
producido en un sistema transcripción/traducción in vitro
(véase el procedimiento descrito en el Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism, Vol 82 (1997) Nº 4, páginas
1288-1292 - Prentice). Se fusionaron las células de
bazo de ratón con la línea de células de mieloma de ratón
(X63-Ag8.653 de ECACC) y se clonaron usando técnicas
estándar (Oda) para producir hibridomas estables que segregaban el
anticuerpo de TSHR. Se encontró que el anticuerpo 4E31 precipitaba
^{35}S-TSHR en el ensayo de inmunoprecipitación y
reaccionaba bien con el TSHR en los análisis western blotting. Se
purificó el 4E31 de los sobrenadantes del cultivo de hibridoma
mediante cromatografía en una columna Prosep-A
(Bioprocessing, Consett DH8 6TJ UK). Se obtuvieron los fragmentos
Fab_{2} tras digestión con pepsina (concentración de pepsina de 1
mg/ml en acetato de sodio 70 mM, NaCl 50 mM pH 4,0, relación IgG a
enzima de 5:1) y cromatografía sobre Prosep A para adsorber la IgG
intacta. Se almacenaron en alícuotas de aproximadamente 1 mg/ml a
-70ºC las preparaciones de 4E31 Fab_{2}.
Se incubó el receptor de la TSH porcina
recombinante solubilizada con TSH marcada con ^{125}I para formar
un complejo TSH marcada con ^{125}I - receptor de la TSH. Se
inmovilizó la IgG 4E31 (o IgG control) por enlace de ésta con
perlas de látex magnético, y se incubaron estas perlas (100 \mul;
1 \mug de 4E31) con el complejo TSH marcada con ^{125}I -
receptor de la TSH preformado (100 \mul). Tras 1 h a 37ºC, se
separaron las perlas con un imán, se lavaron y se contaron respecto
de ^{125}I. Se precipitó una muestra del complejo receptor de la
TSH marcado con ^{125}I - receptor de la TSH con PEG para
determinar la cantidad de TSH marcada libre presente. La Tabla 1
muestra los resultados obtenidos:
| Muestra | cpm enlazado con perlas | |
| Perlas de IgG 4E31 más: | ||
| \hskip0,1cm (a) complejo TSH marcada- receptor de la TSH | 16.374 | |
| \hskip0,1cm (b) únicamente TSH marcada | 2.118 | |
| Perlas de IgG control más complejo TSH marcada- receptor de TSH | 2.433 | |
| Complejo TSH marcada-receptor de TSH precipitado mediante PEG | 16.499 | |
| Cpm total en 100 \mul de complejo marcado | 37.073 | |
| La IgG control usada fue un anticuerpo monoclonal de ratón para la ácido glutámico decarboxilasa). |
Estos estudios indican claramente que 4E31 se
podría enlazar con el receptor de la TSH en el mismo momento que la
TSH. De manera adicional, se podría usar 4E31 acoplado con un
soporte sólido para separar el enlace de la TSH con el receptor de
la TSH de la TSH libre con resultados similares a aquellos obtenidos
con PEG.
La Tabla 2 muestra que, en presencia de suero de
un individuo donador humano sano, aproximadamente un 55% de la TSH
marcada añadida se enlaza con los tubos recubiertos con 4E31 y el
receptor de la TSH porcina recombinante (de acuerdo con la primera
forma de realización de la invención, esquema ii más arriba), Se
observó un enlace similar en el caso de suero de pacientes con
tiroiditis de Hashimoto y pacientes con lupus eritematoso sistémico
(SLE). Sin embargo, con suero procedente de 5 pacientes con
enfermedad de Graves fue acentuadamente menos marcado el enlace con
la TSH (aproximadamente un 35%). Los 5 sueros contenían cantidades
fácilmente detectables del autoanticuerpo del receptor de la TSH
tal como se juzgó por la inhibición del enlace de la TSH con el
receptor de la TSH porcina nativa y la separación del enlace del
receptor y la TSH libre con PEG.
La Tabla 3 muestra resultados similares con
tubos recubiertos con receptor de la TSH porcina nativa (es decir,
no recombinante) mediante 4E31. De nuevo, los resultados obtenidos
con el ensayo del tubo recubierto son similares a aquellos
obtenidos con el procedimiento de separación mediante PEG.
El efecto inhibidor sobre el enlace
^{125}I-TSH que se muestra en las tablas 2 y 3 fue
dependiente de la concentración de los TRAb en el suero. Tal como
se muestra en la Tabla 4, el aumento de las cantidades de los TRAb
de la preparación estándar (anticuerpo estimulador del tiroides 1ª
Internacional Estándar 90/672) tuvo un efecto dependiente de la
dosis sobre la inhibición del enlace con la TSH.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro ejemplo de la invención (de acuerdo con la
segunda forma de realización de la invención, esquema (i) más
arriba es un ensayo en el que se marca 4E31 (Fab)_{2} con
^{125}I y se hace reaccionar con el receptor de la TSH. A
continuación se incuba este complejo con los autoanticuerpos del
receptor de la TSH en el suero de paciente y se hace precipitar el
complejo termolecular resultante mediante la adición de proteína A
en fase sólida. Se muestra en la Tabla 5 un ejemplo.
Los sueros de Graves 18 y 19 proporcionan los
valores de inhibición del enlace con la TSH del 31% y el 73% de
manera respectiva en el procedimiento de precipitación mediante PEG
usando el receptor de la TSH porcina nativa.
Se podría marcar 4E31 con biotina, que enlaza
los tubos recubiertos con estreptavidina y a continuación se hace
reaccionar con el receptor de la TSH porcina - véase la primera
forma de realización de la invención, Esquema (iii) b. El receptor
inmovilizado por este medio enlaza fácilmente con la TSH marcada con
^{125}I y este enlace se inhibe mediante los autoanticuerpos del
receptor de la TSH en el suero del paciente. Se muestra en la Tabla
6 un ejemplo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ilustrará ahora la presente invención con
referencia a las siguientes figuras que están sólo por motivos de
ejemplo.
La Figura 1 ilustra la correlación entre los
resultados que usan un procedimiento para monitorizar los
autoanticuerpos del receptor de la hormona estimuladora del
tiroides que emplea los tubos recubiertos con TRAb, y un
procedimiento que usa los ensayos de precipitación mediante PEG,
empleando en ambos procedimientos TSH bovina marcada con ^{125}I.
Además, se muestran los resultados en diferentes grupos de pacientes
usando el procedimiento de los tubos recubiertos con TRAb.
La Figura 2 ilustra los resultados de un
procedimiento ELISA que usa placas recubiertas con el receptor de
la TSH; 2a muestra el efecto del TRAb estándar 90/672 en el enlace
de la TSH porcina con las placas recubiertas con el receptor; 2b
muestra una comparación entre un procedimiento ELISA y un ensayo de
precipitación mediante PEG; y se muestran los resultados en
diferentes grupos de pacientes con un procedimiento ELISA de los
TRAb usando TSH bovina.
La Figura 3 ilustra la correlación entre un
procedimiento de ensayo de los TRAb usado de manera convencional y
un procedimiento de ensayo mediante precipitación directa de acuerdo
con la invención. Además, se muestran los resultados en diferentes
grupos de pacientes con un ensayo directo de los TRAb.
Claims (10)
1. Un procedimiento para seleccionar
una muestra de fluido corporal respecto de los autoanticuerpos del
receptor de la hormona estimuladora del tiroides (TSH), que
interactúa con la misma parte del receptor de la TSH que la TSH,
cuyo procedimiento comprende:
- (a)
- proporcionar una fuente del receptor de la TSH;
- (b)
- incubar el receptor de la TSH con una muestra de fluido corporal con el fin de proporcionar una mezcla de incubación:
- (c)
- detectar de manera cualitativa o cuantitativa los autoanticuerpos del receptor de la TSH enlazados con dicho receptor de la TSH en dicha mezcla de incubación de (b);
Caracterizado porque en dicho
procedimiento se emplea de manera adicional al menos un anticuerpo
del receptor de la TSH, o fragmento de dicho anticuerpo, que enlaza
dicho receptor de la TSH en un emplazamiento distinto de la parte
del receptor que enlaza la TSH y los autoanticuerpos del receptor de
la TSH, en el que dicho al menos un anticuerpo del receptor de la
TSH, o fragmento de dicho anticuerpo, se pone en contacto con dicho
receptor de la TSH de (a) e interactúa con el mismo de tal manera
que o bien (i) inmoviliza dicho receptor de la TSH en una fase
sólida por lo cual el receptor de la TSH resultante inmovilizado por
dicho al menos un anticuerpo en el receptor de la TSH, o fragmento
de dicho anticuerpo, puede enlazar de manera concurrente la TSH o
los autoanticuerpos del receptor de la TSH, o (ii) proporcionar
medios de marcado para dicho receptor de la TSH por lo cual el
receptor de la TSH resultante marcado por dicho al menos un
anticuerpo en el receptor de la TSH o fragmento de dicho anticuerpo
puede enlazar de manera concurrente la TSH o los autoanticuerpos del
receptor de la TSH.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho al menos un anticuerpo del
receptor de la TSH es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del
mismo.
3. Un procedimiento de acuerdo con
las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho al menos un anticuerpo
respecto del receptor de la TSH, o fragmento de dicho anticuerpo, se
inmoviliza en una fase sólida.
4. Un procedimiento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en el que se marca dicho
al menos un anticuerpo respecto del receptor de la TSH, o fragmento
de dicho anticuerpo.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que la etapa (c) comprende añadir un
reactivo de IgG anti-humana a dicha mezcla de
incubación obtenida de manera adicional de la etapa (b).
6. Un procedimiento de acuerdo con
las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha mezcla de incubación
comprende de manera adicional la TSH.
7. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que dicha TSH está marcada.
8. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que se inmoviliza dicha TSH en una fase
sólida.
9. Un procedimiento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que se pone en
contacto dicha TSH con dicho receptor de la TSH tras el contacto de
dicho receptor de la TSH con dicho al menos un anticuerpo del
receptor de la TSH o fragmento de dicho anticuerpo.
10. Un procedimiento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que se pone en
contacto dicha TSH con dicho receptor de la TSH antes del contacto
de dicho receptor de la TSH con dicho al menos un anticuerpo del
receptor de la TSH o un fragmento de dicho anticuerpo.
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