ES2490193T3 - Procedimiento para el cribado de proteínas segregadas conservadas - Google Patents

Abstract

Procedimiento de diagnóstico in vitro para la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos indicativos de la enfermedad de Chagas que se unen a un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado, que consiste en la SEC. ID. nº 86 para formar un inmunocomplejo, que comprende las etapas siguientes: a. poner en contacto dicho polipéptido con una muestra biológica durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un inmunocomplejo; y b. detectar la presencia o ausencia del inmunocomplejo formado en a).

Description

Procedimiento para el cribado de proteínas segregadas conservadas.

La presente invención se refiere a procedimientos de diagnóstico in vitro y a utilizaciones de kits de diagnóstico para la detección de la presencia o ausencia polipéptidos anticuerpos indicativos de la enfermedad de Chagas, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los Tripanosomatidae comprenden un gran grupo de protozoos parásitos, algunos de los cuales causan enfermedades importantes en los seres humanos. Los tres organismos modelo que se han estudiado más ampliamente son Trypanosoma brucei, agente causante de la enfermedad del sueño africana, T. cruzi, responsable de la enfermedad de Chagas en América del Sur y Leishmania, que produce la leishmaniasis en Asia, América del Sur y los países mediterráneos. Quinientos millones de personas, principalmente en las zonas tropicales y subtropicales del mundo, están en situación de riesgo de contraer estas enfermedades. Se estima que más de 20 millones de personas están infectadas, lo que produce enormes sufrimientos y más de 100000 muertes al año.

La enfermedad de Chagas es una de las enfermedades parasitarias más importantes y afecta a 15 millones de personas en América Central y del Sur. La incidencia mundial anual de nuevos casos se estima en alrededor de 50000-200000.

El diagnóstico de la infección por T. cruzi es difícil porque los síntomas de la infección suelen estar ausentes o no son específicos, y porque los propios parásitos están por lo general por debajo del nivel de detección en los sujetos infectados (Tarleton et al., 2007). Por lo tanto, el diagnóstico depende generalmente de la medición de anticuerpos específicos para T. cruzi producidos en respuesta a la infección.

Pruebas serológicas convencionales, tales como el ensayo de hemaglutinación indirecta, el ensayo de inmunofluorescencia indirecta y el ensayo por inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), se utilizan ampliamente en los países donde la infección es endémica. La mayoría se basan en la utilización de la totalidad o fracciones antigénicas semipurificadas de epimastigotes de T. cruzi cultivados en cultivo axénico. Un problema persistente en los ensayos convencionales es la aparición de resultados no concluyentes y falsos positivos. Por lo tanto, no existe consenso en el que la preparación de antígeno del parásito sea la mejor para la detección de anticuerpos contra T. cruzi. La Organización Mundial de la Salud y otros grupos de expertos recomiendan utilizar al menos dos pruebas en paralelo para confirmar la infección por T. cruzi. Debido a la falta de un verdadero patrón oro para el diagnóstico serológico de la infección por T. cruzi, el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico sigue siendo un desafío para la enfermedad de Chagas.

Se han publicado métodos ELISA de alta sensibilidad y alta especificidad utilizando péptidos recombinantes o sintéticos como antígenos. En el documento US nº 5.916.572, los compuestos y procedimientos para detectar y proteger contra la infección por T. Cruzi en personas y suministros de sangre implican polipéptidos que comprenden un epítopo de un antígeno de T. cruzi. La inclusión de antígenos recombinantes y péptidos sintéticos para el diagnóstico serológico de la infección por T. cruzi ha supuesto una ventaja desde el punto de vista de aumento de la especificidad. No obstante, cada uno de los antígenos recombinantes presentan menor sensibilidad en comparación con la prueba convencional utilizando extractos de parásitos enteros. El uso de cócteles de antígenos recombinantes, mezclas de péptidos sintéticos o antígenos de múltiples epítopos ha demostrado aumentar la sensibilidad.

En general se supone que los factores segregados/excretados en T. cruzi son muy inmunógenos. De hecho, las formas tripomastigote liberan varios antígenos en el sobrenadante de cultivos de células infectadas. Esta mezcla compleja de antígenos, denominada TESA (antígenos excretores-secretores de tripomastigotes), es muy inmunógena y se ha utilizado para el diagnóstico tanto de la enfermedad de Chagas aguda como crónica. Cabe destacar que los componentes de la mezcla TESA son actualmente desconocidos.

Para completar su ciclo vital, estos parásitos tienen que adaptarse y desarrollarse en un insecto vector (una mosca tsé-tsé, un hemíptero triatomino, o un tábano, respectivamente), y en un anfitrión vertebrado. Estos organismos unicelulares han desarrollado varias estrategias para modificar su entorno, modular respuestas inmunitarias para el anfitrión, o interferir con la actividad antimicrobiana del anfitrión. Materiales segregadas por el parásito desempeñan funciones clave en estos procesos. Las proteasas segregadas que pertenecen a la familia de cisteína-o metaloproteasas se cree generalmente que están involucradas en la manipulación de las respuestas inmunitarias del anfitrión en insectos y vertebrados anfitriones. El análisis bioquímico de la gp63 extracelular de Leishmania ha puesto de manifiesto dos formas de la proteína, una liberada de la superficie de la célula y otra que aparentemente se segrega directamente. La forma segregada proporciona protección para Leishmania contra péptidos antimicrobianos procedentes de insectos. Los parásitos también pueden segregar enzimas que intervienen en los procesos nutritivos. Leishmania, al igual que otros tripanosomátidos, son auxótrofos de purinas, y por consiguiente son totalmente dependientes de la recuperación de estos nutrientes esenciales de sus anfitriones. Para satisfacer sus requisitos esenciales de purina, Leishmania segrega una nucleasa que pueden funcionar externamente del parásito para hidrolizar y acceder a ácidos nucleicos procedentes del anfitrión. Los materiales segregados también

pueden estar directamente involucrados en la invasión de células diana. Tc-TOX, una proteína formadora de poros de T. cruzi, permite al parásito escapar del endosoma y llegar al citoplasma, su entorno celular natural. Las pruebas experimentales sugieren que Leishmania también posee una proteína formadora de poros que contribuye a su liberación de anfitriones macrófagos.

En conjunto, estos resultados demuestran que los materiales segregados están involucrados en los procesos que ayudan al parásito a sobrevivir en un entorno más favorable para su propio desarrollo. Sin embargo, todos los factores en estos procesos no están actualmente identificados con claridad.

En los eucariotas, las proteínas solubles segregadas suelen contener péptidos señal con terminal N que los dirigen al aparato de desplazamiento del retículo endoplásmico (RE). Tras el transporte vesicular desde el RE a través del aparato de Golgi a la superficie celular, proteínas de la luz de la cavidad celular se liberan en el espacio extracelular por fusión de vesículas secretoras del aparato de Golgi con la membrana plasmática.

En los tripanosomátidos, se supone que las moléculas destinadas a la superficie celular y la secreción siguen una ruta eucariota típica viajando desde el RE al aparato de Golgi, a continuación, a la superficie celular a través de una membrana del reservorio flagelar llamada bolsa flagelar. No obstante, un método proteómico reciente aplicado al secretoma de Leishmania sugirió que este parásito utiliza predominantemente secreción no clásica de las vías respiratorias para exportar directamente las proteínas, como por ejemplo la liberación de microvesículas (Silverman J.M., Chan S.K., Robinson D.P., Dwyer D.M., Nandan D., Foster L.J., Reiner N.E.: Proteomic analysis of the secretome of Leishmania donovani. Genome Biol. 2008, 9 (2):R35).

Los análisis comparativos han puesto de manifiesto que los genomas de los parásitos tripanosomátidos que causan la enfermedad en los seres humanos, Leishmania major, Trypanosoma cruzi y Trypanosoma brucei están muy conservados. Además, aproximadamente el 50% de las proteínas previstas en el genoma se anotaron como "proteínas hipotéticas, incluso si para muchos de ellos existe alguna prueba de que existe la expresión de la proteína (El-Sayed N.M., Myler P.J., Blandin G., Berriman M., Crabtree J., Aggarwal G., Caler E., Renauld H., Worthey E.A., Hertz-Fowler C. et al: Comparative genomics of tripanosomátido parasitic protozoa. Science 2005, 309(5733):404409; Atwood J.A., 3º, Weatherly D.B., Minning T.A., Bundy B., Cavola C., Opperdoes F.R., Orlando R., Tarleton R.L.: The Trypanosoma cruzi proteome. Science 2005, 309 (5733):473-476; Jones A., Faldas A., Foucher A., Hunt E., Tait A., Wastling J.M., Turner C.M.: Visualisation and analysis of proteomic data from the procyclic form of Trypanosoma brucei. Proteomics 2006, 6(1):259-267). Entre todas las “proteínas hipotéticas” identificadas por El-Sayed et al., una secuencia de 408 aminoácidos previstos se presentó en la base de datos pública UniProt con la referencia Q4DKL3, dándose a conocer dicha secuencia como SEC. ID. nº 86 en la presente solicitud. La evolución en la lucha contra las infecciones producidas por estos patógenos requiere una mejor comprensión de la biología de estos parásitos a fin de diseñar estrategias para el nuevo tratamiento. En general se supone que los factores excretados/segregados desempeñan funciones cruciales en la biología o la virulencia de parásitos tripanosomátidos y por lo tanto podrían representar dianas para vacunas o diseño racional de fármacos. En tripanosomátidos el proceso de secreción no se entiende completamente y diversas vías puede contribuir a la formación del "proteoma extracelular". La identificación de los materiales segregados aumentaría los esfuerzos hacia la comprensión de los mecanismos de secreción de proteínas de estos parásitos de importancia médica.

La disponibilidad de tres secuencias del genoma tripanosomátido proporciona datos valiosos para la explotación de proteínas utilizando herramientas bioinformáticas, especialmente para la localización o la predicción de funciones para hipotéticas proteínas. Dado que un número significativo de genes codificadores de proteínas tripanosomátidas se anotan como hipotéticos, se necesitan estudios adicionales para determinar su función.

Se desarrollaron varios procedimientos dirigidos a la caracterización de dicho material extracelular. Incluso si se recoge sobrenadante de un cultivo es relativamente fácil de realizar, la identificación de los diferentes factores puede ser difícil debido a la abundancia relativamente baja de los constituyentes. Además, el cultivo in vitro de periodos de mamíferos para los tripanosomátidos es imposible o laboriosa. Además, incluso si los parásitos se cultivan en medios sin células y sin suero, el sobrenadante del cultivo puede estar contaminado con materiales que no son principalmente "segregados" por el parásito. Estos materiales pueden desprenderse de la superficie del parásito o pueden proceder de organismos muertos. Así, para evitar este tipo de inconvenientes lo mejor es limitar el tiempo de incubación del parásito en un medio sin suero a unas pocas horas. Además también ha sido realizado la caracterización mediante el cribado de bibliotecas de ADNc con sueros generados contra los sobrenadantes del medio de cultivo. Sin embargo, la utilización de estas proteínas del procedimiento con una abundancia baja o que son poco inmunógenas es probable que se pierda. Recientemente, el secretoma de promastigotes de L. donovani se analizó utilizando un método proteómico cuantitativo basado en la metodología SILAC (Silverman et al., Genome Biology (2008), 9, R35). Aunque los autores identificaron un total de 358 proteínas segregadas en un medio de promastigotes acondicionado, la metodología SILAC fue incapaz de detectar las proteínas que es bien conocido que se segregan, por ejemplo, quitinasa y SAcP (fosfatasa ácida segregada). Esto puede explicarse por las proporciones relativas (proteína extracelular en comparación con la asociada a células) utilizadas por el método SILAC para identificar proteínas extracelulares. Por ejemplo, esta metodología está limitada en su capacidad para detectar proteínas para las que se segrega la gran mayoría (extracelular) y casi no queda nada dentro de la célula. En consecuencia, no se puede calcular ninguna relación fiable. La metodología desarrollada en el documento WO

2006/108720 es totalmente diferente de la de la presente exposición. Se basa en las propiedades de inmunogenicidad de materiales liberados en los sobrenadantes de cultivo por las formas promastigote de L. major,y un cribado de la biblioteca de ADNc. Mediante el uso de este procedimiento se pueden identificar sólo las proteínas inmunógenas liberadas por el parásito en el sobrenadante del cultivo. Un subconjunto de estas proteínas es 5 potencialmente segregado por la vía secretora clásica, basado en las predicciones del péptido señal en la secuencia de polipéptido. Otro subconjunto podría exportarse por otras rutas, ya que no llevan un péptido señal predicho. Otra diferencia con la presente exposición es la identificación dependiente de la fase: su punto de partida es los materiales liberados por los promastigotes en fase estacionaria, mientras que la presente exposición es independiente de la fase, ya que el punto de partida es genómico (las secuencias pueden expresarse por cualquier

10 fase del ciclo vital de parásitos) y parásitos transgénicos se utilizan para la sobreexpresión de las proteínas diana. Van Ooij et al. (Ploss Pathogens, 2008, 4(6), 1-15) utilizan un análisis bioinformático para la predicción del péptido señal, pero específico para la especies Plasmodium, y su validación funcional sólo se realiza en Plasmodium. Esta metodología destinada a detectar y estudiar la función de las proteínas segregadas que llevan motivo de retención en el RE y el motivo PEXEL (Elemento de exportación del Plasmodium), no descritos en los tripanosomátidos.

15 En vista de esto, los inventores diseñaron un nuevo método experimental basado en el cribado bioinformático del genoma para identificar nuevas proteínas conservadas entre los protozoos parásitos, en particular las conservadas entre los tres principales patógenos tripanosomátidos y que se segregan por la vía clásica. Dicha metodología posee dos ventajas principales. En primer lugar, la detección de proteínas segregadas no se limita a una fase de parásito

20 específica, ya que el método se basa en la utilización de los parásitos de Leishmania transgénicos para detectar proteínas extracelulares. En segundo lugar, permite la detección de pequeñas cantidades de proteínas extracelulares que de otra manera no pueden detectarse por otras metodologías, tales como, espectrometría de masas cuantitativa.

25 En consecuencia, la invención utiliza un polipéptido segregado conservado aislado o purificado, que consiste en la SEC. ID. nº 86.

La invención propone un procedimiento de diagnóstico in vitro para la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos indicativos de la enfermedad de Chagas que se unen a un polipéptido segregado conservado aislado o

30 purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86 para formar un inmunocomplejo, que comprende las etapas siguientes:

a. poner en contacto dicho polipéptido con una muestra biológica durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un inmunocomplejo; y

35 b. detectar la presencia o ausencia del inmunocomplejo formado en a).

La invención también propone un procedimiento de diagnóstico in vitro para la detección de la presencia o ausencia de polipéptidos indicadores de la enfermedad de Chagas que se unen a un anticuerpo obtenido por inmunización de un animal con un polipéptido segregado, conservado aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86 a formar

40 un inmunocomplejo, que comprende las etapas siguientes:

a. poner en contacto dicho anticuerpo con una muestra biológica durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un inmunocomplejo; y

45 b. detectar la presencia o ausencia del inmunocomplejo formado en a).

Según la invención, dicho polipéptido que consiste en la SEC. ID. nº 86 se ha identificado por un procedimiento para identificar polipéptidos conservados a partir de especies parasitarias de protozoos que son segregados por la vía secretora dependiente del retículo endoplásmico/aparato de Golgi, comprendiendo dicho procedimiento las

50 siguientes etapas:

a. analizar un supuesto polipéptido conservado a partir de especies parasitarias de protozoos para determinar si dicho polipéptido tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

b. buscar un ortólogo, en miembros de la familia relacionados, de dicho polipéptido, teniendo dicho ortólogo un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

c. analizar dicho ortólogo para determinar si dicho ortólogo tiene un péptido señal de secreción en el terminal N 60 y un punto de corte dicho justo detrás de dicho péptido señal,

d. seleccionar el polipéptido conservado y su correspondiente ortólogo que tiene un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

65 e. clonar los genes que codifican el polipéptido seleccionado en la etapa d) mediante un vector de expresión,

f.

transfectar células replicativas de protozoos parásitos,

g.

cultivar in vitro dichas células en condiciones de pH y temperatura que se encuentran naturalmente en un anfitrión infectado por una cepa parasitaria protozoaria,

h.

analizar la presencia de polipéptidos segregados en las células parasitarias, protozoarias y proliferantes e

i.

identificar dichos polipéptidos segregados mediante un procedimiento de identificación de proteínas.

Según la exposición, "proteínas conservadas" se definen por la presencia de genes ortólogos en los miembros de la familia. Por ejemplo, para los tres tripanosomátidos, Leishmania, Trypanosoma cruzi yTrypanosoma brucei, (tri Tryp) los genes ortólogos se definen por "Jaccard COG Clustering". La ortología entre los organismos 'tri Tryp' se predice utilizando un procedimiento conocido como agrupación COG de Jaccard. En resumen, esto implica en primer lugar las proteínas en cada conjunto de datos del organismo que se agrupan en grupos utilizando búsquedas BLASTP recíprocas, con una puntuación de corte asignada. Los representantes de cada grupo para cada organismo se seleccionan a continuación y se realizan de nuevo búsquedas BLASTP recíprocas de tres maneras en estos conjuntos de datos. Un grupo ortólogos agrupado (COG) es un grupo de proteínas que contiene las mejores blancos recíprocos entre los genomas. (Aslett M. et al., Int. J. Parasitol. 2005 35:481-93).

Según la exposición "miembros de la familia" se define como organismos que pertenecen a los mismos géneros.

Según la exposición, "parásitos protozoarios" generalmente se refiere a cualesquier organismo protozoario que sean eucariotas, unicelulares, parásitos y se caracterizan por al menos una fase de desarrollo dentro de su anfitrión vertebrado. Parásitos utilizados en los procedimientos de la exposición incluyen, pero no se limitan a, parásitos de protozoarios que son miembros de los géneros Toxoplasma, Neospora, Eimeria, Theileria, Sarcocystis, Cryptosporidium y la familia de los Tripanosomátidos (Trypanosoma y Leishmania).

En una forma de realización ventajosa de la exposición, el supuesto polipéptido conservado se ha identificado cribando una base de datos de información.

Más específicamente, la presente exposición se refiere a un procedimiento para la identificación de polipéptidos segregados conservadas de parásitos tripanosomátidos.

En una forma de realización ventajosa dichos parásitos tripanosomátidos se seleccionan del grupo que comprende

Leishmania major, Leishmania infantum, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Leishmania amazonensis, Leishmania chagasi, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Trypanosoma vivax, Trypanosoma congolense, Trypanosoma brucei rhodesiense y Trypanosoma brucei gambiense.

Otros objetivos de la exposición se refieren al polipéptido que consiste en la SEC. ID. nº 86 que ha sido identificado por un procedimiento para identificar polipéptidos conservados de parásitos tripanosomátidos que son segregados por la ruta secretora dependiente del retículo endoplásmico/aparato de Golgi, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

a.

analizar un supuesto polipéptido conservado de un parásito tripanosomátido para determinar si dicho polipéptido tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

b.

buscar un ortólogo, en miembros de la familia relacionados, de dicho polipéptido identificado con un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

c.

analizar dicho ortólogo para determinar si dicho ortólogo tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

d.

seleccionar el polipéptido conservado y su correspondiente ortólogo que tiene un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

e.

clonar los genes que codifican el polipéptido seleccionado en la etapa d) mediante un vector de expresión,

f.

transfectar células replicativas de tripanosomátido en la fase de promastigotes,

g.

cultivar in vitro dichas células en condiciones de pH y temperatura que se encuentran en la naturaleza en una célula anfitriona infectada por una cepa de tripanosomátido,

h.

recoger células replicativas transfectadas obtenidas en la etapa g),

i.

incubar dichas células en un medio exento de suero durante un periodo de 1 a 10 horas, preferentemente

durante un periodo de 5 a 6 horas, a una temperatura comprendida entre 25-27°C,

j.

analizar la presencia de polipéptidos segregados por dichas células y

k.

identificar dichos polipéptidos segregados mediante un procedimiento de identificación de proteínas.

Otro objetivo adicional de la invención es un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de estimulación linfocítica en un paciente que se sospecha que padece la enfermedad de Chagas, que comprende las etapas siguientes:

a.

poner en contacto los linfocitos T contenidos en una muestra obtenida de dicho paciente con un polipéptido conservado segregado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86; y

b.

detectar la presencia o ausencia de una respuesta proliferativa de dichos linfocitos T a dicho polipéptido.

Más específicamente, la presente exposición se refiere a un procedimiento para identificar polipéptidos conservados en el que el supuesto polipéptido conservado se identifica mediante el cribado de un genoma seleccionado entre el genoma accesible de Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Trypanosoma vivax, Leishmania major, Leishmania braziliensis, en particular, mediante el cribado de Trypanosoma cruzi integrado, recursos de genoma TcruziDB.

Aún en otra forma de realización, las células de tripanosomátido replicativas utilizados en la etapa f) son promastigotes de Leishmania infantum.

Aún en otra forma de realización, los cebadores utilizados en la etapa e) se seleccionan del grupo que comprende las SEC. ID. nº 124-165.

El polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica el polipéptido segregado que consiste de SEC. ID. nº 86 comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la secuencia SEC. ID. nº 85.

Según la invención, los términos "aislado o purificado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si ocurre en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o una proteína/péptido presente de forma natural en un organismo vivo no está ni "aislado", ni purificado, el mismo polinucleótido separado de los materiales coexistentes de su estado natural, obtenido por clonación, ampliación y/o síntesis química está "aislado" como se emplea el término en el presente documento. Por otra parte, un polinucleótido o una proteína/péptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado", incluso si está presente todavía en dicho organismo.

Según la invención, el término "polinucleótido(s)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Esta definición incluye, sin limitación, ADN mono-y bi-catenario, ADN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias o regiones mono-, bi-y tri-catenarias, ARN mono-y bi-catenario y el ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser monocatenario o, más normalmente, regiones bicatenarias o tricatenarias, o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Además, "polinucleótido" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en dichas regiones pueden ser de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más normalmente involucran sólo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice a menudo es un oligonucleótido. Como se emplea en la presente memoria, el término "polinucleótido(s)" incluye también los ADN o los ARN descritos anteriormente que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, los ADN o ARN con estructuras modificadas para la estabilidad o por otras razones son "polinucleótido(s)", como pretende ese término en la presente memoria. Por otra parte, los ADN o ARN que comprenden bases poco frecuentes, tales como inosina, o bases modificadas, tales como las bases tritiladas, por nombrar sólo dos ejemplos, son polinucleótidos como se emplea el término en la presente memoria, se apreciará que se ha hecho una gran variedad de modificaciones al ADN y ARN que sirven para muchos fines útiles conocidos por los expertos en la técnica. "Polinucleótido(s)" abarca polinucleótidos cortos o fragmentos a menudo denominados oligonucleótido(s). El término "polinucleótido(s)", como se emplea en la presente memoria por lo tanto abarca dichas formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de polinucleótidos, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, inclusive, por ejemplo, células simples y complejas que presentan la misma función biológica que el polipéptido codificado por las SEC. ID. nº 86, nº 88, nº 90, nº 92, nº 94, nº 96, nº 98, nº 100, nº 102, nº 104, nº 106, nº 108, nº 110 y nº 173. El término "polinucleótido(s)" también abarca los nucleótidos cortos o fragmentos, a menudo denominados" oligonucleótidos", que debido a la mutagénesis no son 100% idénticos pero no obstante codifican la misma secuencia de aminoácidos o secuencias con gran similitud.

Una composición inmunógena que genera una respuesta inmunitaria contra una enfermedad de Chagas, comprende un polinucleótido correspondiente a la SEC. ID. nº 85 o un polipéptido correspondiente a la SEC. ID. nº 86 y un

vehículo aceptable.

Gracias al procedimiento de la exposición es posible seleccionar una proteína conservada de Trypanosoma cruzi y utilizar dicha proteína o su correspondiente nucleótido para tratar la enfermedad de Chagas, es decir, el procedimiento según la exposición que permite tratar dicha enfermedad.

Ventajosamente, la composición inmunógena conduce a una respuesta inmunitaria que genera una respuesta celular y/o humoral, preferentemente una respuesta celular.

Una composición de la vacuna que genera una respuesta de protección contra una enfermedad de Chagas, comprende un polinucleótido correspondiente a la SEC. ID. nº 85 o un polipéptido correspondiente a la SEC. ID. nº 86 y un vehículo aceptable.

Un anticuerpo puede obtenerse por la inmunización de un animal con un polipéptido que consiste en la SEC. ID. nº

86.

Los anticuerpos pueden prepararse por una variedad de procedimientos que utilizan los polipéptidos descritos anteriormente. Por ejemplo, el polipéptido, o fragmentos antigénicos del mismo, se pueden administrar a un animal con el fin de provocar la producción de anticuerpos policlonales. Alternativamente, los anticuerpos utilizados descritos en la presente memoria pueden ser anticuerpos monoclonales, que se preparan utilizando tecnología de hibridomas. Como se ha mencionado anteriormente, la presente exposición se refiere preferentemente a anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos excretados/segregados por tripanosomátidos o a fragmentos de los mismos como se definió anteriormente. En particular, la exposición presenta anticuerpos "neutralizantes". Por anticuerpos "neutralizantes" se entiende anticuerpos que interfieren con cualquiera de las actividades biológicas de cualquiera de los polipéptidos excretados/segregados por tripanosomátidos. Cualquier ensayo convencional conocido para un experto en la técnica puede emplearse para evaluar potencialmente anticuerpos neutralizantes. Una vez producidos, los anticuerpos monoclonales y policlonales se analizan preferentemente por transferencia Western, análisis de inmunoprecipitación o cualquier otro procedimiento adecuado para reconocimiento de los polipéptidos específicos excretado/segregados por tripanosomátidos.

Con respecto a los anticuerpos, la expresión "se une específicamente a" se refiere a anticuerpos que se unen con una afinidad relativamente elevada a uno o más epítopos de una proteína de interés, pero que no reconocen sustancialmente y se unen a otras moléculas distintas de la(s) de interés. Como se emplea en la presente memoria, la expresión " afinidad relativamente alta" significa una afinidad de unión entre el anticuerpo y la proteína de interés de por lo menos 106 M-1, y preferentemente de por lo menos aproximadamente 107 M-1 y aún más preferentemente

M-1 M-1

108 a 1010 . La determinación de dicha afinidad se lleva a cabo preferentemente en condiciones de inmunoanálisis de unión competitiva convencional que es de conocimiento común para un experto en la técnica. Como se emplea en la presente memoria, "anticuerpo" y "anticuerpos" incluyen todas las posibilidades mencionadas en lo sucesivo: anticuerpos o fragmentos de los mismos obtenidos por purificación, tratamiento proteolítico o por ingeniería genética, montajes artificiales que comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos y montajes artificiales diseñados para imitar la unión de anticuerpos o fragmentos de los mismos. Estos incluyen anticuerpos completos, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos scFv, otros fragmentos, péptidos de RDC y miméticos. Estos pueden ser obtenidos y preparados fácilmente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar digestión enzimática para obtener fragmentos F(ab')2 y Fab sometiendo una molécula de IgG a escisión con pepsina o papaína respectivamente. Los anticuerpos recombinantes también están comprendidos por la presente exposición.

Preferentemente, el anticuerpo es una inmunoglobulina humana o animal, tal como IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgE o IgD que lleva regiones variables (híbridas) de rata o de ratón o RDC (humanizadas o "animalizadas"). Además, el anticuerpo también se puede conjugar con cualquier vehículo adecuado conocido para un experto en la técnica para proporcionar, por ejemplo, un suministro específico y retención prolongada del anticuerpo, ya sea en un área local específica o para una aplicación general.

La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo proveniente de un anticuerpo no humano, normalmente murino, que conserva o conserva sustancialmente las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo original pero que es menos inmunógeno en los seres humanos. Esto puede conseguirse por varios procedimientos, como por ejemplo (a) injertar sólo las RDC no humanas en el marco humano y regiones constantes con o sin retención de los residuos del marco críticos, o (b) trasplantar los dominios variables no humanos completos, pero "camuflándoles" con una sección similar a la humana mediante la sustitución de los residuos superficiales. Dichos procedimientos son bien conocidos para un experto en la técnica.

Como se mencionó anteriormente, el anticuerpo es inmunológicamente específico para el polipéptido de la presente exposición y derivados inmunológicos del mismo. Como se emplea en la presente memoria, la expresión "derivado inmunológico" se refiere a un polipéptido que posee una actividad inmunológica que es sustancialmente similar a la actividad inmunológica de todo el polipéptido, y dicha actividad inmunológica se refiere a la capacidad de estimular la producción de anticuerpos inmunológicamente específicos para los polipéptidos o derivados de los mismos

segregados por tripanosomátidos. La expresión "derivado inmunológico" abarca por lo tanto "fragmentos", "segmentos", "variantes" o "análogos" de un polipéptido.

En otra forma de realización, se proporciona la utilización de un kit de diagnóstico para la detección de la presencia 5 o ausencia de anticuerpos indicativos de la enfermedad de Chagas. Según ello dicho kit comprende:

a. un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86;

b. un reactivo para detectar el inmunocomplejo polipéptido-anticuerpo; opcionalmente una muestra biológica de 10 referencia que carece de anticuerpos que se unen inmunológicamente con dicho péptido; y

c. opcionalmente una muestra comparativa que comprende anticuerpos que pueden unirse específicamente a dicho péptido;

15 en la que dicho polipéptido, reactivo, muestra biológica de referencia y muestra comparativa están presentes en una cantidad suficiente para llevar a cabo dicha detección.

La invención proporciona además la utilización de un kit de diagnóstico para la detección de la presencia o ausencia de polipéptidos indicadores de una o más enfermedades seleccionadas de entre leishmaniasis, enfermedad de 20 Chagas y la enfermedad del sueño, que comprende:

a. un anticuerpo obtenido por inmunización de un animal con un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86;

25 b. un reactivo para detectar el inmunocomplejo polipéptido-anticuerpo; y

c. opcionalmente una muestra biológica de referencia que carece de polipéptidos que se unen inmunológicamente a dicho anticuerpo; y

30 d. opcionalmente una muestra comparativa que comprende polipéptidos que pueden unirse específicamente a dicho anticuerpo;

en la que dicho anticuerpo, reactivo, muestra biológica de referencia y muestra comparativa están presentes en una cantidad suficiente para llevar a cabo dicha detección.

35 La presente invención se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos 1 a 2 y a las figuras 1 a 9.

La figura 1 ilustra los genes de T. cruzi seleccionados por análisis mediante simulación informática. Las 13 proteínas

40 tienen la mayor probabilidad de la presencia del péptido señal y se seleccionaron para la confirmación funcional de secreción auténtica. El gen beta-tubulina de T. cruzi (GeneID Tc001047053506563) se añadió a la muestra de los inventores como una potencial referencia negativa para proteínas.

La probabilidad del péptido señal SPP fue predicha por SignalP 3.0; la probabilidad máxima de punto de corte CSP 45 fue predicha por SignalP.

La figura 2 ilustra el diseño del cebador de las 13 supuestas proteínas segregadas de T. cruzi conservadas en tripanosomátidos y T. cruzi. La tubulina se toma como referencia negativa. F: Cebador directo con inclusión del codón de iniciación; Rint: cebador inverso interno para RT-PCR; R: cebador inverso utilizado para la ampliación del

50 ORF completo. En la columna "Secuencias de cebadores" las enzimas de restricción utilizadas para la clonación en el vector pTEX están en cursiva y la secuencia His-Tag está en negrita. Columna "PM" corresponde al peso molecular esperado de las proteínas. En la primera columna, última línea Tc00.1047053506563.40 corresponde al gen de beta-tubulina.

55 La figura 3 ilustra la identificación de genes ortólogos de L. infantum y de cebadores utilizados para la clonación. F: Cebador directo con inclusión del codón de iniciación; R: cebador inverso utilizado para la ampliación del ORF completo. En la columna "Secuencias de cebadores" las enzimas de restricción utilizadas para la clonación en el vector pTEX están en cursiva y la secuencia con etiqueta His está en negrita. Columna "PM" corresponde al peso molecular esperado de las proteínas.

60 La figura 4 ilustra el análisis de la expresión de proteínas potencialmente segregadas durante el ciclo vital de T.cruzi. Análisis por RT-PCR del ARN completo de epimastigotes (E), tripomastigotes (T) y amastigotes (A) de T. cruzi (clon proveniente de la cepa Y), respectivamente, utilizando ADNc obtenidos por cebadores de PCR específicos de genes enumerados en la figura 2. La identificación de los genes y las longitudes esperadas de ADNc se enumeran en

65 orden en la figura 2. B: Blanco. M: marcador molecular: Smart Ladder SF.

La figura 5 ilustra los análisis por PCR en promastigotes transfectados en episomas de L. infantum (A) La ampliación del fragmento del gen NEO en L. infantum episomalmente transfectadas promastigotes. (B) Ampliación de genes completos transfectados en promastigotes de L. infantum. Los cebadores específicos de PCR directo e inverso y las longitudes de genes se enumeran en orden en la figura 2. WT: Parásitos naturales. M: Marcador molecular: Smart Ladder SL.

La figura 6 ilustra la expresión de proteínas en promastigotes transfectados en episomas de L. infantum durante la fase exponencial de desarrollo (A) Análisis de transferencia Western de proteínas etiquetadas con His detectadas en lisado de células enteras. Cantidades iguales de proteína completa (35 µg) se resolvieron por electroforesis en geles de gradiente 4-12% (Invitrogen), se transfirieron y se revelaron con anticuerpo anti-HisTag seguido de ECL (Amersham). La identificación de genes y el peso molecular teórico de las proteínas detectadas se enumeran en orden en la figura 2. (B) Identificación de proteínas segregadas en el lisado de células completas (Lys) y en el sobrenadante de cultivo concentrado exento de células (CCFS) obtenido a partir de promastigotes incubados durante 6 horas en un medio sin suero. Obsérvese la ausencia de β-tubulina en el sobrenadante concentrado de la línea 8. Se utilizaron promastigotes (naturales) no transfectados de L. infantum como referencia negativa. Patrones de masa molecular de proteínas en kDa se muestran a la izquierda de cada panel.

La figura 7 ilustra la expresión homóloga de proteínas segregadas en promastigotes transfectados de L. infantum en episomas según el ejemplo. Se transfectaron promastigotes de L. infantum con genes: LinJ19.0410 y LinJ36.5780 correspondientes a las proteínas segregadas Tc00.1047053505789.10 (SEC. ID. nº 93) y Tc00.1047053506155.99 (SEC. ID. nº 103), respectivamente. El lisado de células completas (Lys) y el sobrenadante de cultivo concentrado sin células (CCFS) se obtuvieron como en la figura 6. Se detectaron proteínas etiquetadas sólo en parásitos recombinantes transfectados con LinJ19.0410 (58 kDa) (Líneas 1 y 2) y LinJ36.5780 (28 kDa) (Líneas 3 y 4). Se utilizaron promastigotes no transfectados de L. infantum (naturales) como referencias negativas (Líneas 5 y 6). A la izquierda se muestran patrones de masa molecular de proteínas en kDa. El lisado de células completas (Lys), el sobrenadante del cultivo concentrado sin células (CCFS) y el procedimiento de electroforesis fueron como se menciona en la figura 6. Promastigotes de L. infantum no transfectados (naturales) se utilizaron como referencias negativas (Líneas 5 y 6). A la izquierda se muestran patrones de masa molecular de proteínas en kDa.

La figura 8 ilustra la purificación de la proteína recombinante rTc00.1047053509999.10 (SEC. ID. nº 85). Carril 1: lisado bacteriano depurado; carril 2: flujo a través; carriles 3-5: lavados; carriles 6-8: eluidos a pH 5,9; carriles 9-11: eluidos a pH 4,5. PM: Marcadores moleculares (BenchMark Protein Ladder, Invitrogen). Las proteínas se resolvieron por electroforesis en un gel de gradiente 4-12% y se visualizaron por tinción de Coomassie. La proteína purificada apareció en los eluidos de pH 4,5 como una banda de 45 kDa correspondiente al peso molecular teórico de la proteína recombinante.

La figura 9 representa la transferencia Western de la proteína recombinante rTc00.1047053509999.10 (SEC. ID. nº 85) con sueros de individuos no chagásicos (carril 1) y los sueros de pacientes chagásicos (carriles 2-13).

Ejemplo 1: Identificación de proteínas segregadas conservadas en tripanosomátidos

1.1. Procedimientos

1.1.1. Análisis de secuencias por simulación informática

La publicación V 5.0 del genoma de T. cruzi se extrajo de los recursos del genoma de T. cruzi integrado TcruziDB (http://tcruzidb.org/tcruzidb/). Las secuencias de proteínas que no llevan un aminoácido metionina inicial se eliminaron manualmente. También se descartaron las proteínas que pertenecen a grandes familias de moléculas de superficie, que incluyen trans-sialidasas, mucinas, gp63s y proteínas de superficie relacionadas con la mucina. Por último los ORF que codifican proteínas que llevan un peso molecular (PM) superior a 90 kDa también se eliminaron. El programa informático SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) se utilizó para predecir la presencia de un péptido señal de secreción y un punto de corte en secuencias de aminoácidos. En las secuencias de proteínas con una probabilidad de péptido señal de secreción superior a 0,8 asociada a una probabilidad de punto de corte superior a 0,7 se analizó la presencia de ortólogos en las bases de datos de parásitos Trypanosoma brucei y Leishmania major relacionados.

1.1.2 Cepas y cultivos de parásitos

El clon TcY7 (o Y cl7) de T. cruzi proveniente de la cepa Y (Allaoui A., Francois C., Zemzoumi K., Guilvard E., Ouaissi A.: Intracellular growth and metacyclogenesis defects in Trypanosoma cruzi carrying a targeted deletion of a Tc52 protein-encoding allele. Mol. Microbiol., 32 (6):1273-1286; Garzon E., Borges M.C., Cordeiro-da-Silva A., Nacife V., Meirelles M. de N., Guilvard E., Bosseno M.F., Guevara A.G., Breniere S.F., Ouaissi A.: Trypanosoma cruzi carrying a targeted deletion of a Tc52 protein-encoding allele elicits attenuated Chagas' disease in mice. Immunol. Lett. 2003, 89(1):67-80) se utilizó en todo este este estudio. Se cultivaron epimastigotes en medio de triptosa con infusión de hígado (LIT) enriquecido con 10% de FCS a 28°C en condiciones normales como describe Camarg o EP (Growth And Differentiation In Trypanosoma Cruzi. I. Origin Of Metacyclic Trypanosomes In Liquid Media. Rev Inst

Med Trop Sao Paulo 1964, 12:93-100) y se recogen durante la fase de crecimiento logarítmico. Los tripomastigotes metacíclicos, obtenidos en la diferenciación de epimastigotes en fase estacionaria tardía, se utilizaron para iniciar la infección de fibroblastos de ratón (L929). Se produjeron y se recogieron tripomastigotes y amastigotes según describieron anteriormente los inventores (Mathieu-Daude F., Bosseno M.F., Garzon E., Lelievre J., Sereno D., Ouaissi A., Breniere S.F.: Sequence diversity and differential expression of Tc52 immuno-regulatory protein in Trypanosoma cruzi: potential implications in the biological variability of strains. Parasitol Res. 2007, 101(5):13551363). Los sedimentos para la purificación de ARN se procesaron inmediatamente en tampón de lisis. El clon de promastigote natural (WT) de L. infantum (MHOM/MA/67/ITMAP-263) se mantuvo a 26°C mediante sub pases semanales en medio SDM 79 enriquecido con FCS al 10% inactivado térmicamente, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina según Brun R., Schonenberger (Cultivation and in vitro cloning or procyclic culture forms of Trypanosoma brucei in a semi-defined medium. Short communication. Acta Trop. 1979, 36(3):289-292).

1.1.3.Transcripción inversa y ampliaciones por PCR

Se extrajo ARN completo de epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes con el kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) según las instrucciones del fabricante, y se trató con DNasa I (kit sin ADN Ambion Inc., Austin, Tejas). La transcripción inversa se realizó para 1 µg de ARN completo utilizando hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones de los fabricantes. El ADNc (4 µl de diluciones 1/10) de cada etapa se amplió por PCR en un volumen de reacción de 20 µl con 10 µl de mezcla maestra 1X (Promega, Madison, Wisconsin), genes cebadores directos e inversos internos específicos para el gen 0,5 M (enumerados en la figura 2) utilizando las siguientes condiciones de ciclación: 94ºC durante 3 min. seguido de 30 ciclos de 94°C durante 30 s., 55°C a 58°C (según el par de cebadores) dura nte 30 s, 72°C durante 45 s y una elongación final a 72°C durante 5 min. Los amplicones se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio.

1.1.4. La clonación y secuenciación

Los genes codificadores seleccionados por análisis mediante simulación informática se clonaron en el vector de expresión pTeX, que lleva el gen de resistencia a la neomicina (NEO). Los ORF completos se ampliaron a partir de ADN genómico con cebadores inverso y directo específicos incluyendo diferentes enzimas de restricción y una etiqueta 6-histidina en la región terminal C (véanse las figuras 2 y 3). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en 20 µl utilizando 0,5 µM de cada cebador, dNTP 0,2 mM, 0,4 U de Phusion high-fidelity polimerasa (Finnzymes, Espoo, Finlandia) y las siguientes condiciones de ciclación: 98ºC durante 30 s seguido por 25 ciclos de 98°C durante 10 s, 64°C a 68°C durante 15 s, 72°C durante 25 a 6 0 s (según el tamaño de gen), y un alargamiento a 72ºC durante 5 min. Se insertaron fragmentos digeridos y purificados en el vector pTeX desfosforilado digerido con las enzimas de restricción correspondientes. Las secuencias clonadas se confirmaron por digestión de restricción y secuenciación. Se realizaron preparados a gran escala de los diferentes montajes utilizando el kit plasmid midi (Promega).

1.1.5. Procedimientos de transfección

Se sometieron a electroporación promastigotes del clon de Leishmania infantum como se describe en otra parte (Sereno D., Roy G., Lemesre J.L., Papadopoulou B., Ouellette M.: DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrob. Agents Chemother. 2001, 45(4):1168-1173). En resumen, los promastigotes se lavaron dos veces con solución salina de tampón HEPES-NaCl (EPES 21 mM, KCl 5 mM, NaH2PO4 0,7 mM, NaCl 137 mM), se volvieron a poner en suspensión a razón de 108 células/ml en tampón de electroporación HEPES-NaCl (pH 7,2) enriquecido con glucosa 6 mM y se enfrió en hielo durante 10 min. Las células (108) se combinaron con 15 µg de vector, se dejaron en hielo durante otros 10 min. y se sometieron a electroporación utilizando un aparato Easyject Plus (Eurogentec, Lieja, Bélgica) fijado a 450 V y 450 µF, para un impulso. Las células se dejaron en hielo durante otros 10 min y se transfirieron a 4 ml de medio de cultivo. El antibiótico G-418 (20 g/ml) se añadió 24 h después, y se subcultivaron parásitos a una dilución de 1/10 en 5 ml de SDM en presencia de 20 µg/ml de G418. Se observaron células resistentes a los medicamentos 15-20 días después. Los parásitos se cultivaron en presencia de concentraciones gradualmente crecientes de G418 y se mantuvieron rutinariamente en SDM que contiene 150 µg/ml de G418.

1.1.6. Ampliaciones por PCR en parásitos transfectados

Se llevaron a cabo ampliaciones por PCR para comprobar la presencia del gen NEO y el gen correspondiente en los parásitos transfectados. Un fragmento de 800 pb correspondiente al gen NEO se amplió con cebadores directo e inverso específicos (SEC. ID. nº 170 F5'ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGG3' y SEC. ID. nº 171 R5' TCAGAAGAACTCGTCAAGAA 3'). Se ampliaron ORF completos de los genes específicos con los cebadores enumerados en la figura 2. Las reacciones por PCR se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 20 µl utilizando 10 µl de mezcla Master Mix 1X (Promega, Madison, Wisconsin), NEO 0,5 M y cebadores directo e inverso para genes utilizando las siguientes condiciones de ciclación: 94ºC durante 3 min seguido por 30 ciclos de 94°C durante 30 s, 55°C a 58°C (según el par de cebadore s) durante 30 s, 72°C durante 45 s a 2 min (según e l tamaño de gen) y una elongación final a 72°C durante 5 min.

1.1.7. Producción de sobrenadantes de cultivo exentos de células

Para analizar la presencia de las proteínas segregadas en el sobrenadante, se recogieron del cultivo por centrifugación 1 x 109 promastigotes de L. infantum en fase logarítmica, se lavaron dos veces en tampón HEPES-NaCl, se volvieron a poner en suspensión en 40 ml de HEPES-NaCl (pH 7,2), glucosa 11 mM, 200 µg/ml de G-418 y se incubaron durante 6 h a 27°C. A continuación, se evaluó la viabilidad del parásito como se describió anteriormente (Vergnes B., Sereno D., Madjidian-Sereno N., Lemesre J.L., Ouaissi A.: Cytoplasmic SIR2 homologue overexpression promotes survival of Leishmania parasites by preventing programmed cell death. Gene 2002, 296(12):139-150) y se recogieron por centrifugación a 2100 x g durante 10 min a 4°C. El sedimento de parásito se almacenó a -80°C para posterior análisis por SDS-PAGE y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de membrana de PVDF de 0,45 µm de baja retención (Millipore, Boston, Massachusetts). Tras la adición de la mezcla de inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich) el filtrado se concentró hasta 80 veces utilizando un dispositivo de filtro Ultra-centrífuga de Amicon, según las instrucciones de los fabricantes (Amicon Bioseparations, MilliporeCorp.). El sobrenadante del cultivo sin células concentrado se congeló y se almacenó a -80°C.

1.1.8. Producción de lisados de parásitos

Los sedimentos celulares de promastigotes de L. infantum naturales y transfectados con episomas se volvieron a poner en suspensión en tampón RIPA (Tris-HCl 25 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 1% y SDS al 0,1%), se incubaron en hielo durante 30 min y se sometieron a ultrasonidos tres veces durante 20 s. La fase soluble se recuperó por centrifugación a 10000 g durante 30 min (4°C) y la concentración de prote ínas se determinó utilizando un ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California).

1.1.9. Electroforesis en gel y análisis de transferencia Western

Las proteínas procedentes de lisados de parásitos (35 µg) o de sobrenadantes sin células concentrados 80 veces (2 µg) se separaron en un gel NuPAGE Bis-Tris (4-12%) en tampón de operación de MOPS-SDS (Invitrogen) en condiciones reductoras (DTT 50 mM) y se transfirió a una membrana de PVDF (Hybond-P, Amersham). La membrana se aclaró dos veces en TBS y se incubó durante 1 h en el tampón de bloqueo conjugado con anti-His HRP (Qiagen). A continuación, la membrana se incubó en anticuerpo conjugado con anti-His HRP 1/3000 (Qiagen) durante 1 h y se lavó siete veces durante 5 minutos en tampón TBS-T (TBS-0,5% de Tween 20). Se detectaron señales por emisión de quimioluminiscencia empleando el sistema de detección de transferencia Western ECL Plus y ECL Hyperfilms (GE Healthcare, Reino Unido).

1.2. Resultados

1.2.1. Selección bioinformática de proteínas segregadas en tripanosomátidos

El cribado preliminar del banco de genes de T. cruzi se realizó de descartar: (i) secuencias incompletas, (ii) genes constitutivos y secuencias que pertenecen a grandes familias de genes, como las transialidasas, mucinas, proteínas de superficie asociadas a la mucina (MASP), (iii) proteínas codificadoras de secuencias con un peso molecular superior a 90 kDa, para facilitar la posterior clonación de genes. En las secuencias codificadoras restantes se examinó tanto la presencia del péptido señal como un punto de corte de la peptidasa del péptido señal de secreción (SPP). Sólo 216 secuencias tenían una probabilidad de 0,8 y 0,7 de llevar tanto el péptido señal de secreción como el punto de corte de peptidasa, respectivamente. Entre ellos, 91 (42%) se anotaron como "hipotéticas proteínas, conservadas" en el banco de datos. El criterio final para las proteínas seleccionadas susceptibles de ser segregadas por la ruta eucariótica clásica fue la presencia del péptido señal y la zona de peptidasa señal en miembros ortólogos de los parásitos relacionados; Leishmania major, L. infantum y T. brucei. Entre las 91 secuencias, sólo 45 presentaban miembros ortólogos con los criterios de péptido señal. Se seleccionaron las 13 proteínas que tienen la mayor probabilidad de la presencia del péptido señal (figura 1) para la confirmación funcional de secreción auténtica. El gen beta-tubulina de T. cruzi (GeneID Tc00.1047053506563 -SEC. ID. nº 83) se añadió a la muestra como una posible referencia negativa para la secreción de proteínas.

1.2.2. Análisis de la expresión de proteínas potencialmente segregadas durante el ciclo de vida de T. cruzi

La expresión de los 13 genes codificadores diferentes se analizó a lo largo del ciclo vital de desarrollo de T.cruzi. El gen beta-tubulina de T. cruzi (GeneID Tc00.1047053506563 -SEC. ID. nº 83), constitutivamente expresado en las tres etapas de T. cruzi se utilizó como referencia positiva. La expresión de cada gen estaba apoyada por la ampliación por RT-PCR positiva en las formas infecciosas de tripomastigote y amastigote. No obstante dos genes (Gene ID Tc00.1047053511901.30 (SEC. ID. nº 17) y Tc00.1047053509999.10 (SEC. ID. nº 85)) resultaron negativas para la ampliación del ADNc en la forma epimastigote no infecciosa, lo que sugiere una posible expresión específica para la etapa de estos genes (figura 4).

1.2.3. Procedimiento experimental para la detección de proteínas segregadas

Se montó una prueba de funcionamiento para confirmar la presencia de proteínas seleccionadas en el medio

extracelular mediante la detección de proteínas diana en los sobrenadantes sin células. Por lo tanto los 13 genes codificadores seleccionados de T. cruzi y el gen que codifica la referencia negativa beta-tubulina se ampliaron a partir de ADN genómico. Se añadió una secuencia que codifica una etiqueta 6xHis en el extremo terminal en C de cada uno de los genes codificados. Esto permitiría detectar la proteína en los extractos totales de proteínas parásitas

o en sobrenadantes sin células. Los productos de PCR ampliados se clonaron en el vector lanzadera pTeX que se utiliza ampliamente para la expresión en tripanosomátidos (Kelly J.M., Ward, H.M., Miles M.A., Kendall G.: A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania. Nucleic. Acids Res. 1992, 20(15):3963-3969). La transformación y selección de T. cruzi no es tan fácil de realizar como la de Leishmania, debido principalmente a períodos más largos requeridos para la selección de parásitos resistentes a los medicamentos. Dado que los inventores tenían intención de desarrollar un procedimiento rápido y fiable para identificar proteínas segregadas conservadas de tripanosomátido, utilizaron Leishmania como organismo receptor para la validación experimental de sus proteínas seleccionadas. Por lo tanto, promastigotes de Leishmania infantum se transformaron con pTEX que lleva los 14 genes seleccionados de T. cruzi (incluyendo el gen de beta-tubulina), y se seleccionaron parásitos recombinantes con resistencia a la geneticina G418. En cada población de parásitos se comprobó la presencia tanto del gen NEOR como del gen seleccionado cuya secreción había que analizar. Un fragmento de 800 pb específico, indicador de la presencia del gen NEOR, se detectó en los promastigotes transfectados y no en los parásitos naturales (figura 5A). Por otra parte, la presencia de cada gen experimental en parásitos recombinantes se confirmó utilizando cebadores específicos (figura 5B). Las PCR fueron negativas en los parásitos naturales, lo que demuestra que la ampliación para cada gen es específica a pesar de que se conservan en los tripanosomátidos (datos no presentados). La expresión de estos genes se identificó utilizando un anticuerpo dirigido contra la etiqueta His transportada por las proteínas recombinantes (figura 6A). El análisis de transferencia Western demostró que; (i) los inventores fueron capaces de detectar fácil y específicamente a la proteína con etiqueta 6xHis en el extracto procedente de parásitos recombinantes, (ii) Leishmania recombinante expresa una cantidad relativamente alta de proteína de T. cruzi, y (iii) el peso molecular de la proteína marcada detectada correspondió al PM esperado (véase la figura 2). Los inventores establecieron un procedimiento para detectar proteínas recombinantes en los sobrenadantes sin células. Con el fin de limitar la contaminación potencial por las proteínas procedentes de organismos muertos, restringieron la incubación en medios sin suero a 6 horas, y comprobaron la viabilidad de las poblaciones de parásitos antes y después de este período de incubación. Los sobrenadantes sin parásitos y sin células se recogían, si la viabilidad de la población celular era superior al 98%. Los análisis de transferencia Western de los sobrenadantes sin células concentrados pusieron de manifiesto que entre las 14 proteínas sólo 3 se segregaban activamente (Tc00.1047053506155.99 (SEC. ID. nº 103), Tc00.1047053505789.10 (SEC. ID. nº 93) y Tc00.1047053509999.10 (SEC. ID. nº 85)) (figura 6B). Estas proteínas representan material genuino segregado, ya que; (i) la sobreexpresión del gen de beta-tubulina no provoca el desplazamiento de la proteína beta-tubulina en el espacio extracelular (diferencia entre Lys y CCFS en la figura 6B), y (ii) la detección de la proteína marcada en el sobrenadante sin células no está relacionada con el nivel de su expresión por Leishmania (baja abundancia de Tc00.1047053506155.99, (SEC. ID. nº 103) en la figura 6B). Como era de esperar, para las tres proteínas se observó una ligera diferencia de peso molecular entre la proteína etiquetada detectada en todo el extracto soluble y la detectada en el sobrenadante sin células. Esta observación podría explicarse por una pérdida del péptido señal (figura 6B). Como era de esperar, no se detectó ninguna banda en los parásitos naturales (figura 6B). Además, para verificar que la secreción no está relacionado con el sistema de expresión heterólogo, dos genes de Leishmania (GenID LinJ19.0410 (SEC. ID. nº 77) y LinJ36.5780 (SEC. ID. nº 107)) correspondientes al ortólogo del gen Tc00.1047053506155.99 (SEC. ID. nº 103) y del gen Tc00.1047053505789.10 (SEC. ID. nº 93), se seleccionaron para validar dicho procedimiento. Al utilizar el mismo protocolo que anteriormente, se produjeron los parásitos que expresan las proteínas marcadas con 6xHis (Véase la figura 3). Como era de esperar, se detectó la presencia de la proteína marcada en el medio extracelular sólo en los parásitos transfectados con episomas (figura 7).

En conjunto, estos resultados demuestran que el procedimiento utilizado por los inventores les permitió identificar proteínas nuevas y realmente segregadas que se conservan entre diferentes especies y están involucradas en el retículo endoplásmico/vía secretora de dependiente de Golgi.

Ejemplo 2: Propiedades inmunógenas de proteínas segregadas conservadas de Trypanosoma cruzi identificadas por un procedimiento genómico

2.1. Material y procedimientos

2.1.1. Cepas bacterianas y plásmidos

Se utilizó TOP10 de Escherichia coli (Invitrogen) para la clonación primaria, y BL21 de E. coli (DE3) para la expresión proteica. La secuencia codificadora para la proteína segregada Tc00.1047053509999.10 se clonó bajo el control del activador T71ac. El vector plasmídico utilizado fue pET-21b (Novagen, Madison, Wis.) que confiere resistencia a la ampicilina y que permite la expresión de la proteína diana fusionada a una cola terminal C de seis restos de histidina.

2.1.2. Clonación de los genes de T. cruzi en el vector de expresión

El gen de T. cruzi que codifica la proteína segregada se amplió a partir de ADN genómico (clon TcY7proveniente de la cepa Y) por PCR utilizando cebadores directos e inversos específicos (Tabla 1). El gen Tc00.1047053509999.10 (SEC. ID. nº 85) se clonó sin la secuencia de aminoácidos correspondiente al péptido señal del terminal N predicho. Se llevaron a cabo reacciones de PCR en 20 µl utilizando 0,5 µM de cada cebador, dNTP 0,2 mM, 0,4 U de Phusion high fidelity polimerase (Finnzymes, Espoo, Finlandia) y las siguientes condiciones de ciclación: 98ºC durante 30 s. seguido por 25 ciclos de 98°C durante 10 s., 65°C d urante 15 s., 72°C durante 45 s., y una elongación de 72°C durante 5 min. Se insertaron fragmentos digeridos y purificados en el vector pET-21b desfosforilado digerido con las enzimas de restricción correspondientes. Las secuencias clonadas se confirmaron por digestión de restricción y secuenciación. Se realizaron preparados a gran escala de las montajes utilizando el kit plasmid midi (Promega).

Tabla 1. Los cebadores utilizados para la clonación en el vector de expresión pET21b

ID de gen

Secuencias de cebadoresa Tamaño del producto de ampliación (pb) PM (kDa)b

F CATCGCAGC ATATGGCAGAAGAGGAGGACGTGAGG

Tc00.1047053509999.10

R GCACTGACT CTCGAGGCCGCACCAGCGCTCCAGAA 1182 45,8

F, cebador directo y R, cebador inverso utilizados para la ampliación de la secuencia codificadora sin el péptido señal de secreción predicho. a Las secuencias de restricción utilizadas para la clonación en el vector pET21b se indican en cursiva. b Peso molecular esperado de la proteína.

2.1.3. Expresión y purificación de proteínas recombinantes de T. cruzi

El plásmido que lleva la proteína diana se utilizó para transformar la cepa BL21 (DE3) de E. coli. Se cultivaron colonias durante la noche a 37°C con agitación en u n medio de autoinductor ZYP-5052 (Studier FW, 2005) que contiene 100 µg/ml de ampicilina. Se obtuvieron lisados de E. coli depurados a partir de sedimentos celulares (cultivos de 50 ml) resuspendidos en 5 ml de tampón que contiene NaH2PO4 100 mM, Tris-Cl 10 mM y urea 8 M (pH 8,0). El sobrenadante clarificado se aplicó a una columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen) y la proteína recombinante se eluyó en tampón de urea 8M a pH 4,5. Para evaluar la pureza de las proteínas, se analizaron las fracciones eluidas en gel de SDS-PAGE por tinción con azul de Coomassie y/o por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-His (CTerm)-HRP como se detalla a continuación.

2.1.4. SDS-PAGE

El análisis de SDS-PAGE se realizó en un gel Bis-Tris NuPAGE (4-12%) en tampón de operación de MOPS-SDS (Invitrogen) en condiciones reductoras (DTT 50 mM). Los geles se tiñeron con azul de Coomassie o se sometió a electrotransferencia sobre membranas de PVDF (Hybond-P, Amersham) para los análisis de transferencia Western.

2.1.5. Análisis de transferencia Western

Las membranas de PVDF se enjuagaron dos veces en TBS y se utilizaron para la inmunodetección de las proteínas recombinantes con un anticuerpo anti-His (C-Term)-HRP (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las membranas utilizadas para la detección de anticuerpos anti-T. cruzi en sueros de pacientes se enjuagaron dos veces en TBS y se bloquearon durante la noche en TBS-Tween 0,1% (TBS-T) y 5% de leche descremada. Se cortaron a continuación tiras de papel (5 mm) y se incubaron por separado a una dilución 1:2500 de suero humano durante 2 h a temperatura ambiente. Las tiras se lavaron cinco veces (5 min) en TBS-T y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con IgG antihumana conjugada con HRP (cadena pesada y ligera específica) (Nordic Immunology) diluida 20000 veces en TBS-T y 5% de leche descremada. Las tiras se lavaron como antes, y los inmunocomplejos se revelaron por emisión de quimioluminiscencia utilizando el sistema de detección de transferencia Western ECL Plus y ECL Hyperfilms (GE Healthcare, Reino Unido).

2.1.6. Sueros de los pacientes

Se extrajeron sueros positivos de individuos chagásicos infectados de una región endémica situada en el noreste de Argentina (provincia del Chaco), una ciudad sin vectores situada en el noroeste de Argentina (ciudad de Salta) y de niños bolivianos tratados con Benznidazol (5 mg/kg/día) en la comunidad de Tupiza (departamento de Potosí), una zona bajo transmisión controlada del vector. Se extrajeron sueros negativos de donantes de sangre sanos de la misma región, respectivamente. Se determinó el estado de infección de T. cruzi utilizando dos pruebas convencionales: ELISA comercial e IHA basado en antígenos de homogeneizado de parásitos. Los sueros positivos para ambas reacciones se consideraron verdaderos positivos. Los sueros negativos para ambas reacciones se consideraron verdaderos negativos.

2.2. Resultados

Se dan en las figuras 8 y 9.

2.2.1. Expresión y purificación de la proteína recombinante rTc00.1047053509999.10 (SEC. ID. nº 85)

Con el fin de determinar las propiedades antigénicas de esta proteína segregada por T. cruzi, se produjo la proteína

5 recombinante en E. coli para analizar posteriormente su reactividad con sueros de pacientes chagásicos. Se evaluó la expresión proteica en bacterias transformadas que llevan el plásmido recombinante. La proteína recombinante se expresó y purificó en condiciones desnaturalizantes enBL21 (DE3) de E. coli (figura 8).

2.2.2. Reactividad de sueros de pacientes chagásicos con rTc00.1047053509999.10 (SEC. ID. nº 85)

10 Se evaluó la capacidad de la proteína recombinante rTc00.1047053509999.10 para detectar infecciones chagásicas por transferencia Western. Como se muestra en la figura 9 la proteína recombinante rTc00.1047053509999.10 fue reconocida por los sueros de pacientes chagásicos como una sola banda. Los sueros de donantes sanos no reconocieron la proteína recombinante. Se detectaron anticuerpos anti-Tc00.1047053509999.10 en el 80% (18/22)

15 de los sueros de pacientes chagásicos. Los sueros analizados pertenecen a pacientes originarios de diferentes regiones de América Latina. Seis sueros son de pacientes que viven en el noroeste de Argentina (ciudad de Salta) y que presentan insuficiencia cardíaca detectada por electrocardiograma y ecocardiograma. Cinco de estos sueros fueron positivos por análisis de transferencia Western. Entre seis sueros de niños del noreste de Argentina (provincia del Chaco), sólo 5 reconocieron la proteína recombinante. Los sueros restantes corresponden a cinco niños

20 bolivianos y cinco pacientes mejicanos que reconocían la proteína de T. cruzi en cuatro de los cinco sueros ensayados.

Además, se evaluó la potencial reactividad cruzada con anticuerpos de cinco pacientes infectados con L. infantum. La proteína recombinante no fue reconocida por estos sueros lo que sugiere que los anticuerpos detectados por los

25 pacientes chagásicos son específicos para la infección por T. cruzi.

En vista de las propiedades antigénicas de Tc00.1047053509999.10 de T. cruzi (SEC. ID. nº 85) dicha proteína recombinante puede representar un antígeno interesante para identificar específicamente anticuerpos anti-T. cruzi en sueros y puede representar una nueva herramienta de diagnóstico potencial para la enfermedad de Chagas.

Listado de secuencias

<110> INSTITUT DE RECHERCHE POUR LE DEVELOPPEMENT CORRALES, Rosa Milagros MATHIEU-DAUDE,

Françoise SERENO, Denis 35

<120> Procedimiento para el cribado de proteínas segregadas conservadas

<130> WOB 08 BD IRD CHAG

40 <150> EP 08290657

<151> 2008-07-04

<160> 173

<170> PatentIn versión 3.5

45 <210> 1

<211> 705

<212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi

50 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(705)

<400> 1

<210> 2

<211> 234

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<400> 2

<210> 3 5 <211> 666

<212> ADN

<213> Leishmania major

<220> 10 <221> CDS

<222> (1)..(666)

<400> 3

<210> 4

<211> 221

<212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 4

<210> 5 5 <211> 483

<212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220> 10 <221> CDS

<222> (1)..(483)

<210> 6

<211> 160

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<210> 7

<211> 495 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(495)

<210> 8

<211> 164

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<210> 9

<211> 1065

<212> ADN 15 <213> Trypanosoma cruzi

<220>

<221> CDS

<222> (1).. (1065)

<210> 10

<211> 354

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<210> 11

<211> 1038 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1038)

<210> 12

<211> 345

<212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 12

<210> 13

<211> 1050 5 <212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1050)

<210> 14

<211> 349

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<210> 15

<211> 1104 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1104)

<400> 15

<210> 16

<211> 367

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<210> 17

<211> 1041

<212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1041)

<210> 18

<211> 346

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<210> 19

<211> 1002 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1002)

<210> 20

<211> 333

<212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 20

<210> 21

<211> 1005 5 <212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1005)

<210> 22

<211> 334

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<400> 22

<210> 23

<211> 1002 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (1002)

<210> 24

<211> 333

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<400> 24

<210> 25

<211> 1269 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (1269)

<210> 26

<211> 422

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<210> 27

<211> 1296 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1296)

<210> 28

<211> 431

<212> PRT

<213> Leishmania major

<210> 29

<211> 1296 5 <212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (1296)

<220>

<221> misc_feature

<222> (74).. (74) 15 <223>nisa,c,g,ort

<400> 29

<210> 30

<211> 431 5 <212> PRT

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (25).. (25)

<223> El 'Xaa' en el lugar 25 representa Tyr, Cys, Ser, o Phe.

<400> 30

<210> 31

<211> 1263 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1263)

<210> 32

<211> 420

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<210> 33

<211> 1944

<212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1944)

<210> 34

<211> 647

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<400> 34

<210> 35

<211> 2043 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(2043)

<400> 35

<210> 36

<211> 680

<212> PRT

<213> Leishmania major

<210> 37

<211> 2043 5 <212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (2043)

<210> 38

<211> 680

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<210> 39

<211> 2190 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(2190)

<210> 40

<211> 729

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<400> 40

5

<210> 41 <211> 1521 <212> ADN <213> Trypanosoma cruzi

10

<220> <221> CDS

86

<222> (1)..(1521)

<210> 42

<211> 506

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<210> 43

<211> 1962 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1962)

<210> 44

<211> 653

<212> PRT

<213> Leishmania major

<210> 45

<211> 1962 5 <212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1962)

<210> 46

<211> 653 <212> PRT

<213> Leishmania infantum

<210> 47

<211> 1593 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (1593)

<400> 47

<210> 48

<211> 530

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<210> 49

<211> 1518 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1518)

<210> 50

<211> 505

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<400> 50

<210> 51

<211> 1962 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1962)

<210> 52

<211> 653

<212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 52

<210> 53

<211> 1962 5 <212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1962)

<400> 53

<210> 54

<211> 653

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<210> 55

<211> 1593 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1593)

<210> 56

<211> 530

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<400> 56

<210> 57

<211> 612 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(612)

<210> 58

<211> 203

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<210> 59

<211> 639 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(639)

<210> 60

<211> 212

<212> PRT

<213> Leishmania major

<210> 61

<211> 639 5 <212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (639)

<210> 62

<211> 212

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<210> 63

<211> 612 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(612)

<210> 64

<211> 203

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<210> 65

<211> 687 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(687)

<210> 66

<211> 228

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<400> 66

<210> 67

<211> 747 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(747)

<400> 67

<210> 68

<211> 248

<212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 68

<212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

10 <221> CDS

<222> (1).. (708)

<400> 69

<212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

10 <221> CDS

5

<210> 70

<211> 235

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

10

<400> 70

<222> (1).. (699)

<400> 71

<210> 72

<211> 232

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<210> 73

<211> 2031 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (2031)

<400> 73

<210> 74

<211> 676

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<400> 74

<210> 75

<211> 1647 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1647)

<400> 75

<210> 76

<211> 548

<212> PRT

<213> Leishmania major

<210> 77

<211> 1590 5 <212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1590)

<400> 77

<210> 78

<211> 529

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<210> 79

<211> 1644 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1644)

<210> 80

<211> 547

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<400> 80

<210> 81

<211> 1713 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1713)

<210> 82

<211> 570

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<400> 82

<210> 83

<211> 1329 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (1329)

<210> 84

<211> 442

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<210> 85

<211> 1227 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1227)

<210> 86

<211> 408

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<210> 87

<211> 1824

<212> ADN

<213> Leishmania major 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1824)

10 <400> 87

<210> 88

<211> 607

<212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 88

<210> 89

<211> 1812 5 <212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1812)

<210> 90

<211> 603

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<400> 90

<210> 91

<211> 1221 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1221)

<400> 91

<210> 92

<211> 406

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<210> 93

<211> 1488 5 <212> ADN

<213> Trypanosmacruzi

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1488)

<210> 94

<211> 495

<212> PRT

<213> Trypanosmacruzi

<210> 95

<211> 1647 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1647)

<400> 95

<210> 96

<211> 548

<212> PRT

<213> Leishmania major

<210> 97

<211> 1590 5 <212> ADN

<213> Leishmania infantum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1590)

<400> 97

<210> 98

<211> 529

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<210> 99

<211> 1644 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1644)

<210> 100

<211> 547

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<400> 100

<210> 101

<211> 1713 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1713)

<210> 102

<211> 570

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<400> 102

<210> 103

<211> 735 5 <212> ADN

<213> Trypanosoma cruzi

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(735)

<210> 104

<211> 244

<212> PRT

<213> Trypanosoma cruzi

<210> 105

<211> 738 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (738)

<400> 105

<210> 106

<211> 245

<212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 106

5 <210> 107

<211> 738

<212> ADN

<213> Leishmania infantum

10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(738)

<400> 107

<210> 108

<211> 245

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<210> 109

<211> 789

<212>

ADN 10 <213> Trypanosoma brucei

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(789)

<210> 110

<211> 262

<212> PRT

<213> Trypanosoma brucei

<210> 111

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido señal

<210> 112

<211> 20

<212>

PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido señal

<210> 113

<211> 31 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido señal 30

<400> 113

<210> 114 35 <211> 29

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 40 <223> Péptido señal

45 <210> 115

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido señal

<210> 116

<211> 28

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido señal

<400> 116

<210> 117

<211> 27

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Péptido señal

<210> 118

<211> 25

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido señal

<210> 119

<211> 25

<212> PRT 45 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido señal

<400> 119 <210> 120

<211> 32 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido señal 10

<210> 121 15 <211> 31

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Péptido señal

25 <210> 122

<211> 43

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Péptido señal <400> 123

35

<210> 123

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Péptido señal

<210> 124 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 124 catgagctta ctagtatgtt gtctctggca gaagtgtgt

39

<210> 125 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 125 acggtgccca aaggcgtgta

20

<210> 126 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 126 cacacggaag ctttcaatga tgatgatgat gatggcgacc aaacctagcc ataag

55

<210> 127 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 127 ctgggggaat tcatgcggtg gatttttttg ttacttgcc

39

<210> 128 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 128 ccgatacgtc caccacccct c

21

<210> 129 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 129 cgtcggaagc ttctagtgat ggtggtggtg atggacaagt tcgtggcatg taattg

56

<210> 130 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 130 acacggacta gtatgattgt attgaatgga atttctgag

39

<210> 131 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 131 ctaatagtcc gaagtcgttg cg

22

<210> 132 <211> 53 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 132 ctacacaagc ttttagtgat ggtgatggtg atggctgcgc ctccacaccg tgc

53

<210> 133 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 133 ctgataggca ctagtatgtt tccggcgcag gaattcct

38

<210> 134 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 134 cccctttcag gtgaccatta caagag

26

<210> 135 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 135 gccgtcaagc ttttagtggt ggtggtggtg atgctccgct cccaacttca aacga

55

<210> 136 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 136 ctgataggca ctagtatgcg tcgcacttta ttttgtctg

39

<210> 137 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 137 ctctccaact cgtacggcga

20

<210> 138 <211> 59 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 138 ctgcaggcaa gcttctaatg gtggtgatgg tgatgttatg ataccggcat caagtcccc

59

<210> 139 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 139 cgcactcact agtatgccct ctggcaaagc aactg

35

<210> 140 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 140 tcactgctcc gccctggttt c

21

<210> 141 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 141 cgctccctcg agttagtggt gatggtggtg atgggcagca tttaccgacc ctga

54

<210> 142 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 142 gctcagccaa gcttatgcgc acttcttctg ccgtgt

36

<210> 143 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 143 atcggggagt tttgtgcagg ttgag

25

<210> 144 <211> 58 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 144 gtggtcttct cgagttagtg atggtggtgg tgatggtcga ctttaatgct cgcgtata

58

<210> 145 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 145 ctgcccagta ctagtatgtc tgctaaagcc tcacggc

37

<210> 146 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 146 tccaggtagt cacccattcc gtg

23

<210> 147 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 147 ctcagccaag cttttaatga tgatgatgat ggtgtcgtct cgcctcacag tgct

54

<210> 148 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 148 ctgcgctgga ctagtatgtc tgttaaagcc tcacggcg

38

<210> 149 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 149 ccattccgtg accgccgtag ac

22

<210> 150 <211> 53 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 150 ctcggtaagc ttttaatgat gatgatgatg gtgtcgtctc gcctcacagt gct

53

<210> 151 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 151 ctcgctggaa ttcatgcggt gggtgatagt tgtatttgc

39

<210> 152 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 152 cgccaacaac gtagttgcca ag

22

<210> 153 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 153 acggacctcg agttagtgat ggtggtggtg atgcttgttg agtttggagc ggcg

54

<210> 154 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 154 cgcgggacta gtatgaaaca aaaaatgcga cgcaaattg

39

<210> 155 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 155 gtgaggatgg ggaaccaaaa gagtc

25

<210> 156 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 156 cagccaagct tctagtgatg gtgatgatga tggacattct tcttctttgt aaagtag

57

<210> 157 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 157 cgcggcacta gtatgtattc atgtttgtcg ctgaggc

37

<210> 158 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 158 gcagcaacgg caacaaagag c

21

<210> 159 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 159 catggcaagc ttttagtgat ggtggtggtg atgctcctct ctgggtttcc ttcg

54

<210> 160 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 160 cgcgccacta gtatgtacgt cgtgcttttt ttcgttt

37

<210> 161 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 161 cgcatatttc cgctccgttc c

21

<210> 162 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 162 agcagtccaa gcttttagtg atggtgatga tgatggccgc accagcgctc cagaa

55

<210> 163 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 163 gggtgccact agtatgcgtg agattgtgtg cgttcag

37

<210> 164 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 164 gggcggaaga tctgcccgta tg

22

<210> 165 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 165 agcgctcaag cttttagtga tggtggtggt gatggtactg ctcctcctcg tcgaact

57

<210> 166 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 166 catgaccact agtatggcca aaacagcgct tctc

34

<210> 167 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 167 gcagtccaag cttttagtga tggtgatgat gatgaggtgt tctcaggggt gacga

55

<210> 168 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 168 catgctcgac tagtatgggg tgccgcagta gctg

34

<210> 169 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 169 gcagtccaag cttttaatga tgatggtggt gatgatcatc caacatctgg caccgc

56

<210> 170 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 170 atgattgaac aagatggatt gcacgcagg

29

<210> 171 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

5

<400> 171 tcagaagaac tcgtcaagaa 20

10

<210> 172 <211> 1593 <212> ADN <213> Leishmania major

15

<220> <221> CDS <222> (1)..(1593)

<210> 173

<211> 530

<212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 173

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de diagnóstico in vitro para la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos indicativos de la enfermedad de Chagas que se unen a un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado, que consiste en la SEC. ID. nº 86 para formar un inmunocomplejo, que comprende las etapas siguientes:

   a.

   poner en contacto dicho polipéptido con una muestra biológica durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un inmunocomplejo; y

   b.

   detectar la presencia o ausencia del inmunocomplejo formado en a).

2. 2. Procedimiento de diagnóstico in vitro para la detección de la presencia o ausencia de polipéptidos indicadores de la enfermedad de Chagas que se unen a un anticuerpo obtenido por inmunización de un animal con un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86 para formar un inmunocomplejo, que comprende las etapas siguientes:

   a.

   poner en contacto dicho anticuerpo con una muestra biológica durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un inmunocomplejo; y

   b.

   detectar la presencia o ausencia del inmunocomplejo formado en a).

3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86 se ha identificado mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

   a.

   analizar un supuesto polipéptido conservado a partir de especies parasitarias de protozoos para determinar si dicho polipéptido tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

   b.

   buscar un ortólogo, en miembros de la familia relacionados, de dicho polipéptido, presentando dicho ortólogo un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

   c.

   analizar dicho ortólogo para determinar si dicho ortólogo tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

   d.

   seleccionar el polipéptido conservado y su correspondiente ortólogo que tiene un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

   e.

   clonar los genes que codifican el polipéptido seleccionado en la etapa d) mediante un vector de expresión,

   f.

   transfectar células replicativas de protozoos parásitos,

   g.

   cultivar in vitro dichas células en las condiciones de pH y temperatura que se encuentran en la naturaleza en un anfitrión infectado por una cepa parasitaria de protozoo,

   h.

   analizar la presencia de polipéptidos segregados en las células proliferantes parasitarias de protozoos, e

   i.

   identificar dichos polipéptidos segregados mediante un procedimiento de identificación de proteínas.

4. 4. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86 ha sido identificado mediante un procedimiento para identificar polipéptidos conservados de parásitos tripanosomátidos que son segregados por la ruta secretora dependiente del retículo endoplásmico/aparato de Golgi, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

   a.

   analizar un supuesto polipéptido conservado de un parásito tripanosomátido para determinar si dicho polipéptido tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

   b.

   buscar un ortólogo, en miembros de la familia relacionados, de dicho polipéptido identificado con un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

   c.

   analizar dicho ortólogo para determinar si dicho ortólogo tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

   d.

   seleccionar el polipéptido conservado y su correspondiente ortólogo que tiene un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

   e.

   clonar los genes que codifican el polipéptido seleccionado en la etapa d) mediante un vector de expresión,

   f.

   transfectar las células replicativas de tripanosomátido en la fase de promastigotes,

   g.

   cultivar in vitro dichas células en las condiciones de pH y temperatura que se encuentran en la naturaleza en una célula anfitriona infectada por una cepa de tripanosomátido,

   h.

   recoger células replicativas transfectadas obtenidas en la etapa g),

   i.

   incubar dichas células en un medio exento de suero durante un periodo de 1 a 10 horas, preferentemente durante un periodo de 5 a 6 horas, a una temperatura comprendida entre 25 y 27°C,

   j.

   analizar la presencia de polipéptidos segregados por dichas células, e

   k.

   identificar dichos polipéptidos segregados mediante un procedimiento de identificación de proteínas.

5. 5. Procedimiento para detectar la presencia o ausencia de estimulación linfocítica en un paciente que se sospecha que padece la enfermedad de Chagas, que comprende las etapas siguientes:

   a.

   poner en contacto los linfocitos T contenidos en una muestra obtenida de dicho paciente con un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86; y

   b.

   detectar la presencia o ausencia de una respuesta proliferativa de dichos linfocitos T a dicho polipéptido.

6. 6. Utilización de un kit de diagnóstico para la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos indicativos de la enfermedad de Chagas, comprendiendo dicho kit de diagnóstico:

   a.

   un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86;

   b.

   un reactivo para detectar el inmunocomplejo polipéptido-anticuerpo; opcionalmente, una muestra biológica de referencia que carece de anticuerpos que se unen inmunológicamente con dicho péptido; y

   c.

   opcionalmente, una muestra comparativa que comprende anticuerpos que pueden unirse específicamente a dicho péptido;

   en la que dichos polipéptido, reactivo, muestra biológica de referencia y muestra comparativa están presentes en una cantidad suficiente para llevar a cabo dicha detección.
7. 7. Utilización de un kit de diagnóstico para la detección de la presencia o ausencia de polipéptidos indicadores de la enfermedad de Chagas, comprendiendo dicho kit de diagnóstico:

   a.

   un anticuerpo obtenido por inmunización de un animal con un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86;

   b.

   un reactivo para detectar el inmunocomplejo polipéptido-anticuerpo; y

   c.

   opcionalmente, una muestra biológica de referencia que carece de polipéptidos que se unen inmunológicamente a dicho anticuerpo; y

   d.

   opcionalmente, una muestra comparativa que comprende polipéptidos que pueden unirse específicamente a dicho anticuerpo;

   en la que dichos anticuerpo, reactivo, muestra biológica de referencia y muestra comparativa están presentes en una cantidad suficiente para llevar a cabo dicha detección.