【発明の詳細な説明】
T.cruzi感染の検出および予防のための化合物および方法技術分野
本発明は、一般に、T.cruzi感染の診断に関する。本発明は、より詳細には、T
.cruzi感染について個体および血液供給品をスクリーニングするための方法およ
び診断キットにおける、一つ以上のT.cruzi抗原性ペプチドまたはそれに対する
抗体の使用に関する。本発明はまた、Chagas病を予防するために個体を免疫化す
るためのワクチン組成物に関する。発明の背景
原生動物寄生体は、世界の多くの地域で健康に対して大きな脅威となっている
。Trypanosoma cruzi(T.cruzi)は、主に、中央および南アメリカで数百万の個体
に感染している、このような寄生体の１つである。この寄生体の感染は、慢性の
心臓病および種々の免疫系障害を生じ得るChagas病を引き起こし得る。ラテンア
メリカでは、1800万の人々が T.cruziに感染していると推定されているが、この
感染の臨床症状に対する確実な処置はない。現在利用可能なChagas病の予防のた
めのワクチンは存在しない。
この病気が風土病である地域では、伝播の最も顕著な経路は、感染したトリア
トーマ類サシガメ(triatomid bug)との接触による。しかし、その他の地域では
、輸血が伝播の最も優勢な手段である。このような地域で T.cruziの伝播を阻害
するために、個体におけるT.cruzi感染を診断するため、および血液供給品をス
クリーニングするための正確な方法を開発することが必要である。0.1％〜62％
の試料が感染されているかもしれず、そしてこの寄生体が輸血によりしばしば伝
播される南アメリカでは、血液バンクのスクリーニングが特に重要である。また
、特定の合衆国の都市における血液供給品が、T.cruzi寄生体で汚染されている
かもしれないことに関心が高まっている。
T.cruzi感染の診断は問題が多い。なぜなら、日常の使用に適切であるこの寄
生体を検出する正確な方法が利用可能でないからである。数十年間存続し得る感
染の急性期の間は、感染は静態のままであり得、そして宿主は、無症候であり得
る。その結果、T.cruzi感染に対する血清学的試験が最も信頼性があり、そして
最も一般に用いられ得る。
しかし、このような診断は、この寄生体の複雑な生活環および宿主の多種多様
な免疫応答により複雑である。この寄生体は、昆虫ベクター中でエピマスティゴ
ート期を、そして哺乳動物宿主中で２つの主要期を経験する。１つの宿主期は血
液中に存在し(トリポマスティゴート期)、そして第２期は細胞内である(無べん
毛型期)。複数の期は、感染の間、寄生体により呈示される多種多様な抗原を生
じる。さらに、原生動物感染に対する免疫応答は複雑であり、寄生体抗原のアレ
イに対する体液性および細胞媒介性応答の両者を含む。
寄生体抗原に対する抗体を検出することは、臨床感染および無症状感染を診断
する最も一般的かつ信頼性のある方法であるが、現行の試験は高価でかつ難しい
。大部分の血清学的試験は、全 T.cruziまたは溶解 T.cruziを用い、そしてT.cr
uzi感染を正確に検出するために、補体結合、間接免疫蛍光、受動凝集、ELISAを
含む３つの試験のうち２つについて陽性の結果を必要とする。このような試験の
コストおよび困難性は、多くの風土病地域で血液または血清のスクリーニングを
妨げてきた。
従って、当該分野において血液供給品および個体におけるT.cruzi感染を検出
する、より特異的および高感度な方法に対する必要性が存在する。本発明は、こ
れらの必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。発明の要旨
簡単に述べれば、本発明は、個体および血液供給品におけるT.cruzi感染を検
出および防止するための化合物および方法、ならびに生物学的試料におけるT.cr
uzi感染をスクリーニングするための化合物および方法を提供する。１つの局面
において、本発明は、生物学的試料におけるT.cruzi感染を検出するための方法
を提供し、この方法は、(a)生物学的試料を、配列番号１〜配列番号22に列挙さ
れるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するT.cruzi抗原
または保存的置換および／もしくは改変のみが異なる抗原の改変体のエピトープ
を含むポリペプチドと接触させる工程；ならびに(b)生物学的試料におけるポリ
ペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それによってこの生物学的試料中の T
.cruzi感染を検出する工程を包含する。
本発明の別の局面において、配列番号１〜配列番号21に列挙されるヌクレオチ
ド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するT.cruzi抗原のエピトープま
たは保存的置換および／もしくは改変のみが異なる抗原の改変体を含むポリペプ
チドが提供される。
関連する局面において、上記のポリペプチドをコードするDNA配列、これらのD
NA配列を含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換またはト
ランスフェクトされた宿主細胞もまた提供される。
別の局面において、本発明は、生物学的試料におけるT.cruzi感染を検出する
ための診断キットを提供し、このキットは、（ａ）配列番号１〜配列番号22に列
挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するT.cruzi
抗原または保存的置換および／もしくは改変のみが異なる抗原の改変体のエピト
ープを含むポリペプチド；および（ｂ）検出因子を含む。
本発明のなお別の局面において、生物学的試料におけるT.cruzi感染の存在を
検出するための方法が提供され、この方法は、(a)生物学的試料を、配列番号１
〜配列番号22に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
を有するT.cruzi抗原または保存的置換および／もしくは改変のみが異なる抗原
の改変体のエピトープに結合するモノクローナル抗体と接触させる工程；ならび
に(b)生物学的試料におけるモノクローナル抗体に結合するT.cruzi寄生体の存在
を検出する工程を包含する。
関連する局面において、上記のポリペプチドおよび生理学的に受容可能なキャ
リアを含む薬学的組成物、ならびにアジュバンドと組み合わせた上記のポリペプ
チドを含むワクチンもまた提供される。
本発明はまた、他の局面において、Chagas病に対する防御免疫を患者において
誘導するための方法をさらに提供し、この方法は上記の薬学的組成物またはワク
チンを患者に投与する工程を包含する。
他の局面において、本発明は生物学的試料におけるT.cruzi感染を検出するた
めの方法を提供し、この方法は、（ａ）生物学的試料を、配列番号１〜配列番号
22に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するT.
cruzi抗原または保存的置換および／もしくは改変のみが異なる抗原の改変体の
エピトープを含む第一のポリペプチドと接触させる工程；（ｂ）生物学的試料を
、他のT.cruzi抗原または保存的置換および／もしくは改変のみが異なるその改
変体の１つ以上のエピトープを含む１つ以上のさらなるポリペプチドと接触させ
る工程；および（ｃ）生物学的試料における上記ポリペプチドの１つ以上に結合
する抗体の存在を検出し、それによってこの生物学的試料におけるT.cruzi感染
を検出する工程を包含する。１つの実施態様において、さらなるポリペプチドは
、TcDまたは保存的置換および／もしくは改変のみが異なるその改変体のエピト
ープを含む。別の実施態様において、さらなるポリペプチドは、TcD（または保
存的置換および／もしくは改変のみが異なるその改変体）のエピトープおよびTc
E（または保存的置換および／もしくは改変のみが異なるその改変体）のエピト
ープを含む。なお別の実施態様において、さらなるポリペプチドは、TcD（また
は保存的置換および／もしくは改変のみが異なるその改変体）のエピトープおよ
びPEP-2（または保存的置換および／もしくは改変のみが異なるその改変体）の
エピトープを含む。
なおさらなる局面において、本発明は２つ以上のポリペプチドを含む組合せポ
リペプチドを提供し、各ポリペプチドは、配列番号１〜配列番号22に列挙される
ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するT.cruzi抗原また
は保存的置換および／もしくは改変のみが異なるその改変体のエピトープを含む
。配列番号１〜配列番号22に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされる
アミノ酸配列を有するT.cruzi抗原または保存的置換および／もしくは改変のみ
が異なるその改変体の少なくとも１つのエピトープ、ならびにTcDエピトープ、T
cEエピトープ、PEP-2エピトープ、および保存的置換および／もしくは改変のみ
が異なるそれらの改変体からなる群より選択される少なくとも１つのエピトープ
を含む組合せポリペプチドもまた提供される。
関連する局面において、生物学試料におけるT.cruzi感染を検出するための方
法が提供され、この方法は（a）生物学的試料を、上記の組合せポリペプチドの
少なくとも１つと接触させる工程および（ｂ）生物学的試料中で組合せポリペプ
チドに結合する抗体の存在を検出する工程を包含する。
本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参
照すれば明らかになる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、各々を個々
に援用したかのように、本明細書においてその全体が参考として援用される。図面の簡単な説明
図１は、T.cruzi感染（Pos）および非感染（Neg）個体からの血清を使用して
実施されたELISAアッセイにおける、T.cruzi溶解産物および本発明の代表的なポ
リペプチド（rTcc6）の反応性を比較するグラフである。縦線は、±１標準偏差
を示す。
図２は、T.cruzi感染（Pos）および非感染（Neg）個体からの血清を使用して
実施されたELISAアッセイにおける、本発明の代表的なポリペプチドの反応性の
比較を示すグラフである。実験１は、rTcc22、ならびにペプチドTcc22-1およびT
cc22-1+の比較を示す；実験２は、rTcc22、rTcHi12、ならびにペプチドTcc22-1
、Tcc22-1+およびTcc22-2.1の比較を示す。縦線は、±１標準偏差を示す。
図３は、T.cruzi感染（Pos）および非感染（Neg）個体からの血清を使用して
、ならびに内臓リーシュマニア症（VL）、皮膚リーシュマニア症（CL）、結核（
TB）、およびマラリアに罹患している個体からの血清を使用して実施されたELIS
Aアッセイにおける、T.cruzi溶解産物および代表的なポリペプチド（Tcc38）の
反応性の比較を示すグラフである。縦線は、±１標準偏差を示す。
図４は、T.cruzi感染（Pos）および非感染（Neg）個体からの血清を使用して
実施されたELISAアッセイにおける、T.cruzi溶解産物および本発明のいくつかの
ポリペプチド（これらは、TcLo1およびTcHi10抗原の異なったリーディングフレ
ームを表す）の反応性の比較を示すグラフである。縦線は、±１標準偏差を示す
。
図５は、T.cruzi感染（Pos）および非感染（Neg）個体からの血清、ならびに
内臓リーシュマニア症（VL）、皮膚リーシュマニア症（CL）、マラリア、および
結核（TB）に罹患している個体からの血清を使用して実施されたELISAアッセイ
における、T.cruzi溶解産物および代表的なポリペプチド（TccLo1.2）の反応性
を比較するグラフである。
図６は、一連のポリペプチドの組合せとT.cruzi陽性および陰性血清とのELISA
反応性を示すグラフである。
図７は、一連のTcEポリペプチド改変体とT.cruzi陽性および陰性血清とのELIS
A反応性を示すグラフである。
図８は、本発明の二つのジペプチド、一つのトリペプチド、および一つのテト
ラペプチドと、T.cruzi陽性および陰性血清とのELISA反応性を比較するグラフで
ある。
図９は、本発明の代表的なポリペプチド（TcHi29）およびTcEの、正常個体、T
.cruzi患者、および他の疾患に罹患した患者からの血清とのELISA反応性を示す
グラフである。
図１０は、二つの代表的なジペプチド混合物とT.cruzi陽性および陰性血清と
のELISA反応性を比較するグラフであり、一方の混合物はTcEエピトープを含み、
他方は本発明のTcHi29エピトープを含む。発明の詳細な説明
上記のように、本発明は、一般に、個体および血液供給品のT.cruzi感染を検
出および予防する化合物および方法に関する。本発明の化合物は、一般に、T.cr
uzi抗原の１つ以上のエピトープを含む。特に、配列番号１〜配列番号22に列挙
されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するT.cruzi抗
原のエピトープを含むポリペプチドが好ましい。本明細書において使用される用
語「ポリペプチド」は、全長（すなわち、天然の）抗原を含む任意の長さのアミ
ノ酸鎖を包含する。従って、エピトープを含むポリペプチドは、エピトープから
のみなり得るか、またはさらなる配列を含み得る。さらなる配列は、天然の抗原
由来であり得るか、または異種性であり得る。そしてこのような配列は抗原性で
あり得る（が抗原性である必要はない）。特定のアミノ酸配列を「有する」タン
パク質は、その全長内配列に列挙された配列を含むタンパク質である。このよう
なタンパク質はさらなるアミノ酸配列を含み得るか、または含み得ない。さらな
るT.cruziタンパク質の一つ以上のエピトープの使用もまた、本明細書中に列挙
された配列の一つ以上のエピトープに優先してまたは組合わせて診断の感度およ
び特異性を増強するために意図される。
本明細書中で使用される「エピトープ」は、T.cruzi感染個体の血清と反応す
るT.cruzi抗原の部分である（すなわち、エピトープは特異的にこのような血清
内の一つ以上の抗体によって結合される）。本願中において記載される抗原のエ
ピトープは、一般に当業者に公知である方法（例えば、Paul，Fundamental Immu
nology，第３編，243-247(Raven Press，1993)およびそこで引用された参考文献
において要約された方法）を使用して同定され得る。例えば、天然のT.cruzi抗
原由来のポリペプチドは、T.cruzi感染患者から得られるプールされた血清と反
応する能力についてスクリーニングされ得る。例えば、T.cruzi感染血清との反
応性を評価するために適切なアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着法（ELISA）
）は、以下に、およびHarlowおよびLane，Antibodies:A Laboratory Manual,Col
d Spring Harbor Laboratory，1988においてより詳細に記載される。ポリペプチ
ドのエピトープは、全長ポリペプチドの反応性と実質的に同様なレベルでこのよ
うな抗血清と反応する部分である。言い換えれば、エピトープは、抗体結合アッ
セイ（例えば、ELISA）において全長ポリペプチドによって生成される応答の少
なくとも約80％、および好ましくは少なくとも約100％を生成し得る。
本発明の化合物および方法はまた、上記ポリペプチドの改変体を包含する。本
明細書中で用いられる「改変体」は、列挙されたポリペプチドと保存的置換また
は保存的改変においてのみ異なり、その結果列挙されたポリペプチドの抗原性性
質を保持するポリペプチドである。「保存的置換」は、あるアミノ酸が、類似の
性質を有する別のアミノ酸に置換され、その結果ペプチド化学の当業者がポリペ
プチドの二次構造および疎水親水指数の性質が実質的に変化しないと予期するよ
うな置換である。一般に、以下の群のアミノ酸が保存的交換を代表する：（１）
ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；（２）cys、ser、tyr、thr；
（３）val、ile、leu、met、ala、phe；（４）lys、arg、his；および（５）phe
、tyr、trp、his。改変体はまた、あるいは、他の保存的改変を含み、これらは
、ポリペプチドの抗原性性質、二次構造および疎水親水指数の性質に対して最小
の
影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含み得る。例えば、ポリペプチドは、
合成を容易にするために、または固体支持体へのポリペプチドの結合を増大する
ために、リンカーまたはその他の配列と結合され得る。
関連する局面において、複数のT.cruzi抗原のエピトープを含む組合せポリペ
プチドが、開示される。「組合せポリペプチド」は異なったT.cruzi抗原または
その改変体のエピトープが、例えば単一アミノ酸鎖にペプチド結合を介して結合
されるポリペプチドである。こうして形成されたアミノ酸鎖は、直線状か、また
は分枝状であり得る。エピトープは、直接結合され得（すなわち、アミノ酸を介
在することなしに）、またはエピトープの抗原性性質を有意に変えないリンカー
配列（例えば、Gly-Cys-Gly）を介して結合され得る。ペプチドエピトープはま
た、非ペプチド結合（例えば、ペプチドエピトープ上の特異的官能基間を（例え
ば、アミノ基、カルボキシル基、またはスルフヒドリル基を介して）化学的にま
たは光化学的にカップリングするヘテロまたはホモニ機能性試薬）を介して結合
され得る。本発明の組合せポリペプチドにおいて有用に利用され得る二機能性試
薬は、当業者に周知である。エピトープはまた、溶液中かまたは固層中のいずれ
かで、一つ以上のエピトープが第一のリガンド／抗リガンド対の第一のメンバー
に結合され、次いでリガンド／抗リガンド対の相補的なメンバーに結合されるア
ビジン／ビオチンのような相補的なリガンド／抗リガンド対よって結合され得る
。組合せポリペプチドは、本明細書中に記載されるようなポリペプチドの複数の
エピトープを含み得、および／または本明細書中に記載されるエピトープに結合
される一つ以上の他T.cruzi抗原（例えば、TcD、TcE、またはPEP-2）のエピトー
プを含み得る。
一般に、T.cruzi抗原およびこのような抗原をコードするDNA配列は、任意の種
々の手順を使用して調製され得る。例えば、T.cruzi cDNAまたはゲノムDNA発現
ライブラリーは、T.cruzi感染個体の血清のプールでスクリーニングされ得る。
このようなスクリーニングは、一般に、当業者に周知の技術（例えば、Sambrook
ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborator
ies，Cold Spring Harbor，N.Y.,1989に記載される技術）を使用して実施され得
る。簡単に述べれば、バクテリオファージライブラリーをプレートし、そしてフ
ィルターに移し得る。次いで、このフィルターを血清および検出因子とインキュ
ベートし得る。本発明の文脈では、「検出因子」は、抗体-抗原複合体に結合し
得る任意の化合物であり、次いで、この複合体は、当業者に公知の任意の種々の
手段により検出され得る。スクリーニング目的のための代表的な検出因子は、レ
ポーター基に結合した、プロテインＡ、プロテインＧ、IgG、またはレクチンの
ような「結合因子」を含む。好適なレポーター基は、酵素、基質、コファクター
、インヒビター、色素、放射性核種、化学発光基、蛍光基、およびビオチンを含
むがこれらに限定されない。より好適には、レポーター基は、テトラメチルベン
ジジンまたは2,2'-アジノ-ジ-3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸のような基
質とのインキュベーションにより検出され得る西洋ワサビペルオキシダーゼであ
る。血清中の抗体に結合するタンパク質を発現するcDNAを含むプラークは、当業
者に公知の技術により単離および精製され得る。適切な方法は、例えば、Sambro
okら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborato
ries,Cold Spring Harbor，N.Y.,1989に見出され得る。
配列番号１〜配列番号18に列挙されるヌクレオチド配列を有するDNA分子は、
上記のように、T.cruzi感染個体由来の血清のプールを用いてT.cruziゲノム発現
ライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。より詳細には、
配列番号１〜配列番号16に列挙されるヌクレオチド配列を有するDNA分子は、米
国特許第5,304,371号および1995年３月14日に出願された米国特許出願第08/403,
379号に記載される寄生生物溶解産物、ならびに／またはT.cruzi抗原TcDおよびT
cEの一方もしくは両方と血清学的反応性を（ELISAまたはウェスタンアッセイに
おいて）示す血清のプールを用いてライブラリーをスクリーニングすることによ
って単離され得る。次いで、引き続くスクリーニングが、検出可能な抗TcD抗体
を欠く患者血清を用いて行われる。配列番号17（5'末端）および配列番号18（3'
末端）に列挙されるヌクレオチド配列を有するDNA分子は、溶解物、TcD、および
TcEとのより低い血清学的反応性を示す（すなわち、ELISAまたはウェスタンアッ
セイにおいてバックグラウンドの反応性を超えて３標準偏差より少ないシグナル
を検出する）血清のプールを用いてゲノム発現ライブラリーをスクリーニングし
、その後引き続き検出可能な抗TcD抗体を欠く患者血清を用いて次のスクリーニ
ン
グすることによって単離され得る。
配列番号19〜配列番号22に列挙される配列を有するDNA分子は、T.cruzi感染個
体の血清（より高いおよびより低い血清学的反応性の両方）を用いて非増幅T.cr
uzi cDNA発現ライブラリーをスクリーニングすることによって、上記のように、
得られ得る。
あるいは、配列番号１〜配列番号22に列挙される配列を有するDNA分子は、T.c
ruziゲノムDNAまたはcDNAからポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅され得る。こ
のアプローチのために、配列番号１〜配列番号22に提供される配列に基づいて配
列特異的プライマーが設計され得、そして購入または合成され得る。次いで、DN
A配列の増幅部分は周知の技術（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A La
boratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY(
1989)に記載の技術）を使用して全長ゲノムまたはcDNAクローンを単離するため
に使用され得る。
上記DNA配列によってコードされるアミノ酸配列を有する抗原のエピトープが
、一般に、天然の抗原の部分を含むポリペプチドを産生し、そしてT.cruzi感染
個体の血清を用いてポリペプチドの反応性を評価することによって、上記のよう
に同定され得る。多くの場合、天然の抗原において見出された一つ以上の反復配
列を含むペプチドは、エピトープを含む。このような反復配列は、上記のヌクレ
オチド配列の調査に基づいて同定され得る。上記のDNA配列によってコードされ
る抗原についての代表的な反復配列は、配列番号23〜配列番号36および配列番号
47〜配列番号49において提供される。より詳細には、配列番号３に列挙される配
列についての反復配列は配列番号23（フレーム１）、配列番号24（フレーム２）
、および配列番号25（フレーム３）において提供される。配列番号４に列挙され
る配列についての反復配列は、配列番号26（フレーム１）および配列番号27（フ
レーム３）において提供される。そして配列番号９についての反復配列は、配列
番号47（フレーム１）、配列番号48（フレーム２）、および配列番号49（フレー
ム３）において提供される。配列番号12については、反復配列は、配列番号28（
フレーム１）、配列番号29（フレーム２）、および配列番号30（フレーム３）に
おいて提供される。配列番号31は、配列番号15についての反復配列を列挙する。
配
列番号16については、反復配列は、配列番号32（フレーム２）および配列番号33
（フレーム３）において提供される。最後に、配列番号18についての反復配列は
、配列番号34（フレーム１）、配列番号35（フレーム２）、および配列番号36（
フレーム３）において提供される。
本明細書中に記載のポリペプチドは、当業者に周知の技術を用いて生成され得
る。約100より少ないアミノ酸、そして、一般に、約50より少ないアミノ酸を有
するポリペプチドは、例えば、伸長するアミノ酸鎖にアミノ酸が連続的に添加さ
れる、Merrifieldの固相合成法を用いて合成され得る。Merrifield、J.Am.Chem.
Soc.85:2149-2146、1963を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は
、Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CAのような供給者から市販されている
。従って、例えば、上記の反復配列またはそれらの部分を含むポリペプチドは、
この方法により合成され得る。同様に、他の天然の抗原またはそれらの改変体の
エピトープは、自動合成機を用いて調製され得る。
あるいは、本発明のポリペプチドは、培養した宿主細胞における、このポリペ
プチドをコードする組換えDNAの発現により調製され得る。好ましくは、宿主細
胞は、E.coli、酵母、昆虫細胞株(例えば、SpodopteraまたはTrichoplusia)、ま
たはCHO、COS、およびNS-1を含む（が、これらに制限されない）哺乳動物細胞株
である。この様式で発現されるDNA配列は、天然に存在するタンパク質（例えば
、配列番号１〜配列番号22のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を有す
る全長抗原）、天然に存在するタンパク質の部分、またはこのようなタンパク質
の改変体をコードし得る。このようなDNA配列によってコードされる代表的なポ
リペプチドは、配列番号37〜配列番号46、配列番号52、および配列番号65におい
て提供される。
本発明の発現されたポリペプチドは、一般に、実質的に純粋な形態で単離され
る。ポリペプチドは、好ましくは少なくとも80重量％の純度まで、より好ましく
は少なくとも95重量％の純度まで、そして最も好ましくは少なくとも99重量％の
純度まで単離される。一般に、このような精製は、例えば、硫酸アンモニウム分
画、SDS-PAGE電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーの標準的技術
を用いて達成され得る。
本発明の別の局面では、個体および血液供給品のT.cruzi感染を検出する方法
が開示される。１つの実施態様において、T.cruzi感染は、抗体を含む任意の生
物学的試料中で検出され得る。好ましくは、試料は、血液、血清、血漿、唾液、
脳脊髄液、または尿である。より好ましくは、試料は、患者または血液供給品か
ら得た血液または血清試料である。簡単に述べれば、T.cruzi感染は、上記の任
意の１つ以上のポリペプチド、またはそれらの改変体を用いて検出され、試料中
のポリペプチド（単数または複数）に対する抗体の存在または非存在が、予め決
定したカットオフ値と比較して決定され得る。
試料中の抗体を検出するために精製抗原を用いる当業者に公知の種々のアッセ
イフォーマットが存在する。例えば、HarlowおよびLane，Antibodies: A Labora
tory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988を参照のこと。好ましい実
施態様において、このアッセイは、固体支持体上に固定化されたポリペプチドの
使用を含み、試料から抗体を結合し、そして取り除く。次いで、結合した抗体は
、抗体/ペプチド複合体に結合し、そして検出可能なレポーター基を含む検出因
子を用いて検出され得る。適切な検出因子は、抗体/ペプチド複合体およびレポ
ーター基で標識された遊離のポリペプチドに結合する抗体を含む（例えば、半競
合アッセイにおいて）。あるいは、競合アッセイが利用され得、そこでは、ポリ
ペプチドに結合する抗体がレポーター基で標識され、そして試料との抗原のイン
キュベーションの後、固定化抗原に結合させる。試料の成分が、標識抗体のポリ
ペプチドへの結合を阻害する程度は、試料と固定化ポリペプチドとの反応性の指
標である。
固体支持体は、抗原が結合し得る、当業者に公知の任意の固体材料であり得る
。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェル、またはニ
トロセルロース膜もしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、支持体は、ガラ
ス、ファイバーガラス、ラテックス、またはプラスチック材料（例えば、ポリス
チレンまたはポリビニルクロライド）のような、ビーズまたはディスクであり得
る。支持体はまた、例えば、米国特許第5,359,681号に開示されるような、磁気
粒子またはファイバー光学センサーであり得る。
ポリペプチドは、特許および科学的文献に詳細に記載されている、当業者に公
知の種々の技術を用いて固体支持体に結合され得る。本発明の文脈では、用語「
結合」は、吸着のような非共有結合的会合、および共有結合(これは、抗原と支
持体上の官能基との間の直接結合であり得、または架橋剤による結合であり得る
)の両者をいう。マイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への吸着による
結合が好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中のポリペプチドを、
適切な時間の間、固体支持体と接触させることにより達成され得る。接触時間は
、温度により異なるが、代表的には、約１時間と１日との間である。一般に、プ
ラスチックマイクロタイタープレート(例えば、ポリスチレンまたはポリビニル
クロライド)のウェルを、約10 ng〜約１μgの範囲の量(そして、好ましくは約10
0ng)のポリペプチドと接触させれば、適切な量の抗原を結合するに十分である。
ニトロセルロースは、１cm3あたり約100μgのタンパク質を結合する。
固体支持体へのポリペプチドの共有結合は、一般に、最初、支持体を、支持体
およびポリペプチド上のヒドロキシル基またはアミノ基のような官能基の両方と
反応する二官能性試薬と反応させることにより達成され得る。例えば、ポリペプ
チドは、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、ベンゾキノンを用いて
、または支持体上のアルデヒド基とポリペプチド上のアミンおよび活性水素との
縮合により結合され得る(例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handb
ook(1991)、A12-A13を参照のこと)。
特定の実施態様では、このアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で
ある。このアッセイは、最初、通常はマイクロタイタープレートのウェルである
固体支持体上に固定化されたポリペプチド抗原を、試料と、試料内のポリペプチ
ドに対する抗体が、固定化ポリペプチドに結合されるように、接触させることに
より実施され得る。次いで、非結合試料を、固定化ポリペプチドから除去し、そ
して固定化抗体-ポリペプチド複合体に結合し得る検出因子が添加される。次い
で、固体支持体に結合したままの検出因子の量を、特定の検出因子に適切な方法
を用いて測定する。
一旦、ポリペプチドが支持体上に固定化されれば、残存する支持体上のタンパ
ク質結合部位は、代表的には、ブロックされる。任意の適切なブロッキング剤が
当業者に公知であり、例えば、ウシ血清アルブミンまたは Tween 20TM(Sigma Ch
e
mical Co.，St．Louis，MO)がある。次いで、固定化ポリペプチドを、試料とイ
ンキュベートし、そして(試料中に存在すれば)抗体を抗原に結合させる。試料は
、インキュベーションの前に、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)のような適切な希
釈剤で希釈され得る。一般に、適切な接触時間(すなわちインキュベーション時
間)は、T.cruzi感染試料内の T.cruzi抗体の存在を検出するのを可能にするに十
分である時間である。好ましくは、接触時間は、結合抗体と非結合抗体との間の
平衡で達成される結合レベルの少なくとも95％である結合レベルを達成するに十
分である。当業者は、平衡を達成するために必要な時間は、経時的に生じる結合
のレベルをアッセイすることにより容易に決定され得ることを認識する。室温で
は、約30分間のインキュベーション時間が一般に十分である。
次いで、非結合試料は、0.1％のTween 20TMを含むPBSのような適切な緩衝液で
固体支持体を洗浄することにより除去され得る。次いで、検出因子を固体支持体
に添加し得る。適切な検出因子は、固定化抗体-ポリペプチド複合体に結合し、
しかも当業者に公知の任意の種々の手段により検出され得る、任意の化合物であ
る。好ましくは、検出因子は、レポーター基に結合した結合因子(例えば、プロ
テインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン、レクチンまたは遊離の抗原など)を
含む。好適なレポーター基は、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ)、基
質、コファクター、インヒビター、染料、放射性核種、発光基、蛍光基、および
ビオチンを含む。結合因子のレポーター基への結合は、当業者に公知の標準的な
方法を用いて達成され得る。通常の結合因子はまた、多くの供給元（例えば、Zy
med Laboratories，San Francisco，CAおよびPierce，Rockford，IL）から、種
々のレポーター基に結合して購買し得る。
次いで、検出因子を、固定化抗体-ポリペプチド複合体と、結合抗体を検出す
るに十分な時間インキュベートする。適切な時間は、一般に、製造者の指示から
、または経時的に生じる結合のレベルをアッセイすることにより決定され得る。
次いで、非結合検出因子を除去し、そして結合検出因子をレポーター基を用いて
検出する。レポーター基を検出するために用いる方法は、レポーター基の性質に
依存する。放射活性基には、シンチレーションカウンティングまたはオートラジ
オグラフ法が一般に適切である。分光学的方法を用いて、染料、発光基、および
蛍
光基を検出し得る。ビオチンは、異なるレポーター基(通常、放射活性または蛍
光基または酵素)に結合したアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基
は、一般に、基質を添加し(一般に特定の時間で)、その後反応生成物の分光学的
分析またはその他の分析により検出され得る。
試料中のT.cruzi抗体の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結
合したままのレポーター基から検出されるシグナルを、一般には、予め決定され
たカットオフ値に対応するシグナルと比較する。好ましくは、このカットオフ値
は、固定化抗原を、非感染患者からの試料とインキュベートしたときに得られる
平均の平均シグナル（average mean signal）である。一般に、平均値を３標準
偏差超えるシグナルを生成する試料を、T.cruzi抗体およびT.cruzi感染について
陽性であると考える。代わりの好ましい実施態様では、カットオフ値は、Sacket
tら、Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine，106-7
頁(Little Brown and Co.，1985)の方法に従って、レシーバーオペレーター曲線
（Receiver Operator Curve）を用いて決定される。簡単に述べれば、本実施態
様では、カットオフ値は、診断試験の結果についての各々の可能なカットオフ値
に対応する、真陽性の割合（すなわち、感度）および偽陽性の割合（100％特異
性）の対のプロットから決定され得る。上方左手の隅に最も近いプロット上のカ
ットオフ値（すなわち、最大面積を包囲する値）が、最も正確なカットオフ値で
あり、そして本方法により決定されたカットオフ値より高いシグナルを生成する
試料は、陽性であると考えられ得る。あるいは、カットオフ値は、プロットに沿
って左側にシフトされ、偽陽性の割合を最小化し得るか、または右側にシフトさ
れて偽陰性の割合を最小化し得る。一般に、本方法により決定されたカットオフ
値よりも高いシグナルを生成する試料は、T.cruzi感染について陽性と考えられ
る。
関連する実施態様では、アッセイは、フロースルーまたは細片試験フォーマッ
トで実施され、そこでは、抗原は、ニトロセルロースのような膜上に固定化され
る。フロースルー試験では、試料内の抗体は、試料が膜を通過するにつれて固定
化ポリペプチドに結合する。次いで、検出因子(例えば、プロテインＡ-コロイド
金)が、検出因子を含む溶液が膜を通過して流れるにつれ、抗体-ポリペプチド複
合体に結合する。次いで、結合した検出因子の検出を上記のように実施し得る。
細片試験フォーマットでは、ポリペプチドが結合する膜の一端を、試料を含む溶
液中に浸漬する。試料は、膜に沿って検出因子を含む領域を通って固定化ポリペ
プチドの領域まで移動する。ポリペプチドにおける検出因子の濃度は、試料中の
T.cruzi抗体の存在を示す。このような試験は、代表的には、極微量(例えば一滴
)の患者血清または血液を用いて実施され得る。
上記のアッセイは、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドを用いて
実施され得る。あるいは、感度は、１つ以上のさらなるT.cruzi抗原のエピトー
プを、上記のポリペプチド（単数または複数）との組合せで用いることによって
改善され得る。特に、TcDのエピトープ（例えば、米国特許第5,304,371号におい
て開示される）、PEP-2および/またはTcE（これらの両方が、例えば、1995年３
月14日に出願された米国特許出願第08/403,379号に開示される）は、上記のポリ
ペプチド（単数または複数）と共に用いられ得る。PEP-2抗原性エピトープはま
た、Peraltaら、J．Clin．Microbiol．32:971-74，1994において議論される。Tc
Dの配列は、配列番号50において提供される。TcEの配列は、配列番号51において
提供される。TcD抗原性エピトープは、好ましくは、アミノ酸配列Ala Glu Pro L
ys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser（配列番号53）またはアミノ
酸配列Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro（配列
番号54）を有する。TcEエピトープは、好ましくは、アミノ酸配列Lys Ala Ala I
le Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Thr Ala Pro Ala（
配列番号55）またはアミノ酸配列Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Al
a Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala（配列番号56）を有し、そしてPEP
2エピトープは、好ましくは、アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly G
ln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala（配列番号57）を有
する。
さらなるエピトープは、同一のポリペプチド内に（すなわち、組合せポリペプ
チド内に）存在し得るか、または別々のポリペプチドに含まれ得る。好ましくは
、ポリペプチドは、上記のようにマイクロタイタープレートのウェルまたは膜の
ような固体支持体上への吸着によって固定化され、その結果、ほぼ同様の量の各
ポ
リペプチドが、支持体と接触し、そしてその結果、支持体と接触しているポリペ
プチドの総量が、約１ng〜約10μgの範囲にある。残りの工程は、一般に上記の
ように実施され得る。
上記のポリペプチドはまた、TcD、TcE、および/またはPEP2由来の一つ以上の
エピトープを用いる診断の後に用いられ得る。本実施態様では、本発明のポリペ
プチドは、TcD、TcE、および/またはPEP2でのスクリーニングに基づいて、T.cru
zi感染の診断を確認するために用いられる。TcD、TcE、および/またはPEP2由来
のエピトープを用いるT.cruzi感染の診断は、1995年３月14日に出願された米国
特許出願第08/403,379号に記載されている。
本発明のなお別の局面では、上記のように、１つ以上のエピトープに対する単
一特異性抗体(これはポリクローナルまたはモノクローナルであり得る)を用いて
、生物学的試料中のT.cruziを検出するための方法が提供される。精製または合
成ポリペプチドに対する抗体は、当業者に公知の種々の任意の技術により調製さ
れ得る。例えば、Harlowおよび Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold
Spring Harbor Laboratory，1988を参照のこと。このような技術の１つでは、
抗原性ポリペプチドを含む免疫原を、最初、広範な種々の哺乳動物(例えば、マ
ウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびヤギ)のいずれかに注入される。この工
程では、本発明のポリペプチドを、改変なしで免疫原として供し得る。あるいは
、比較的短いポリペプチドでは特に、ポリペプチドが、ウシ血清アルブミンまた
はキーホールリンペットヘモシアニンのようなキャリアタンパク質に結合される
場合、優れた免疫応答が惹起され得る。免疫原は、動物宿主中に、好ましくは、
１つ以上の追加免疫を取り入れた予め決定されたスケジュールに従って注入され
、そして動物から定期的に採血する。次いで、ポリペプチドに特異的なポリクロ
ーナル抗体が、例えば、適切な固体支持体に結合したポリペプチドを用いるアフ
ィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Kohler
およびMilstein，Eur.J.Immunol.6:511-519、1976の技術、およびそれに対する
改良を用いて調製され得る。簡単に述べれば、これらの方法は、所望の特異性(
すなわち、目的のポリペプチドとの反応性)を有する抗体を生成し得る不死化細
胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫化された動
物から得た脾臓細胞から生成され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、ミエロー
マ細胞融合パートナー(好ましくは、免疫化された動物と同系であるパートナー)
との融合により不死化される。種々の融合技術が用いられ得る。例えば、脾臓細
胞およびミエローマ細胞は、非イオン性界面活性剤を用いて数分間結合され得、
次いで、ハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しな
い選択培地上に低密度でプレートされる。好適な選択技術は、HAT(ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン)選択を用いる。十分な時間の後(通常約１〜２週
間)、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一のコロニーを選択し、そして
ポリペプチドに対する結合活性を試験する。高い反応性および特異性を有するハ
イブリドーマが好ましい。
モノクローナル抗体は、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離
され得る。さらに、種々の技術（例えば、マウスのような適切な脊椎動物宿主の
腹膜腔中へのハイブリドーマ細胞株の注入）を用いて、収率を増大し得る。次い
で、モノクローナル抗体を腹水または血液から回収し得る。混入物は、クロマト
グラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出のような従来技術により、抗体から除
去され得る。
本明細書中に記載の１つ以上のポリペプチドのエピトープに対する単一特異性
抗体を使用して、直接または競合的であり得る、任意の種々の免疫アッセイの１
つを用いて、生物学的試料のT.cruzi感染を検出し得る。本発明のこの局面にお
ける使用に適切な生物学的試料は、上記の通りである。簡単に述べれば、１つの
直接アッセイフォーマットでは、単一特異性抗体は、(上記のような)固体支持体
上に固定化され、そして試験される試料と接触され得る。非結合試料を除去した
後、レポーター基で標識された第２の単一特異性抗体を添加し、そして結合抗原
を検出するために用い得る。例示的な競合アッセイでは、試料は、適切なレポー
ター基で標識されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体と組み合わされ得
る。次いで、試料と抗体との混合物は、適切な固体支持体上に固定化されたポリ
ペプチド抗原と組み合わされ得る。試料中の抗原に結合しなかった抗体を固定化
抗原に結合させ、そして残りの試料および抗体を除去する。固体支持体に結合し
た抗体のレベルは、試料中の抗原レベルに反比例する。従って、固体支持体に結
合した抗体のより低いレベルは、試料中のT.cruziの存在を示す。T.cruzi感染の
存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基
から検出されるシグナルは、一般的に、予め決定されたカットオフ値に対応する
シグナルと比較される。このようなカットオフ値は、一般的に上記のように決定
され得る。ELISAの文脈において上記で論議した任意のレポーター基を用いて、
単一特異性抗体を標識し得、そして結合は用いたレポーター基に適切である任意
の種々の技術により検出され得る。試料中のT.cruziを検出するために単一特異
性抗体を用いる他のフォーマットは、当業者に明らかであり、そして上記のフォ
ーマットは例示目的にのみ提供される。
本発明の別の局面では、ワクチンおよび薬学的組成物が、哺乳動物におけるT.
cruzi感染およびその合併症の予防のために提供される。薬学的組成物は、一般
に、T.cruziタンパク質の１つ以上の抗原性エピトープを含む１つ以上のポリペ
プチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む。ワクチンは、免疫応答の
増大のために、１つ以上の上記ポリペプチドおよびアジュバントを含む。
投与およびポリペプチド用量の経路および頻度は、個体により変化し、そして
他の原生動物感染に対する免疫で現在用いられているそれらに準じ得る。一般に
、薬学的組成物およびワクチンは、注入(例えば、筋肉内、静脈内、または皮下)
、鼻腔内(例えば吸入による)または経口により投与され得る。１〜４用量が２〜
６週間の間に投与され得る。好ましくは、２用量が、第１回目より２〜４週間後
の第２回目用量で投与される。適切な用量は、しばらくの間、T.cruzi感染から
哺乳動物を保護するに十分である、処置動物で抗体を惹起するために有効である
ポリペプチドの量である。一般に、用量に存在するポリペプチドの量は、宿主１
kgあたり約１pg〜約100mg、代表的には、約10pg〜約１mg、そして好ましくは、
約100pg〜約１μgの範囲である。適切な用量サイズは、動物のサイズとともに変
化するが、代表的には、10〜60kgの動物について、約0.01mL〜約５mLの範囲であ
る。
当業者に公知の任意の適切なキャリアが本発明の薬学的組成物に用いられ得る
が、キャリアのタイプは、投与様式に依存して変化する。皮下注射のような非経
口投与では、好ましくは、キャリアは、水、生理食塩水、アルコール、脂質、ワ
ックス、または緩衝液を含む。経口投与では、上記のキャリアまたは固体キャリ
ア(例えば、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム
、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、お
よび炭酸マグネシウム)のいずれかが用いられ得る。生分解性のマイクロスフェ
ア(例えば、ポリ乳酸ガラクチド)もまた、本発明の薬学的組成物用のキャリアと
して用いられ得る。
種々のアジュバントのいずれかを本発明のワクチンで使用して、免疫応答を非
特異的に増大し得る。大部分のアジュバントは、急速な異化作用から抗原を保護
するために設計された物質(例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱物油、および
リピドＡ、Bordella pertussis、またはMycobacterium tuberculosisのような免
疫応答の非特異的刺激剤)を含む。このようなアジュバントは、例えば、フロイ
ントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント(Difco Laboratories，Detro
it，MI)ならびにMerck Adjuvant 65(Merck and Company,Inc.，Rahway，NJ)とし
て市販されている。
以下の実施例は、限定のためではなく、例示のために提供される。
実施例
実施例１ T.cruzj 抗原をコードするDNAの調製
本実施例は、T.cruzi抗原をコードするゲノムDNAおよびcDNA分子の調製を説明
する。Ａ．ゲノムクローンの調製
ゲノム発現ライブラリーを、λ ZAP発現系（Stratagene，La Jolla，CA）を製
造者の指示に従って用いて、ランダムに剪断したT.cruziゲノムDNA（Tulahuen C
2株）から構築した。１つのスクリーニングにおいて、ライブラリーを、寄生生
物溶解産物、ならびに／または米国特許第5,304,371号および1995年３月14日に
出願された米国特許出願第08/403,379号に記載されるT.cruzj抗原TcDおよびTcE
の一方もしくは両方と高い反応性を示す５人の患者由来の血清のプールを用いて
スクリーニングした。５人の患者の血清のそれぞれを、ウェスタンおよびELISA
アッセイに基づいて、全溶解産物および／またはTcDもしくはTcEと反応性である
と決定した。抗E.coli反応性を、スクリーニングの前に、吸着により血清から除
去した。50,000pfuの非増幅ライブラリーを、血清プールを用いてスクリーニン
グし、そして血清と反応するタンパク質を発現するプラークを、プロテインＡ−
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ABTS基質とともに）を用いて検出した。次いで、
その後のスクリーニングを、組換え体TcDを用いるウェスタンおよびELISAアッセ
イにおいて検出可能な抗TcD抗体を欠く３人の患者由来の血清のプールを用いて
行なった。
同様のスクリーニングを、溶解産物、TcD、およびTcEと低い反応性を示す（す
なわち、ELISAまたはウェスタンアッセイにおいてバックグラウンド反応性を３
標準偏差超えないシグナルを検出した）血清のプールを用いて行ない、続いて上
記のように検出可能な抗TcD抗体を欠く患者血清を用いてその後のスクリーニン
グを行なった。
次いで、上記のスクリーニングの少なくとも１つにおいて両方のプールの血清
と反応するタンパク質を発現した28クローンを単離した。pBSK(-)ファージミド
（Stratagene,Inc.,La Jolla，CA）の切り出しを、製造者のプロトコルに従って
実施した。重複するクローンを、エキソヌクレアーゼIII消化により作製し、そ
して１本鎖テンプレートを、VCSM 13ヘルパーファージを用いる感染の後に単離
した。DNAを、ジデオキシチェーンターミネーション法またはTaqジ-ターミネー
ター系により、Applied Biosystem自動配列決定機373A型を用いて配列決定した
。
28クローンのうち、５個は以前に報告されており、２個は同一であり、そして
８個は縮重42塩基対反復により示される同一のペプチド配列を含んでいた。配列
番号16は、42塩基対の反復配列を含むプロトタイプクローンを示す。従って、T.
cruzi抗原をコードする、14個の新規のDNA配列を、反応性の血清プールで上記の
スクリーニングを用いて調製した（配列番号１から配列番号16、ここで、配列番
号４および配列番号５は、それぞれ、単一クローンの5'末端および3'末端を示し
、配列番号９および配列番号10は、それぞれ、単一クローンの5'末端および3'末
端を示す。１つの新規配列は、低い反応性を有する血清を用いるスクリーニング
で得られた（配列番号17（5'末端）および配列番号18（3'末端）に示す）。）Ｂ．cDNAクローンの調製
ポリＡ＋ RNAを、細胞内無鞭毛体期のT.cruzi（Tulahuen C2株）から精製した
。RNAを逆転写し、そして製造者の指示に従ってλ UniZap発現ベクター（Strata
gene，La Jolla，CA）中の一方向性cDNA発現ライブラリーの構築に用いた。50,0
00pfuの非増幅ライブラリーを、高いおよび低い血清学的反応性の両方を示す患
者血清を含む血清プールを用いてスクリーニングし、その後、上記のように、検
出可能な抗TcD抗体を欠く患者血清を用いて引き続きスクリーニングを行なった
。計32個のクローンをこのスクリーニングにより単離した。これらのクローンの
うちの25個は、高度に免疫原性であると以前に同定された、翻訳装置のタンパク
質であり、そしていずれも、ゲノム発現ライブラリーをスクリーニングすること
により同定されたクローンとは異なっていた。残りの７個は、配列番号19〜配列
番号22に提供される配列により示される。配列番号22に記載の配列は、T.cruzi
ユビキチンの配列である。
実施例２ 合成ポリペプチドの合成
本実施例は、本明細書中に記載のT.cruzi抗原に由来する配列を有するポリペ
プチドの合成を説明する。
ポリペプチドは、Millipore 9050ペプチド合成機で、HBTU（O-ベンゾトリアゾ
ール-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（O-benzo
triazole-N,N,N',N'-tetramethyuronium hexafluorophosphate））活性化を用い
るFMOC化学を用いて合成され得る。gly-cys-gly配列を、ペプチドのアミノ末端
またはカルボキシル末端に結合して、ペプチドの結合または標識方法を提供し得
る。固体支持体からのペプチドの切断は、以下の切断混合物を用いて実施され得
る：トリフルオロ酢酸：エタンジオール：チオアニソール：水：フェノール（40
:1:2:2:3）。２時間の切断後、ペプチドを、冷メチル-ｔ-ブチル-エーテル中で
沈降させ得る。次いで、ペプチドペレットを、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）含
有水中に溶解させ、そしてC18逆相HPLCによる精製の前に凍結乾燥し得る。水（0
.
1％TFA含有）中の０％〜60％アセトニトリル（0.1％TFA含有）の勾配を用いて、
ペプチドを溶出し得る。純粋な画分の凍結乾燥の後、エレクトロスプレー質量分
析法を用いて、およびアミノ酸分析によりペプチドを特徴付けする。
この手順を用いて、以下の配列を有するペプチド（例えば、Tcc22-1，Tcc22-1
+、Tcc22-2.1（配列番号41に含まれる）、TcLo1.1、1.2、および1.3（配列番号3
4、35、および36に含まれる）、ならびにTcHi10.1および10.3（配列番号26およ
び27））を合成した： 実施例３ T.cruzi 組換え体抗原の血清学的反応性
本実施例は、血清学的に活性であることが見出された、いくつかの組換え体抗
原の診断的特性を説明する。これは、T.cruzi陽性および陰性血清との反応性の
研究、ならびに他の疾患の患者からの血清との交差反応性の研究を含む。
アッセイを、96ウェルプレート（Corning Easiwash，Corning，NewYork）にお
いて実施した。ウェルを、50μlの炭酸コーティング緩衝液（pH9.6）中でコート
した。T.cruzi溶解産物については100ng/ウェルを用い、そして各組換え体抗原
については、200ng/ウェルを用いた。ウェルを、４℃にて一晩（または37℃に
て２時間）コートした。次いで、プレートの中身を除去し、そしてウェルを200
μlのPBS/１％BSAで２時間ブロックした。ブロッキング工程の後、ウェルをPBS/
0.1％ Tween 20TMで５回洗浄した。次いで、PBS/0.1％ Tween 20/0.1% BSA中に1
:50で希釈した50μlの血清（T.cruzi感染について陽性または陰性のいずれか）
を、各ウェルに添加し、そして室温にて30分間インキュベートした。次いで、プ
レートを再度PBS/0.1％ Tween 20TMで５回洗浄した。
次いで、酵素結合体（西洋ワサビペルオキシダーゼ−プロテインＡ，Zymed，S
an Francisco，CA）を、PBS/0.1％ Tween 20TM/0.1％ BSA中に１：20,000で希釈
し、そして50μlの希釈結合体を各ウェルに添加し、そして室温にて30分間イン
キュベートした。インキュベーションの後、ウェルを再度PBS/0.1％ Tween 20TM
で５回洗浄した。100μlのペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジン（Kirk
egaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD）を希釈せずに、各ウェル
に添加し、そして15分間インキュベートした。反応を、100μlの1N H2SO4を各ウ
ェルに添加することにより停止し、そしてプレートを450nmで読みとった。
図１は、T.cruzi溶解産物の反応性と比較した、組換え体rTcc6（配列番号39）
の反応性を示す。陰性の平均＋３標準偏差のカットオフに基づいて、50個の血清
サンプルのうち49個が溶解産物に陽性であり、そして50個のうち34個がrTcc6に
ついて陽性であった。同様の研究（図２に示す）において、組換え体rTcc22（配
列番号41）は、79.2％（48個の血清サンプルのうち38個が陽性）の反応性を有す
ることが見出された。同様の基準を用いるT.cruzi溶解産物を用いる組換え体rTc
c38（配列番号38）の比較研究は、溶解産物についての39/39と比較して、24/39
が陽性であることを示した（図３）。Tcc38は、潜在的に交差反応する血清で試
験した場合、T.cruzi溶解産物を上回る、増大された特異性を示した。
組換え体TcHi12（配列番号37）はまた、62.5％（15/24）の感度を有して免疫
反応性であることが見出された（図２）。
実施例４ T.cruzi 合成ペプチド抗原の血清学的反応性
本実施例は、実施例２に記載のいくつかのペプチドの診断学的特性を説明する
。
これらのペプチドを、T.cruzi陽性および陰性血清との反応性について、そして
いくつかの場合には、他の潜在的に交差反応性の疾患の患者由来の血清との交差
反応性について試験した。
第１の群のペプチドは、最も反応性な反復配列を決定するために異なるリーデ
ィングフレームを含んでいた。試験したペプチドは、配列番号18に提供されるDN
A配列のリーディングフレーム１、２、および３を表す、TcLo1.1（配列番号34に
含まれる）、TcLo1.2（配列番号35に含まれる）、およびTcLo1.3（配列番号36に
含まれる）、ならびにTcHi10配列（配列番号５に示される）についての２つのリ
ーディングフレームを示す、TcHi10.1（配列番号26）およびTcHi10.3（配列番号
27）であった。データを図４に示す。TcLoフレームの場合、T.cruzi陽性および
陰性個体由来の血清で試験した場合、TcLo1.1および1.2ペプチドは両方とも強く
反応したが、TcLo1.2はシグナル対ノイズが優れていた。TcLo1.3は、より低いシ
グナルを有したが、バックグラウンドもまた低かった。この研究において、溶解
産物は、24/24陽性を検出し、TcLo1.1は21/24を検出し、TcLo1.2は23/24を検出
し、そしてTcLo1.3は15/24を検出した。同様の研究において、２つのフレームTc
Hi10.1および10.3は、それぞれ、19/24および14/24陽性を検出したが、TcLo1に
ついてよりもシグナルは低かった。これらの異なるリーディングフレームについ
ての交差反応性研究は、TcLo1.2が、T.cruzi溶解産物と比較して、試験した血清
（図５）に最小の交差反応性を有することを実証した。
実施例２において議論するように、rTcc22についての重複ペプチドをまた合成
して、活性なエピトープを決定した。ペプチドTcc22-1、1＋、および2を、T.cru
zi陽性および陰性血清を用いて試験した。結果を図２に示す。Tcc22-1＋およびT
cc22-2.1ペプチドは、Tcc22-1ペプチドよりも反応性であった。第１の実験にお
いて、Tcc22-1およびTcc22-1＋は、38/48陽性を検出した組換え体Tcc22と比較し
て、29/48および36/48陽性を検出した。その後の実験において、Tcc22-2.1はま
た、反応性であるが、同じプレートコーティングレベルでTcc22-1＋よりもシグ
ナルが少ないことが示された。
TcHi15フレーム３反復配列（配列番号49）を有するポリペプチドをまた、合成
し、そしてELISAアッセイにおいて200ng/ウェルのコーティングレベルを用いて
試験した。計48個のT.cruzi陽性血清および26個の陰性血清を、このペプチド配
列の反応性を決定するために試験した。この研究において、ペプチドは、68.75
％（48個の陽性のうち33個を検出）の感度および92.3％（36個の陰性のうち24個
）の特異性を有した。このことは、このポリペプチドが、T.cruzi感染の検出に
おける潜在的な重要性を有することを示す。このアッセイの結果を以下の表１に
示す。表１ TcHi15 フレーム３ポリペプチドとT.cruzi陽性および陰性血清との反応性 実施例５ ペプチド組合せの血清学的反応性
本実施例は、いくつかのペプチド組合せの診断的特性を説明する。
TcLo1.2ペプチド（配列番号35に含まれる）を、合成ペプチドTcD、ならびにま
た、二重エピトープペプチドD/2（これは、TcDおよびPEP-2配列を含む）およびD
/E（これは、TcDおよびTcE配列を含む）と組み合わせて試験した。これらの組合
せを、個々のペプチドならびにトリペプチド2/D/E（これはTcD、TcE、およびPEP
-2を含む）と比較した。使用したTcD配列は、Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro
Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser（配列番号53）であり、TcE配列は、Lys Ala Ala
Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Thr Ala Pro Ala
（配列番号55）であり、そしてPEP2配列は、Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe GlyG
ln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala（配列番号57）であ
った。
データを図６に示す。結果は、表２においてまとめたように、TcLo1.2が、TcD
、D/2、およびD/Eの反応性を増大させ得ることを示す。
表２ T.cruzi 感染の検出におけるペプチド組合せの感度 これらの結果は、本明細書中に記載されるT.cruzi抗原の使用が、他の抗原の
血清学的特性を増強し得ることを実証する。
実施例６ TcE 反復配列の血清学的反応性
本実施例は、いくつかのTcE反復配列の診断的特性を説明する。
組換え体TcEの反復配列領域は、Ａ（アラニン）、Ｔ（トレオニン）、または
Ｉ（イソロイシン）が反復配列中に存在し得る残基をもたらす、いくつかの縮重
を含む。すべての縮重を示すために、合成TcEペプチドについての元の配列を、
３つの反復を含む単一のペプチドにおいて、Ａ、Ｔ、およびＩで作製した（実施
例５を参照のこと）。反復領域をさらにエピトープマッピングするため、および
血清学的活性に必要とされる反復数を決定するために、以下のペプチドを実施例
２に記載のように調製した：
次いで、これらのペプチドの血清学的反応性を比較した。計24個の陽性および
21個の陰性の血清を、実施例３に記載のように実施したELISAアッセイにおける
固相としてTcE変異体のそれぞれを用いて25ng/ウェルのペプチドを用いて試験し
た。異なるペプチドの反応性を、図７に示す。最大の反応性は、それぞれの反復
が縮重残基にＡを含んだ３回反復ペプチド（TcE(3A)）で観察された。このペプ
チドは、３回反復においてＡ、Ｔ、およびＩ残基を含む元のTcE配列よりもさら
に高い反応性を示した。対照的に、3Iおよび3T変異体は、試験したT.cruzi陽性
サンプルで本質的に陰性であった。２回反復にＡを含む配列（TcE(2A)）は、3A
配列よりも明らかに反応性が小さく、そしてＡおよびＴを有する２回反復配列（
TcE(AT)）は陰性であった。陰性の平均＋３標準偏差のカットオフに基づいて、
元のTcE(A,T,I)は、24個のポジティブのうち17個を検出し、そして3A変異体は、
24個のポジティブのうち19個を検出した。最大の血清学的活性を得るためには、
少なくとも３回反復が必要であるようでもある。
実施例７ 複数エピトープペプチドの組合せの血清学的反応性
本実施例は、いくつかの複数エピトープペプチドの組合せの診断的特性を説明
する。
２つのジペプチドPEP-2/TcLo1.2（これは、PEP-2（配列番号57）およびTcLo1.
2（配列番号35）配列を含む）ならびにTcD/TcE（これは、TcD（配列番号53）お
よびTcE（配列番号55）配列を含む）を、上記の実施例２に記載のように合成し
た。これらの２つのジペプチドとT.cruzi抗体陽性血清との反応性を、トリペプ
チド2/D/Eの反応性と比較した。ELISAを、実施例３に記載のように、PEP-2/TcLo
1.2を250ng/ウェルで用い、そしてTcD/TcEを50ng/ウェルで用いて実施した。こ
の研究の結果を図８に示す。トリペプチド2/D/Eと反応しないことが見出された
１つのT.cruzi陽性血清を、TcLo1.2エピトープのスクリーニングに用いた。この
血清は、予想されたように、TcLo1.2エピトープにより、そしてまたジペプチド
混合物（TcD/TcEと一緒のPEP-2/TcLo1.2）により検出された。
線状配列中に４つの免疫反応性T.cruziエピトープ（PEP-2、TcD、TcE、および
TcLo1.2）を含有するテトラペプチド（本明細書中では、以下2/Lo/2E/D（配列番
号6３）という）を、実施例２に記載のように合成した。このテトラペプチドを
、100ng/ウェルでコートし、そしてT.cruzi陽性および陰性血清とのその反応性
を実施例３に記載のようにアッセイした。テトラペプチド2/Lo/2E/Dの反応性を
、図８に示す。トリペプチド2/D/Eと反応しないことが見出された１つのT.cruzi
陽性血清は、予想されたようにテトラペプチドにより検出された。
４つの免疫反応性T.cruziエピトープ（PEP-2、TcD、TcE、およびTcLo1.2）は
また、リジンコア残基から始まる「分枝」ペプチドの使用により１つの試薬に連
結され得る。例えば、α-アミノ基上の9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmo
c）およびεーアミノ基上の1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシ-1-イリ
デン）エチル（Dde）を用いるリジンの直交保護を使用して、他のアミノ基の存
在下における１つのアミノ基の選択的脱保護を行い、その結果リジン上のα-基
またはε-基のいずれかから第１のペプチド鎖を合成させた。この第１のペプチ
ド鎖は、第２のペプチド鎖の合成の過程の間に除去されない保護基で終結する。
例えば、tert-ブトキシカルボニル（Boc）アミノ酸は、DdeおよびFmocの組合せ
とともに用いられ得た。次いで、残りのリジンアミノ保護基は、第２のアミノ酸
鎖が第２のアミノ部分から合成される前に除去される。例えば、ε-Ddeは、20％
ヒドラジンを用いて除去される。固相支持体からの分枝ペプチドの切断およびN-
α-Boc部分の除去は、標準的なプロトコルに従って、トリフルオロ酢酸を用いて
実施される。このアプローチを用いて、２つの独立なアミノ酸配列を、以下に示
すように、「コア」リジン残基から構築して、その結果TcD，TcE，PEP2、TcLo1.
2、および他のエピトープの種々の組合せをコア残基にカップリングし得る。得
られるペプチドの精製を、実施例２に記載のように実施する。
実施例８
TcHi29およびTcEの血清学的反応性の比較
抗原TcHi29（配列番号52）は、TcE反復配列の多型であることが示された。TcE
に比較して以下の配列を有するTcHi29ペプチドを合成した。
図９は、これらの２つの関連する配列と、T.cruzi陽性患者由来の血清ならび
に他の疾患カテゴリー由来の血清との、上記の手順を用いるELISAにより決定し
た反応性の比較を示す。データは、試験した他の疾患群とはほとんどまたは全く
反応性がないが、T.cruzi陽性血清間の反応性の分布が２つのペプチドについて
部分的に重複したことを示す。試験した53個のコンセンサスな陽性サンプルのう
ち、TcEは、31/53を検出し、そしてTcHi 29は36/53を検出した。この群内では、
TcEおよびTcHi29は両方とも24個の同じ血清を検出した。TcEは、TcHi29により検
出されない７個の陽性血清を検出した。これは次いで、TcEにより見逃された12
個の陽性血清を検出した。ジペプチドTcD/TcHi29をまた合成し、そしてELISA（1
00ng/ウェル TcD/TcHi29、250ng/ウェル PEP-2/TcLo1.2）においてPEP-2/TcLo1.
2ジペプチドとの組合せで使用し、そしてTcD/TcE＋PEP-2/TcLo1.2ジペプチドの
組合せと比較した。図10に示すように、データは、２つの混合物の全活性が、研
究したT.cruzi陽性および陰性集団の両方について同様であることを示し、そし
てこのようなペプチドの組合せにおいて、TcHi29がTcEの代替品と考えられ得る
ことを示唆する。
前述より、本発明の特定の実施態様を例示の目的で本明細書中に記載したが、
本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理
解される。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ｂ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
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ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ
Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ
，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，
ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ
Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 スケイキー，イェイサー エイ．ダブリュ
ー.
アメリカ合衆国 ワシントン 98117，シ
アトル，25ティーエイチ アベニュー エ
ヌ．ダブリュー．8327
(72)発明者 ローディス，マイケル ジェイ.
アメリカ合衆国 ワシントン 98126，シ
アトル，36ティーエイチ アベニュー エ
ス．ダブリュー．9223
(72)発明者 ホートン，レイモンド エル.
アメリカ合衆国 ワシントン 98021，ボ
セル，242エヌディー プレイス エス.
イー．2636