JP2002537783A - T.cruzi感染の検出および予防のための、化合物および方法 - Google Patents
T.cruzi感染の検出および予防のための、化合物および方法Info
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Abstract
Description
細には、1以上のT.cruzi抗原性ペプチド、またはそれに対する抗体の、
T.cruzi感染についての個体および血液供給をスクリーニングするための
方法および診断キットにおける使用に関する。本発明はまた、シャーガス病を予
防するために個体を免疫するためのワクチン組成物に関する。
panosoma cruzi(T.cruzi)は、主に中央アメリカおよび
南アメリカにおいて何百万もの個体に感染するような寄生生物の1種である。こ
の寄生生物の感染は、シャーガス病を引き起こし得る。これは、慢性心疾患およ
び種々の免疫系障害を生じ得る。ラテンアメリカにおいて1800万人の人がT
.cruziに感染していることが見積もられているが、感染の臨床的な症状に
ついての信頼できる処置は存在しない。シャーガス病の予防のためのワクチンは
、現在利用可能ではない。
triatomid虫との接触を通してである。しかし、他の地域においては、
輸血が伝染の優勢な手段である。そのような地域においてT.cruzi感染を
阻害するために、個体におけるT.cruzi感染を診断するためおよび血液供
給をスクリーニングするための正確な方法を開発することが必要である。サンプ
ルの0.1%〜62%が感染し、そして寄生生物が輸血によってしばしば伝染す
る南アフリカでは、血液銀行スクリーニングが特に重要である。特定の米国の都
市における血液供給もまた、T,cruzi寄生生物によって汚染され得るとい
う関心が増大している。
寄生生物を検出するための正確な方法が利用可能でなかったからである。何十年
も続き得る感染の急性期の間、その感染は静止状態でありそして宿主が無症候性
であり得る。結果として、T.cruzi感染についての血清学的試験は、最も
信頼でき、そして最も一般的に使用される。
免疫応答によって複雑である。この寄生生物は、昆虫ベクター中でエピマスティ
ゴート段階を、そして哺乳動物宿主中で2つの主要段階を通過する。1つの宿主
段階は血液中に存在し(トリポマスティゴート段階)、そして第2の段階は細胞
内である(無べん毛型段階)。複数の段階が、感染の間に寄生生物によって提示
される抗原の多様性を生じる。さらに、原生生物感染に対する免疫応答は、複雑
であり、寄生生物抗原のアレイに対する体液性応答および細胞媒介応答の両方を
含む。
診断する最も一般的で信頼できる方法であり、現在の試験は高価でありかつ困難
である。大部分の血清学的な試験は、全体のまたは溶解したT.cruziを使
用し、そしてT.cruzi感染を正確に検出するために3つの試験(補体結合
、間接的免疫蛍光、受動的凝集反応、またはELISAを含む)の内の2つで陽
性な結果を必要とする。このような試験のコストおよび困難さは、多くの地方病
地域において血液または血清のスクリーニングを妨害する。
出する、より特異的かつ感受性の方法についての必要性が存在する。本発明は、
これらの必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
の検出および防御のため、および生物学的サンプル中のT.cruzi感染につ
いてのスクリーニングのための化合物および方法を提供する。1つの局面におい
て、本発明は、生物学的サンプル中でのT.cruzi感染を検出するための方
法を提供し、この方法は、以下を包含する:(a)生物学的サンプルを、配列番
号1〜配列番号22に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ
酸配列を有するT.cruzi抗原のエピトープ、または保存性置換および/も
しくは改変においてのみ異なるそのような抗原の改変体のエピトープを含むポリ
ペプチドと接触させる工程; ならびに(b)生物学的サンプル中におけるポリ
ペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それから生物学的サンプル中のT.c
ruzi感染を検出する工程。
チド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するT.cruzi抗原のエピ
トープ、または保存性置換および/もしくは改変においてのみ異なるそのような
抗原の改変体のエピトープを含むポリペプチドが提供される。
のDNA配列を含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターを用いて形質
転換またはトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供される。
を検出するための診断キットを提供し、このキットは以下を含む:(a)配列番
号1〜配列番号22に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ
酸配列を有するT.cruzi抗原のエピトープ、または保存性置換および/も
しくは改変においてのみ異なるそのような抗原の改変体のエピトープを含むポリ
ペプチド;ならびに(b)検出試薬。
感染の存在を検出するための方法を提供し、この方法は以下を包含する:(a)
生物学的サンプルを、配列番号1〜配列番号22に列挙されるヌクレオチド配列
によってコードされるアミノ酸配列を有するT.cruzi抗原のエピトープ、
または保存性置換および/もしくは改変においてのみ異なるそのような抗原の改
変体のエピトープに結合するモノクローナル抗体を接触させる工程;ならびに(
b)生物学的サンプル中においてモノクローナル抗体に結合するT.cruzi
寄生生物の存在を検出する工程。
ア、ならびにアジュバントと組み合わせて上記のポリペプチドを含むワクチンを
含む薬学的組成物もまた、提供される。
を患者に投与する工程を包含する、患者におけるシャーガス病に対する防御免疫
を誘導するための方法を提供する。
を検出するための方法を提供し、この方法は以下を包含する:(a)生物学的サ
ンプルを、配列番号1〜配列番号22に列挙されるヌクレオチド配列によってコ
ードされるアミノ酸配列を有するT.cruzi抗原のエピトープ、または保存
性置換および/もしくは改変においてのみ異なる上記抗原の改変体のエピトープ
を含む第1のポリペプチドと接触させる工程;(b)生物学的サンプルを、他の
T.cruzi抗原、または保存性置換および/もしくは改変においてのみ異な
るその上記抗原の改変体の1つ以上のエピトープを含む1つ以上のさらなるポリ
ペプチドと接触させる工程;および(c)生物学的サンプル中における1つ以上
の上記ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それから生物学的サンプル
中のT.cruzi感染を検出する工程。1つの実施形態において、さらなるポ
リペプチドは、TcDのエピトープ、または保存性置換および/もしくは改変に
おいてのみ異なるその改変体のエピトープを含む。別の実施形態において、さら
なるポリペプチドは、TcDのエピトープ(または保存性置換および/もしくは
改変においてのみ異なるその改変体)、およびTcEのエピトープ(または保存
性置換および/もしくは改変においてのみ異なるその改変体)を含む。なお別の
実施形態において、さらなるポリペプチドは、TcDのエピトープ(または保存
性置換および/もしくは改変においてのみ異なるその改変体)およびPEP−2
(または保存性置換および/もしくは改変においてのみ異なるその改変体)を含
み得る。
プチドの組み合わせを提供し、各ポリペプチドは、配列番号1〜配列番号22に
列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するT.c
ruzi抗原のエピトープ、または保存性置換および/もしくは改変においての
み異なるその改変体のエピトープを含む。配列番号1〜配列番号22に列挙され
るヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するT.cruzi
抗原の少なくとも1つのエピトープ、または保存性置換および/もしくは改変に
おいてのみ異なるその改変体のエピトープ、ならびに、TcDエピトープ、Tc
Eエピトープ、PEP−2エピトープ、および保存性置換および/もしくは改変
においてのみ異なるそれらの改変体のエピトープからなる群より選択される少な
くとも1つのエピトープを含む、組み合わせポリペプチドもまた、提供される。
特定の実施形態において、配列番号82または95のアミノ酸配列を含む組み合
わせポリペプチドが提供される。このような組み合わせポリペプチドは、合成的
手段によるかまたは組換えDNA技術を用いるかのいずれかで調製され得る。
ための方法が提供され、この方法は、(a)生物学的サンプルを、上記の組み合
わせのポリペプチドの少なくとも1つと接触させる工程、および(b)生物学的
サンプルにおいて、組み合わせポリペプチドに結合する抗体の存在を検出する工
程を包含する。
が参照して明らかになる。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、あたか
も個々に援用されるかのように、それによってその全体が本明細書中に参考とし
て援用される。
i感染を検出および防御するための化合物および方法に関する。本発明の化合物
は、一般的に、T.cruzi抗原の1つ以上のエピトープを含む。特に、配列
番号1〜配列番号22に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミ
ノ酸配列を有するT.cruzi抗原のエピトープを含むポリペプチドが好まし
い。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、全長(すなわち、
ネイティブな)抗原を含む、任意の長さのアミノ酸の鎖を含む。従って、エピト
ープを含むポリペプチドは、全体的にエピトープから構成され得るか、またはさ
らなる配列を含み得る。さらなる配列は、ネイティブな抗原から誘導され得るか
、または異種であり得、そしてそのような配列は、抗原性であり得る(しかし、
そのれが必要というわけではない)。特定のアミノ酸配列を「有する」タンパク
質は、列挙された配列をその全長配列内に含むタンパク質である。このようなタ
ンパク質は、さらなるアミノ酸配列を含んでもよいし、含まなくてもよい。診断
の感度および特異性を増強するための、本明細書中に列挙された1つ以上のエピ
トープの配列の前のまたはそれと組み合わせるさらなるT.cruziタンパク
質からの1つ以上のエピトープの使用もまた、意図される。
一部であり、これは、T.cruziに感染した個体由来の血清と反応する(す
なわち、あるエピトープがこのような血清内の1つ以上の抗体により特異的に結
合される)。本願に記載される抗原のエピトープは、一般に、当業者に公知の方
法(例えば、Paul、Fundamental Immunology、第3
版、243−247(Raven Press、1993)およびそこで引用さ
れる参考文献に要約される方法)を使用して同定され得る。例えば、ネイティブ
なT.cruzi抗原由来のポリペプチドは、T.cruziに感染した患者か
ら得たプールされた血清と反応する能力に関して、スクリーニングされ得る。T
.cruziに感染した血清との反応性を評価するための適切なアッセイ(例え
ば、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA))は、以下ならびにHa
rlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory
Manual、Cold Spring Harbor Laboratory
、1988にさらに詳細に記載される。ポリペプチドのエピトープは、全長ポリ
ペプチドの反応性に実質的に類似のレベルで、このような抗血清と反応する部分
である。換言すれば、エピトープは、抗体結合アッセイ(例えば、ELISA)
において、全長ポリペプチドによって生成される応答の少なくとも約80%、そ
して好ましくは少なくとも約100%を生成し得る。
細書中で使用される場合に、ポリペプチド「改変体」とは、保存的置換および/
または改変のみが、言及されるポリペプチドとは異なり、その結果、このポリペ
プチドの抗原性特性が保持される、ポリペプチドである。好ましい実施形態にお
いて、改変体ポリペプチドは、5以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によっ
て、同定された配列とは異なる。このような改変体は、一般に、上記ポリペプチ
ド配列の1つを改変し、そして例えば、本明細書中に記載の代表的な手順を使用
して、この改変したポリペプチドの抗原性特性を評価することによって、同定さ
れ得る。ポリペプチド改変体は、好ましくは、同定されたポリペプチドとの少な
くとも約70%、より好ましくは少なくとも約90%、そして最も好ましくは少
なくとも約95%の同一性(以下に記載されるように決定される)を示す。
の特性を有する別のアミノ酸で置換され、その結果、ペプチド化学の当業者が、
そのポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー(hydropathic)の
性質が実質的に変化しないと予測する、置換である。一般に、以下のアミノ酸の
群は、保存的変化を示す:(1)ala、pro、gly、glu、asp、g
ln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3
)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、
his;および(5)phe、tyr、trp、his。
二次構造およびヒドロパシーの性質に対する最少の影響を有するアミノ酸の、欠
失または付加が挙げられる)を含み得る。例えば、ポリペプチドは、このタンパ
ク質の移動を翻訳と同時にまたは翻訳後に方向付けるタンパク質のN末端におい
て、シグナル(またはリーダー)配列と結合体化し得る。このポリペプチドはま
た、ポリペプチドの合成、精製もしくは同定の容易のために(例えば、ポリ−H
is)、あるいはこのポリペプチドの固体支持体上への結合を増強するために、
リンカーまたは他の配列と結合体化し得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロ
ブリンFc領域と結合体化し得る。
加を有する点で、言及されるヌクレオチド配列とは異なる配列である。このよう
な改変は、標準的な変異誘発技術(例えば、Adelmanら(DNA、2:1
83、1983)により教示されるような、オリゴヌクレオチドに向けられた部
位特異的変異誘発のような)を使用して、容易に導入され得る。ヌクレオチド改
変体は、天然に存在する対立遺伝子改変体であってもよく、天然に存在しない改
変体であってもよい。改変体ヌクレオチド配列は、好ましくは、言及される配列
に対して少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、そして最も
好ましくは少なくとも約90%の同一性(以下に記載されるように決定される)
を示す。
上のDNA配列と実質的に相同性のDNA配列によってコードされる改変体を含
む。本明細書中で使用される場合に、「実質的に相同性」とは、中程度にストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNA配列をいう。適切な中程度に
ストリンジェントな条件は、5X SSC、0.5%SDS、1.0mM ED
TA(pH8.0)の溶液中での予備洗浄;50℃〜65℃、5X SSC、一
晩で、または種間相同性の場合には、45℃、0.5X SSCでのハイブリダ
イズ;続いて65℃で20分間、各々2X、0.5X、および0.2XのSSC
(0.1% SDSを含む)での2回の洗浄を包含する。このようにDNA配列
をハイブリダイズすることはまた、コード縮重に起因して、DNA配列をハイブ
リダイズすることによってコードされる免疫原性ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列と同様に、本発明の範囲内である。
最大の対応について整列される場合に、これら2つの配列におけるヌクレオチド
またはアミノ酸残基の配列が同一である場合に、これら2つの配列は「同一」で
あるといわれる。2つの配列の間の比較は、代表的に、比較窓にわたって配列を
比較し、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって、実施される
。本明細書中で使用される場合に、「比較窓」とは、少なくとも20、通常は3
0〜約75、40〜約50の連続した部分のセグメントをいい、ここで、配列は
、同数の連続部分を有する参照配列と、これら2つの配列を最適に整列させた後
に、比較され得る。
Inc.、Madison、WI)のLasergene総合ソフトウェアにお
けるMegalignプログラムを使用して、デフォルトパラメータを用いて、
実施され得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかの整列
スキームを実行する:Dayhoff,M.O.(1978)「A model
of evolutionary change in proteins−
Matrices for detecting distant relat
ionships」Dayhoff,M.O.(編)Atlas of Pro
tein Sequence and Structure、National
Biomedical Research Foundation、Wash
ington DC 第5巻、増補3、345〜358頁;Hein J.(1
990)Unified Approach to Alignment an
d Phylogenes、626〜645頁、Methods in Enz
ymology第183巻、Academic Press,Inc.、San
Diego、CA;Higgins,D.G.およびSharp,P.M.(
1989)「Fast and sensitive multiple se
quence alignments on a microcomputer
」CABIOS 5:151−153;Myers,E.W.およびMulle
r W.(1988)「Optimal alignments in lin
ear space」CABIOS 4:11−17;Robinson,E.
D.(1971)Comb.Theor 11:105;Santou,N.N
es,M.(1987)「The neighbor joining met
hod.A new method for reconstructing
phylogenetic trees」Mol.Biol.Evol.4:4
06−425;Sneath,P.H.A.およびSokal,R.R.(19
73)Numerical Taxonomy−the Principles
and Practice of Numerical Taxonomy、
Freeman Press、San Francisco、CA;Wilbu
r,W.J.およびLipman,D.J.(1983)Rapid simi
larity searches of nucleic acid and
protein data banks Proc.Natl.Acad.,S
ci.USA 80:726−730。
くとも20の位置を有する比較窓にわたって比較することによって決定され、こ
こで、この比較窓内のポリヌクレオチド配列の部分は、これら2つの配列の最適
な整列について、参照配列(これは、付加も欠失も含まない)と比較した場合に
、20%以下、通常は5〜15%、または10〜12%の付加または欠失(すな
わち、ギャップ)を含み得る。この百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残
基が両方の配列に生じる位置の数を決定して合致した位置の数を得、この合致し
た位置の数を参照配列の位置の総数(すなわち、窓のサイズ)で除算し、そして
この結果に100を乗算して、配列同一性の百分率を得ることによって、計算さ
れる。
リペプチドが開示される。「組合せポリペプチド」とは、異なるT.cruzi
抗原のエピトープまたはその改変体が、例えばペプチド連結を介して、単一のア
ミノ酸鎖に結合される、ポリペプチドである。このように形成されるアミノ酸鎖
は、直鎖状であっても分枝鎖であってもよい。このエピトープは、直接結合され
得る(すなわち、介在するアミノ酸なしで)か、またはそのエピトープの抗原性
特性を有意に変化させないリンカー配列(例えば、Gly−Cys−Gly)に
よって結合され得る。このペプチドエピトープはまた、非ペプチド連結(例えば
、ペプチドエピトープ上の特定の官能基の間を、例えばアミノ基、カルボキシル
基、またはスルフヒドリル基を介して、化学的にまたは光化学的に結合する、ヘ
テロ二官能性薬剤またはホモ二官能性薬剤)を介して連結され得る。本発明の組
合せポリペプチドにおいて有用に使用され得る二官能性薬剤は、当業者に周知で
ある。エピトープはまた、相補的リガンド/抗リガンド対(例えば、アビジン/
ビオチン)によって連結され得、このとき1つ以上のエピトープが、このリガン
ド/抗リガンド対の第一のメンバーに連結され、次いでこのリガンド/抗リガン
ド対の相補的メンバーに、溶液中または固相のいずれかで結合される。組合せポ
リペプチドは、本明細書中に記載されるようなポリペプチドの多重エピトープを
含み得、そして/または本明細書中に記載のエピトープに連結する、1つ以上の
他のT.cruzi抗原のエピトープ(例えば、TcD、TcEまたはPEP−
2)を含み得る。
、任意の種々の手順を使用して調製され得る。例えば、T.cruzi cDN
AまたはゲノムDNA発現ライブラリーが、T.cruziに感染した個体由来
の血清のプールでスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングは、一般
に、当業者に周知の技術(例えば、Sambrookら、Molecular
Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spr
ing Harbor Laboratories、Cold Spring
Harbor、N.Y.、1989に記載されるもの)を使用して実施され得る
。簡単に言えば、バクテリオファージライブラリーがプレートされ得、そしてフ
ィルターに移され得る。次いで、このフィルターは、血清および検出試薬ととも
にインキュベートされ得る。本発明に関して、「検出試薬」とは、抗体−抗原複
合体に結合し得る任意の化合物であり、これが次いで、当業者に公知の任意の種
々の手段によって、検出され得る。スクリーニングの目的のための代表的な検出
試薬は、レポーター基に結合した、プロテインA、プロテインG、IgGまたは
レクチンのような「結合剤」を含む。好ましいレポーター基としては、酵素、基
質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基、およびビオチ
ンが挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、レポーター基は、
西洋ワサビペルオキシダーゼであり、これは、テトラメチルベンジジンまたは2
,2’−アミノ−ジ−3−エチルベンゾチアゾールスルホン酸のような基質とと
もにインキュベートすることによって、検出され得る。血清中の抗体に結合する
タンパク質を発現するcDNAを含むプラークは、当業者に公知の技術によって
、単離および精製され得る。適切な方法は、例えば、Sambrookら、Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual、
Cold Spring Harbor Laboratories、Cold
Spring Harbor、N.Y.、1989に見出され得る。
は、上記のように、T.cruziゲノム発現ライブラリーを、T.cruzi
に感染した個体由来の血清のプールを用いてスクリーニングすることにより、単
離され得る。より特定すると、配列番号1〜配列番号16に言及されるヌクレオ
チド配列を有するDNA分子は、このライブラリーを、寄生生物溶解物ならびに
/あるいはT.cruzi抗原TcDおよびTcEの一方または両方(米国特許
第5,304,371号および1995年3月14日に出願された米国出願番号
08/403,379に記載される)との血清学的反応性を示す(ELISAま
たはウェスタンアッセイにおいて)血清のプールを用いてスクリーニングするこ
とによって、単離され得る。次いで、引き続くスクリーニングが、検出可能な抗
TcD抗体を欠く患者の血清を用いて、実施される。配列番号17(5’末端)
および配列番号18(3’末端)に言及されるヌクレオチド配列を有するDNA
分子は、ゲノム発現ライブラリーを、溶解物、TcDおよびTcEとのより低い
血清学的反応性を示す(すなわち、ELISAまたはウェスタンアッセイにおい
て、バックグラウンド反応性にわたって3未満の標準偏差のシグナルを検出する
)血清のプールを用いてスクリーニングし、続いて検出可能な抗TcD抗体を欠
く患者の血清を用いてスクリーニングすることによって、単離され得る。
ていないT.cruzi cDNA発現ライブラリーを、上記のように、T.c
ruziに感染した個体由来の血清(より高い血清学的反応性およびより低い血
清学的反応性の両方)を用いてスクリーニングすることによって、得られ得る。
、T.cruziゲノムDNAまたはcDNAから、ポリメラーゼ連鎖反応を介
して増幅され得る。このアプローチに関して、配列特異的なプライマーは、配列
番号1〜配列番号22に提供される配列に基づいて設計され得、そして購入また
は合成され得る。次いで、DNA配列の増幅された部分を使用して、全長ゲノム
クローンまたはcDNAクローンを、周知の技術(例えば、Sambrookら
、Molecular Cloning:A Laboratory Manu
al、Cold Spring Harbor Laboratories、C
old Spring Harbor、NY(1989)に記載される技術)を
用いて、単離し得る。
、一般に、上記のように、ネイティブな抗原の部分を含むポリペプチドを生成す
ること、およびT.cruziに感染した個体由来の血清とのこのポリペプチド
の反応性を評価することによって、同定され得る。多くの例において、ネイティ
ブな抗原に見出される1つ以上の反復配列を含むペプチドは、エピトープを含む
。このような反復配列は、上記ヌクレオチド配列の検査に基づいて、同定され得
る。上記DNA配列によりコードされる抗体に関する代表的な反復配列は、配列
番号23〜配列番号36および配列番号47〜配列番号49に提供される。より
特定すると、配列番号3に言及される配列に関する反復配列は、配列番号23(
フレーム1)、配列番号24(フレーム2)および配列番号25(フレーム3)
に提供される。配列番号4に言及される配列に関する反復配列は、配列番号26
(フレーム1)および配列番号27(フレーム3)に提供され、そして配列番号
9に関する反復配列は、配列番号47(フレーム1)、配列番号48(フレーム
2)および配列番号49(フレーム3)に提供される。配列番号12については
、反復配列は、配列番号28(フレーム1)、配列番号29(フレーム2)およ
び配列番号30(フレーム3)に提供される。配列番号31は、配列番号15の
反復配列を言及する。配列番号16については、反復配列は、配列番号32(フ
レーム2)および配列番号33(フレーム3)に提供される。最後に、配列番号
18の反復配列は、配列番号34(フレーム1)、配列番号35(フレーム2)
および配列番号36(フレーム3)に提供される。
され得る。約100未満のアミノ酸を有するポリペプチド、そして一般的には約
50未満のアミノ酸は、例えば、Merrifield固相合成方法(ここでは
、アミノ酸が、伸長するアミノ酸鎖に連続的に付加される)を使用して合成され
得る。Merrifield、J.Am.Chem.Soc.85:2149−
2146、1963を参照のこと。ポリペプチドの自動化合成のための装置は、
Perkin Elmer/Applied Biosystems Divi
sion、Foster City、CAのような供給業者から市販される。従
って、例えば、上記の反復配列を含むポリペプチドまたはその部分は、この方法
により合成され得る。同様に、他のネイティブな抗原のエピトープまたはその改
変体は、自動化合成装置を使用して調製され得る。
プチドをコードする組換えDNAの発現によって調製され得る。好ましくは、宿
主細胞はE.coli、酵母、昆虫の細胞株(例えば、Spodopteraま
たはTrichoplusia)または哺乳動物細胞株((限定されないが)C
HO、COS、およびNS−1を含む)である。この様式で発現されるDNA配
列は、天然に存在するタンパク質(例えば、配列番号1〜配列番号22のDNA
配列によってコードされるアミノ酸配列を有する全長抗原、天然に存在するタン
パク質の部分、またはこのようなタンパク質の改変体をコードし得る。このよう
なDNA配列によってコードされる代表的なポリペプチドは、配列番号37〜配
列番号46、配列番号52および配列番号65に提供される。
れる。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも80重量%の純度まで、より好
ましくは、少なくとも95重量%の純度まで、そして最も好ましくは少なくとも
99重量%の純度までに単離される。一般的に、このような精製は、例えば、硫
安沈殿分画、SDS−PAGE電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフ
ィーに関する標準的技術を使用して達成され得る。
検出する方法が開示される。1つの実施形態では、T.cruzi感染は、抗体
を含む任意の生物学的サンプル中で検出され得る。好ましくは、サンプルは、血
液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、または尿である。より好ましくは、サンプル
は、患者または血液供給源から得られる血液サンプルまたは血清サンプルである
。簡潔には、T.cruzi感染は、任意の1つ以上の上記ポリペプチドまたは
その改変体を使用して検出され、予め決定されたカットオフ(cut−off)
値と比較して、サンプル中のポリペプチド(1つまたは複数)に対する抗体の存
在または非存在を決定し得る。
の種々のアッセイ様式が存在する。例えば、HarlowおよびLane、An
tibodies:A Laboratory Manual、Cold Sp
ring Harbor Laboratory、1988を参照のこと。好ま
しい実施形態では、アッセイは、サンプル由来の抗体に結合しそしてこのサンプ
ル由来の抗体を除去するための固体支持体上の固定化ポリペプチドの使用を包含
する。次いで、結合された抗体は、抗体/ペプチド複合体に結合し、そして検出
可能なレポーター基を含む検出試薬を使用して検出され得る。適切な検出試薬と
しては、抗体/ポリペプチド複合体に結合する抗体およびリポーター基で標識さ
れた遊離ポリペプチドを含む(例えば、半競合アッセイにおいて)。あるいは、
競合アッセイが利用され得、ここではポリペプチドに結合する抗体が、リポータ
ー基で標識され、そして抗原とサンプルとのインキュベーションの後に固定化抗
原に結合される。サンプル中の成分が、ポリペプチドへの標識抗体の結合を阻害
する程度が、固定化ポリペプチドとのサンプルの反応性の指標である。
。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートの試験ウェルまたはニトロ
セルロースもしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、支持体は、ビーズまた
はディスク(例えば、ガラス、繊維ガラス、ラテックスまたはプラスチック材料
(例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロリド))であり得る。支持体はま
た、磁気粒子または光ファイバー検出器(例えば、米国特許第5,359,68
1号に開示されるような)であり得る。
において十分に記載されている)を使用して、固体支持体に結合され得る。本発
明の文脈において、用語「結合される(結合した)」は、非共有結合(例えば、
吸着)および共有結合の両方をいう(これは、抗原と支持体上の官能基との間の
直接的な結合であり得るか、または架橋剤による連結であり得る)。マイクロタ
イタープレート中のウェルまたは膜への吸着による結合が好ましい。このような
場合、吸着は、適切な量の時間、適切な緩衝液中においてポリペプチドと固体支
持体とを接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度とともに変動
するが、代表的には、約1時間と1日との間である。一般的には、プラスチック
マイクロタイタープレート(例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロリド)
のウェルと、約10ng〜約1μgの範囲(そして好ましくは約100ng)の
量のポリペプチドとを接触させることは、十分な量の抗原を結合するに十分であ
る。ニトロセルロースは、1cm3あたり約100μgのタンパク質を結合する
。
リペプチド上の官能基(例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基)の両方と反応
する二官能性試薬と支持体とを反応させることによって達成され得る。例えば、
ポリペプチドは、ベンゾキノンを使用してか、または支持体上のアルデヒド基と
ポリペプチド上のアミンおよび活性水素との縮合によって、適切なポリマーコー
ティングを有する支持体に結合され得る(例えば、Pierce Immuno
tchnology Catalog and Handbook(1991)
、A12〜A13を参照のこと)。
SA)である。このアッセイは、まず、固体支持体(通常、マイクロタイタープ
レートのウェル)上に固定されたポリペプチド抗原とサンプルとを接触させるこ
とによって実施され、その結果、サンプル中のポリペプチドに対する抗体は、固
定されたポリペプチドに結合される。次いで、結合していないサンプルを、固定
されたポリペプチドから除去し、そして固定された抗体−ポリペプチド複合体に
結合し得る検出試薬を添加する。次いで、固体支持体に結合されたまま残存する
検出試薬の量を、特定の検出試薬について適切な方法を使用して決定する。
質結合部位は、代表的にブロックされる。当業者に公知の任意の適切なブロック
剤(blocking agent)は、例えば、ウシ血清アルブミンまたはT
ween 20TM(Sigma Chemical Co.,St.Louis
、MO)である。次いで、固定されたポリペプチドをサンプルと共にインキュベ
ートし、そして抗体(サンプル中に存在する場合)を、抗原に結合させる。サン
プルは、インキュベーション前に適切な希釈剤(例えば、リン酸緩衝化生理食塩
水(PBS))で希釈され得る。一般的に、適切な接触時間(すなわち、インキ
ュベーション時間)とは、T.cruzi感染サンプルにおけるT.cruzi
抗体の存在の検出を許容するに十分な期間の時間である。好ましくは、接触時間
は、結合した抗体と結合していない抗体との間の平衡状態で達成されるレベルの
少なくとも95%である結合レベルを達成するに十分である。当業者は、平衡状
態を達成するために必要とされる時間が、一定時間にわたって生じる結合のレベ
ルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを理解する。室温では、
約30分間のインキュベーション時間が、一般的に十分である。
en 20TMを含有するPBS)で固体支持体を洗浄することによって除去され
得る。次いで、検出試薬を固体支持体に添加し得る。適切な検出試薬は、固定さ
れた抗体−ポリペプチド複合体に結合し、そして当業者に公知の種々の任意の手
段によって検出され得る任意の化合物である。好ましくは、検出試薬は、レポー
ター基に結合体化された結合剤(例えば、プロテインA、プロテインG、免疫グ
ロブリン、レクチン、または遊離抗原のような)を含む。好ましいレポーター基
としては、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ)、基質、補因子、イン
ヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基およびビオチンが挙げられる。レ
ポーター基への結合剤の結合体化は、当業者に公知の標準的方法を使用して達成
され得る。種々のレポーター基に結合体化された、一般的な結合剤はまた、多く
の供給業者から購入され得る(例えば、Zymed Laboratories
、San Francisco、CAおよびPierce、Rockford、
IL)。
抗体−ポリペプチド複合体と共にインキュベートされる。適切な量の時間は、一
般的に、製造業者の指示書から、または一定時間にわたって生じる結合のレベル
をアッセイすることによって決定され得る。次いで、結合していない検出試薬は
除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を使用して検出される。レ
ポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する
。放射性の基については、シンチレーション計数器またはオートラジオグラフィ
方法が、一般的に適切である。分光学的な方法を使用して、色素、発光基および
蛍光基を検出し得る。ビオチンは、異なるレポーター基(通常は、放射性または
蛍光性の基または酵素)にカップリングされ、アビジンを使用して検出され得る
。酵素レポーター基は、一般的に、基質の添加(一般的には、特定期間の時間)
、次いで、分光学的または他の反応産物の分析によって検出され得る。
支持体に結合されたまま残存するレポーター基から検出されるシグナルを、一般
的に、予め決定されたカットオフ値に対応するシグナルに対して比較する。この
カットオフ値とは、好ましくは、固定した抗原を、感染していない患者由来のサ
ンプルと共にインキュベートした場合に得られるシグナルの平均である。一般的
に、この平均を超えて3標準偏差であるシグナルを生成するサンプルを、T.c
ruzi抗体およびT.cruzi感染について陽性とみなす。代替的な好まし
い実施形態では、カットオフ値は、Sackettら、Clinical Ep
idemiology:A Basic Science for Clini
cal Medicine、第106〜7頁(Little Brown an
d Co.、1985)の方法に従って、Receiver Operator
Curveを使用して決定される。簡潔には、本実施形態では、カットオフ値
を、真の陽性比率(すなわち、感受性)および偽陽性比率(100%特異性)の
対のプロット(これは、診断的試験結果についての各陽性カットオフ値に対応す
る)から決定され得る。左上側の角に最も近いプロットにおけるカットオフ値(
すなわち、最大領域を囲む値)が、最も正確なカットオフ値であり、そしてこの
方法によって決定されるカットオフ値よりも高いシグナルを生成するサンプルを
陽性とみなし得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性比率を最小化するために
プロットに沿って左手に、または偽陰性比率を最小化するために右手にシフトさ
れ得る。一般的に、この方法によって決定されるカットオフ値よりも高いシグナ
ルを生成するサンプルを、T.cruzi感染について陽性とみなす。
)試験様式またはストリップ(strip)試験様式で実施され、ここでは、抗
原をニトロセルロースのような膜に固定する。フロースルー試験では、サンプル
中の抗体は、膜を通過するサンプルとして固定されたポリペプチドに結合する。
次いで、抗体−ポリペプチド複合体に結合する検出試薬(例えば、プロテインA
−コロイド金)を、検出試薬を含有する溶液としてこの膜に貫流させる。次いで
、結合した検出試薬の検出を、上記のように実施し得る。ストリップ試験様式で
は、ポリペプチドが結合する膜の一端を、サンプルを含有する溶液中に浸漬させ
る。サンプルは、検出試薬を含有する領域を通過して膜に沿って移動し、そして
固定されたポリペプチドの領域まで移動する。このポリペプチドにおける検出試
薬の濃度は、サンプル中のT.cruzi抗体の存在を示す。このような試験は
、代表的に、非常に少量(例えば、1滴)の患者の血清または血液を用いて実施
され得る。
用いて実施され得る。あるいは、この感度は、1つ以上のさらなるT.cruz
i抗原のエピトープを上記のポリペプチドと組み合わせて用いることによって、
改善され得る。特に、TcD(例えば、米国特許第5,304,371号に開示
される)、PEP−2またはTcE(これらの両方は、例えば、米国シリアル番
号第08/403,379(1995年、3月14日出願)に開示される)のエ
ピトープは、上記のポリペプチドと組み合わせて使用され得る。PEP−2抗原
性エピトープがまた、Peraltaら、J.Clin.Microbiol.
32:971−74,1994に議論される。TcDの配列は、配列番号50に
提供され、TcEの配列は、配列番号51に提供される。TcD抗原性エピトー
プは、好ましくは、アミノ酸配列Ala Glu Pro Lys Ser A
la Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys S
er(配列番号53)、またはアミノ酸配列Ala Glu Pro Lys
Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro
Lys Pro(配列番号54)を有する。TcEエピトープは、好ましくは、
アミノ酸配列Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Ly
s Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Al
a Thr Ala Pro Ala(配列番号55)、またはアミノ酸配列L
ys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala A
la Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala A
la Pro Ala(配列番号56)を有し、そしてPEP2エピトープは、
好ましくは、アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro
Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys
Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala(配列番号57)を
有する。
チド(combination polypeptide)の中)に存在し得る
か、または別のポリペプチド中に含まれ得る。組み合わせポリペプチドは、以下
の実施例2に記載されるように合成的にか、または以下の実施例7に記載のよう
に組み換えDNA技術を用いてかのいずれかで調整され得る。好ましくは、この
ポリペプチドは、マイクロタイタープレートの壁もしくは膜(上記に記載のよう
な)のような固体支持体上に吸着によって固定化され、その結果、大体同じ量の
各ポリペプチドが、その支持体と接触し、そして支持体と接触するポリペプチド
の総量は、約1ng〜10μgの範囲となる。この工程の残りは、一般的に、上
記に記載のように実施され得る。
来の1つ以上のエピトープを用いて、以下の診断に使用され得る。この実施形態
において、本発明は発明のポリペプチドは、TcD、TcEおよび/またはPE
P2を用いたクスリーニングに基づいたT.cruzi感染の診断を確認するた
めに使用される。TcD、TcEおよび/またはPEP2由来のエピトープを用
いたT.cruzi感染の診断は、米国シリアル番号第08/403,379号
(1995年3月14日出願)に記載される。
一特異的な抗体(これは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る)を
用いた、生物学的サンプル中のT.cruziを検出する方法が提供される。精
製ポリペプチドまたは合成ポリペプチドに対する抗体は、当業者に公知の任意の
種々の技術によって調整され得る。例えば、HarlowおよびLane,An
tibodies:A Laboratory Manual,Cold Sp
ring Harbor Laboratory,1988を参照のこと。ある
そのような技術において、抗原性ポリペプチドを含む免疫原は、最初に任意の広
範な種々の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ)に
注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変せずに免疫原と
して役立ち得る。あるいは、相対的に短いポリペプチドに関して特に、ポリペプ
チドがウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンのようなキ
ャリアタンパク質に結合される場合、優れた免疫応答が誘発され得る。免疫原は
、好ましくは1つ以上のブースター免疫を組み入れる予め決定されたスケジュー
ルに従って、動物宿主に注射され、そしてその動物は、定期的に繁殖される。次
いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体が、例えば、適切な固体支持
体に結合したポリペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって
、そのような抗血清から精製され得る。
lerおよびMilstein,Eur.J.Immunol.6:511−5
19,1976ならびにこれに対する改善技術を用いて調整され得る。簡単に言
うと、これらの方法は、所望の特異性(すなわち、目的のポリペプチドとの反応
性)を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調整を含む。そのような細胞株は
、例えば、上記のように免疫化された動物から得られた脾細胞から産生され得る
。次いでこの脾細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー(好ましくは、免疫
された動物と同系である融合パートナー)との融合によって不死化される。種々
の融合技術が使用され得る。例えば、この脾細胞および骨髄腫細胞は、非イオン
性界面活性剤と数分間合わされ得、次いでハイブリッド細胞の増殖を支持するが
骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地上に、低い密度でプレートに播かれる。
好ましい選択技術は、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)選
択を使用する。十分な時間の後(通常、約1〜2週間)、ハイブリッドのコロニ
ーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてポリペプチドに対する結合活性
について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい
。
得る。さらに、種々の技術(例えば、マウスのような適切な脊椎動物宿主の腹膜
腔へのハイブリドーマ細胞株の注射)が、収率を上げるために使用され得る。次
いで、モノクローナル抗体は、腹水または血液から回収され得る。夾雑物は、従
来の技術(例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱および抽出)によって
抗体から除去され得る。
は、任意の種々の免疫アッセイを用いて生物学的サンプル中のT.cruzi感
染を検出するために使用され得、これは直接または競合的であり得る。本発明の
この局面の使用に適切な生物学的サンプルは、上記に記載のようなサンプルであ
る。簡単に言うと、1つの直接アッセイ形式において、単一特異的抗体は、固体
支持体上(上記に記載のような)に固定化され、そして試験されるサンプルと接
触され得る。結合していないサンプルの除去後、レポーター基によって標識され
た第2の単一特異的抗体が、添加され、そして結合抗原を検出するために使用さ
れ得る。例示的な競合アッセイにおいて、サンプルは、適切なレポーター基で標
識された、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と結合され得る。次い
で、サンプルと抗体の混合物が、適切な固体支持体上に固定化されたポリペプチ
ド抗原と結合され得る。サンプル中で抗原に結合していない抗体は、固定化され
た抗原に結合され、そしてサンプルおよび抗体の残りが除去される。固体支持体
への抗体結合のレベルは、サンプル中の抗原のレベルと逆に関連する。従って、
低いレベルの固体支持体への抗体の結合は、サンプル中のT.cruziの存在
を示す。T.cruzi感染の存在または非存在を決定するために、固体支持体
に結合したままであるレポーター基から検出されたシグナルは、一般的に、予備
決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。そのようなカットオ
フ値は、一般的に、上記のように決定され得る。ELISAの文脈中に上記で議
論された任意のレポーター基を使用して、単一特異的抗体を標識し得、そして結
合は、使用されるレポーター基に適切な任意の種々の技術によって検出され得る
。サンプル中のT.cruziを検出するための単一特異的抗体を用いる他の形
式は、当業者に明らかであり、そして、上記の形式は、単に例示的な目的で提供
される。
合併症の予防のためのワクチンおよび薬学的処方物が提供される。薬学的処方物
は、一般的に、T.cruziタンパク質の1つ以上のエピトープを含む1つ以
上のポリペプチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む。ワクチンは、
免疫応答の増強のための、1つ以上の上記のポリペプチドおよびアジュバントを
含む。
そして他の原生動物感染に対する免疫に現在使用されるこれらと近似し得る。一
般的に、薬学的組成物およびワクチンは、注射(例えば、筋内、静脈内または皮
下)、鼻腔内(例えば、吸引によって)または経口によって投与され得る。1と
4との間の用量が、2〜6週間で投与され得る。第1回よりも2〜4週間遅れて
第2回目が行なわれる、2用量の投与が好ましい。適切な用量は、処置される哺
乳動物中で抗体を惹起するのに十分な量のポリペプチドであり、これは、ある期
間、哺乳動物をT.cruzi感染から保護するのに十分である。一般的に、1
用量に存在するポリペプチドの量は、宿主のkgあたり、約1pg〜約100m
g、代表的には約10pg〜約1mg、そして好ましくは約100pg〜1μg
である。適切な用量サイズは、動物の大きさによって変化するが、代表的に10
〜60kgの動物に対して約0.01mL〜約5mLの範囲である。
るが、キャリアの型は、投与の形態に依存して変化する。非経口投与(例えば、
皮下注射)に関して、キャリアは好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂
肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与に関しては、任意の上記のキャリア
または固体キャリア(例えば、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸
マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、スクロ
ース、および炭酸マグネシウム)が、使用され得る。生物分解性ミクロスフェア
(例えば、ポリ乳酸ガラクチド(polylactic galactide)
)がまた、本発明の薬学的組成物のキャリアとして使用され得る。
のワクチン中に使用され得る。多くのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原
を保護するために設計された物質(例えば、水酸化アルミニウムもしくはミネラ
ルオイル)、および免疫応答の非特異的刺激物質(例えば、脂質A、Borde
lla pertussisもしくはMycobacterium tuber
culosis)を含む。そのようなアジュバントは、例えば、Freunds
Incomplete Adjuvant and Complete Ad
juvant(Difco Laboratories,Detroit,MI
)およびMerck Adjuvant 65(Merck and Comp
any,Inc,Rahway,NJ)のように市販される。
調整を示す。
ratagene,La Jolla,CA)を用いて、無作為に剪断されたT
.cruziゲノムDNA(Tulahuen C2株)から構築した。1つの
スクリーニングにおいて、このライブラリーを、寄生虫溶解物および/またはT
.cruzi抗原TcDおよびTcEの1つもしくは両方と高い反応性を示す5
人の患者由来の血清プールを用いて、スクリーニングした(米国特許第5,30
4,371号および米国シリアル番号第08/403,379(1995年3月
14日出願)に記載される)。5人の患者の血清の各々を、全溶解物および/ま
たはTcDもしくはTcEを用いたウエスタンおよびELISAアッセイに基づ
いて、反応性であると決定した。抗E.coli反応性は、スクリーニングの前
に吸着によって血清から除去した。50,000pfuの増幅していないライブ
ラリーを、血清プールを用いてスクリーニングし、そして血清と反応するタンパ
ク質を発現するプラークを、プロテインA西洋ワサビペルオキシダーゼ(ABT
S基質を有する)を用いて検出した。次いで、引き続くスクリーニングは、組み
換えTcDを用いたウエスタンおよびELISAアッセイにおいて検出可能な抗
TcD抗体を欠く3人の患者由来の血清プールを用いて実施した。
ち、ELISAまたはウエスタンアッセイにおいて、バックグラウンドの反応性
に対して3未満の標準偏差が検出されたシグナル)を示す血清プールを用いて実
施し、続いて、上記のように、検出可能な抗TcD抗体を欠く患者血清を用いて
引き続きスクリーニングした。
反応するタンパク質を発現する28個のクローンを単離した。pBSK(−)フ
ァージミド(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)の切
除は、製造者らのプロトコールに従って実施した。オーバーラップするクローン
が、エキソヌクアーゼIII消化によって産生され、そして一本鎖鋳型を、VC
SM 13ヘルパーファージを用いた感染の後に単離した。このDNAを、Ap
plied Biosystems自動化配列決定装置(Model 373A
)を用いて、ジデオキシチェインターミネーター法(dideoxy chai
n termination method)またはTaqジターミネーター系
(Taq di−terminator system)によって配列決定した
。
つは縮重42塩基対反復によって示される同一のペプチド配列を含んだ。配列番
号16は、42塩基対反復配列を含むプロトタイプのクローンを示す。従って、
T.cruzi抗原をコードする14個の新規DNA配列が、反応性血清プール
を用いた上記のスクリーニングを用いて調整された(配列番号1〜配列番号16
に示し、ここで、配列番号4および配列番号5は、それぞれ、単一クローンの5
’および3’末端を示し、配列番号9および配列番号10は、それぞれ、単一ク
ローンの5’および3’末端を示す)。1つの新規な配列が、低い反応性を有す
る血清を用いたスクリーニングで得られた(配列番号17(5’末端)および配
列番号18(3’末端)に示す)。
べん毛型段階から精製した。このRNAを逆転写し、そして製造者らの指示書に
従ってλ UniZap発現ベクター(Stratagene,La Joll
a,CA)中に、一方向性cDNA発現ライブラリーを構築するために使用した
。50,000pfuの増幅されていないライブラリーを、高い血清学的反応性
および低い血清学的反応性の両方を示す患者血清を含む血清プールを用いてスク
リーニングし、続いて、上記のように検出可能な抗TcD抗体を欠く患者血清を
用いて引き続きスクリーニングした。全部で32個のクローンをこのスクリーニ
ングから単離した。これらのクローンの25個は、高い免疫原性として以前に同
定された翻訳装置のタンパク質であり、そしてこれらの全ては、このゲノム発現
ライブラリーのスクリーニングによって同定されたクローンとは異なっていた。
残りの7個を、配列番号19〜配列番号22に提供される配列によって表す。配
列番号22に示される配列は、T.cruziユビキチンの配列である。
ペプチドの合成を示す。
トラメチルウロニウム(tetramethyuronium)ヘキサフルオロ
ホスフェート)活性化と共にFMOC化学を用いてMillipore 905
0ペプチド合成機で合成し得る。gly−cys−gly配列をペプチドのアミ
ノ末端またはカルボキシ末端に結合して、ペプチドの結合または標識の方法を提
供し得る。固体支持体からのペプチドの切断を、以下の切断混合物を用いて行い
得る:トリフルオロ酢酸:エタンジオール:チオアニソール:水:フェノール(
40:1:2:2:3)。2時間の切断の後、ペプチドを、冷メチル−t−ブチ
ル−エーテル中で沈澱させ得る。次いで、ペプチドのペレットを、0.1%トリ
フルオロ酢酸(TFA)を含む水中に溶解し、そしてC18逆相HPLCで精製
する前に凍結乾燥し得る。水中(0.1% TFA)0%〜60%アセトニトリ
ル(0.1%TFA含有)の勾配を用いて、ペプチドを溶出し得る。純粋画分を
凍結乾燥させた後に、このペプチドをエレクトロスプレー質量分析を用い、そし
てアミノ酸分析により特徴付けした。
2−1+、Tcc22−2.1(配列番号41内に含まれる)、TcLo1.1
、1.2、および1.3(配列番号34、35、および36内に含まれる)およ
びTcHi10.1および10.3(配列番号26および27)のようなペプチ
ドを合成した:
の診断特性を示す。これは、T.cruzi陽性血清および陰性血清との反応性
の研究ならびに他の疾患を有する患者由来の血清との交叉反応性研究を含む。
rning,New York)中で行った。ウェルを炭酸コーティング緩衝液
(pH9.6)50μlでコーティングした。T.cruzi溶解物については
100ng/ウェルを用い、そして組換え抗原の各々については200ng/ウ
ェルを用いた。ウェルを4℃で一晩(または37℃で2時間)コーティングした
。次いで、プレート内容物を除去し、そして200μlのPBS/1% BSA
で2時間、ウェルをブロッキングした。ブロッキング工程の後、PBS/0.1
% TweenTM 20でウェルを5回洗浄した。次いで、PBS/0.1%
Tween 20TM/0.1% BSAで1:50に希釈した50μlの血清(
T.cruzi感染に対して陽性または陰性のいずれか)を、各ウェルに添加し
、そして室温で30分間インキュベートした。次いで、再びこのプレートをPB
S/0.1% Tween 20TMで5回洗浄した。
d,San Francisco,CA)を、PBS/0.1% Tween
20TM/0.1% BSAで1:20,000に希釈し、そして希釈した結合体
50μlを各ウェルに添加し、そして室温で30分間インキュベートした。イン
キュベーションの後、再びウェルをPBS/0.1% Tween 20TMで5
回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質であるテトラメチルベンジジン(Kirke
gaard and Perry Laboratories,Gaither
sburg,MD)100μlを希釈せずに、各ウェルに添加し、15分間イン
キュベートした。100μlの1N H2SO4を各ウェルに添加することにより
反応を停止させ、そしてプレートを450nmで読みとった。
39)の反応性を示す。陰性の平均および3つの標準偏差のカットオフに基づく
と、50の血清サンプルのうち49が溶解物に対して陽性であり、50のうち3
4がrTcc6に対して陽性であった。同様の研究(図2に示す)において、組
換えrTcc22(配列番号41)は、79.2%の感受性を有することが見い
だされた(48の血清サンプルのうち38が陽性であった)。同様の基準を用い
ると、組換えrTcc38(配列番号38)とT.cruzi溶解物との比較研
究により、溶解物について39/39と比較して、24/39が陽性であった(
図3)。潜在的に交叉反応性の血清を用いて試験した場合、Tcc38は、T.
cruzi溶解物より改善された特異性を示した。
/24)の感受性を有することが見いだされた(図2)。
らのペプチドをT.cruzi陽性血清および陰性血清との反応性について試験
し、そしていくらかの場合には、潜在的に交叉反応性である他の疾患を有する患
者由来の血清との交叉反応性について試験した。
ィングフレームを含んでいた。試験したペプチドは、配列番号18に提供される
DNA配列のリーディングフレーム1、2および3を示すTcLo1.1(配列
番号34内に含まれる)、TcLo1.2(配列番号35内に含まれる)、およ
びTcLo1.3(配列番号36内に含まれる)、ならびにTcHi10配列(
配列番号5に示される)のリーディングフレームのうち2つを示すTcHi10
.1(配列番号)26およびTcHi10.3(配列番号27)であった。デー
タを図4に示す。TcLoフレームの場合、T.cruzi陽性個体および陰性
個体由来の血清に対して試験したとき、TcLo1.1および1.2の両ペプチ
ドは、強く反応性であったが、TcLo1.2は、シグナル対ノイズにおいて優
れていた。TcLo1.3は、より低いシグナルを有したが、低いバックグラウ
ンドも有した。この研究において溶解物は24/24陽性を検出し、TcLo1
.1は、24/21を検出し、TcLo1.2は23/24を検出し、そしてT
cLo1.3は15/24を検出した。同じ研究において、2つのフレームTc
Hi10.1および10.3は、それぞれ19/24および14/24陽性を検
出したが、TcLo1よりシグナルが小さかった。これらの異なるリーディング
フレームを用いた交叉反応性研究により、TcLo1.2は、T.cruzi溶
解物と比較した場合、試験した血清と最小限の交叉反応性を有することが示され
る(図5)。
決定するためにrTcc22に関して合成した。ペプチドTcc22−1、1+
、および2を、T.cruzi陽性血清および陰性血清を用いて試験した。結果
を図2に示す。Tcc22−1およびTcc22−2.1ペプチドは、Tcc2
2−1ペプチドより活性であった。第1の実験において、38/48陽性を検出
した組換えTcc22と比較して、Tcc22−1およびTcc22−1+は2
9/48および36/48陽性を検出した。引き続く実験において、Tcc22
−2.1はまた、同じプレートコーティングレベルでTcc22−1+より反応
性であったが、シグナルは小さかった。
ドを合成し、そして200ng/ウェルのコーティングレベルを用いてELIS
Aアッセイにおいて試験した。合計48のT.cruzi陽性血清および26の
陰性血清を、このペプチド配列の反応性を決定するために試験した。この研究に
おいて、このペプチドは、68.75%の感受性(48陽性のうち33を検出)
および92.3%の特異性(36陰性のうち24)を有した。このことは、この
ポリペプチドは、T.cruzi感染を検出することにおいて潜在的な重要性を
有することを示す。このアッセイの結果を、以下の表1に示す。
そしてまた二重エピトープ(dual epitope)ペプチドD/2(Tc
DおよびPEP−2配列を含む)およびD/E(TcDおよびTcE配列を含む
)と組み合わせて試験した。これらの組み合わせを個々のペプチドならびにトリ
ペプチド2/D/E(これは、TcD、TcEおよびPEP−2を含む)と比較
した。使用したTcD配列は以下であった:
D、D/2およびD/Eの反応性を増大させ得ることを示す。
は、他の抗原の血清診断的特性を増強することを実証する。
)、T(スレオニン)またはI(イソロイシン)が反復配列中に存在し得る残基
中に生じている。全ての縮重を示すために、合成TcEペプチドの本来の配列を
、3つの反復を含む単一ペプチド中にA、TおよびIで作製した(実施例5を参
照のこと)。さらに反復領域をエピトープマッピングし、そして血清学的活性に
必要な反復数を決定するために、以下のペプチドを実施例2に記載されるように
調製した:
および21の陰性血清を、25ng/ウェルのペプチドを用いてELISAアッ
セイにおける固相を実施例3に記載されるように行った場合、TcE改変体の各
々を用いて試験した。異なるペプチドの反応性を図7に示す。最も高い反応性は
、各反復が縮重残基においてAを含んでいた3反復ペプチド(TcE(3A))
で見られた。このペプチドは3反復中にA、TおよびI残基を含んでいる本来の
TcE配列よりなお高い反応性を示した。対照してみると、3Iおよび3T改変
体は、試験したT.cruzi陽性サンプルに対して本質的に陰性であった。A
での2反復を含む配列(TcE(2A))は、3A配列より明らかに反応性がお
とり、そしてAおよびTでの2反復配列(TcE(AT))は、陰性であった。
陰性の平均+3つの標準偏差のカットオフに基づくと、本来のTcE(A、T、
I)は、24陽性のうち17を検出し、そして3A改変体は、24陽性のうち1
19を検出した。これは、最大の血清学的活性を得るためには、少なくとも3反
復が必要であることを表す。
わせの血清学的反応性) 本実施例は、いくつかの多重エピトープペプチド組み合わせの診断的特性を示
す。
号57)およびTcLo1.2(配列番号35)の配列を含む)ならびにTcD
/TcE(これは、TcD(配列番号53)およびTcE(配列番号55)配列
を含む)を実施例2に記載のように合成した。これらの2つのジペプチドのT.
cruzi抗体陽性血清に対する反応性を、トリペプチド2/D/Eの反応性と
比較した。250ng/ウェルのPEP−2/TcLo1.2および50ng/
ウェルのTcD/TcEを用いて、実施例3に記載のようにELISAを行った
。この研究の結果を図8に示す。トリペプチド2/D/Eと反応しないことが見
出された1つのT.cruzi陽性血清をTcLo1.2エピトープについての
スクリーニングについて使用した。この血清は、予測したとおり、TcLo1.
2エピトープにより検出され、そしてまたジペプチド混合物(TcD/TcEと
ともにPEP−2/TcLo1.2)により検出された。
びTcLo1.2を含む、直鎖状配列であるテトラペプチド(本明細書中以降、
2/Lo/2E/D(配列番号63)といわれる)を、実施例2に記載のように
合成した。このテトラペプチドを100ng/ウェルでコーティングし、そして
T.cruzi陽性血清および陰性血清に対するその反応性を実施例3に記載の
ようにアッセイした。テトラペプチド2/Lo/2E/Dの反応性を図8に示す
。トリペプチド2/D/Eに対して反応しないことが見出された1つのT.cr
uzi陽性血清は、予測したとおり、テトラペプチドにより検出された。
びTcLo1.2をまた、リジンコア残基から生じた「分枝」ペプチドの使用に
より1つの試薬に連結した。例えば、9−フルオレニルメトキシカルボニル(F
moc)を利用するα−アミノ基に対するリジンの直接保護(orthogon
al protection)および1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキ
ソシクロヘックス−1−イリデン)エチル(Dde)を利用するε−アミノ基に
対するリジンの直接保護を用いて、他方のアミノ基の存在下で一方のアミノ基の
選択的脱保護を可能にする。これにより、リジン上のα−またはε−基のいずれ
かに由来する第1のペプチド鎖の合成を可能にする。第1のペプチド鎖は、第2
のペプチド鎖の合成過程の間に除去されない保護基で終結する。例えば、ter
t−ブトキシカルボニル(Boc)アミノ酸を、DdeおよびFmoc組み合わ
せと共に使用し得る。次いで、残りのリジンアミノ保護基を除去した後、第2の
アミノ酸鎖を第2のアミノ部分から合成する。例えば、ε−Ddeを、20%
ヒドラジンで除去する。固体支持体からの分枝ペプチドの切断およびN−α−B
oc部分の除去を、標準的なプロトコルに従ってトリフルオロ酢酸を用いて行う
。このアプローチを用いて2つの独立したアミノ酸配列を、以下に示すように「
コア」リジン残基から構築し得、従ってTcD、TcE、PEP2、TcLo1
.2および他のエピトープの種々の組み合わせをコア残基にカップリングさせ得
る。得られたペプチドの精製を実施例2に記載のように行う。
57)、ペプチドTcD(配列番号53)、ペプチドTcE(配列番号55)、
およびペプチドTcLo1.2(配列番号35)の融合ポリペプチド(本明細書
中では以下、TcFといわれる)の調製を説明する。
合成し、一致したオリゴヌクレオチド対をアニーリングして二本鎖DNAを作製
し、アニールされた対を、適切な酵素で切断されたベクターDNAと連結し、そ
して配列決定のための適切な細菌宿主株(XL2、Stratagene、La
Jolla、CA)中に形質転換することによって作製した。一旦、正確な配
列が得られると、構築物は改変されたpET28ベクター中にサブクローン化さ
れ、そして発現および精製のためにBLR pLYS S(Novagen,M
adison,WI)中に形質転換した。
配列番号66)およびオリゴヌクレオチドPDM−98(配列番号67);PD
M−96(配列番号68)およびPDM−99(配列番号69);ならびにPD
M−97(配列番号70)およびPDM−100(配列番号71)の一致した対
を、合成し、キナーゼ処理(kinased)、そしてアニールした。次いで、
これらの3対のアニールされたオリゴを、連結し、EcoRI(New Eng
land Biolabs,Beverly,MA)で消化し、Eco72Iお
よびEcoRIを用いて、改変されたTベクター構築物中にクローン化した。P
EP2−TcD−TcE融合の構築物について、以下の一致した対のオリゴヌク
レオチドを合成し、キナーゼ処理し、そしてアニールした:PDM−103(配
列番号72)およびPDM−105(配列番号73);ならびにPDM−104
(配列番号74)およびPDM−106(配列番号75)。これらの2対のアニ
ールされたオリゴを、Eco47III(New England Biola
bs)およびEcoRIで切断されたpT7ΔL2PEP2−TcD構築物中に
連結した。
た対のオリゴヌクレオチドPDM−108(配列番号76)およびオリゴヌクレ
オチドPDM−110(配列番号77);ならびにPDM−109(配列番号7
8)およびPDM−111(配列番号79)を合成し、キナーゼ処理し、そして
アニールした。これらの2対のアニールされたオリゴヌクレオチドを、EagI
で切断し、平滑末端のためにT4 DNAポリメラーゼで処理し、次いでEco
RIで切断されたpT7ΔL2PEP2−TcD−TcE構築物と連結した。p
T7ΔL2ベクター中の内部EagI部位に起因して、PCR反応は、全長PE
P2−TcD−TcE−Lo1.2構築物をクローン化するために、鋳型として
連結混合物を用いて行った。PCRを、以下の条件を使用して、プライマーPD
M−101およびプライマーPDM−107(それぞれ、配列番号80および8
1)を用いて達成した: 96℃ 2分間 96℃ 15秒間 61℃ 15秒間、72℃ 1分間 ×40サイクル 72℃ 4分間 PCR反応のために、Pful DNAポリメラーゼ(Stratagene,
La Jolla,CA)を使用した。PCR後、DNAをエタノール沈澱に供
し、SmaIおよびEcoRIで消化し、そしてEco72IおよびEcoRI
で消化された、改変されたTベクター構築物中に連結した。
urg,MD)およびSph I(New England Biolabs)
で消化し、平滑末端のためにT4 DNAポリメラーゼで処理し、次いでベクタ
ーの内部のEag I部位およびNsi I部位を検出するために再連結した。
次いで、この新しいクローンをEagIおよびNsiIで消化し、平滑末端のた
めにT4 DNAポリメラーゼで処理し、そして、TcLo1.2配列の末端に
インフレームで終止コドンを作製するために再連結した。このクローンをNde
IおよびEco RIで消化し、そして同じ酵素で切断された、改変されたpE
T28bベクター中にサブクローン化した。
)中に形質転換し、そしてカナマイシン(30μg/ml、Sigma、St.
Louis、MO)およびクロラムフェニコール(34μg/ml Sigma
)と共にLBブロス中で一晩増殖させた。一晩の培養物(12ml)を使用して
、同じ抗生物質を有する500mlの2XYTを接種し、そしてこの培養物を、
0.3〜0.6のOD560にて、IPTGを用いて、1.0mMの最終濃度ま
で誘導した。誘導の4時間後、細菌を収集し、そして20mM Tris(8.
0)、100mM NaCl、0.1%DOC、20μg/ml ロイペプチン
および20mM PMSF中で超音波処理し、次いで26,000×gで遠心分
離した。超音波処理後、この融合タンパク質を可溶性の上清中に見出した。この
上清を、Pro−bondニッケル樹脂カラム(Invitrogen、Car
lsbad、CA)に結合させた。このカラムを、50mlの20mM Tri
s(8.0)、100mM NaCl洗浄緩衝液で洗浄し、漸増濃度のイミダゾ
ールで溶出した。特に、この溶出は、20mM Tris(8.0)、100m
M NaCl洗浄緩衝液中の50mM、100mM、および500mMのイミダ
ゾールを用いて行った。目的のタンパク質を含む溶出液をプールし、そして10
mM Tris(8.0)に対して透析した。
た。試験結果は、高いレベルの内毒素混入を示した。従って、濾過滅菌されたタ
ンパク質を、High Q アニオン交換カラム(Biorad、Hercul
es、CA)で精製し、10mM Tris(8.0)中で結合し、そして10
mM Tris(8.0)中で1MまでのNaCl勾配で溶離した。目的のタン
パク質を含む溶出液をプールし、そして10mM Tris(8.0)に対して
透析した。透析後、このタンパク質を再濃縮し、濾過滅菌し、そしてタンパク質
濃度を決定するためにBCAアッセイ(Pierce、Rockford、IL
)を行った。決定されたTcFのアミノ酸配列は、配列番号82で提供される。
来の血清との反応性を、上述のようにELISAによって試験した。図11に示
されるように、TcFの反応性は、分枝状の合成テトラペプチド2/D/E/L
o1.2の反応性と非常に類似していることが見出された。
有意に変化させることなく変更され得ることが予期される。また、ペプチド間で
のGly−Cys−Gly結合の含有は、ポリペプチドの活性に有意に影響を与
えることなく固相結合を増大させ得る。
を有する、ペプチドPEP−2(配列番号57)、ペプチドTcD(配列番号5
3)、ペプチドTcE(配列番号55)、およびペプチドTcLo1.2(配列
番号35)の融合ポリペプチド(本明細書中では以下、TcF−2といわれる)
を、重複するリン酸化されたオリゴを合成し、一致したオリゴ対をアニーリング
して二本鎖DNAを作製し、アニールされた対を、適切な酵素で切断されたベク
ターDNAと連結し、そして配列決定のための適切な細菌宿主株(XL2、St
ratagene)中に形質転換することによって調製した。一旦、正確な配列
が得られると、改変されたpET28ベクター中に構築物をサブクローン化し、
そして発現および精製のためにBLR pLYS S(Novagen,Mad
ison,WI)中に形質転換した。
リゴを合成し、キナーゼ処理し、そしてアニーリングすることによって構築した
:PDM−95(配列番号66)およびPDM−98(配列番号67);PDM
−112(配列番号83)およびPDM−113(配列番号84);ならびにP
DM−114(配列番号85)およびPDM−115(配列番号86)。3対の
アニールされたオリゴを、連結し、EcoRI(New England Bi
olabs,Beverly,MA)で消化し、Eco72IおよびEcoRI
で切断された場合にはインフレームでHisタグを有する、改変されたpT7b
lue構築物中にクローン化した。PEP2−GCG−TcD−GCG−TcE
融合物の構築のために、以下の一致した対のオリゴを合成し、キナーゼ処理し、
そしてアニールした:PDM−116(配列番号87)およびPDM−117(
配列番号88);ならびにPDM−118(配列番号89)およびPDM−11
9(配列番号90)。次いで、これらの一致したオリゴの2つの対を、Eco4
7II(New England Labs.)およびEco RIで切断され
た上記のPEP2−GCG−TcD構築物に連結した。
号92)、ならびにPDM−122(配列番号93)およびPDM−123(配
列番号94)の一致した対を合成し、キナーゼ処理し、そしてアニールし、次い
でEag Iで切断された上記のPEP2−GCG−TcD−GCG−TcE構
築物と連結し、平滑末端のためにT4 DNAポリメラーゼで処理し、次いでE
co RIで切断した。次いで、このクローンをNde I(Gibco BR
L)およびEco RIで消化し、そして同じ酵素で切断された、改変されたp
ET28ベクター中にサブクローン化した。
)に形質転換し、そしてカナマイシン(30μg/ml、Sigma、St.L
ouis、MO)およびクロラムフェニコール(34μg/ml Sigma)
を有するLBブロス中で一晩増殖させた。12mlの一晩の培養物を使用して、
同じ抗生物質を有する500mlの2XYTを接種し、そしてこの培養物を、0
.37のOD560にて、IPTGを用いて、1.0mMの最終濃度まで誘導し
た。誘導の4時間後、細菌を収集し、そして20mM Tris(8.0)、1
00mM NaCl、0.1%DOC、20μg/ml ロイペプチンおよび2
0mM PMSF中で超音波処理し、次いで26,000×gで遠心分離した。
超音波処理後、この融合タンパク質を可溶性の上清中に見出した。次いで、この
上清を、Pro−bondニッケル樹脂(Invitrogen、Carlsb
ad、CA)に結合させた。このカラムを、50mlの20mM Tris(8
.0)、100mM NaCl洗浄緩衝液で洗浄し、次いで漸増濃度のイミダゾ
ールで溶出した。この溶出は、20mM Tris(8.0)、100mM N
aCl洗浄緩衝液中の50mM、100mM、および500mMのイミダゾール
を用いて行った。目的のタンパク質を含む溶出液をプールし、次いで10mM
Tris(8.0)に対して透析した。
A)アニオン交換カラムに取り込み、10mM Tris(8.0)中で結合し
、そして10mM Tris(8.0)中で1MまでのNaCl勾配で溶離した
。目的のタンパク質を含む溶出液をプールし、そして10mM Tris(8.
0)に対して透析した。透析後、このタンパク質を再濃縮し、濾過滅菌し、そし
てタンパク質濃度を決定するためにBCAアッセイ(Pierce)を行った。
決定されたTcF−2のアミノ酸配列は、配列番号95で提供される。
示された。TcEと比較して以下の配列を有するTcHi29ペプチドを合成し
た。 TcE KAAIAPAKAAAAPAKAATAPA(配列番号55) TcHi29 KTAAPPAKTAAPPAKTAAPPA(配列番号64) 図9は、上記の手順を使用してELISAによって決定されるような、T.c
ruzi陽性患者由来の血清ならびに他の疾患カテゴリー由来の血清に関連する
これらの2つの配列の反応性の比較を示す。データは、試験された他の疾患群と
の交差反応性をほとんど示さないか、または全く示さないが、T.cruzi陽
性血清の間での反応性の分布は、2つのペプチドについて部分的に重複すること
を示した。試験された53個のコンセンサス陽性サンプルのうち、TcEは31
/53を検出し、そしてTcHi29は、36/53を検出した。このTcEお
よびTcHi29の群において、両者は24個の同一血清を検出した。TcEは
、TcHi29によって検出されなかった7個の陽性血清を検出し、代わってT
cHi29は、TcEによって検出されなかった12個の陽性血清を検出した。
ジペプチドTcD/TcHi29をまた合成し、そしてELISA(100ng
/ウェル TcD/TcHi29、250ng/ウェル PEP−2/TcLo
1.2)において、PEP−2/TcLo1.2ジペプチドと組み合わせて使用
し、そしてTcD/TcEおよびPEP−2/TcLo1.2のジペプチドの組
み合わせと比較した。図10に示されるように、データは、2つの混合物の全体
の活性が、研究されたT.cruziの陽性集団および陰性集団の両者について
類似していることを示し、そしてこのようなペプチドの組合せにおいて、TcH
i29はTcEに代替的であると考えられ得ることを示唆する。
が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ること
が理解される。
g)個体からの血清を使用して行ったELISAアッセイにおいて、T.cru
zi溶解物の反応性と代表的な本発明のポリペプチド(rTcc6)とを比較す
るグラフである。バーは、±1標準偏差を表す。
g)個体からの血清を使用して行ったELISAアッセイにおいて、本発明の代
表的なポリペプチドの反応性の比較を表すグラフである。実験1は、rTcc2
2と、ペプチドTcc22−1およびTcc22−1+との比較を示す;実験2
は、rTcc22、rTcHi12と、ペプチドTcc22−1、Tcc22−
1+およびTcc22−2.1との比較を示す。バーは、±1標準偏差を表す。
g)個体からの血清を使用して、ならびに内臓リーシュマニア症(VL)、皮膚
リーシュマニア症(CL)、結核(TB)、およびマラリアを有する個体由来の
血清を使用して行ったELISAアッセイにおいて、T.cruzi溶解物の反
応性と代表的なポリペプチド(Tcc38)との比較を示すグラフである。バー
は、±1標準偏差を表す。
性の比較を示すグラフである。このグラフは、T.cruzi感染した(Pos
)個体および感染していない(Neg)個体からの血清を使用して行ったELI
SAアッセイにおいて、TcLo1抗原およびTcHi10抗原の異なるリーデ
ィングフレームを示す。バーは、±1標準偏差を表す。
g)個体からの血清を使用して、ならびに内臓リーシュマニア症(VL)、皮膚
リーシュマニア症(CL)、マラリア、および結核(TB)を有する個体由来の
血清を使用して行ったELISAアッセイにおいて、T.cruzi溶解物の反
応性と代表的なポリペプチド(TccLo1.2)との比較を示すグラフである
。バーは、±1標準偏差を表す。
リペプチドの組合せのELISA反応性を示すグラフである。
cEポリペプチド改変体のELISA反応性を示すグラフである。
2つのジペプチド、トリペプチド、およびテトラペプチドのELISA反応性を
比較するグラフである。
の血清を用いる、本発明の代表的なポリペプチド(TcHi29)およびTcE
のポリペプチドのELISA反応性を示すグラフである。
つの代表的なジペプチド混合物のELISA反応性を比較するグラフであり、一
方の混合物にはTcEエピトープが含まれ、そして他方には本発明のTcHi2
9エピトープが含まれる。
融合ポリペプチドTcFのELISA反応性と、合成分枝テトラペプチド2/D
/E/Lo1.2の反応性とを比較するグラフである。
Claims (2)
- 【請求項1】 T.cruzi抗原の少なくとも1つのエピトープを有する
組み合わせポリペプチドであって、該エピトープが、以下: (1)アミノ酸配列Gly−Asp−Lys−Pro−Ser−Pro−Phe
−Gly−Gln−Ala−Ala−Ala−Gly−Asp−Lys−Pro
−Ser−Pro−Phe−Gly−Gln−Alaを含む、PEP−2エピト
ープ; (2)アミノ酸配列Ala−Glu−Pro−Lys−Ser−Ala−Glu
−Pro−Lys−Pro−Ala−Glu−Pro−Lys−Serを含む、
TcDエピトープ; (3)アミノ酸配列Ala−Glu−Pro−Lys−Pro−Ala−Glu
−Pro−Lys−Ser−Ala−Glu−Pro−Lys−Proを含む、
TcDエピトープ; (4)アミノ酸配列Lys−Ala−Ala−Ile−Ala−Pro−Ala
−Lys−Ala−Ala−Ala−Ala−Pro−Ala−Lys−Ala
−Ala−Thr−Ala−Pro−Alaを含む、TcEエピトープ; (5)アミノ酸配列Lys−Ala−Ala−Ala−Ala−Pro−Ala
−Lys−Ala−Ala−Ala−Ala−Pro−Ala−Lys−Ala
−Ala−Ala−Ala−Pro−Alaを含む、TcEエピトープ; (6)アミノ酸配列;Gly−Thr−Ser−Glu−Glu−Gly−Se
r−Arg−Gly−Gly−Ser−Ser−Met−Pro−Ser−Gl
y−Thr−Ser−Glu−Glu−Gly−Ser−Arg−Gly−Se
r−Ser−Met−Pro−Alaを含む、TcLo1.2エピトープ; ならびに保存的な置換および/あるいは改変においてのみ異なるそれらの改変体
、 からなる群より選択される、組み合わせポリペプチド。 - 【請求項2】 生物学的サンプルにおいてT.cruzi感染を検出するた
めの方法であって、以下 (a)該生物学的サンプルを、請求項1に記載の組み合わせポリペプチドと接触
させる工程;および (b)該生物学的サンプルにおいて、該組み合わせポリペプチドに結合する抗体
の存在を検出し、これにより該生物学的サンプルにおけるT.cruzi感染を
検出する工程、 を包含する、方法。
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