ES2345569T3 - Peptido aptamero para neutralizar la union de anticuerpos especificos a antigenos plaquetarios y aplicaciones terapeuticas y de diagnostico que lo contienen. - Google Patents
Peptido aptamero para neutralizar la union de anticuerpos especificos a antigenos plaquetarios y aplicaciones terapeuticas y de diagnostico que lo contienen. Download PDFInfo
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Abstract
Péptido aptámero que comprende: A.al menos un dodecapéptido que tiene en la dirección N-terminal a C-terminal una secuencia de: i.cuatro aminoácidos alifáticos seleccionados de entre el grupo consistente en valina, isoleucina, leucina, alanina y glicina, ii.dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo consistente en ácido aspártico y ácido glutámico, iii.una prolina, iv.un aminoácido básico seleccionado de entre el grupo consistente en arginina y lisina, v.dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo consistente en ácido aspártico y ácido glutámico, vi.un alcohol aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en treonina y serina, y vii.un aminoácido aromático seleccionado de entre el grupo consistente en triptófano, tirosina y fenilalanina; B.al menos un polipéptido, y opcionalmente C.uno o más marcador(es) detectable(s).
Description
Péptido aptámero para neutralizar la unión de
anticuerpos específicos a antígenos plaquetarios y aplicaciones
terapéuticas y de diagnóstico que lo contienen.
La presente invención se refiere a un péptido
aptámero que reproduce en particular el epítopo del antígeno
plaquetario humano HPA-1a presente en las moléculas
GPIIb/IIIa plaquetarias y que es capaz de neutralizar la unión de
anticuerpos específicos del HPA-1a
(anti-HPA-1a). Este péptido aptámero
se utiliza ventajosamente en un método para detectar e identificar
anticuerpos específicos de HPA-1a en suero humano,
en un kit de diagnóstico para explorar e identificar anticuerpos,
en un inmunoensayo y en una composición farmacéutica.
Las plaquetas son uno de los componentes
principales de la sangre humana y son los componentes celulares del
sistema de coagulación sanguínea. La sangre está compuesta
básicamente de plasma, glóbulos rojos (eritrocitos), glóbulos
blancos (leucocitos) y plaquetas (trombocitos). Las plaquetas se
producen en la médula ósea por los megacariocitos. Se entiende
comúnmente que las plaquetas no son realmente verdaderas células,
sino que son fragmentos de membrana y citoplasma que contienen
gránulos. De forma más específica, las plaquetas comprenden una
membrana exterior y el citoplasma procedente de megacariocitos, que
a su vez contienen gránulos, cuerpos densos, un sistema tubular
denso y mitocondrias.
Además de las glicoproteínas plaquetarias
GPIIb/IIIa, GPIa/IX, GPIa/IIa o GPIV, las plaquetas contienen al
menos cinco glicoproteínas que están ligadas por anclajes glicosil
fosfatidil inositol (GPI). Entre ellos se encuentra una
glicoproteína de 170 kDa clasificada como CD109. CD 109 se
caracteriza por portar, entre otros, el aloantígeno Gov.
La trombocitopenia inmune es un estado clínico
en el que las plaquetas son destruidas por anticuerpos. La púrpura
trombocitopénica idiopática (ITP) es un trastorno común
caracterizado por la destrucción plaquetaria autoinmune causada por
los autoanticuerpos antiplaquetarios IgG, que se dirigen contra las
glicoproteínas plaquetarias GPIIb/IIIa, GPIa/IX, GPIa/IIa o GPIV.
La trombocitopenia fetal/neonatal aloinmune (NAIT) se debe a los
aloanticuerpos (anti-HPA) contra el aloantígeno
plaquetario materno humano (HPA) que destruyen las plaquetas
fetales, provocando una trombocitopenia grave. La NAIT tiene una
incidencia estimada de 1/1.000 embarazos y causa derrames
cerebrales en el útero o ventriculomegalia. La exploración y la
identificación de aloanticuerpos es un paso obligatorio para
prevenir y curar esta enfermedad. La púrpura
post-transfusión (PTP) es otra destrucción
plaquetaria inmunomediada debida a los aloanticuerpos
anti-HPA. La refractariedad plaquetaria es una
situación clínica en la que las plaquetas transfundidas son
destruidas por aloanticuerpos producidos por el receptor. La
caracterización de estos anticuerpos es un paso necesario para
proporcionar una transfusión de plaquetas eficaz.
Hasta ahora, todos los métodos para detectar
auto- o alo-anticuerpos dirigidos a plaquetas
utilizan plaquetas frescas en ensayos de inmunoblotting,
inmunoprecipitación, inmunocaptura, inmunofluorescencia plaquetaria
o inmovilización con anticuerpos monoclonales de antígenos
plaquetarios, tales como el ensayo de inmovilización con
anticuerpos monoclonales plaquetario (MAIPA) o el ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Todos estos ensayos
requieren previamente una colección de plaquetas tipificadas en los
sistemas HPA. Además, estos ensayos conocidos en la técnica
utilizan plaquetas frescas, tal como se ha señalado anteriormente.
Sin embargo, durante su conservación a 4ºC o -20ºC, las
glicoproteínas plaquetarias experimentan un proceso de
desprendimiento, de forma que la preparación plaquetaria es
inapropiada para detectar ciertos anticuerpos plaquetarios. Todos
los intentos para mantener un nivel normal de expresión de las
glicoproteínas plaquetarias durante un período más largo de tiempo,
tal como más de una semana, no han tenido éxito. Debido a estos
hechos, es necesario reunir un nuevo lote de plaquetas de los
donantes cada semana. Por tanto, existe la necesidad constante en
el campo de la inmunología plaquetaria de un método para mantener un
nivel normal de expresión de glicoproteínas plaquetarias durante un
largo período de tiempo (por ejemplo, más de un mes).
La WO9411740 describe fragmentos de
HPA-1a, GPIIb/IIIa y su utilización en la detección
de anticuerpos específicos de HPA-1a.
Por tanto, el problema técnico subyacente en la
presente invención consiste en proporcionar un nuevo sistema que
permita la detección y/o identificación de anticuerpos específicos
del antígeno plaquetario humano en suero humano. En particular, la
presente invención debe proporcionar (i) un aptámero que conserve la
expresión de su epítopo de los aloantígenos plaquetarios presentes
en las glicoproteínas plaquetarias -es decir el nivel normal y
preferentemente también el modelo normal- de forma estable bajo
almacenamiento, (ii) un proceso para producir dichos aptámeros
estables, y (iii) aplicaciones analíticas, especialmente
inmunológicas, de dichos aptámeros estables.
La solución al problema técnico anterior se
consigue por medio de las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
En particular, se proporciona un péptido
aptámero que comprende:
- A.
- al menos un dodecapéptido que tiene en la dirección N-terminal a C-terminal una secuencia de:
- i.
- cuatro aminoácidos alifáticos seleccionados de entre el grupo consistente en valina, isoleucina, leucina, alanina y glicina,
- ii.
- dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo consistente en ácido aspártico y ácido glutámico,
- iii.
- una prolina,
- iv.
- un aminoácido básico seleccionado de entre el grupo consistente en arginina y lisina,
- v.
- dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo consistente en ácido aspártico y ácido glutámico,
- vi.
- un alcohol aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en treonina y serina, y
- vii.
- un aminoácido aromático seleccionado de entre el grupo consistente en triptófano, tirosina y fenilalanina;
- B.
- al menos un polipéptido, y opcionalmente
- C.
- uno o más marcador(es) detectable(s).
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El término "péptido aptámero" tal como se
emplea aquí también incluye todo compuesto tal como se ha definido
más arriba, donde el dodecapéptido funciona como un hapteno. Además,
el péptido aptámero de acuerdo con la presente invención es capaz
de reproducir un epítopo de HPA-1a presente en las
glicoproteínas plaquetarias GPIIb/IIIa.
De acuerdo con la presente invención, el término
"dodecapéptido" incluye cualquier dodecapéptido que tenga una
secuencia de aminoácidos tal como se ha definido anteriormente o
como se explica en las Figuras 1a y 1b. En particular, el
dodecapéptido puede estar unido a uno o más polipéptidos por
cualquier modo de unión, por ejemplo enlace(s)
covalente(s), puente de hidrógeno, enlaces de
van-der-Waals o
electrostático(s). En una realización preferente de la
presente invención, el dodecapéptido está enlazado al polipéptido de
forma covalente.
En una realización de la presente invención, el
péptido aptámero tal como se ha definido anteriormente comprende un
dodecapéptido que tiene la secuencia VVAGDDPREDTW (SEQ ID NO:1).
Además, aquí, el término "polipéptido" no
es limitativo con respecto a la longitud o el tipo de secuencia,
sino que incluye cualquier secuencia de aminoácidos, tal como
secuencias de proteínas andamio o proteínas de fusión. De acuerdo
con la presente invención, dicho(s) polipéptido(s) se
puede(n) utilizar también en la presente invención en forma
de sus fragmentos y puede(n) contener cualquier residuo
procedente de su preparación, tales como las etiquetas empleadas
para la detección o en cualquier etapa de purificación.
El(los) polipéptido(s) de acuerdo con la presente
invención también incluye(n) dicho(s)
polipéptido(s) con alteraciones procedentes del contacto con
un entorno biológico, tal como glicolisación, adhesión de ácidos
nucleicos o cualquier otra modificación química.
En otra realización de la presente invención, el
péptido aptámero tal como se ha definido anteriormente comprende un
polipéptido seleccionado de entre el grupo consistente en
tiorredoxina (Trx), proteína fluorescente verde (GFP), nucleasa de
estafilococo, polipéptidos de espiral enrollada y polipéptidos que
contienen cisteína capaces de formar puentes disulfuro.
El(los) polipéptido(s) de acuerdo
con la presente invención puede(n) funcionar como soporte
inerte, como proteína andamio útil para presentar el dodecapéptido
al anticuerpo, como ayudante de la purificación útil para purificar
el péptido aptámero o como medio de detección útil para la detección
del péptido aptámero.
De acuerdo con la presente invención,
el(los) dodecapéptido(s) definido(s)
anteriormente se puede(n) unir en cualquier posición
del(de los) polipéptido(s). Por ejemplo,
el(los) dodecapéptido(s) se puede(n) unir al
N-terminal o al C-terminal
del(de los) polipéptido(s) o se puede(n)
incorporar dentro del polipéptido, lo que resulta en dos fragmentos
que flanquean el N- y C-terminal de dicho
dodecapéptido. También es posible que el péptido aptámero de
acuerdo con la presente invención contenga dos o más dodecapéptidos
que se pueden unir al mismo o a distintos emplazamientos de
dicho(s) polipéptido(s) o a fragmentos del(de
los) mismo(s). En otra realización de la presente invención,
el péptido aptámero contiene dos o más dodecapéptidos unidos entre
sí directamente o a través de un espaciador peptídico.
El término "marcador detectable" tal como
se emplea aquí no se limita a un tipo especial de marcador de
detección, tal como un marcador de detección bioquímico, sino que
incluye cualquier residuo conocido en la técnica que sea adecuado
para la detección.
En una realización de la presente invención, el
péptido aptámero tal como se ha definido anteriormente, comprende
un marcador detectable seleccionado de entre el grupo consistente en
un marcador fluorescente, un marcador radioactivo,
His-tag, glutatión transferasa (GST),
Flag-tag, biotina, Ha-tag,
Myc-tag y XPress-tag.
Tal como se emplea aquí, el término "antígeno
1a plaquetario humano de tiorredoxina"
(Trx-HPA-1a) se refiere a una
realización preferente de la presente invención, donde el péptido
aptámero tal como se ha definido anteriormente comprende un
dodecapéptido según la SEQ ID NO:1 fusionado dentro del sitio activo
de la tiorredoxina polipeptídica (Trx), teniendo como marcador de
detección dicha Trx His-tag (Figuras 3a y 3b). Dicho
Trx-HPA-1a tiene una secuencia
proteica de acuerdo con la SEQ ID NO:2 (Fig. 3b) y es codificado por
la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:3 (Fig. 3a).
El péptido aptámero de la presente invención se
puede preparar por cualquier método conocido en la técnica, tal
como tecnología de ADN recombinante.
Otra realización de la presente invención se
refiere a un método para detectar o identificar anticuerpos
específicos del antígeno plaquetario humano, el cual comprende las
etapas de:
- i)
- proporcionar un suero humano en el que se deben ensayar anticuerpos específicos de plaquetas humanas;
- ii)
- poner en contacto el suero humano con el péptido aptámero tal como se ha definido anteriormente; y
- iii)
- detectar la interacción directa o indirecta del péptido aptámero con el anticuerpo específico del antígeno plaquetario humano.
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Aquí, el término "antígeno plaquetario
humano" incluye un epítopo HPA-11 presente en las
glicoproteínas plaquetarias GPIIb/IIIa, pero también un epítopo
HPA-1a soluble presente en forma soluble de esta
GPIIb/IIIa en suero o en cualquier fluido corporal.
Aquí, el término "anticuerpo específico del
antígeno plaquetario humano" incluye cualquier anticuerpo
específico de HPA-1a
(anti-HPA-1a), así como aquellos
anticuerpos que tienen reactividad cruzada con otras proteínas o
glicoproteínas.
Tal como se emplea aquí, el término "suero
humano" incluye cualquier suero sanguíneo humano, plasma o fluido
amniótico obtenido directamente de un paciente o de sangre
almacenada.
De acuerdo con la presente invención, la
expresión "interacción directa o indirecta" incluye cualquier
interacción entre el péptido aptámero y el anticuerpo específico
del antígeno plaquetario humano e incluye además cualquier
interacción en la que estén implicadas otras moléculas. Dichas otras
moléculas pueden ser, por ejemplo, proteínas, complejos proteicos,
ácidos nucleicos, azúcares y/o lípidos.
La etapa de detección (iii) del método definido
anteriormente comprende uno o más método(s) de detección
seleccionado(s) de entre el grupo consistente en
Inmunoblotting, inmunoprecipitación, inmunocaptura, inmovilización
de anticuerpos monoclonales de antígenos plaquetarios o ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), citometría de flujo,
tecnologías de arrays proteicos, espectroscopía, espectrometría de
masas, cromatografía, resonancia plasmónica superficial, extinción
de fluorescencia y/o transferencia de energía de fluorescencia.
En una realización preferente de la presente
invención, el anticuerpo que se debe detectar o identificar en el
método definido anteriormente es el
anti-HPA-1a.
En otra realización de la presente invención, el
método según se define anteriormente se puede emplear para detectar
y/o identificar anticuerpos específicos de antígenos plaquetarios
humanos en el suero de un paciente que padece de una forma de
trombocitopenia inmune.
En una realización preferente de la presente
invención, el método tal como se ha definido anteriormente se
utiliza para detectar y/o identificar anticuerpos específicos de
antígenos plaquetarios humanos en el suero de un paciente, donde el
paciente sufre de una trombocitopenia inmune seleccionada de entre
el grupo consistente en púrpura trombocitopénica idiopática (ITP),
trombocitopenia fetal/neonatal aloinmune (NAIT), púrpura
post-transfusión (PTP) o refractariedad
plaquetaria.
Otra realización de la presente invención se
refiere a un kit de diagnóstico para explorar e identificar
anticuerpos específicos de antígenos plaquetarios humanos que
comprenden el péptido aptámero de acuerdo con la presente
invención. El kit de diagnóstico puede contener cualquier otro
ingrediente/compuesto conocido en la técnica para llevar a cabo la
exploración o los procedimientos de identificación.
Otra realización de la presente invención se
refiere a un inmunoensayo para la detección de anticuerpos
específicos de antígenos plaquetarios humanos en suero humano, el
cual comprende la utilización del péptido aptámero de acuerdo con
la presente invención. Ejemplos de dichos inmunoensayos son
Inmunoblotting, inmunoprecipitación, inmunocaptura, inmovilización
de anticuerpos monoclonales de antígenos plaquetarios o el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y/o radioinmunoensayos.
Otros ensayos se refieren a la resonancia plasmónica superficial,
evanescencia de fluorescencia y citometría de flujo.
Otra realización de acuerdo con la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende
una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido aptámero de acuerdo
con la presente invención y opcionalmente uno o más componentes
adicionales seleccionados de entre el grupo consistente en un
soporte farmacéuticamente aceptable, sales farmacéuticamente
aceptables, agentes auxiliares, diluyentes y disolventes o cualquier
combinación de los mismos.
Además, la composición farmacéutica se puede
administrar en una dosificación adecuada de 5 a 50 mg por cualquier
vía apropiada, tal como vía parenteral, oral, cutánea o sublingual,
o ser inyectada en un órgano linfoide a un paciente que la
necesite.
La composición farmacéutica de la presente
invención se puede utilizar para el tratamiento y/o la prevención
de trastornos por trombocitopenia inmune tal como púrpura
trombocitopénica idiopática (ITP), trombocitopenia fetal/neonatal
aloinmune (NAIT), púrpura post-transfusión (PTP) o
refractariedad plaquetaria. Este aptámero se podría utilizar para
neutralizar los anticuerpos
anti-HPA-1a en el plasma de la
madre, se podría inyectar en el feto o en el líquido amniótico.
Además, este aptámero se podría injertar en un soporte, tal como
microesferas o polímeros, para reducir los anticuerpos cuando se
incuba el plasma con estos soportes durante un procedimiento de
aféresis (aféresis de plasma selectiva).
Las figuras muestran:
Fig. 1: (a) las combinaciones de aminoácidos del
dodecapéptido incluido en el péptido aptámero de acuerdo con la
presente invención. Todas las secuencias contienen, en este orden, 4
aminoácidos alifáticos (V, I, L, A, G), 2 aminoácidos ácidos (D,
E), 1 prolina, 1 aminoácido básico (R, K, H), 2 aminoácidos ácidos
(D, E), 1 alcohol aminoácido (T, S) y 1 aminoácido aromático (W, Y,
F). La flecha indica la dirección N-terminal a
C-terminal del péptido.
(b) ejemplo aleatorio de un dodecapéptido de
acuerdo con la presente invención. Las flechas indican la dirección
de la secuencia de N-terminal a C- terminal. El
dodecapéptido resultante del ejemplo tiene la secuencia peptídica
Gly-Ile-Val-Val-Glu-Asp-Pro-Lys-Asp-Glu-Thr-Tyr.
Fig. 2: Western blotting ensayado con el
anticuerpo monoclonal Cambran. La proteína total se extrae de clones
bacterianos seleccionados (1-9). Se utilizó una
muestra procedente de plaquetas de HPA-1a como
control positivo (línea izquierda, "plata"). Los clones
positivos se caracterizan por una banda de 63 kD (líneas 2, 3, 5, 8,
9).
Fig. 3: (a) secuencia que codifica la proteína
Trx-HPA-1a. Este ORF (open reading
frame = marco de lectura abierto) se clona entre los sitios de
restricción Ndel y Sall del vector de expresión
pT7-7. La proteína
Trx-HPA-1a posee una cola
6-His en su extremo C-terminal.
(b) secuencia de la proteína
Trx-HPA-1a. La proteína contiene una
secuencia de 12 aminoácidos de longitud en el sitio activo de la
tiorredoxina, así como una cola poli-histidina en el
extremo C-terminal.
Fig. 4: (a) detección de la proteína
recombinante por SDS-PAGE (azul de Coomassie). 20
\mug de la proteína purificada por cromatografía de intercambio
iónico se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida
al 20% (calle 1). Se muestran a la derecha los marcadores de peso
molecular.
(b) espectro de masas de electropulverización de
la proteína Trx-HPA-1a. Se detecta
un pico principal mayor al esperado (14.640 Da). El pico más
pequeño (D) corresponde a la
Trx-HPA-1a que carece de dos
residuos de metionona en el extremo N-terminal.
(c) espectro de espectrometría de masas
MALDI-TOF de los productos obtenidos después de la
digestión tríptica de la
Trx-HPA-1a. Los asteriscos negros
(H) corresponden a los picos del tamaño esperado. Juntos estos picos
corresponden al 80% de la secuencia de
Trx-HPA-1a.
Fig. 5: inmunoprecipitados que se resuspenden y
analizan por Western blotting utilizando el anticuerpo
anti-His. Los tampones empleados para la
inmunoprecipitación fueron PBS (calles 1, 2, 9, 10),
PBS-Tween (0,01%) (calles 3, 4),
PBS-NP40 (0,1%) (calles 5, 6),
PBS-Triton (0,5%) (calles 7, 8). Para las
inmunoprecipitaciones se utilizaron muestras de suero que contenían
el anticuerpo anti-HPA-1a (1, 3, 5,
7) o no lo contenían (2, 4, 6, 8). Se muestran los controles
negativos sin Trx-HPA-1a (9) o sin
inmunoglobulinas (10).
Fig. 6: resultado de un experimento típico de
inmunocaptura. Se utilizaron los sueros siguientes: dos muestras
que contenían el anticuerpo
anti-HPA-1a (1-2),
una muestra que contenía el anticuerpo
anti-HPA-1b (3), un control
negativo (4). Los pocillos se recubrieron con 50 ó 100 ng de la
proteína Trx-HPA-1a. La interacción
con Trx-HPA-1a se detecta sólo con
sueros que contienen el anticuerpo
anti-HPA-1a (1, 2).
Fig. 7: experimentos ELISA. Curso temporal del
análisis de OD a 492 nm. Se utilizó un suero que contenía el
anticuerpo anti-HPA-1a (P+ y St
Camb) o no lo contenía (429876, 383545, 489956, 361177). Se muestra
(6c) el valor de d^{2}OD/dt^{2}. El cálculo de
d^{2}OD/dt^{2} permite distinguir entre muestras positivas y
muestras negativas.
Fig. 7d: detección de anticuerpos específicos
de HPA-1a en sueros humanos determinada por el
ensayo ELISA en placas microtituladas (Nunc) recubiertas, durante
toda la noche, a 4ºC, con 150 ng de
Trx-HPA-1a por pocillo en tampón
carbonato. Se enjuagaron las placas dos veces con 200 \mul de PBS.
La unión no específica se bloqueó adicionando 200 \mul de PBS que
contenía un 1% de seroalbúmina bovina (BSA) (A7030, Sigma) durante
100 minutos a temperatura ambiente (RT). Después, se enjuagaron las
placas una vez con 200 \mul de PBS y se incubaron de nuevo
durante 45 minutos a RT en una incubadora, con agitación, con sueros
humanos diluidos (1:100 a 4:5) en 100 \mul de PBS + un 1% de BSA.
Después de tres lavados con PBS que contenía un 0,05% de Tween 20 y
un lavado con PBS, se incubaron las placas durante 40 minutos a RT
en una incubadora, con agitación, con conjugado HRP antihumano de
cabra, fragmento Fc específico (Jackson ImmunoResearch). Después de
tres lavados con PBS + un 0,05% de Tween 20 y dos lavados con PBS,
se detectó la unión del anticuerpo
anti-HPA-1 mediante la adición de
sustrato peroxidasa (OPD: 1,2-fenilendiamina
diclorhidrato) de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(DakoCytomation). 20 minutos más tarde, se interrumpió la reacción
por adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 0,5M. Se registró la
absorción a 492 nm con un lector de placas ELISA. La evolución de OD
a 492 nm depende del título del
anti-HPA-1a en el suero. Esta
evolución es característica de la interacción
anticuerpo-antígeno, lo que demuestra que el
aptámero de Trx-HPA-1a puede
distinguir suero con o sin
anti-HPA-1a. Las muestras
denominadas Sch y Pan contenían el anticuerpo
anti-HPA-1a, mientras que la muestra
Neg es un control negativo procedente de un donante sano.
Para la alta dilución (1/50), OD es < 0,05 para el suero
Neg, mientras que OD > 0,23 para Sch y Pan.
La situación es la misma a baja dilución (1/2), con OD < 0,11
para Neg y > 0,66 para Sch y Pan.
Fig. 8: (a) neutralización de los
aloanticuerpos anti-HPA-1a de suero
humano en el ensayo MAIPA. Se utilizaron dos fechas diferentes de
producción para comparar la estabilidad con el tiempo, (b)
neutralización del anticuerpo Camtran en el ensayo MAIPA con
Trx-HPA-1a. 100 ng de
Trx-HPA-1a son suficientes para
inhibir Camtran en el ensayo MAIPA y (c) neutralización de 2 sueros
humanos que contenían anticuerpos de HPA-1a
(anti-HPA-1a) específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La librería peptídica aleatoria FliTrx^{TM},
basada en el sistema descrito por Lu y col., (Lu Z, Murray KS, Van
Cleave V, LaVallie ER, Stahl ML, McCoy JM. Expression of thioredoxin
random peptide libraries on the Escherichia coli cell
surface as functional fusions to flagellin: a system designed for
exploring protein-protein interactions,
Biotechnology (N.Y.), abril 1995, 13(4):366.72), se obtuvo de
Invitrogen (San Diego, CA). Se obtuvo la proteína mAb Camtran
contra GPIIb/IIIa específica del fenotipo HPA-1a de
Cambridge (Griffin H.M., Ouwehand W. H., A human monoclonal
antibody specific for the Leucine 33 (HPA-1a) form
of platelet glicoprotein IIIa from V gene phage display library,
Blood 1995, 86, 12:4430-4436).
Se realizan cultivos celulares y métodos
generales de selección tal como se describe en el protocolo del
fabricante. El pFliTrx^{TM} que contiene el promotor PL
bacteriófago para dirigir la expresión, se propaga en E.
coli (GI826), donde la expresión del represor cl está bajo el
control del promotor trp. Las células de E. coli que
albergan los plásmidos se cultivan a saturación durante toda la
noche a 25ºC en medio IMC (1 x M9 sales (40 mM Na_{2}HPO_{4},
20 mM KH_{2}PO_{4}, 8,5 mM NaCl, 20 mM NH_{4}Cl, un 0,2% de
casaminoácidos, un 0,5% de glucosa, 1 mM MgCl_{2}, que contiene
100 \mug/ml de ampicilina. La expresión de las proteínas de
fusión tiorredoxina-flagelina que contienen los
insertos peptídicos es inducida por 100 \mug/ml de triptófano
durante 6 horas a 25ºC. Entonces se añade una mezcla de 0,1 g de
lecha en polvo desnatada, 300 \mul de NaCl 5M y 500 \mul de
\alpha-metilmanósido al 20% a 10 ml del cultivo
inducido por E. coli. La solución resultante se utiliza como
librería peptídica lista para el screening como sigue.
Se utilizan placas de 60 mm con cultivo celular
(Nunc) para el screening de la librería peptídica. Las placas se
han prerrecubierto durante una hora a 20-25ºC con 20
\mug de anticuerpo diluido en 1 ml de agua esterilizada. Tras
retirar el líquido, se lavan las placas con 10 ml de agua estéril y
luego se completan con 10 ml de una solución de bloqueo (1% de
leche en polvo desnatada, 150 mM NaCl, 1% de
\alpha-metilmanósido y 100 \mug/ml de
ampicilina en medio IMC), con agitación suave durante 1 hora. Justo
antes de terminar la inducción de 6 horas de la librería peptídica,
se decanta la solución de bloqueo y se añaden a las placas 10 ml de
partes alícuotas de la solución resultante. Se agitan suavemente
las placas a 75 r.p.m. en un agitador horizontal durante 1 minuto y
se incuban durante 1 hora a 20-25ºC. Se decanta el
cultivo bacteriano y se lavan las placas con suave agitación
durante 5 minutos con 10 ml de medio IMC que contiene 100 \mug/ml
de ampicilina y un 1% de \alpha-metilmanósido.
Después de lavar cuatro veces más, se separan las bacterias unidas
con 1 ml de IMC mediante agitación durante 30 segundos. Se recogen
las bacterias separadas restantes de la placa y se cultivan durante
la siguiente ronda de bioselección. Se lleva a cabo el mismo
procedimiento en las cuatro rondas de bioselección posteriores.
Después de cinco rondas de bioselección, las colonias bacterianas se
seleccionan aleatoriamente de las placas con RMG (1 x M9 sales, 2%
de casaminoácidos, 0,5% de glucosa, 1 mM de MgCl_{2}, 100
\mug/ml de ampicilina y 1,5% de agar) y se cultivan durante toda
la noche a 30ºC.
La identificación de los clones positivos por
Western blotting se realiza esencialmente de acuerdo con el
protocolo del fabricante. Brevemente, cuarenta clones de la placa
RMG se transfieren a 2 ml de medio RM (1 x M9 sales, 2% de
casaminoácidos, 1% de glicerol, 1 mM de MgCl_{2}) que contiene 100
\mug/ml de ampicilina, y se cultivan a saturación a 30ºC con
agitación. Una muestra de 40 \mul procedente del cultivo durante
toda la noche se inocula, a 37ºC, a 2 ml de IMC que contiene 100
\mug/ml de ampicilina y 100 \mug/ml de triptófano, hasta
obtener una densidad celular de OD_{600} 0,75. Se cosecha una
parte alícuota de 1,5 ml de cultivo celular inducido y se
centrifuga a 10.000 g durante 1 minuto. El gránulo se resuspende en
tampón de carga de gel de poliacrilamida-SDS,
hervido durante 5 minutos y sometido a electroforesis en un 8% de
SDS-gel de poliacrilamida. Las proteínas separadas
son manchadas sobre una membrana de nitrocelulosa (PROTRAN® BA 79,
Schleicher & Schuell) en una célula de transferencia
electroforética líquida (Bio-Rad). Entonces, las
membranas son bloqueadas con TBS (10 mM Tris pH 7,2 y 0,15M de
NaCl), con un 5% de leche en polvo desnatada, durante toda la
noche, a 4ºC, después se incuban con anticuerpo Cambran, se diluyen
a 1:100 en TBS con un 1% de leche en polvo, 0,05% de Tween 20,
durante 2 horas a 20-25ºC. Después de lavarlas tres
veces con TBS con un 0,05% de Tween 20, las membranas se incuban
entonces con IgG antihumano de cabra conjugado con peroxidasa de
rábano picante (HRP), Fc específico (Sigma A0170) diluida al
1:92.000 durante 40 minutos a 20-25ºC. Después de
tres lavados más con TBS con un 0,05% de Tween 20, se detecta el
conjugado unido por Lumi-LightPLUS Western Blotting
Substrate (Roche). Entonces se vuelven a analizar los clones
positivos mediante Western blotting realizado con un suero humano
que reacciona contra la proteína GPIIb/IIIa que es específica del
fenotipo HPA-1b.
Los ADN plásmidos de los clones identificados se
aíslan utilizando el sistema Wizard® Plus SV Minipreps DNA
Purification System (Promega). Las secuencias de nucleótidos se
determinan por MWG utilizando el cebador de secuenciación Directo
FliTrx^{TM}
(5'-ATTCACCTGACTGACGAC-3').
Un ADNc que codifica el péptido de tiorredoxina
es amplificado por reacción PCR utilizando el plásmido pFlitrx
seleccionado previamente. Las condiciones PCR son las siguientes: 1
minuto a 95ºC, seguido de 12 ciclos a 95ºC durante 45 segundos,
36ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos, luego 20 ciclos
a 95ºC durante 45 segundos, 45ºC durante 30 segundos, 72ºC durante
45 segundos y 72ºC durante 3 minutos para reemplazar el enjuague.
En el extremo 3', la secuencia del cebador
5'-TGTCGACCAGGTTAGCGTC-3' presenta
un sitio SalI y, en el extremo 5', la secuencia del cebador
5'-TCATATGATGAGCGATAAAATTA-3'
presenta un sitio NdeI. El fragmento de ADN generado por PCR
se subclona con el sistema pGEM®-T Easy Vector System I (Promega).
Luego, el constructo del plásmido se amplifica y digiere con la
enzima de restricción NdeI y SalI. El fragmento de
ADN digerido se clona en los sitios NdeI y SalI del
vector resistente a la ampicilina pT7-7 (vector
basado en el sistema de expresión de la polimerasa T7), que codifica
seis codones de His seguido de un codón de parada aguas abajo del
sitio Saltl. El plásmido se transforma en la cepa DH5\alpha
de Escherichia coli y se aíslan las colonias resistentes a
la ampicilina. Se cultivan las colonias resistentes para permitir
una producción a gran escala, así como la purificación del plásmido.
La construcción apropiada del plásmido es confirmada por
secuenciación del ADN.
El plásmido se transforma en la cepa C41 (DE3)
de E. coli (Miroux B, Walker JE,
Over-production of proteins in Escherichia coli:
mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and
globular proteins at high levels. J. Mol. Biol., julio 1996,
19;260(3):289-98). Una colonia recién
transformada se inocula en 400 ml de medio 2 YT (16% de Bacto
triptona, 10% de Bacto extracto de levadura, 85,5 mM NaCl) que
contiene 20 \mug/ml de ampicilina y se cultiva a 37ºC hasta
OD_{600} de 0,6-0,8 antes de la inducción con 0,7
mM de isopropil b-D tiogalactopiranósido. Después
de incubación durante toda la noche a 37ºC, se cosechan por
centrifugación las células. Se suspende el gránulo y se incuba
durante 30 minutos a 4ºC en 10 ml de tampón de lisis (20 mM
Tris-Hcl pH 8,0, 20% de glicerol, 500 mM NaCl, 0,1%
de Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mg/ml de lisozima, 1/2
tableta de Complete Mini EDTA-free (Roche) y 250
unidades/ml de benzonasa (Merck)). Se rompen las fracciones (5 ml)
mediante sonicación durante 30 segundos. Después de cuatro rondas de
centrifugación de los sobrenadantes (9.000 g durante 30 minutos),
la fracción soluble se aplica a una columna de 7 ml de
Ni-NTA-agarosa (Qiagen) equilibrada
previamente en tampón de lisis sin lisozima ni benzonasa. La mezcla
se incuba en un baño a 4ºC durante 1 hora. Se lava la columna con
el tampón de lisis sin lisozima ni benzonasa y luego con 20 mM
Tris-HCl pH 8,0, 20% de glicerol, 100 mM KCl, 0,5
mM PMSF y 20 mM imidazol, se eluye
Trx-HPA-1a con el mismo tampón que
contiene 100 mM de imidazol. Las fracciones que contienen
Trx-HPA-1a, según
SDS-PAGE, se agrupan. El tampón de las muestras se
cambia y la muestra se concentra por centrifugación con membrana de
concentrador Vivaspin (Vivascience), corte de 5 kDa y 20 mM Tris a
pH 8,0, 10 mM NaCl. Se aplican las muestras a una columna de 1 ml
Q-Sepharose (Mono Q HR 5/5, Amersham Pharmacia
Biotech). Se lava la columna con 20 mM de Tris pH 8,0, 10 mM NaCl, y
se eluye Trx-HHPA-1a con un
gradiente lineal de 10 mM a 1M de NaCl. Se agruparon las fracciones
ricas en Trx-HPA-1a, se
concentraron a 1-15 mg/ml, se equilibraron en PBS o
agua esterilizada en un Vivaspin Concentrator y se almacenaron a
-20ºC hasta su uso. Las concentraciones de proteínas se determinan
por el método Bradford (Kruger NJ, The Bradford method for protein
quantitation. Methods Mol. Biol. 1994; 32:9-15).
Se obtienen los espectros de masas utilizando un
instrumento de electropulverización API 165 (Applied Biosystems).
La identidad se establece por huella dactilar de la masa peptídica y
análisis Maldi-Tof (voyager-DE TM
PRO, Applied Biosystems).
Se aplican sueros humanos equilibrados con un
10% de Tris-HCl 1M pH 8 a 250 \mul/ml de una
columna de perlas de proteína A-sepharose (P3391,
Sigma-Aldrich) equilibrada previamente en 100 mM de
Tris-HCl pH 8. Se lava la columna con diez
volúmenes de 100 mM Tris-HCl pH 8 y diez volúmenes
de 10 mM Tris-HCl pH 8. Se eluye el IgG total con
100 mM de glicina a pH 3. Las fracciones de elución se neutralizan
con un 10% de Tris-HCl 1M pH 8. Las fracciones que
contienen IgG se concentran y el tampón es intercambiado en una
membrana de concentrador Vivaspin, corte de 5 kDa y PBS. Se
analizan las muestras en SDS-PAGE y se determinan
las concentraciones de IgG por el método Bradford (Kruger, NJ., The
Bradford method for protein quantitation. Methods Mol. Biol. 1994;
32:9-15).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuba 1 \mug de la proteína
Trx-HPA-1a con 30 \mug de extracto
de IgG procedente de suero humano en un tampón A (PBS con trehalosa
0,5M) o un tampón A con un 0,01% de Tween 20 o con un 0,1% de NP40 o
con un 0,05% de Triton, durante 2 horas a 20-25ºC.
Se añade a la mezcla 1M de Tris-HCl y se incuba con
25 \mul de proteína A-perlas de sefarosa
equilibradas previamente en 10 mM de Tris-HCl pH 8,
a 4ºC, durante 45 minutos. Luego se lavan las perlas tres veces con
100 mM de Tris-HCl pH 8, un 0,2% de Tween 20, a 4ºC,
durante 10 minutos y después tres veces con 10 mM de
Tris-Hcl pH 8, un 0,2% de Tween 20. Para que caiga
el complejo proteína
A-sefarosa-IgG-Trx-HPA-1a,
se centrifuga la mezcla 2 minutos a 10.000 g. Se eluyen las
proteínas hirviéndolas en el tampón de muestra SDS y el eluato se
resuelve en un 15% de SDS-gel de poliacrilamida y
manchado sobre una membrana de nitrocelulosa (PROTRAN® BA79,
Schleicher & Schuell) en una célula de transferencia
electroforética líquida. Las membranas se bloquean entonces con
leche en polvo al 5% en TBS a 4ºC durante toda la noche, luego se
incuban con el anticuerpo anti-His (sonda His, Santa
Cruz Biotechnology), se diluyen al 1:200 en leche en polvo al 1% en
TBS, un 0,05% de Tween 20, durante 1 h 10 min a
20-25ºC. Después de tres lavados con TBS y un 0,05%
de Tween 20, las membranas se incuban entonces con IgG de cabra
anti-conejo conjugado con HRP (Dakocytomation), se
diluyen a 1:3.000 durante 50 minutos a 20-25ºC.
Después de tres lavados más con TBS y un 0,05% de Tween 20, se
detecta el conjugado unido por Lumi-LightPLUS
Western Blotting Substrate.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmunocaptura es una técnica clásica para
detectar anticuerpos IgG dirigidos contra plaquetas de acuerdo con
la técnica publicada por Rachel y col., (Med Lab Sci.: 1985, 42;
194-199).
Aquí, la interacción entre
Trx-HPA-1a y los sueros humanos que
contienen Ab contra el HPA-1a plaquetario se somete
a prueba por inmunocaptura. Se utiliza un ensayo de sistema en fase
sólida para la detección de anticuerpos IgG contra plaquetas
(Capture P®, Immucor). El conjunto de plaquetas se sustituye por la
proteína Trx-HPA-1a. Placas
microtituladas con pocillos cónicos se recubren durante toda la
noche, a 4ºC, con 50 ng o con 100 ng de
Trx-HPA-1a por pocillo en un tampón
carbonato (Na_{2}CO_{3} 15 mM, NaHCO_{3} 35 mM en agua
desionizada). Después de lavado con PBS, se añaden a los pocillos
50 \mul de suero de un donante anónimo y se incuba a 37ºC durante
45 minutos. Después de seis lavados, 50 \mul de
Capture-P indican eritrocitos (glóbulos rojos que
llevan el anticuerpo IgG antihumano).
\vskip1.000000\baselineskip
La detección de anticuerpos específicos
HPA-1a en suero humano se determina por una prueba
ELISA utilizando placas microtituladas (Nunc) recubiertas durante
toda la noche, a 4ºC, con 100 ng de
Trx-HPA-1a por pocillo en tampón
carbonato. Se enjuagan las placas dos veces con 250 \mul de PBS.
Los sitios no específicos son bloqueados por una incubación de 1 h
30 min a 20-25ºC con 250 \mul de PBS que contiene
un 1% de seroalbúmina bovina (BSA) (A7030, Sigma). Se enjuagan las
placas una vez con 250 \mul de PBS y luego se incuban durante 45
minutos a 20-25ºC, en una incubadora con agitación,
con 10 \mul de suero humano diluido en 100 \mul de PBS y 1%
BSA. Después de tres lavados con PBS que contiene un 0,05% de Tween
20 y un lavado con PBS, se incuban las placas durante 40 minutos, a
20-25ºC, en una incubadora con agitación, con IgG de
cabra antihumano conjugado con HRP, fragmento Fc específico
(Jackson ImmunoResearch). Después de tres lavados con PBS y un
0,05% de Tween 20 y dos lavados con PBS, se detecta la unión del
anticuerpo anti-HPA-1 mediante la
adición de sustrato peroxidasa OPD
(1,2-fenilendiamina diclorhidrato) (DakoCytomation)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se mide la
absorción a 492 nm y se continúa durante 25-30
minutos en el lector de placas ELISA. Para interrumpir la reacción,
se añaden en el pocillo 100 \mul de H_{2}SO_{4} 0,5M. Luego se
analiza la curva de evolución de la absorbancia de acuerdo con los
tiempos de incubación de OPD.
\vskip1.000000\baselineskip
En este experimento, se determina la capacidad
de Trx-HPA-1a para neutralizar la
unión de los aloanticuerpos policlonales específicos a
HPA-1a de IgG humano mediante la tecnología MAIPA.
Se utiliza la tecnología MAIPA tal como se describe en Kiefel y
col. (Blood: 1987, 70; 1722-1727). La tecnología
MAIPA es una técnica altamente específica para detectar e
identificar alo- y auto-anticuerpos
plaquetarios.
En particular, 50 \mul de suero humano que
contiene o no anti-HPA-1a policlonal
o 15 ng de Camtran en 50 \mul de suero humano sin
anti-HPA-1a policlonal se incuban
durante 25 minutos a 20-25ºC, en una incubadora con
agitación, con 0,1 ng, 10 ng, 100 ng ó 1.000 ng de
Trx-HPA-1a diluidos en 20 \mul de
PBS. Se preincuba la mezcla 5 minutos con 3 \mul de perlas
Ni-NTA agarosa y el complejo de
aloanticuerpos/Trx-HPA-1a se rebaja
por centrifugación a 13.000 r.p.m. durante 2 minutos. Se utilizan 50
\mul del sobrenadante para realizar la MAIPA. La neutralización
del suero se determina entonces como es habitual por medio de la
técnica MAIPA.
Se añaden concentraciones crecientes de
Trx-HPA-1a (0,1 ng, 10 ng, 100 ng y
1.000 ng) diluidas en 30 \mul de PBS a 50 \mul de suero humano
que contiene o no anti-HPA-1a
policlonal o 15 ng de Camtran diluidos en 50 \mul de suero humano
sin anti-HPA-1a policlonal. Después
de la incubación a 20-25ºC durante 25 minutos, se
preincuba la mezcla con 3 \mul de perlas Ni-NTA
agarosa y el complejo de aloanticuerpos o
Camtran/Trx-HPA-1a se rebaja por
centrifugación a 13.000 rpm durante 2 minutos. La neutralización de
50 \mul de suero del sobrenadante se determina entonces como es
habitual por medio de la técnica MAIPA. Se muestran los resultados
en las Figuras
8a, b y c.
8a, b y c.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de sangre (Tabla 1, izquierda)
proceden de donantes anónimos o de pacientes con NAIT. Se realiza
la MAIPA en suero crudo (Tabla 1, "MAIPA") o con
inmunoglobulinas de proteína A purificadas (Tabla 1, "MAIPA
pura"). Se observa que la gran mayoría de los donantes es
negativa utilizando tanto MAIPA como ELISA. Siete muestras que son
negativas con MAIPA muestran una densidad óptica por encima de 0,1
(OD > 0,1) con ELISA (medición de punto final). Sin embargo,
para todas las muestras de los donantes, el análisis del curso
temporal muestra que la densidad óptica aumenta linealmente con el
tiempo, siendo la derivada primera constante (dOD/dt = constante) y
siendo la derivada segunda igual a cero (d^{2}OD/dt^{2} = 0).
Por tanto, se indexa una determinada muestra como negativa por
ELISA si d^{2}OD/dt^{2} = 0. Los resultados de los análisis
temporales por ELISA se muestran en la columna indicada (Tabla 1,
"Curva"): todas las muestras de los donantes son ensayadas
como negativas (d^{2}OD/dt^{2} = 0), mientras que se observa que
las tres muestras sometidas a prueba procedentes de pacientes con
NAIT (Pan, St Camb, Bru) son positivas (d^{2}OD/dt^{2} > 0).
Por consiguiente, una determinada muestra es negativa con el ELISA
descrito aquí si cumple con uno de los siguientes criterios:
densidad óptica por debajo de 0,1 (punto final) o d^{2}OD/dt^{2}
= 0 (curso temporal). Se debe señalar que todas las muestras que se
indican como siendo negativas con el protocolo de punto final
también se indican como negativas con el protocolo de análisis
temporal. Además, la inmunodepleción de tres muestras procedentes
de pacientes con NAIT (Pan, Sch, Ac mB2) se llevan a cabo con éxito
con el péptido aptámero purificado (Tabla 1, "neutr."). Se
muestran los genotipos para los locus de HPA (Tabla 1
"geno").
\newpage
La Tabla 1 muestra los resultados resumidos de
los experimentos de detección del anticuerpo
anti-HPA-1a utilizando MAIPA y
ELISA. Los símbolos son: (-) negativo; (+) positivo; (-/+) sometido
a prueba en primer lugar como negativo pero siendo positivo
posteriormente; (ND) no determinado.
Claims (13)
1. Péptido aptámero que comprende:
- A.
- al menos un dodecapéptido que tiene en la dirección N-terminal a C-terminal una secuencia de:
- i.
- cuatro aminoácidos alifáticos seleccionados de entre el grupo consistente en valina, isoleucina, leucina, alanina y glicina,
- ii.
- dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo consistente en ácido aspártico y ácido glutámico,
- iii.
- una prolina,
- iv.
- un aminoácido básico seleccionado de entre el grupo consistente en arginina y lisina,
- v.
- dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo consistente en ácido aspártico y ácido glutámico,
- vi.
- un alcohol aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en treonina y serina, y
- vii.
- un aminoácido aromático seleccionado de entre el grupo consistente en triptófano, tirosina y fenilalanina;
- B.
- al menos un polipéptido, y opcionalmente
- C.
- uno o más marcador(es) detectable(s).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Péptido aptámero según la reivindicación 1,
caracterizado porque la secuencia del dodecapéptido es según
la SEQ ID NO:1.
3. Péptido aptámero según la reivindicación 1 ó
2, caracterizado porque el polipéptido se selecciona de entre
el grupo consistente en tiorredoxina (Trx), proteína fluorescente
verde (GFP), nucleasa de estafilococo, polipéptidos de espiral
enrollada, polipéptidos que contienen cisteína capaces de formar
puentes disulfuro o uno o más fragmentos de los mismos.
4. Péptido aptámero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el marcador
detectable se selecciona de entre el grupo consistente en un
marcador fluorescente, un marcador radioactivo,
His-tag, glutatión-transferasa
(GST), Flag-tag, biotina, Ha-tag,
Myc-tag y XPress-tag.
5. Ácido nucleico que contiene una secuencia de
nucleótidos que codifica el péptido aptámero según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4.
6. Método para detectar o identificar
anticuerpos específicos del antígeno plaquetario humano, que
comprende las etapas de:
- i)
- proporcionar un suero humano en el que se deben ensayar anticuerpos específicos de plaquetas humanas;
- ii)
- poner en contacto el suero humano con el péptido aptámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y
- iii)
- detectar la interacción directa o indirecta del péptido aptámero con el anticuerpo específico del antígeno plaquetario humano.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Método según la reivindicación 6,
caracterizado porque la etapa de detección (iii) comprende
uno o más méto-
do(s) de detección seleccionado(s) de entre el grupo consistente en Inmunoblotting, inmunoprecipitación, inmunocaptura, inmovilización con anticuerpos monoclonales de antígenos plaquetarios, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), citometría de flujo, tecnología de arrays de proteínas, espectroscopía, espectrometría de masas, cromatografía, resonancia plasmónica superficial, extinción de fluorescencia y transferencia de energía de fluorescencia.
do(s) de detección seleccionado(s) de entre el grupo consistente en Inmunoblotting, inmunoprecipitación, inmunocaptura, inmovilización con anticuerpos monoclonales de antígenos plaquetarios, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), citometría de flujo, tecnología de arrays de proteínas, espectroscopía, espectrometría de masas, cromatografía, resonancia plasmónica superficial, extinción de fluorescencia y transferencia de energía de fluorescencia.
8. Método según la reivindicación 6 ó 7,
caracterizado porque el anticuerpo específico del antígeno
plaquetario humano que se debe detectar o identificar es
anti-HPA-1a.
\newpage
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, para detectar y/o identificar anticuerpos
específicos del antígeno plaquetario humano en el suero de un
paciente que padece de una forma de trombocitopenia inmune.
10. Método según la reivindicación 9,
caracterizado porque la trombocitopenia inmune se selecciona
de entre el grupo consistente en púrpura trombocitopénica
idiopática (ITP), trombocitopenia fetal/neonatal aloinmune (NAIT),
púrpura post-transfusión (PTP) o refractariedad
plaquetaria.
11. Kit de diagnóstico para explorar y/o
identificar anticuerpos específicos del antígeno plaquetario humano,
que comprende el péptido aptámero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
12. Inmunoensayo para la detección de
anticuerpos específicos del antígeno plaquetario humano en suero
humano, que comprende la utilización del péptido aptámero según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
13. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz del péptido aptámero de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y opcionalmente uno o
más componentes adicionales seleccionados de entre el grupo
consistente en un soporte farmacéuticamente aceptable, sales
farmacéuticamente aceptables, agentes auxiliares, diluyentes y
disolventes, o cualquier combinación de los mismos.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06002496 | 2006-02-07 | ||
| EP06002496 | 2006-02-07 |
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES07703325T Active ES2345569T3 (es) | 2006-02-07 | 2007-02-07 | Peptido aptamero para neutralizar la union de anticuerpos especificos a antigenos plaquetarios y aplicaciones terapeuticas y de diagnostico que lo contienen. |
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