JP2002537783A - Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の検出および予防のための、化合物および方法 - Google Patents

Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の検出および予防のための、化合物および方法

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イエイサー エイ．ダブリュー． スケイキー，
マイケル ジェイ． ロデス，
レイモンド エル． ハウトン，
ジョン エム． スミス，
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コリクサ コーポレイション
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Abstract

(57)【要約】 クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）の感染の診断のための化合物および方法が提供される。開示される化合物は、ポリペプチドまたはそれに対する抗体であり、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の１以上のエピトープを含む。この化合物は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための種々の免疫アッセイにおいて有用である。このポリペプチド化合物は、Ｔ．ｃｒｕｚｉに曝された個体におけるシャーガス病に対する防御免疫を誘導するためのワクチンおよび薬学組成物においてさらに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般的に、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の診断に関する。本発明は、より詳
細には、１以上のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原性ペプチド、またはそれに対する抗体の、
Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染についての個体および血液供給をスクリーニングするための
方法および診断キットにおける使用に関する。本発明はまた、シャーガス病を予
防するために個体を免疫するためのワクチン組成物に関する。
【０００２】 （発明の背景） 原生生物の寄生生物は、世界の多くの地域で深刻な健康の脅威である。Ｔｒｙ
ｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）は、主に中央アメリカおよび
南アメリカにおいて何百万もの個体に感染するような寄生生物の１種である。こ
の寄生生物の感染は、シャーガス病を引き起こし得る。これは、慢性心疾患およ
び種々の免疫系障害を生じ得る。ラテンアメリカにおいて１８００万人の人がＴ
．ｃｒｕｚｉに感染していることが見積もられているが、感染の臨床的な症状に
ついての信頼できる処置は存在しない。シャーガス病の予防のためのワクチンは
、現在利用可能ではない。
【０００３】 その疾患が地方病性である地域における、伝播の最も顕著な経路は、感染した
ｔｒｉａｔｏｍｉｄ虫との接触を通してである。しかし、他の地域においては、
輸血が伝染の優勢な手段である。そのような地域においてＴ．ｃｒｕｚｉ感染を
阻害するために、個体におけるＴ．ｃｒｕｚｉ感染を診断するためおよび血液供
給をスクリーニングするための正確な方法を開発することが必要である。サンプ
ルの０．１％〜６２％が感染し、そして寄生生物が輸血によってしばしば伝染す
る南アフリカでは、血液銀行スクリーニングが特に重要である。特定の米国の都
市における血液供給もまた、Ｔ，ｃｒｕｚｉ寄生生物によって汚染され得るとい
う関心が増大している。
【０００４】 Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の診断は問題であった。なぜなら、慣用的な使用に適した
寄生生物を検出するための正確な方法が利用可能でなかったからである。何十年
も続き得る感染の急性期の間、その感染は静止状態でありそして宿主が無症候性
であり得る。結果として、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染についての血清学的試験は、最も
信頼でき、そして最も一般的に使用される。
【０００５】 しかし、このような診断は、この寄生生物の複雑な生活環および宿主の多様な
免疫応答によって複雑である。この寄生生物は、昆虫ベクター中でエピマスティ
ゴート段階を、そして哺乳動物宿主中で２つの主要段階を通過する。１つの宿主
段階は血液中に存在し（トリポマスティゴート段階）、そして第２の段階は細胞
内である（無べん毛型段階）。複数の段階が、感染の間に寄生生物によって提示
される抗原の多様性を生じる。さらに、原生生物感染に対する免疫応答は、複雑
であり、寄生生物抗原のアレイに対する体液性応答および細胞媒介応答の両方を
含む。
【０００６】 寄生生物抗原に対する抗体を検出することは、臨床的および準臨床的な感染を
診断する最も一般的で信頼できる方法であり、現在の試験は高価でありかつ困難
である。大部分の血清学的な試験は、全体のまたは溶解したＴ．ｃｒｕｚｉを使
用し、そしてＴ．ｃｒｕｚｉ感染を正確に検出するために３つの試験（補体結合
、間接的免疫蛍光、受動的凝集反応、またはＥＬＩＳＡを含む）の内の２つで陽
性な結果を必要とする。このような試験のコストおよび困難さは、多くの地方病
地域において血液または血清のスクリーニングを妨害する。
【０００７】 従って、当該分野において、血液供給および個体中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検
出する、より特異的かつ感受性の方法についての必要性が存在する。本発明は、
これらの必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
【０００８】 （発明の要旨） 手短に述べると、本発明は、個体および血液供給におけるＴ．ｃｒｕｚｉ感染
の検出および防御のため、および生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染につ
いてのスクリーニングのための化合物および方法を提供する。１つの局面におい
て、本発明は、生物学的サンプル中でのＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための方
法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）生物学的サンプルを、配列番
号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ
酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープ、または保存性置換および／も
しくは改変においてのみ異なるそのような抗原の改変体のエピトープを含むポリ
ペプチドと接触させる工程； ならびに（ｂ）生物学的サンプル中におけるポリ
ペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それから生物学的サンプル中のＴ．ｃ
ｒｕｚｉ感染を検出する工程。
【０００９】 本発明の別の局面において、配列番号１〜配列番号２１に列挙されるヌクレオ
チド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピ
トープ、または保存性置換および／もしくは改変においてのみ異なるそのような
抗原の改変体のエピトープを含むポリペプチドが提供される。
【００１０】 関連する局面において、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、これら
のＤＮＡ配列を含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターを用いて形質
転換またはトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供される。
【００１１】 別の局面において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＴ．ｃｒｕｚｉ感染
を検出するための診断キットを提供し、このキットは以下を含む：（ａ）配列番
号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ
酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープ、または保存性置換および／も
しくは改変においてのみ異なるそのような抗原の改変体のエピトープを含むポリ
ペプチド；ならびに（ｂ）検出試薬。
【００１２】 なお別の局面において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＴ．ｃｒｕｚｉ
感染の存在を検出するための方法を提供し、この方法は以下を包含する：（ａ）
生物学的サンプルを、配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列
によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープ、
または保存性置換および／もしくは改変においてのみ異なるそのような抗原の改
変体のエピトープに結合するモノクローナル抗体を接触させる工程；ならびに（
ｂ）生物学的サンプル中においてモノクローナル抗体に結合するＴ．ｃｒｕｚｉ
寄生生物の存在を検出する工程。
【００１３】 関連する局面において、上記のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリ
ア、ならびにアジュバントと組み合わせて上記のポリペプチドを含むワクチンを
含む薬学的組成物もまた、提供される。
【００１４】 本発明はまた、他の局面において、上記のような薬学的組成物またはワクチン
を患者に投与する工程を包含する、患者におけるシャーガス病に対する防御免疫
を誘導するための方法を提供する。
【００１５】 他の局面において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＴ．ｃｒｕｚｉ感染
を検出するための方法を提供し、この方法は以下を包含する：（ａ）生物学的サ
ンプルを、配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコ
ードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープ、または保存
性置換および／もしくは改変においてのみ異なる上記抗原の改変体のエピトープ
を含む第１のポリペプチドと接触させる工程；（ｂ）生物学的サンプルを、他の
Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原、または保存性置換および／もしくは改変においてのみ異な
るその上記抗原の改変体の１つ以上のエピトープを含む１つ以上のさらなるポリ
ペプチドと接触させる工程；および（ｃ）生物学的サンプル中における１つ以上
の上記ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それから生物学的サンプル
中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出する工程。１つの実施形態において、さらなるポ
リペプチドは、ＴｃＤのエピトープ、または保存性置換および／もしくは改変に
おいてのみ異なるその改変体のエピトープを含む。別の実施形態において、さら
なるポリペプチドは、ＴｃＤのエピトープ（または保存性置換および／もしくは
改変においてのみ異なるその改変体）、およびＴｃＥのエピトープ（または保存
性置換および／もしくは改変においてのみ異なるその改変体）を含む。なお別の
実施形態において、さらなるポリペプチドは、ＴｃＤのエピトープ（または保存
性置換および／もしくは改変においてのみ異なるその改変体）およびＰＥＰ−２
（または保存性置換および／もしくは改変においてのみ異なるその改変体）を含
み得る。
【００１６】 なおさらなる局面において、本発明は、２つ以上のポリペプチドを含むポリペ
プチドの組み合わせを提供し、各ポリペプチドは、配列番号１〜配列番号２２に
列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃ
ｒｕｚｉ抗原のエピトープ、または保存性置換および／もしくは改変においての
み異なるその改変体のエピトープを含む。配列番号１〜配列番号２２に列挙され
るヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ
抗原の少なくとも１つのエピトープ、または保存性置換および／もしくは改変に
おいてのみ異なるその改変体のエピトープ、ならびに、ＴｃＤエピトープ、Ｔｃ
Ｅエピトープ、ＰＥＰ−２エピトープ、および保存性置換および／もしくは改変
においてのみ異なるそれらの改変体のエピトープからなる群より選択される少な
くとも１つのエピトープを含む、組み合わせポリペプチドもまた、提供される。
特定の実施形態において、配列番号８２または９５のアミノ酸配列を含む組み合
わせポリペプチドが提供される。このような組み合わせポリペプチドは、合成的
手段によるかまたは組換えＤＮＡ技術を用いるかのいずれかで調製され得る。
【００１７】 関連する局面において、生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出する
ための方法が提供され、この方法は、（ａ）生物学的サンプルを、上記の組み合
わせのポリペプチドの少なくとも１つと接触させる工程、および（ｂ）生物学的
サンプルにおいて、組み合わせポリペプチドに結合する抗体の存在を検出する工
程を包含する。
【００１８】 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を各々
が参照して明らかになる。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、あたか
も個々に援用されるかのように、それによってその全体が本明細書中に参考とし
て援用される。
【００１９】 （発明の詳細な説明） 上記のように、本発明は、一般的に個体および血液供給におけるＴ．ｃｒｕｚ
ｉ感染を検出および防御するための化合物および方法に関する。本発明の化合物
は、一般的に、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の１つ以上のエピトープを含む。特に、配列
番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミ
ノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープを含むポリペプチドが好まし
い。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、全長（すなわち、
ネイティブな）抗原を含む、任意の長さのアミノ酸の鎖を含む。従って、エピト
ープを含むポリペプチドは、全体的にエピトープから構成され得るか、またはさ
らなる配列を含み得る。さらなる配列は、ネイティブな抗原から誘導され得るか
、または異種であり得、そしてそのような配列は、抗原性であり得る（しかし、
そのれが必要というわけではない）。特定のアミノ酸配列を「有する」タンパク
質は、列挙された配列をその全長配列内に含むタンパク質である。このようなタ
ンパク質は、さらなるアミノ酸配列を含んでもよいし、含まなくてもよい。診断
の感度および特異性を増強するための、本明細書中に列挙された１つ以上のエピ
トープの配列の前のまたはそれと組み合わせるさらなるＴ．ｃｒｕｚｉタンパク
質からの１つ以上のエピトープの使用もまた、意図される。
【００２０】 本明細書中で使用される場合に、「エピトープ」とは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の
一部であり、これは、Ｔ．ｃｒｕｚｉに感染した個体由来の血清と反応する（す
なわち、あるエピトープがこのような血清内の１つ以上の抗体により特異的に結
合される）。本願に記載される抗原のエピトープは、一般に、当業者に公知の方
法（例えば、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３
版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９３）およびそこで引用さ
れる参考文献に要約される方法）を使用して同定され得る。例えば、ネイティブ
なＴ．ｃｒｕｚｉ抗原由来のポリペプチドは、Ｔ．ｃｒｕｚｉに感染した患者か
ら得たプールされた血清と反応する能力に関して、スクリーニングされ得る。Ｔ
．ｃｒｕｚｉに感染した血清との反応性を評価するための適切なアッセイ（例え
ば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））は、以下ならびにＨａ
ｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、１９８８にさらに詳細に記載される。ポリペプチドのエピトープは、全長ポリ
ペプチドの反応性に実質的に類似のレベルで、このような抗血清と反応する部分
である。換言すれば、エピトープは、抗体結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）
において、全長ポリペプチドによって生成される応答の少なくとも約８０％、そ
して好ましくは少なくとも約１００％を生成し得る。
【００２１】 本発明の化合物および方法はまた、上記のポリペプチドの改変体を含む。本明
細書中で使用される場合に、ポリペプチド「改変体」とは、保存的置換および／
または改変のみが、言及されるポリペプチドとは異なり、その結果、このポリペ
プチドの抗原性特性が保持される、ポリペプチドである。好ましい実施形態にお
いて、改変体ポリペプチドは、５以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によっ
て、同定された配列とは異なる。このような改変体は、一般に、上記ポリペプチ
ド配列の１つを改変し、そして例えば、本明細書中に記載の代表的な手順を使用
して、この改変したポリペプチドの抗原性特性を評価することによって、同定さ
れ得る。ポリペプチド改変体は、好ましくは、同定されたポリペプチドとの少な
くとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少
なくとも約９５％の同一性（以下に記載されるように決定される）を示す。
【００２２】 本明細書中で使用される場合に、「保存的置換」とは、あるアミノ酸が、類似
の特性を有する別のアミノ酸で置換され、その結果、ペプチド化学の当業者が、
そのポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）の
性質が実質的に変化しないと予測する、置換である。一般に、以下のアミノ酸の
群は、保存的変化を示す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇ
ｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３
）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、
ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
【００２３】 改変体はまた、または代替的に、他の改変（そのポリペプチドの抗原性特性、
二次構造およびヒドロパシーの性質に対する最少の影響を有するアミノ酸の、欠
失または付加が挙げられる）を含み得る。例えば、ポリペプチドは、このタンパ
ク質の移動を翻訳と同時にまたは翻訳後に方向付けるタンパク質のＮ末端におい
て、シグナル（またはリーダー）配列と結合体化し得る。このポリペプチドはま
た、ポリペプチドの合成、精製もしくは同定の容易のために（例えば、ポリ−Ｈ
ｉｓ）、あるいはこのポリペプチドの固体支持体上への結合を増強するために、
リンカーまたは他の配列と結合体化し得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロ
ブリンＦｃ領域と結合体化し得る。
【００２４】 ヌクレオチド「改変体」とは、１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または付
加を有する点で、言及されるヌクレオチド配列とは異なる配列である。このよう
な改変は、標準的な変異誘発技術（例えば、Ａｄｅｌｍａｎら（ＤＮＡ、２：１
８３、１９８３）により教示されるような、オリゴヌクレオチドに向けられた部
位特異的変異誘発のような）を使用して、容易に導入され得る。ヌクレオチド改
変体は、天然に存在する対立遺伝子改変体であってもよく、天然に存在しない改
変体であってもよい。改変体ヌクレオチド配列は、好ましくは、言及される配列
に対して少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も
好ましくは少なくとも約９０％の同一性（以下に記載されるように決定される）
を示す。
【００２５】 本発明により提供されるポリペプチドは、本明細書中で特に言及される１つ以
上のＤＮＡ配列と実質的に相同性のＤＮＡ配列によってコードされる改変体を含
む。本明細書中で使用される場合に、「実質的に相同性」とは、中程度にストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ配列をいう。適切な中程度に
ストリンジェントな条件は、５Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０℃〜６５℃、５Ｘ ＳＳＣ、一
晩で、または種間相同性の場合には、４５℃、０．５Ｘ ＳＳＣでのハイブリダ
イズ；続いて６５℃で２０分間、各々２Ｘ、０．５Ｘ、および０．２ＸのＳＳＣ
（０．１％ ＳＤＳを含む）での２回の洗浄を包含する。このようにＤＮＡ配列
をハイブリダイズすることはまた、コード縮重に起因して、ＤＮＡ配列をハイブ
リダイズすることによってコードされる免疫原性ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列と同様に、本発明の範囲内である。
【００２６】 ２つのヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、以下に記載されるように
最大の対応について整列される場合に、これら２つの配列におけるヌクレオチド
またはアミノ酸残基の配列が同一である場合に、これら２つの配列は「同一」で
あるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的に、比較窓にわたって配列を
比較し、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって、実施される
。本明細書中で使用される場合に、「比較窓」とは、少なくとも２０、通常は３
０〜約７５、４０〜約５０の連続した部分のセグメントをいい、ここで、配列は
、同数の連続部分を有する参照配列と、これら２つの配列を最適に整列させた後
に、比較され得る。
【００２７】 比較のための最適な配列の整列は、生物情報ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，
Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ総合ソフトウェアにお
けるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して、デフォルトパラメータを用いて、
実施され得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかの整列
スキームを実行する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）「Ａ ｍｏｄｅｌ
ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−
Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔ
ｉｏｎｓｈｉｐｓ」Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ ＤＣ 第５巻、増補３、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ Ｊ．（１
９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎ
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ｙｍｏｌｏｇｙ第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（
１９８９）「Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｎ ａ ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ
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ｈｏｄ．Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ
ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４
０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９
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Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｗｉｌｂｕ
ｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｒａｐｉｄ ｓｉｍｉ
ｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｎｋｓ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６−７３０。
【００２８】 好ましくは、「配列同一性の百分率」は、２つの最適に整列した配列を、少な
くとも２０の位置を有する比較窓にわたって比較することによって決定され、こ
こで、この比較窓内のポリヌクレオチド配列の部分は、これら２つの配列の最適
な整列について、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較した場合に
、２０％以下、通常は５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すな
わち、ギャップ）を含み得る。この百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残
基が両方の配列に生じる位置の数を決定して合致した位置の数を得、この合致し
た位置の数を参照配列の位置の総数（すなわち、窓のサイズ）で除算し、そして
この結果に１００を乗算して、配列同一性の百分率を得ることによって、計算さ
れる。
【００２９】 関連する局面において、多重Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープを含む組合せポ
リペプチドが開示される。「組合せポリペプチド」とは、異なるＴ．ｃｒｕｚｉ
抗原のエピトープまたはその改変体が、例えばペプチド連結を介して、単一のア
ミノ酸鎖に結合される、ポリペプチドである。このように形成されるアミノ酸鎖
は、直鎖状であっても分枝鎖であってもよい。このエピトープは、直接結合され
得る（すなわち、介在するアミノ酸なしで）か、またはそのエピトープの抗原性
特性を有意に変化させないリンカー配列（例えば、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）に
よって結合され得る。このペプチドエピトープはまた、非ペプチド連結（例えば
、ペプチドエピトープ上の特定の官能基の間を、例えばアミノ基、カルボキシル
基、またはスルフヒドリル基を介して、化学的にまたは光化学的に結合する、ヘ
テロ二官能性薬剤またはホモ二官能性薬剤）を介して連結され得る。本発明の組
合せポリペプチドにおいて有用に使用され得る二官能性薬剤は、当業者に周知で
ある。エピトープはまた、相補的リガンド／抗リガンド対（例えば、アビジン／
ビオチン）によって連結され得、このとき１つ以上のエピトープが、このリガン
ド／抗リガンド対の第一のメンバーに連結され、次いでこのリガンド／抗リガン
ド対の相補的メンバーに、溶液中または固相のいずれかで結合される。組合せポ
リペプチドは、本明細書中に記載されるようなポリペプチドの多重エピトープを
含み得、そして／または本明細書中に記載のエピトープに連結する、１つ以上の
他のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープ（例えば、ＴｃＤ、ＴｃＥまたはＰＥＰ−
２）を含み得る。
【００３０】 一般に、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原およびこのような抗原をコードするＤＮＡ配列は
、任意の種々の手順を使用して調製され得る。例えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉ ｃＤＮ
ＡまたはゲノムＤＮＡ発現ライブラリーが、Ｔ．ｃｒｕｚｉに感染した個体由来
の血清のプールでスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングは、一般
に、当業者に周知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９に記載されるもの）を使用して実施され得る
。簡単に言えば、バクテリオファージライブラリーがプレートされ得、そしてフ
ィルターに移され得る。次いで、このフィルターは、血清および検出試薬ととも
にインキュベートされ得る。本発明に関して、「検出試薬」とは、抗体−抗原複
合体に結合し得る任意の化合物であり、これが次いで、当業者に公知の任意の種
々の手段によって、検出され得る。スクリーニングの目的のための代表的な検出
試薬は、レポーター基に結合した、プロテインＡ、プロテインＧ、ＩｇＧまたは
レクチンのような「結合剤」を含む。好ましいレポーター基としては、酵素、基
質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基、およびビオチ
ンが挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、レポーター基は、
西洋ワサビペルオキシダーゼであり、これは、テトラメチルベンジジンまたは２
，２’−アミノ−ジ−３−エチルベンゾチアゾールスルホン酸のような基質とと
もにインキュベートすることによって、検出され得る。血清中の抗体に結合する
タンパク質を発現するｃＤＮＡを含むプラークは、当業者に公知の技術によって
、単離および精製され得る。適切な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９に見出され得る。
【００３１】 配列番号１〜配列番号１８に言及されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子
は、上記のように、Ｔ．ｃｒｕｚｉゲノム発現ライブラリーを、Ｔ．ｃｒｕｚｉ
に感染した個体由来の血清のプールを用いてスクリーニングすることにより、単
離され得る。より特定すると、配列番号１〜配列番号１６に言及されるヌクレオ
チド配列を有するＤＮＡ分子は、このライブラリーを、寄生生物溶解物ならびに
／あるいはＴ．ｃｒｕｚｉ抗原ＴｃＤおよびＴｃＥの一方または両方（米国特許
第５，３０４，３７１号および１９９５年３月１４日に出願された米国出願番号
０８／４０３，３７９に記載される）との血清学的反応性を示す（ＥＬＩＳＡま
たはウェスタンアッセイにおいて）血清のプールを用いてスクリーニングするこ
とによって、単離され得る。次いで、引き続くスクリーニングが、検出可能な抗
ＴｃＤ抗体を欠く患者の血清を用いて、実施される。配列番号１７（５’末端）
および配列番号１８（３’末端）に言及されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
分子は、ゲノム発現ライブラリーを、溶解物、ＴｃＤおよびＴｃＥとのより低い
血清学的反応性を示す（すなわち、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンアッセイにおい
て、バックグラウンド反応性にわたって３未満の標準偏差のシグナルを検出する
）血清のプールを用いてスクリーニングし、続いて検出可能な抗ＴｃＤ抗体を欠
く患者の血清を用いてスクリーニングすることによって、単離され得る。
【００３２】 配列番号１９〜配列番号２２に言及される配列を有するＤＮＡ分子は、増幅し
ていないＴ．ｃｒｕｚｉ ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、上記のように、Ｔ．ｃ
ｒｕｚｉに感染した個体由来の血清（より高い血清学的反応性およびより低い血
清学的反応性の両方）を用いてスクリーニングすることによって、得られ得る。
【００３３】 あるいは、配列番号１〜配列番号２２に言及される配列を有するＤＮＡ分子は
、Ｔ．ｃｒｕｚｉゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応を介
して増幅され得る。このアプローチに関して、配列特異的なプライマーは、配列
番号１〜配列番号２２に提供される配列に基づいて設計され得、そして購入また
は合成され得る。次いで、ＤＮＡ配列の増幅された部分を使用して、全長ゲノム
クローンまたはｃＤＮＡクローンを、周知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）に記載される技術）を
用いて、単離し得る。
【００３４】 上記ＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を有する抗原のエピトープは
、一般に、上記のように、ネイティブな抗原の部分を含むポリペプチドを生成す
ること、およびＴ．ｃｒｕｚｉに感染した個体由来の血清とのこのポリペプチド
の反応性を評価することによって、同定され得る。多くの例において、ネイティ
ブな抗原に見出される１つ以上の反復配列を含むペプチドは、エピトープを含む
。このような反復配列は、上記ヌクレオチド配列の検査に基づいて、同定され得
る。上記ＤＮＡ配列によりコードされる抗体に関する代表的な反復配列は、配列
番号２３〜配列番号３６および配列番号４７〜配列番号４９に提供される。より
特定すると、配列番号３に言及される配列に関する反復配列は、配列番号２３（
フレーム１）、配列番号２４（フレーム２）および配列番号２５（フレーム３）
に提供される。配列番号４に言及される配列に関する反復配列は、配列番号２６
（フレーム１）および配列番号２７（フレーム３）に提供され、そして配列番号
９に関する反復配列は、配列番号４７（フレーム１）、配列番号４８（フレーム
２）および配列番号４９（フレーム３）に提供される。配列番号１２については
、反復配列は、配列番号２８（フレーム１）、配列番号２９（フレーム２）およ
び配列番号３０（フレーム３）に提供される。配列番号３１は、配列番号１５の
反復配列を言及する。配列番号１６については、反復配列は、配列番号３２（フ
レーム２）および配列番号３３（フレーム３）に提供される。最後に、配列番号
１８の反復配列は、配列番号３４（フレーム１）、配列番号３５（フレーム２）
および配列番号３６（フレーム３）に提供される。
【００３５】 本明細書中に記載されるポリペプチドは、当業者に周知の技術を使用して作製
され得る。約１００未満のアミノ酸を有するポリペプチド、そして一般的には約
５０未満のアミノ酸は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成方法（ここでは
、アミノ酸が、伸長するアミノ酸鎖に連続的に付加される）を使用して合成され
得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−
２１４６、１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動化合成のための装置は、
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉ
ｓｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡのような供給業者から市販される。従
って、例えば、上記の反復配列を含むポリペプチドまたはその部分は、この方法
により合成され得る。同様に、他のネイティブな抗原のエピトープまたはその改
変体は、自動化合成装置を使用して調製され得る。
【００３６】 あるいは、本発明のポリペプチドは、培養された宿主細胞におけるこのポリペ
プチドをコードする組換えＤＮＡの発現によって調製され得る。好ましくは、宿
主細胞はＥ．ｃｏｌｉ、酵母、昆虫の細胞株（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａま
たはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）または哺乳動物細胞株（（限定されないが）Ｃ
ＨＯ、ＣＯＳ、およびＮＳ−１を含む）である。この様式で発現されるＤＮＡ配
列は、天然に存在するタンパク質（例えば、配列番号１〜配列番号２２のＤＮＡ
配列によってコードされるアミノ酸配列を有する全長抗原、天然に存在するタン
パク質の部分、またはこのようなタンパク質の改変体をコードし得る。このよう
なＤＮＡ配列によってコードされる代表的なポリペプチドは、配列番号３７〜配
列番号４６、配列番号５２および配列番号６５に提供される。
【００３７】 本発明の発現されるポリペプチドは、一般的に、実質的に純粋な形態で単離さ
れる。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも８０重量％の純度まで、より好
ましくは、少なくとも９５重量％の純度まで、そして最も好ましくは少なくとも
９９重量％の純度までに単離される。一般的に、このような精製は、例えば、硫
安沈殿分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフ
ィーに関する標準的技術を使用して達成され得る。
【００３８】 本発明の別の局面では、個体および血液供給源におけるＴ．ｃｒｕｚｉ感染を
検出する方法が開示される。１つの実施形態では、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染は、抗体
を含む任意の生物学的サンプル中で検出され得る。好ましくは、サンプルは、血
液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、または尿である。より好ましくは、サンプル
は、患者または血液供給源から得られる血液サンプルまたは血清サンプルである
。簡潔には、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染は、任意の１つ以上の上記ポリペプチドまたは
その改変体を使用して検出され、予め決定されたカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）
値と比較して、サンプル中のポリペプチド（１つまたは複数）に対する抗体の存
在または非存在を決定し得る。
【００３９】 精製された抗原を使用してサンプル中の抗体を検出するための、当業者に公知
の種々のアッセイ様式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。好ま
しい実施形態では、アッセイは、サンプル由来の抗体に結合しそしてこのサンプ
ル由来の抗体を除去するための固体支持体上の固定化ポリペプチドの使用を包含
する。次いで、結合された抗体は、抗体／ペプチド複合体に結合し、そして検出
可能なレポーター基を含む検出試薬を使用して検出され得る。適切な検出試薬と
しては、抗体／ポリペプチド複合体に結合する抗体およびリポーター基で標識さ
れた遊離ポリペプチドを含む（例えば、半競合アッセイにおいて）。あるいは、
競合アッセイが利用され得、ここではポリペプチドに結合する抗体が、リポータ
ー基で標識され、そして抗原とサンプルとのインキュベーションの後に固定化抗
原に結合される。サンプル中の成分が、ポリペプチドへの標識抗体の結合を阻害
する程度が、固定化ポリペプチドとのサンプルの反応性の指標である。
【００４０】 固体支持体は、抗原を結合し得る、当業者に公知の任意の固体物質であり得る
。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートの試験ウェルまたはニトロ
セルロースもしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、支持体は、ビーズまた
はディスク（例えば、ガラス、繊維ガラス、ラテックスまたはプラスチック材料
（例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロリド））であり得る。支持体はま
た、磁気粒子または光ファイバー検出器（例えば、米国特許第５，３５９，６８
１号に開示されるような）であり得る。
【００４１】 ポリペプチドは、当業者に公知の種々の技術（これらは、特許および科学文献
において十分に記載されている）を使用して、固体支持体に結合され得る。本発
明の文脈において、用語「結合される（結合した）」は、非共有結合（例えば、
吸着）および共有結合の両方をいう（これは、抗原と支持体上の官能基との間の
直接的な結合であり得るか、または架橋剤による連結であり得る）。マイクロタ
イタープレート中のウェルまたは膜への吸着による結合が好ましい。このような
場合、吸着は、適切な量の時間、適切な緩衝液中においてポリペプチドと固体支
持体とを接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度とともに変動
するが、代表的には、約１時間と１日との間である。一般的には、プラスチック
マイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロリド）
のウェルと、約１０ｎｇ〜約１μｇの範囲（そして好ましくは約１００ｎｇ）の
量のポリペプチドとを接触させることは、十分な量の抗原を結合するに十分であ
る。ニトロセルロースは、１ｃｍ3あたり約１００μｇのタンパク質を結合する
。
【００４２】 固体支持体へのポリペプチドの共有結合は、一般的に、まず、支持体およびポ
リペプチド上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応
する二官能性試薬と支持体とを反応させることによって達成され得る。例えば、
ポリペプチドは、ベンゾキノンを使用してか、または支持体上のアルデヒド基と
ポリペプチド上のアミンおよび活性水素との縮合によって、適切なポリマーコー
ティングを有する支持体に結合され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏ
ｔｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９１）
、Ａ１２〜Ａ１３を参照のこと）。
【００４３】 特定の実施形態では、アッセイは、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩ
ＳＡ）である。このアッセイは、まず、固体支持体（通常、マイクロタイタープ
レートのウェル）上に固定されたポリペプチド抗原とサンプルとを接触させるこ
とによって実施され、その結果、サンプル中のポリペプチドに対する抗体は、固
定されたポリペプチドに結合される。次いで、結合していないサンプルを、固定
されたポリペプチドから除去し、そして固定された抗体−ポリペプチド複合体に
結合し得る検出試薬を添加する。次いで、固体支持体に結合されたまま残存する
検出試薬の量を、特定の検出試薬について適切な方法を使用して決定する。
【００４４】 一旦、ポリペプチドが支持体上に固定されると、支持体上に残存するタンパク
質結合部位は、代表的にブロックされる。当業者に公知の任意の適切なブロック
剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）は、例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴ
ｗｅｅｎ ２０TM（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
、ＭＯ）である。次いで、固定されたポリペプチドをサンプルと共にインキュベ
ートし、そして抗体（サンプル中に存在する場合）を、抗原に結合させる。サン
プルは、インキュベーション前に適切な希釈剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩
水（ＰＢＳ））で希釈され得る。一般的に、適切な接触時間（すなわち、インキ
ュベーション時間）とは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染サンプルにおけるＴ．ｃｒｕｚｉ
抗体の存在の検出を許容するに十分な期間の時間である。好ましくは、接触時間
は、結合した抗体と結合していない抗体との間の平衡状態で達成されるレベルの
少なくとも９５％である結合レベルを達成するに十分である。当業者は、平衡状
態を達成するために必要とされる時間が、一定時間にわたって生じる結合のレベ
ルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを理解する。室温では、
約３０分間のインキュベーション時間が、一般的に十分である。
【００４５】 次いで、結合していないサンプルは、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ ２０TMを含有するＰＢＳ）で固体支持体を洗浄することによって除去され
得る。次いで、検出試薬を固体支持体に添加し得る。適切な検出試薬は、固定さ
れた抗体−ポリペプチド複合体に結合し、そして当業者に公知の種々の任意の手
段によって検出され得る任意の化合物である。好ましくは、検出試薬は、レポー
ター基に結合体化された結合剤（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グ
ロブリン、レクチン、または遊離抗原のような）を含む。好ましいレポーター基
としては、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、イン
ヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基およびビオチンが挙げられる。レ
ポーター基への結合剤の結合体化は、当業者に公知の標準的方法を使用して達成
され得る。種々のレポーター基に結合体化された、一般的な結合剤はまた、多く
の供給業者から購入され得る（例えば、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡおよびＰｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、
ＩＬ）。
【００４６】 次いで、検出試薬は、結合した抗体を検出するに十分な量の時間、固定された
抗体−ポリペプチド複合体と共にインキュベートされる。適切な量の時間は、一
般的に、製造業者の指示書から、または一定時間にわたって生じる結合のレベル
をアッセイすることによって決定され得る。次いで、結合していない検出試薬は
除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を使用して検出される。レ
ポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する
。放射性の基については、シンチレーション計数器またはオートラジオグラフィ
方法が、一般的に適切である。分光学的な方法を使用して、色素、発光基および
蛍光基を検出し得る。ビオチンは、異なるレポーター基（通常は、放射性または
蛍光性の基または酵素）にカップリングされ、アビジンを使用して検出され得る
。酵素レポーター基は、一般的に、基質の添加（一般的には、特定期間の時間）
、次いで、分光学的または他の反応産物の分析によって検出され得る。
【００４７】 サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ抗体の存在または非存在を決定するために、固体
支持体に結合されたまま残存するレポーター基から検出されるシグナルを、一般
的に、予め決定されたカットオフ値に対応するシグナルに対して比較する。この
カットオフ値とは、好ましくは、固定した抗原を、感染していない患者由来のサ
ンプルと共にインキュベートした場合に得られるシグナルの平均である。一般的
に、この平均を超えて３標準偏差であるシグナルを生成するサンプルを、Ｔ．ｃ
ｒｕｚｉ抗体およびＴ．ｃｒｕｚｉ感染について陽性とみなす。代替的な好まし
い実施形態では、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐ
ｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１０６〜７頁（Ｌｉｔｔｌｅ Ｂｒｏｗｎ ａｎ
ｄ Ｃｏ．、１９８５）の方法に従って、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ
Ｃｕｒｖｅを使用して決定される。簡潔には、本実施形態では、カットオフ値
を、真の陽性比率（すなわち、感受性）および偽陽性比率（１００％特異性）の
対のプロット（これは、診断的試験結果についての各陽性カットオフ値に対応す
る）から決定され得る。左上側の角に最も近いプロットにおけるカットオフ値（
すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そしてこの
方法によって決定されるカットオフ値よりも高いシグナルを生成するサンプルを
陽性とみなし得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性比率を最小化するために
プロットに沿って左手に、または偽陰性比率を最小化するために右手にシフトさ
れ得る。一般的に、この方法によって決定されるカットオフ値よりも高いシグナ
ルを生成するサンプルを、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染について陽性とみなす。
【００４８】 関連の実施形態では、アッセイは、フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ
）試験様式またはストリップ（ｓｔｒｉｐ）試験様式で実施され、ここでは、抗
原をニトロセルロースのような膜に固定する。フロースルー試験では、サンプル
中の抗体は、膜を通過するサンプルとして固定されたポリペプチドに結合する。
次いで、抗体−ポリペプチド複合体に結合する検出試薬（例えば、プロテインＡ
−コロイド金）を、検出試薬を含有する溶液としてこの膜に貫流させる。次いで
、結合した検出試薬の検出を、上記のように実施し得る。ストリップ試験様式で
は、ポリペプチドが結合する膜の一端を、サンプルを含有する溶液中に浸漬させ
る。サンプルは、検出試薬を含有する領域を通過して膜に沿って移動し、そして
固定されたポリペプチドの領域まで移動する。このポリペプチドにおける検出試
薬の濃度は、サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ抗体の存在を示す。このような試験は
、代表的に、非常に少量（例えば、１滴）の患者の血清または血液を用いて実施
され得る。
【００４９】 上記で議論されるアッセイは、本明細書中に記載の１つ以上のポリペプチドを
用いて実施され得る。あるいは、この感度は、１つ以上のさらなるＴ．ｃｒｕｚ
ｉ抗原のエピトープを上記のポリペプチドと組み合わせて用いることによって、
改善され得る。特に、ＴｃＤ（例えば、米国特許第５，３０４，３７１号に開示
される）、ＰＥＰ−２またはＴｃＥ（これらの両方は、例えば、米国シリアル番
号第０８／４０３，３７９（１９９５年、３月１４日出願）に開示される）のエ
ピトープは、上記のポリペプチドと組み合わせて使用され得る。ＰＥＰ−２抗原
性エピトープがまた、Ｐｅｒａｌｔａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
３２：９７１−７４，１９９４に議論される。ＴｃＤの配列は、配列番号５０に
提供され、ＴｃＥの配列は、配列番号５１に提供される。ＴｃＤ抗原性エピトー
プは、好ましくは、アミノ酸配列Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａ
ｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｓ
ｅｒ（配列番号５３）、またはアミノ酸配列Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｌｙｓ Ｐｒｏ（配列番号５４）を有する。ＴｃＥエピトープは、好ましくは、
アミノ酸配列Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙ
ｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌ
ａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ（配列番号５５）、またはアミノ酸配列Ｌ
ｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａ
ｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａ
ｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ（配列番号５６）を有し、そしてＰＥＰ２エピトープは、
好ましくは、アミノ酸配列Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ（配列番号５７）を
有する。
【００５０】 さらに、エピトープは、同じポリペプチド内（すなわち、組み合わせポリペプ
チド（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）の中）に存在し得る
か、または別のポリペプチド中に含まれ得る。組み合わせポリペプチドは、以下
の実施例２に記載されるように合成的にか、または以下の実施例７に記載のよう
に組み換えＤＮＡ技術を用いてかのいずれかで調整され得る。好ましくは、この
ポリペプチドは、マイクロタイタープレートの壁もしくは膜（上記に記載のよう
な）のような固体支持体上に吸着によって固定化され、その結果、大体同じ量の
各ポリペプチドが、その支持体と接触し、そして支持体と接触するポリペプチド
の総量は、約１ｎｇ〜１０μｇの範囲となる。この工程の残りは、一般的に、上
記に記載のように実施され得る。
【００５１】 上記に記載のポリペプチドはまた、ＴｃＤ、ＴｃＥおよび／またはＰＥＰ２由
来の１つ以上のエピトープを用いて、以下の診断に使用され得る。この実施形態
において、本発明は発明のポリペプチドは、ＴｃＤ、ＴｃＥおよび／またはＰＥ
Ｐ２を用いたクスリーニングに基づいたＴ．ｃｒｕｚｉ感染の診断を確認するた
めに使用される。ＴｃＤ、ＴｃＥおよび／またはＰＥＰ２由来のエピトープを用
いたＴ．ｃｒｕｚｉ感染の診断は、米国シリアル番号第０８／４０３，３７９号
（１９９５年３月１４日出願）に記載される。
【００５２】 本発明のさらに別の局面において、上記のように、１つ以上のエピトープに単
一特異的な抗体（これは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る）を
用いた、生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉを検出する方法が提供される。精
製ポリペプチドまたは合成ポリペプチドに対する抗体は、当業者に公知の任意の
種々の技術によって調整され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。ある
そのような技術において、抗原性ポリペプチドを含む免疫原は、最初に任意の広
範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）に
注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変せずに免疫原と
して役立ち得る。あるいは、相対的に短いポリペプチドに関して特に、ポリペプ
チドがウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンのようなキ
ャリアタンパク質に結合される場合、優れた免疫応答が誘発され得る。免疫原は
、好ましくは１つ以上のブースター免疫を組み入れる予め決定されたスケジュー
ルに従って、動物宿主に注射され、そしてその動物は、定期的に繁殖される。次
いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体が、例えば、適切な固体支持
体に結合したポリペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって
、そのような抗血清から精製され得る。
【００５３】 目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈ
ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５
１９，１９７６ならびにこれに対する改善技術を用いて調整され得る。簡単に言
うと、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応
性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調整を含む。そのような細胞株は
、例えば、上記のように免疫化された動物から得られた脾細胞から産生され得る
。次いでこの脾細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー（好ましくは、免疫
された動物と同系である融合パートナー）との融合によって不死化される。種々
の融合技術が使用され得る。例えば、この脾細胞および骨髄腫細胞は、非イオン
性界面活性剤と数分間合わされ得、次いでハイブリッド細胞の増殖を支持するが
骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地上に、低い密度でプレートに播かれる。
好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選
択を使用する。十分な時間の後（通常、約１〜２週間）、ハイブリッドのコロニ
ーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてポリペプチドに対する結合活性
について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい
。
【００５４】 モノクローナル抗体は、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され
得る。さらに、種々の技術（例えば、マウスのような適切な脊椎動物宿主の腹膜
腔へのハイブリドーマ細胞株の注射）が、収率を上げるために使用され得る。次
いで、モノクローナル抗体は、腹水または血液から回収され得る。夾雑物は、従
来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱および抽出）によって
抗体から除去され得る。
【００５５】 本明細書中に記載の１つ以上のポリペプチドのエピトープに単一特異的な抗体
は、任意の種々の免疫アッセイを用いて生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感
染を検出するために使用され得、これは直接または競合的であり得る。本発明の
この局面の使用に適切な生物学的サンプルは、上記に記載のようなサンプルであ
る。簡単に言うと、１つの直接アッセイ形式において、単一特異的抗体は、固体
支持体上（上記に記載のような）に固定化され、そして試験されるサンプルと接
触され得る。結合していないサンプルの除去後、レポーター基によって標識され
た第２の単一特異的抗体が、添加され、そして結合抗原を検出するために使用さ
れ得る。例示的な競合アッセイにおいて、サンプルは、適切なレポーター基で標
識された、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と結合され得る。次い
で、サンプルと抗体の混合物が、適切な固体支持体上に固定化されたポリペプチ
ド抗原と結合され得る。サンプル中で抗原に結合していない抗体は、固定化され
た抗原に結合され、そしてサンプルおよび抗体の残りが除去される。固体支持体
への抗体結合のレベルは、サンプル中の抗原のレベルと逆に関連する。従って、
低いレベルの固体支持体への抗体の結合は、サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉの存在
を示す。Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の存在または非存在を決定するために、固体支持体
に結合したままであるレポーター基から検出されたシグナルは、一般的に、予備
決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。そのようなカットオ
フ値は、一般的に、上記のように決定され得る。ＥＬＩＳＡの文脈中に上記で議
論された任意のレポーター基を使用して、単一特異的抗体を標識し得、そして結
合は、使用されるレポーター基に適切な任意の種々の技術によって検出され得る
。サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉを検出するための単一特異的抗体を用いる他の形
式は、当業者に明らかであり、そして、上記の形式は、単に例示的な目的で提供
される。
【００５６】 本発明の別の局面において、哺乳動物におけるＴ．ｃｒｕｚｉ感染およびその
合併症の予防のためのワクチンおよび薬学的処方物が提供される。薬学的処方物
は、一般的に、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の１つ以上のエピトープを含む１つ以
上のポリペプチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む。ワクチンは、
免疫応答の増強のための、１つ以上の上記のポリペプチドおよびアジュバントを
含む。
【００５７】 投与の経路および頻度ならびにポリペプチドの用量は、個体によって変化し、
そして他の原生動物感染に対する免疫に現在使用されるこれらと近似し得る。一
般的に、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、筋内、静脈内または皮
下）、鼻腔内（例えば、吸引によって）または経口によって投与され得る。１と
４との間の用量が、２〜６週間で投与され得る。第１回よりも２〜４週間遅れて
第２回目が行なわれる、２用量の投与が好ましい。適切な用量は、処置される哺
乳動物中で抗体を惹起するのに十分な量のポリペプチドであり、これは、ある期
間、哺乳動物をＴ．ｃｒｕｚｉ感染から保護するのに十分である。一般的に、１
用量に存在するポリペプチドの量は、宿主のｋｇあたり、約１ｐｇ〜約１００ｍ
ｇ、代表的には約１０ｐｇ〜約１ｍｇ、そして好ましくは約１００ｐｇ〜１μｇ
である。適切な用量サイズは、動物の大きさによって変化するが、代表的に１０
〜６０ｋｇの動物に対して約０．０１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【００５８】 当業者に公知の任意の適切なキャリアが本発明の薬学的組成物中に使用され得
るが、キャリアの型は、投与の形態に依存して変化する。非経口投与（例えば、
皮下注射）に関して、キャリアは好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂
肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与に関しては、任意の上記のキャリア
または固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸
マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、スクロ
ース、および炭酸マグネシウム）が、使用され得る。生物分解性ミクロスフェア
（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ｇａｌａｃｔｉｄｅ）
）がまた、本発明の薬学的組成物のキャリアとして使用され得る。
【００５９】 任意の種々のアジュバントが、免疫応答を非特異的に増強するために、本発明
のワクチン中に使用され得る。多くのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原
を保護するために設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムもしくはミネラ
ルオイル）、および免疫応答の非特異的刺激物質（例えば、脂質Ａ、Ｂｏｒｄｅ
ｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓもしくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ）を含む。そのようなアジュバントは、例えば、Ｆｒｅｕｎｄｓ
Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄ
ｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ
）およびＭｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ，Ｉｎｃ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）のように市販される。
【００６０】 後の実施例は、例示のために提供されるが、限定のためではない。
【００６１】 （実施例） （実施例１） （Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原をコードするＤＮＡの調整） この実施例は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原をコードするゲノムおよびｃＤＮＡ分子の
調整を示す。
【００６２】 （Ａ，ゲノムクローンの調整） ゲノム発現ライブラリーは、製造者らの指示書に従いλ ＺＡＰ発現系（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、無作為に剪断されたＴ
．ｃｒｕｚｉゲノムＤＮＡ（Ｔｕｌａｈｕｅｎ Ｃ２株）から構築した。１つの
スクリーニングにおいて、このライブラリーを、寄生虫溶解物および／またはＴ
．ｃｒｕｚｉ抗原ＴｃＤおよびＴｃＥの１つもしくは両方と高い反応性を示す５
人の患者由来の血清プールを用いて、スクリーニングした（米国特許第５，３０
４，３７１号および米国シリアル番号第０８／４０３，３７９（１９９５年３月
１４日出願）に記載される）。５人の患者の血清の各々を、全溶解物および／ま
たはＴｃＤもしくはＴｃＥを用いたウエスタンおよびＥＬＩＳＡアッセイに基づ
いて、反応性であると決定した。抗Ｅ．ｃｏｌｉ反応性は、スクリーニングの前
に吸着によって血清から除去した。５０，０００ｐｆｕの増幅していないライブ
ラリーを、血清プールを用いてスクリーニングし、そして血清と反応するタンパ
ク質を発現するプラークを、プロテインＡ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＢＴ
Ｓ基質を有する）を用いて検出した。次いで、引き続くスクリーニングは、組み
換えＴｃＤを用いたウエスタンおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出可能な抗
ＴｃＤ抗体を欠く３人の患者由来の血清プールを用いて実施した。
【００６３】 同様のスクリーニングを、溶解物、ＴｃＤおよびＴｃＥと低い反応性（すなわ
ち、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンアッセイにおいて、バックグラウンドの反応性
に対して３未満の標準偏差が検出されたシグナル）を示す血清プールを用いて実
施し、続いて、上記のように、検出可能な抗ＴｃＤ抗体を欠く患者血清を用いて
引き続きスクリーニングした。
【００６４】 次いで、上記のスクリーニングの少なくとも１つにおいて両方の血清プールと
反応するタンパク質を発現する２８個のクローンを単離した。ｐＢＳＫ（−）フ
ァージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の切
除は、製造者らのプロトコールに従って実施した。オーバーラップするクローン
が、エキソヌクアーゼＩＩＩ消化によって産生され、そして一本鎖鋳型を、ＶＣ
ＳＭ １３ヘルパーファージを用いた感染の後に単離した。このＤＮＡを、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動化配列決定装置（Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ
）を用いて、ジデオキシチェインターミネーター法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉ
ｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）またはＴａｑジターミネーター系
（Ｔａｑ ｄｉ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）によって配列決定した
。
【００６５】 ２８クローンについて、５個は以前に報告され、２つは同一であり、そして８
つは縮重４２塩基対反復によって示される同一のペプチド配列を含んだ。配列番
号１６は、４２塩基対反復配列を含むプロトタイプのクローンを示す。従って、
Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原をコードする１４個の新規ＤＮＡ配列が、反応性血清プール
を用いた上記のスクリーニングを用いて調整された（配列番号１〜配列番号１６
に示し、ここで、配列番号４および配列番号５は、それぞれ、単一クローンの５
’および３’末端を示し、配列番号９および配列番号１０は、それぞれ、単一ク
ローンの５’および３’末端を示す）。１つの新規な配列が、低い反応性を有す
る血清を用いたスクリーニングで得られた（配列番号１７（５’末端）および配
列番号１８（３’末端）に示す）。
【００６６】 （Ｂ．ｃＤＮＡクローンの調整） ポリＡ＋ＲＮＡを、Ｔ．ｃｒｕｚｉ（Ｔｕｌａｈｕｅｎ Ｃ２株）の細胞内無
べん毛型段階から精製した。このＲＮＡを逆転写し、そして製造者らの指示書に
従ってλ ＵｎｉＺａｐ発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）中に、一方向性ｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築するために使用した
。５０，０００ｐｆｕの増幅されていないライブラリーを、高い血清学的反応性
および低い血清学的反応性の両方を示す患者血清を含む血清プールを用いてスク
リーニングし、続いて、上記のように検出可能な抗ＴｃＤ抗体を欠く患者血清を
用いて引き続きスクリーニングした。全部で３２個のクローンをこのスクリーニ
ングから単離した。これらのクローンの２５個は、高い免疫原性として以前に同
定された翻訳装置のタンパク質であり、そしてこれらの全ては、このゲノム発現
ライブラリーのスクリーニングによって同定されたクローンとは異なっていた。
残りの７個を、配列番号１９〜配列番号２２に提供される配列によって表す。配
列番号２２に示される配列は、Ｔ．ｃｒｕｚｉユビキチンの配列である。
【００６７】 （実施例２：合成ポリペプチドの合成） 本実施例は、本明細書中に記載のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原由来の配列を有するポリ
ペプチドの合成を示す。
【００６８】 ポリペプチドを、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾチアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テ
トラメチルウロニウム（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロ
ホスフェート）活性化と共にＦＭＯＣ化学を用いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ９０５
０ペプチド合成機で合成し得る。ｇｌｙ−ｃｙｓ−ｇｌｙ配列をペプチドのアミ
ノ末端またはカルボキシ末端に結合して、ペプチドの結合または標識の方法を提
供し得る。固体支持体からのペプチドの切断を、以下の切断混合物を用いて行い
得る：トリフルオロ酢酸：エタンジオール：チオアニソール：水：フェノール（
４０：１：２：２：３）。２時間の切断の後、ペプチドを、冷メチル−ｔ−ブチ
ル−エーテル中で沈澱させ得る。次いで、ペプチドのペレットを、０．１％トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水中に溶解し、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣで精製
する前に凍結乾燥し得る。水中（０．１％ ＴＦＡ）０％〜６０％アセトニトリ
ル（０．１％ＴＦＡ含有）の勾配を用いて、ペプチドを溶出し得る。純粋画分を
凍結乾燥させた後に、このペプチドをエレクトロスプレー質量分析を用い、そし
てアミノ酸分析により特徴付けした。
【００６９】 この手順を用いて、例えば、以下の配列を有する、Ｔｃｃ２２−１、Ｔｃｃ２
２−１＋、Ｔｃｃ２２−２．１（配列番号４１内に含まれる）、ＴｃＬｏ１．１
、１．２、および１．３（配列番号３４、３５、および３６内に含まれる）およ
びＴｃＨｉ１０．１および１０．３（配列番号２６および２７）のようなペプチ
ドを合成した：
【００７０】
【化１】
【００７１】 （実施例３：Ｔ．ｃｒｕｚｉ組換え抗原の血清学的反応性） 本実施例は、血清学的に活性であることが見いだされたいくつかの組換え抗原
の診断特性を示す。これは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性血清および陰性血清との反応性
の研究ならびに他の疾患を有する患者由来の血清との交叉反応性研究を含む。
【００７２】 アッセイを９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｅａｓｉｗａｓｈ，Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中で行った。ウェルを炭酸コーティング緩衝液
（ｐＨ９．６）５０μｌでコーティングした。Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解物については
１００ｎｇ／ウェルを用い、そして組換え抗原の各々については２００ｎｇ／ウ
ェルを用いた。ウェルを４℃で一晩（または３７℃で２時間）コーティングした
。次いで、プレート内容物を除去し、そして２００μｌのＰＢＳ／１％ ＢＳＡ
で２時間、ウェルをブロッキングした。ブロッキング工程の後、ＰＢＳ／０．１
％ ＴｗｅｅｎTM ２０でウェルを５回洗浄した。次いで、ＰＢＳ／０．１％
Ｔｗｅｅｎ ２０TM／０．１％ ＢＳＡで１：５０に希釈した５０μｌの血清（
Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染に対して陽性または陰性のいずれか）を、各ウェルに添加し
、そして室温で３０分間インキュベートした。次いで、再びこのプレートをＰＢ
Ｓ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０TMで５回洗浄した。
【００７３】 次いで、酵素結合体（西洋ワサビペルオキシダーゼ−プロテインＡ，Ｚｙｍｅ
ｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ
２０TM／０．１％ ＢＳＡで１：２０，０００に希釈し、そして希釈した結合体
５０μｌを各ウェルに添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。イン
キュベーションの後、再びウェルをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０TMで５
回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質であるテトラメチルベンジジン（Ｋｉｒｋｅ
ｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＭＤ）１００μｌを希釈せずに、各ウェルに添加し、１５分間イン
キュベートした。１００μｌの１Ｎ Ｈ2ＳＯ4を各ウェルに添加することにより
反応を停止させ、そしてプレートを４５０ｎｍで読みとった。
【００７４】 図１は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解物と比較した場合の組換えｒＴｃｃ６（配列番号
３９）の反応性を示す。陰性の平均および３つの標準偏差のカットオフに基づく
と、５０の血清サンプルのうち４９が溶解物に対して陽性であり、５０のうち３
４がｒＴｃｃ６に対して陽性であった。同様の研究（図２に示す）において、組
換えｒＴｃｃ２２（配列番号４１）は、７９．２％の感受性を有することが見い
だされた（４８の血清サンプルのうち３８が陽性であった）。同様の基準を用い
ると、組換えｒＴｃｃ３８（配列番号３８）とＴ．ｃｒｕｚｉ溶解物との比較研
究により、溶解物について３９／３９と比較して、２４／３９が陽性であった（
図３）。潜在的に交叉反応性の血清を用いて試験した場合、Ｔｃｃ３８は、Ｔ．
ｃｒｕｚｉ溶解物より改善された特異性を示した。
【００７５】 組換えＴｃＨｉ１２（配列番号３７）はまた、免疫反応性が６２．５％（１５
／２４）の感受性を有することが見いだされた（図２）。
【００７６】 （実施例４：Ｔ．ｃｒｕｚｉ合成ペプチド抗原の血清学的反応性） 本実施例は、実施例２に記載したペプチドのいくつかの診断特性を示す。これ
らのペプチドをＴ．ｃｒｕｚｉ陽性血清および陰性血清との反応性について試験
し、そしていくらかの場合には、潜在的に交叉反応性である他の疾患を有する患
者由来の血清との交叉反応性について試験した。
【００７７】 第１の群のペプチドは、最も反応性の反復配列を決定するために異なるリーデ
ィングフレームを含んでいた。試験したペプチドは、配列番号１８に提供される
ＤＮＡ配列のリーディングフレーム１、２および３を示すＴｃＬｏ１．１（配列
番号３４内に含まれる）、ＴｃＬｏ１．２（配列番号３５内に含まれる）、およ
びＴｃＬｏ１．３（配列番号３６内に含まれる）、ならびにＴｃＨｉ１０配列（
配列番号５に示される）のリーディングフレームのうち２つを示すＴｃＨｉ１０
．１（配列番号）２６およびＴｃＨｉ１０．３（配列番号２７）であった。デー
タを図４に示す。ＴｃＬｏフレームの場合、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性個体および陰性
個体由来の血清に対して試験したとき、ＴｃＬｏ１．１および１．２の両ペプチ
ドは、強く反応性であったが、ＴｃＬｏ１．２は、シグナル対ノイズにおいて優
れていた。ＴｃＬｏ１．３は、より低いシグナルを有したが、低いバックグラウ
ンドも有した。この研究において溶解物は２４／２４陽性を検出し、ＴｃＬｏ１
．１は、２４／２１を検出し、ＴｃＬｏ１．２は２３／２４を検出し、そしてＴ
ｃＬｏ１．３は１５／２４を検出した。同じ研究において、２つのフレームＴｃ
Ｈｉ１０．１および１０．３は、それぞれ１９／２４および１４／２４陽性を検
出したが、ＴｃＬｏ１よりシグナルが小さかった。これらの異なるリーディング
フレームを用いた交叉反応性研究により、ＴｃＬｏ１．２は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶
解物と比較した場合、試験した血清と最小限の交叉反応性を有することが示され
る（図５）。
【００７８】 実施例２において議論されるように、重複するペプチドを、活性エピトープを
決定するためにｒＴｃｃ２２に関して合成した。ペプチドＴｃｃ２２−１、１＋
、および２を、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性血清および陰性血清を用いて試験した。結果
を図２に示す。Ｔｃｃ２２−１およびＴｃｃ２２−２．１ペプチドは、Ｔｃｃ２
２−１ペプチドより活性であった。第１の実験において、３８／４８陽性を検出
した組換えＴｃｃ２２と比較して、Ｔｃｃ２２−１およびＴｃｃ２２−１＋は２
９／４８および３６／４８陽性を検出した。引き続く実験において、Ｔｃｃ２２
−２．１はまた、同じプレートコーティングレベルでＴｃｃ２２−１＋より反応
性であったが、シグナルは小さかった。
【００７９】 また、ＴｃＨｉ１５フレーム３反復配列（配列番号４９）を有するポリペプチ
ドを合成し、そして２００ｎｇ／ウェルのコーティングレベルを用いてＥＬＩＳ
Ａアッセイにおいて試験した。合計４８のＴ．ｃｒｕｚｉ陽性血清および２６の
陰性血清を、このペプチド配列の反応性を決定するために試験した。この研究に
おいて、このペプチドは、６８．７５％の感受性（４８陽性のうち３３を検出）
および９２．３％の特異性（３６陰性のうち２４）を有した。このことは、この
ポリペプチドは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染を検出することにおいて潜在的な重要性を
有することを示す。このアッセイの結果を、以下の表１に示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
【００８２】 （実施例５：ペプチド組み合わせの血清学的反応性） 本実施例は、いくつかのペプチド組み合わせの診断特性を示す。
【００８３】 ＴｃＬｏ１．２ペプチド（配列番号３５内に含まれる）を合成ペプチドＴｃＤ
そしてまた二重エピトープ（ｄｕａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）ペプチドＤ／２（Ｔｃ
ＤおよびＰＥＰ−２配列を含む）およびＤ／Ｅ（ＴｃＤおよびＴｃＥ配列を含む
）と組み合わせて試験した。これらの組み合わせを個々のペプチドならびにトリ
ペプチド２／Ｄ／Ｅ（これは、ＴｃＤ、ＴｃＥおよびＰＥＰ−２を含む）と比較
した。使用したＴｃＤ配列は以下であった：
【００８４】
【化２】
【００８５】 （配列番号５３）。ＴｃＥ配列は、以下であった：
【００８６】
【化３】
【００８７】 （配列番号５５）。そしてＰＥＰ２配列は以下であった：
【００８８】
【化４】
【００８９】 （配列番号５７）。
【００９０】 データを図６に示す。結果は、表２にまとめるように、ＴｃＬｏ１．２がＴｃ
Ｄ、Ｄ／２およびＤ／Ｅの反応性を増大させ得ることを示す。
【００９１】
【表２】
【００９２】 これらの結果は、本明細書中に記載されるように、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の使用
は、他の抗原の血清診断的特性を増強することを実証する。
【００９３】 （実施例６：ＴｃＥ反復配列の血清学的反応性） 本実施例は、いくつかのＴｃＥ反復配列の診断的特性を示す。
【００９４】 組換えＴｃＥの反復配列領域は、いくつかの縮重を含んでおり、Ａ（アラニン
）、Ｔ（スレオニン）またはＩ（イソロイシン）が反復配列中に存在し得る残基
中に生じている。全ての縮重を示すために、合成ＴｃＥペプチドの本来の配列を
、３つの反復を含む単一ペプチド中にＡ、ＴおよびＩで作製した（実施例５を参
照のこと）。さらに反復領域をエピトープマッピングし、そして血清学的活性に
必要な反復数を決定するために、以下のペプチドを実施例２に記載されるように
調製した：
【００９５】
【化５】
【００９６】 次いで、これらのペプチドの血清学的反応性を比較した。合計２４の陽性血清
および２１の陰性血清を、２５ｎｇ／ウェルのペプチドを用いてＥＬＩＳＡアッ
セイにおける固相を実施例３に記載されるように行った場合、ＴｃＥ改変体の各
々を用いて試験した。異なるペプチドの反応性を図７に示す。最も高い反応性は
、各反復が縮重残基においてＡを含んでいた３反復ペプチド（ＴｃＥ（３Ａ））
で見られた。このペプチドは３反復中にＡ、ＴおよびＩ残基を含んでいる本来の
ＴｃＥ配列よりなお高い反応性を示した。対照してみると、３Ｉおよび３Ｔ改変
体は、試験したＴ．ｃｒｕｚｉ陽性サンプルに対して本質的に陰性であった。Ａ
での２反復を含む配列（ＴｃＥ（２Ａ））は、３Ａ配列より明らかに反応性がお
とり、そしてＡおよびＴでの２反復配列（ＴｃＥ（ＡＴ））は、陰性であった。
陰性の平均＋３つの標準偏差のカットオフに基づくと、本来のＴｃＥ（Ａ、Ｔ、
Ｉ）は、２４陽性のうち１７を検出し、そして３Ａ改変体は、２４陽性のうち１
１９を検出した。これは、最大の血清学的活性を得るためには、少なくとも３反
復が必要であることを表す。
【００９７】 （実施例７：多重エピトープ（ｍｕｌｔｉ−ｅｐｉｔｏｐｅ）ペプチド組み合
わせの血清学的反応性） 本実施例は、いくつかの多重エピトープペプチド組み合わせの診断的特性を示
す。
【００９８】 ２つのジペプチドＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ１．２（これは、ＰＥＰ−２（配列番
号５７）およびＴｃＬｏ１．２（配列番号３５）の配列を含む）ならびにＴｃＤ
／ＴｃＥ（これは、ＴｃＤ（配列番号５３）およびＴｃＥ（配列番号５５）配列
を含む）を実施例２に記載のように合成した。これらの２つのジペプチドのＴ．
ｃｒｕｚｉ抗体陽性血清に対する反応性を、トリペプチド２／Ｄ／Ｅの反応性と
比較した。２５０ｎｇ／ウェルのＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ１．２および５０ｎｇ／
ウェルのＴｃＤ／ＴｃＥを用いて、実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡを行った
。この研究の結果を図８に示す。トリペプチド２／Ｄ／Ｅと反応しないことが見
出された１つのＴ．ｃｒｕｚｉ陽性血清をＴｃＬｏ１．２エピトープについての
スクリーニングについて使用した。この血清は、予測したとおり、ＴｃＬｏ１．
２エピトープにより検出され、そしてまたジペプチド混合物（ＴｃＤ／ＴｃＥと
ともにＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ１．２）により検出された。
【００９９】 ４つの免疫反応性Ｔ．ｃｒｕｚｉエピトープＰＥＰ−２、ＴｃＤ、ＴｃＥおよ
びＴｃＬｏ１．２を含む、直鎖状配列であるテトラペプチド（本明細書中以降、
２／Ｌｏ／２Ｅ／Ｄ（配列番号６３）といわれる）を、実施例２に記載のように
合成した。このテトラペプチドを１００ｎｇ／ウェルでコーティングし、そして
Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性血清および陰性血清に対するその反応性を実施例３に記載の
ようにアッセイした。テトラペプチド２／Ｌｏ／２Ｅ／Ｄの反応性を図８に示す
。トリペプチド２／Ｄ／Ｅに対して反応しないことが見出された１つのＴ．ｃｒ
ｕｚｉ陽性血清は、予測したとおり、テトラペプチドにより検出された。
【０１００】 ４つの免疫反応性Ｔ．ｃｒｕｚｉエピトープＰＥＰ−２、ＴｃＤ、ＴｃＥおよ
びＴｃＬｏ１．２をまた、リジンコア残基から生じた「分枝」ペプチドの使用に
より１つの試薬に連結した。例えば、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆ
ｍｏｃ）を利用するα−アミノ基に対するリジンの直接保護（ｏｒｔｈｏｇｏｎ
ａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）および１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキ
ソシクロヘックス−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）を利用するε−アミノ基に
対するリジンの直接保護を用いて、他方のアミノ基の存在下で一方のアミノ基の
選択的脱保護を可能にする。これにより、リジン上のα−またはε−基のいずれ
かに由来する第１のペプチド鎖の合成を可能にする。第１のペプチド鎖は、第２
のペプチド鎖の合成過程の間に除去されない保護基で終結する。例えば、ｔｅｒ
ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）アミノ酸を、ＤｄｅおよびＦｍｏｃ組み合わ
せと共に使用し得る。次いで、残りのリジンアミノ保護基を除去した後、第２の
アミノ酸鎖を第２のアミノ部分から合成する。例えば、ε−Ｄｄｅを、２０％
ヒドラジンで除去する。固体支持体からの分枝ペプチドの切断およびＮ−α−Ｂ
ｏｃ部分の除去を、標準的なプロトコルに従ってトリフルオロ酢酸を用いて行う
。このアプローチを用いて２つの独立したアミノ酸配列を、以下に示すように「
コア」リジン残基から構築し得、従ってＴｃＤ、ＴｃＥ、ＰＥＰ２、ＴｃＬｏ１
．２および他のエピトープの種々の組み合わせをコア残基にカップリングさせ得
る。得られたペプチドの精製を実施例２に記載のように行う。
【０１０１】
【化６】
【０１０２】 （実施例８） （組換えＤＮＡ技術を使用したマルチエピトープペプチドの組合せ物の調製） この実施例は、組換えＤＮＡ技術を使用した、ペプチドＰＥＰ−２（配列番号
５７）、ペプチドＴｃＤ（配列番号５３）、ペプチドＴｃＥ（配列番号５５）、
およびペプチドＴｃＬｏ１．２（配列番号３５）の融合ポリペプチド（本明細書
中では以下、ＴｃＦといわれる）の調製を説明する。
【０１０３】 ＴｃＦポリペプチド融合物を、重複するリン酸化されたオリゴヌクレオチドを
合成し、一致したオリゴヌクレオチド対をアニーリングして二本鎖ＤＮＡを作製
し、アニールされた対を、適切な酵素で切断されたベクターＤＮＡと連結し、そ
して配列決定のための適切な細菌宿主株（ＸＬ２、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に形質転換することによって作製した。一旦、正確な配
列が得られると、構築物は改変されたｐＥＴ２８ベクター中にサブクローン化さ
れ、そして発現および精製のためにＢＬＲ ｐＬＹＳ Ｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中に形質転換した。
【０１０４】 ＰＥＰ２−ＴｃＤ融合の構築物について、オリゴヌクレオチドＰＤＭ−９５（
配列番号６６）およびオリゴヌクレオチドＰＤＭ−９８（配列番号６７）；ＰＤ
Ｍ−９６（配列番号６８）およびＰＤＭ−９９（配列番号６９）；ならびにＰＤ
Ｍ−９７（配列番号７０）およびＰＤＭ−１００（配列番号７１）の一致した対
を、合成し、キナーゼ処理（ｋｉｎａｓｅｄ）、そしてアニールした。次いで、
これらの３対のアニールされたオリゴを、連結し、ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化し、Ｅｃｏ７２Ｉお
よびＥｃｏＲＩを用いて、改変されたＴベクター構築物中にクローン化した。Ｐ
ＥＰ２−ＴｃＤ−ＴｃＥ融合の構築物について、以下の一致した対のオリゴヌク
レオチドを合成し、キナーゼ処理し、そしてアニールした：ＰＤＭ−１０３（配
列番号７２）およびＰＤＭ−１０５（配列番号７３）；ならびにＰＤＭ−１０４
（配列番号７４）およびＰＤＭ−１０６（配列番号７５）。これらの２対のアニ
ールされたオリゴを、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）およびＥｃｏＲＩで切断されたｐＴ７ΔＬ２ＰＥＰ２−ＴｃＤ構築物中に
連結した。
【０１０５】 ＰＥＰ２−ＴｃＤ−ＴｃＥ−Ｌｏ１．２融合の構築物について、２つの一致し
た対のオリゴヌクレオチドＰＤＭ−１０８（配列番号７６）およびオリゴヌクレ
オチドＰＤＭ−１１０（配列番号７７）；ならびにＰＤＭ−１０９（配列番号７
８）およびＰＤＭ−１１１（配列番号７９）を合成し、キナーゼ処理し、そして
アニールした。これらの２対のアニールされたオリゴヌクレオチドを、ＥａｇＩ
で切断し、平滑末端のためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いでＥｃｏ
ＲＩで切断されたｐＴ７ΔＬ２ＰＥＰ２−ＴｃＤ−ＴｃＥ構築物と連結した。ｐ
Ｔ７ΔＬ２ベクター中の内部ＥａｇＩ部位に起因して、ＰＣＲ反応は、全長ＰＥ
Ｐ２−ＴｃＤ−ＴｃＥ−Ｌｏ１．２構築物をクローン化するために、鋳型として
連結混合物を用いて行った。ＰＣＲを、以下の条件を使用して、プライマーＰＤ
Ｍ−１０１およびプライマーＰＤＭ−１０７（それぞれ、配列番号８０および８
１）を用いて達成した： ９６℃ ２分間 ９６℃ １５秒間 ６１℃ １５秒間、７２℃ １分間 ×４０サイクル ７２℃ ４分間 ＰＣＲ反応のために、Ｐｆｕｌ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用した。ＰＣＲ後、ＤＮＡをエタノール沈澱に供
し、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ
で消化された、改変されたＴベクター構築物中に連結した。
【０１０６】 得られたクローンをＨｉｎｄＩＩＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｂ
ｕｒｇ，ＭＤ）およびＳｐｈ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
で消化し、平滑末端のためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いでベクタ
ーの内部のＥａｇ Ｉ部位およびＮｓｉ Ｉ部位を検出するために再連結した。
次いで、この新しいクローンをＥａｇＩおよびＮｓｉＩで消化し、平滑末端のた
めにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そして、ＴｃＬｏ１．２配列の末端に
インフレームで終止コドンを作製するために再連結した。このクローンをＮｄｅ
ＩおよびＥｃｏ ＲＩで消化し、そして同じ酵素で切断された、改変されたｐＥ
Ｔ２８ｂベクター中にサブクローン化した。
【０１０７】 得られた発現構築物をＢＬＲ ｐＬｙｓ Ｓ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｇｅｎ
）中に形質転換し、そしてカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ Ｓｉｇｍａ
）と共にＬＢブロス中で一晩増殖させた。一晩の培養物（１２ｍｌ）を使用して
、同じ抗生物質を有する５００ｍｌの２ＸＹＴを接種し、そしてこの培養物を、
０．３〜０．６のＯＤ５６０にて、ＩＰＴＧを用いて、１．０ｍＭの最終濃度ま
で誘導した。誘導の４時間後、細菌を収集し、そして２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．
０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＤＯＣ、２０μｇ／ｍｌ ロイペプチン
および２０ｍＭ ＰＭＳＦ中で超音波処理し、次いで２６，０００×ｇで遠心分
離した。超音波処理後、この融合タンパク質を可溶性の上清中に見出した。この
上清を、Ｐｒｏ−ｂｏｎｄニッケル樹脂カラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ、ＣＡ）に結合させた。このカラムを、５０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ（８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ洗浄緩衝液で洗浄し、漸増濃度のイミダゾ
ールで溶出した。特に、この溶出は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ洗浄緩衝液中の５０ｍＭ、１００ｍＭ、および５００ｍＭのイミダ
ゾールを用いて行った。目的のタンパク質を含む溶出液をプールし、そして１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）に対して透析した。
【０１０８】 透析後、このタンパク質を濃縮し、濾過滅菌し、そして内毒素について試験し
た。試験結果は、高いレベルの内毒素混入を示した。従って、濾過滅菌されたタ
ンパク質を、Ｈｉｇｈ Ｑ アニオン交換カラム（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌ
ｅｓ、ＣＡ）で精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）中で結合し、そして１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）中で１ＭまでのＮａＣｌ勾配で溶離した。目的のタン
パク質を含む溶出液をプールし、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）に対して
透析した。透析後、このタンパク質を再濃縮し、濾過滅菌し、そしてタンパク質
濃度を決定するためにＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ
）を行った。決定されたＴｃＦのアミノ酸配列は、配列番号８２で提供される。
【０１０９】 組換え融合ポリペプチドＴｃＦの、Ｔ．ｃｒｕｚｉ患者および正常なドナー由
来の血清との反応性を、上述のようにＥＬＩＳＡによって試験した。図１１に示
されるように、ＴｃＦの反応性は、分枝状の合成テトラペプチド２／Ｄ／Ｅ／Ｌ
ｏ１．２の反応性と非常に類似していることが見出された。
【０１１０】 組換え融合ポリペプチドＴｃＦ中のペプチドの順序は、ポリペプチドの活性を
有意に変化させることなく変更され得ることが予期される。また、ペプチド間で
のＧｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ結合の含有は、ポリペプチドの活性に有意に影響を与
えることなく固相結合を増大させ得る。
【０１１１】 融合ペプチドの各々の間にグリシン−シトシン−グリシンアミノ酸スペーサー
を有する、ペプチドＰＥＰ−２（配列番号５７）、ペプチドＴｃＤ（配列番号５
３）、ペプチドＴｃＥ（配列番号５５）、およびペプチドＴｃＬｏ１．２（配列
番号３５）の融合ポリペプチド（本明細書中では以下、ＴｃＦ−２といわれる）
を、重複するリン酸化されたオリゴを合成し、一致したオリゴ対をアニーリング
して二本鎖ＤＮＡを作製し、アニールされた対を、適切な酵素で切断されたベク
ターＤＮＡと連結し、そして配列決定のための適切な細菌宿主株（ＸＬ２、Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換することによって調製した。一旦、正確な配列
が得られると、改変されたｐＥＴ２８ベクター中に構築物をサブクローン化し、
そして発現および精製のためにＢＬＲ ｐＬＹＳ Ｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩ）中に形質転換した。
【０１１２】 より具体的には、ＰＥＰ２−ＧＣＣ−ＴｃＤ融合物を、以下の一致した対のオ
リゴを合成し、キナーゼ処理し、そしてアニーリングすることによって構築した
：ＰＤＭ−９５（配列番号６６）およびＰＤＭ−９８（配列番号６７）；ＰＤＭ
−１１２（配列番号８３）およびＰＤＭ−１１３（配列番号８４）；ならびにＰ
ＤＭ−１１４（配列番号８５）およびＰＤＭ−１１５（配列番号８６）。３対の
アニールされたオリゴを、連結し、ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ
で切断された場合にはインフレームでＨｉｓタグを有する、改変されたｐＴ７ｂ
ｌｕｅ構築物中にクローン化した。ＰＥＰ２−ＧＣＧ−ＴｃＤ−ＧＣＧ−ＴｃＥ
融合物の構築のために、以下の一致した対のオリゴを合成し、キナーゼ処理し、
そしてアニールした：ＰＤＭ−１１６（配列番号８７）およびＰＤＭ−１１７（
配列番号８８）；ならびにＰＤＭ−１１８（配列番号８９）およびＰＤＭ−１１
９（配列番号９０）。次いで、これらの一致したオリゴの２つの対を、Ｅｃｏ４
７ＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｌａｂｓ．）およびＥｃｏ ＲＩで切断され
た上記のＰＥＰ２−ＧＣＧ−ＴｃＤ構築物に連結した。
【０１１３】 オリゴＰＤＭ−１２０（配列番号９２）およびオリゴＰＤＭ−１２１（配列番
号９２）、ならびにＰＤＭ−１２２（配列番号９３）およびＰＤＭ−１２３（配
列番号９４）の一致した対を合成し、キナーゼ処理し、そしてアニールし、次い
でＥａｇ Ｉで切断された上記のＰＥＰ２−ＧＣＧ−ＴｃＤ−ＧＣＧ−ＴｃＥ構
築物と連結し、平滑末端のためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いでＥ
ｃｏ ＲＩで切断した。次いで、このクローンをＮｄｅ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲ
Ｌ）およびＥｃｏ ＲＩで消化し、そして同じ酵素で切断された、改変されたｐ
ＥＴ２８ベクター中にサブクローン化した。
【０１１４】 次いで、発現構築物をＢＬＲ ｂＬｙｓ Ｓ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｇｅｎ
）に形質転換し、そしてカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ、ＭＯ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ Ｓｉｇｍａ）
を有するＬＢブロス中で一晩増殖させた。１２ｍｌの一晩の培養物を使用して、
同じ抗生物質を有する５００ｍｌの２ＸＹＴを接種し、そしてこの培養物を、０
．３７のＯＤ５６０にて、ＩＰＴＧを用いて、１．０ｍＭの最終濃度まで誘導し
た。誘導の４時間後、細菌を収集し、そして２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）、１
００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＤＯＣ、２０μｇ／ｍｌ ロイペプチンおよび２
０ｍＭ ＰＭＳＦ中で超音波処理し、次いで２６，０００×ｇで遠心分離した。
超音波処理後、この融合タンパク質を可溶性の上清中に見出した。次いで、この
上清を、Ｐｒｏ−ｂｏｎｄニッケル樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ、ＣＡ）に結合させた。このカラムを、５０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８
．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ洗浄緩衝液で洗浄し、次いで漸増濃度のイミダゾ
ールで溶出した。この溶出は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ洗浄緩衝液中の５０ｍＭ、１００ｍＭ、および５００ｍＭのイミダゾール
を用いて行った。目的のタンパク質を含む溶出液をプールし、次いで１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（８．０）に対して透析した。
【０１１５】 透析後、タンパク質を、Ｈｉｇｈ Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃ
Ａ）アニオン交換カラムに取り込み、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）中で結合し
、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）中で１ＭまでのＮａＣｌ勾配で溶離した
。目的のタンパク質を含む溶出液をプールし、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．
０）に対して透析した。透析後、このタンパク質を再濃縮し、濾過滅菌し、そし
てタンパク質濃度を決定するためにＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を行った。
決定されたＴｃＦ−２のアミノ酸配列は、配列番号９５で提供される。
【０１１６】 （実施例９） （ＴｃＨｉ２９およびＴｃＥの血清学的活性の比較） 抗原ＴｃＨｉ２９（配列番号５２）は、ＴｃＥ反復配列の多型体であることが
示された。ＴｃＥと比較して以下の配列を有するＴｃＨｉ２９ペプチドを合成し
た。 ＴｃＥ ＫＡＡＩＡＰＡＫＡＡＡＡＰＡＫＡＡＴＡＰＡ（配列番号５５） ＴｃＨｉ２９ ＫＴＡＡＰＰＡＫＴＡＡＰＰＡＫＴＡＡＰＰＡ（配列番号６４） 図９は、上記の手順を使用してＥＬＩＳＡによって決定されるような、Ｔ．ｃ
ｒｕｚｉ陽性患者由来の血清ならびに他の疾患カテゴリー由来の血清に関連する
これらの２つの配列の反応性の比較を示す。データは、試験された他の疾患群と
の交差反応性をほとんど示さないか、または全く示さないが、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽
性血清の間での反応性の分布は、２つのペプチドについて部分的に重複すること
を示した。試験された５３個のコンセンサス陽性サンプルのうち、ＴｃＥは３１
／５３を検出し、そしてＴｃＨｉ２９は、３６／５３を検出した。このＴｃＥお
よびＴｃＨｉ２９の群において、両者は２４個の同一血清を検出した。ＴｃＥは
、ＴｃＨｉ２９によって検出されなかった７個の陽性血清を検出し、代わってＴ
ｃＨｉ２９は、ＴｃＥによって検出されなかった１２個の陽性血清を検出した。
ジペプチドＴｃＤ／ＴｃＨｉ２９をまた合成し、そしてＥＬＩＳＡ（１００ｎｇ
／ウェル ＴｃＤ／ＴｃＨｉ２９、２５０ｎｇ／ウェル ＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ
１．２）において、ＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ１．２ジペプチドと組み合わせて使用
し、そしてＴｃＤ／ＴｃＥおよびＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ１．２のジペプチドの組
み合わせと比較した。図１０に示されるように、データは、２つの混合物の全体
の活性が、研究されたＴ．ｃｒｕｚｉの陽性集団および陰性集団の両者について
類似していることを示し、そしてこのようなペプチドの組合せにおいて、ＴｃＨ
ｉ２９はＴｃＥに代替的であると考えられ得ることを示唆する。
【０１１７】 前記から、本発明の特定の実施形態が、本明細書中に例示の目的で記載された
が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ること
が理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染した（Ｐｏｓ）個体および感染していない（Ｎｅ
ｇ）個体からの血清を使用して行ったＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ｔ．ｃｒｕ
ｚｉ溶解物の反応性と代表的な本発明のポリペプチド（ｒＴｃｃ６）とを比較す
るグラフである。バーは、±１標準偏差を表す。
【図２】 図２は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染した（Ｐｏｓ）個体および感染していない（Ｎｅ
ｇ）個体からの血清を使用して行ったＥＬＩＳＡアッセイにおいて、本発明の代
表的なポリペプチドの反応性の比較を表すグラフである。実験１は、ｒＴｃｃ２
２と、ペプチドＴｃｃ２２−１およびＴｃｃ２２−１＋との比較を示す；実験２
は、ｒＴｃｃ２２、ｒＴｃＨｉ１２と、ペプチドＴｃｃ２２−１、Ｔｃｃ２２−
１＋およびＴｃｃ２２−２．１との比較を示す。バーは、±１標準偏差を表す。
【図３】 図３は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染した（Ｐｏｓ）個体および感染していない（Ｎｅ
ｇ）個体からの血清を使用して、ならびに内臓リーシュマニア症（ＶＬ）、皮膚
リーシュマニア症（ＣＬ）、結核（ＴＢ）、およびマラリアを有する個体由来の
血清を使用して行ったＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解物の反
応性と代表的なポリペプチド（Ｔｃｃ３８）との比較を示すグラフである。バー
は、±１標準偏差を表す。
【図４】 図４は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解物および本発明のいくつかのポリペプチドの反応
性の比較を示すグラフである。このグラフは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染した（Ｐｏｓ
）個体および感染していない（Ｎｅｇ）個体からの血清を使用して行ったＥＬＩ
ＳＡアッセイにおいて、ＴｃＬｏ１抗原およびＴｃＨｉ１０抗原の異なるリーデ
ィングフレームを示す。バーは、±１標準偏差を表す。
【図５】 図５は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染した（Ｐｏｓ）個体および感染していない（Ｎｅ
ｇ）個体からの血清を使用して、ならびに内臓リーシュマニア症（ＶＬ）、皮膚
リーシュマニア症（ＣＬ）、マラリア、および結核（ＴＢ）を有する個体由来の
血清を使用して行ったＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解物の反
応性と代表的なポリペプチド（ＴｃｃＬｏ１．２）との比較を示すグラフである
。バーは、±１標準偏差を表す。
【図６】 図６は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性血清およびＴ．ｃｒｕｚｉ陰性血清との一連のポ
リペプチドの組合せのＥＬＩＳＡ反応性を示すグラフである。
【図７】 図７は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性血清およびＴ．ｃｒｕｚｉ陰性血清との一連のＴ
ｃＥポリペプチド改変体のＥＬＩＳＡ反応性を示すグラフである。
【図８】 図８は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性血清およびＴ．ｃｒｕｚｉ陰性血清との本発明の
２つのジペプチド、トリペプチド、およびテトラペプチドのＥＬＩＳＡ反応性を
比較するグラフである。
【図９】 図９は、正常な個体、Ｔ．ｃｒｕｚｉ患者、および他の疾患を有する患者由来
の血清を用いる、本発明の代表的なポリペプチド（ＴｃＨｉ２９）およびＴｃＥ
のポリペプチドのＥＬＩＳＡ反応性を示すグラフである。
【図１０】 図１０は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性血清およびＴ．ｃｒｕｚｉ陰性血清を用いる２
つの代表的なジペプチド混合物のＥＬＩＳＡ反応性を比較するグラフであり、一
方の混合物にはＴｃＥエピトープが含まれ、そして他方には本発明のＴｃＨｉ２
９エピトープが含まれる。
【図１１】 図１１は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ患者および正常なドナー由来の血清を用いる組換え
融合ポリペプチドＴｃＦのＥＬＩＳＡ反応性と、合成分枝テトラペプチド２／Ｄ
／Ｅ／Ｌｏ１．２の反応性とを比較するグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ Ｃ０７Ｋ 14/44 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スケイキー， イエイサー エイ．ダブリ ュー． アメリカ合衆国 ワシントン 98107， シアトル， 25ティーエイチ アベニュー エヌダブリュー − 8327 (72)発明者 ロデス， マイケル ジェイ． アメリカ合衆国 ワシントン 98126， シアトル， 36ティーエイチ アベニュー エスダブリュー − 9223 (72)発明者 ハウトン， レイモンド エル． アメリカ合衆国 ワシントン 98021， ボゼル， 242エヌディー プレイス エ スイー − 2636 (72)発明者 スミス， ジョン エム． アメリカ合衆国 ワシントン 98208， エベレット， 116ティーエイチ プレイ ス エスイー − 208 (72)発明者 マクネイル， パトリシア ディー． アメリカ合衆国 ワシントン 98198， デ モワネ， エス． 248ティーエイチ ストリート 1421 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 CA04 CA06 DA06 EA04 GA11 HA15 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA18 BA19 CA11 DC50 MA02 NA14 ZA362 ZB072 ZB372 4C085 AA03 BA03 CC13 DD23 DD32 DD35 DD37 EE03 4H045 AA11 AA30 CA20 DA86 EA52 FA73

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の少なくとも１つのエピトープを有する
    組み合わせポリペプチドであって、該エピトープが、以下： （１）アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
    −Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
    −Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａを含む、ＰＥＰ−２エピト
    ープ； （２）アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
    −Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒを含む、
    ＴｃＤエピトープ； （３）アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
    −Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏを含む、
    ＴｃＤエピトープ； （４）アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
    −Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
    −Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａを含む、ＴｃＥエピトープ； （５）アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
    −Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
    −Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａを含む、ＴｃＥエピトープ； （６）アミノ酸配列；Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
    ｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
    ｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
    ｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａを含む、ＴｃＬｏ１．２エピトープ； ならびに保存的な置換および／あるいは改変においてのみ異なるそれらの改変体
    、 からなる群より選択される、組み合わせポリペプチド。
  2. 【請求項２】 生物学的サンプルにおいてＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するた
    めの方法であって、以下 （ａ）該生物学的サンプルを、請求項１に記載の組み合わせポリペプチドと接触
    させる工程；および （ｂ）該生物学的サンプルにおいて、該組み合わせポリペプチドに結合する抗体
    の存在を検出し、これにより該生物学的サンプルにおけるＴ．ｃｒｕｚｉ感染を
    検出する工程、 を包含する、方法。
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