JP2002508506A - Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の検出および予防のための化合物および方法 - Google Patents

Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の検出および予防のための化合物および方法

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Abstract

(57)【要約】 Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ感染を診断するための化合物および方法が提供される。この開示された化合物は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の１つ以上のエピトープを含む、ポリペプチド、またはその抗体である。この化合物は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための種々の免疫アッセイにおいて有用である。このポリペプチド化合物はさらに、Ｔ．ｃｒｕｚｉ．に曝露された個体におけるシャーガス病に対する防御免疫を誘導するためのワクチンおよび薬学的組成物において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の診断に関する。本発明は、より詳細
には、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染について個体および血液供給品をスクリーニングする
ための方法および診断キットにおける、１つ以上のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原性ペプチ
ドまたはそれに対する抗体の使用に関する。本発明はまた、シャーガス病を予防
するために個体を免疫化するためのワクチン組成物に関する。
【０００２】 （発明の背景） 原生動物寄生体は、世界の多くの地域で健康に対して大きな脅威となっている
。Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）は、主に、中央およ
び南アメリカで数百万の個体に感染している、このような寄生体の１つである。
この寄生体の感染は、慢性の心臓病および種々の免疫系障害を生じ得るシャーガ
ス病を引き起こし得る。ラテンアメリカでは、１８００万の人々がＴ．ｃｒｕｚ
ｉに感染していると推定されているが、この感染の臨床症状に対する確実な処置
はない。現在利用可能なシャーガス病の予防のためのワクチンは存在しない。
【０００３】 この病気が風土病である地域では、伝播の最も顕著な経路は、感染したトリア
トーマ類サシガメ（ｔｒｉａｔｏｍｉｄ ｂｕｇ）との接触による。しかし、そ
の他の地域では、輸血が伝播の最も優勢な手段である。このような地域でＴ．ｃ
ｒｕｚｉの伝播を阻害するために、個体におけるＴ．ｃｒｕｚｉ感染を診断する
ため、および血液供給品をスクリーニングするための正確な方法を開発すること
が必要である。０．１％〜６２％のサンプルが感染されているかもしれず、そし
てこの寄生体が輸血によりしばしば伝播される南アメリカでは、血液バンクのス
クリーニングが特に重要である。また、特定の合衆国の都市における血液供給品
が、Ｔ．ｃｒｕｚｉ寄生体で汚染されているかもしれないことに関心が高まって
いる。
【０００４】 Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の診断は問題が多い。なぜなら、慣用的な使用に適切であ
る、この寄生体を検出する正確な方法が利用可能でないからである。数十年間存
続し得る感染の急性期の間は、感染は静態のままであり得、そして宿主は、無症
候であり得る。その結果、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染に対する血清学的試験が最も信頼
性があり、そして最も一般に用いられ得る。
【０００５】 しかし、このような診断は、この寄生体の複雑な生活環および宿主の多種多様
な免疫応答により複雑である。この寄生体は、昆虫ベクター中でエピマスティゴ
ート期を、そして哺乳動物宿主中で２つの主要期を経験する。１つの宿主期は血
液中に存在し（トリポマスティゴート期）、そして第２期は細胞内である（無べ
ん毛型期）。複数の期は、感染の間、寄生体により呈示される多種多様な抗原を
生じる。さらに、原生動物感染に対する免疫応答は複雑であり、寄生体抗原のア
レイに対する体液性および細胞媒介性応答の両者を含む。
【０００６】 寄生体抗原に対する抗体を検出することは、臨床感染および無症状感染を診断
する最も一般的かつ信頼性のある方法であるが、現行の試験は高価でかつ難しい
。大部分の血清学的試験は、全Ｔ．ｃｒｕｚｉまたは溶解Ｔ．ｃｒｕｚｉを用い
、そしてＴ．ｃｒｕｚｉ感染を正確に検出するために、補体結合、間接免疫蛍光
、受動凝集、ＥＬＩＳＡを含む３つの試験のうち２つについて陽性の結果を必要
とする。このような試験のコストおよび困難性は、多くの風土病地域で血液また
は血清のスクリーニングを妨げてきた。
【０００７】 従って、当該分野において血液供給品および個体におけるＴ．ｃｒｕｚｉ感染
を検出する、より特異的および高感度な方法に対する必要性が存在する。本発明
は、これらの必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
【０００８】 （発明の要旨） 簡単に述べれば、本発明は、個体および血液供給品におけるＴ．ｃｒｕｚｉ感
染を検出および防止するための化合物および方法、ならびに生物学的サンプル中
のＴ．ｃｒｕｚｉ感染をスクリーニングするための化合物および方法を提供する
。１つの局面において、本発明は、生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を
検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ） 生物学的サンプルを、配列
番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミ
ノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープあるいは保存的置換および／
または改変のみが異なるこのような抗原の改変体を含むポリペプチドと接触させ
る工程；ならびに（ｂ）生物学的サンプルにおけるポリペプチドに結合する抗体
の存在を検出し、それによってこの生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を
検出する工程を包含する。
【０００９】 本発明の別の局面において、配列番号１〜配列番号２１に列挙されるヌクレオ
チド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピ
トープあるいは保存的置換および／または改変のみが異なる抗原の改変体を含む
ポリペプチドが提供される。
【００１０】 関連する局面において、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、これら
のＤＮＡ配列を含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換ま
たはトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供される。
【００１１】 別の局面において、本発明は、生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検
出するための診断キットを提供し、このキットは、（ａ）配列番号１〜配列番号
２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する
Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープまたは保存的置換および／もしくは改変のみが
異なるこのような抗原の改変体を含むポリペプチド；ならびに（ｂ）検出試薬を
含む。
【００１２】 本発明のなお別の局面において、生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染の
存在を検出するための方法が提供され、この方法は、（ａ）生物学的サンプルを
、配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされ
るアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープあるいは保存的置換お
よび／または改変のみが異なるこのような抗原の改変体に結合するモノクローナ
ル抗体と接触させる工程；ならびに（ｂ）生物学的サンプルにおけるモノクロー
ナル抗体に結合するＴ．ｃｒｕｚｉ寄生体の存在を検出する工程を包含する。
【００１３】 関連する局面において、上記のポリペプチドおよび生理学的に受容可能なキャ
リアを含む薬学的組成物、ならびにアジュバンドと組み合わせた上記のポリペプ
チドを含むワクチンもまた提供される。
【００１４】 本発明はまた、他の局面において、シャーガス病に対する防御免疫を患者にお
いて誘導するための方法もまた提供し、この方法は上記の薬学的組成物またはワ
クチンを患者に投与する工程を包含する。
【００１５】 他の局面において、本発明は生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出
するための方法を提供し、この方法は、（ａ）生物学的サンプルを、配列番号１
〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配
列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープまたは保存的置換および／もしくは
改変のみが異なる抗原の改変体を含む第一のポリペプチドと接触させる工程；（
ｂ）生物学的サンプルを、他のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の１つ以上のエピトープまた
は保存的置換および／または改変のみが異なるその改変体を含む１つ以上のさら
なるポリペプチドと接触させる工程；ならびに（ｃ）生物学的サンプルにおける
上記ポリペプチドの１つ以上に結合する抗体の存在を検出し、それによってこの
生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出する工程を包含する。１つの実
施態様において、さらなるポリペプチドは、ＴｃＤのエピトープまたは保存的置
換および／もしくは改変のみが異なるその改変体を含む。別の実施態様において
、さらなるポリペプチドは、ＴｃＤのエピトープ（あるいは保存的置換および／
または改変のみが異なるその改変体）およびＴｃＥのエピトープ（あるいは保存
的置換および／または改変のみが異なるその改変体）を含む。なお別の実施態様
において、さらなるポリペプチドは、ＴｃＤのエピトープ（あるいは保存的置換
および／または改変のみが異なるその改変体）およびＰＥＰ−２のエピトープ（
または保存的置換および／または改変のみが異なるその改変体）を含む。
【００１６】 なおさらなる局面において、本発明は２つ以上のポリペプチドを含む組合せポ
リペプチドを提供し、各ポリペプチドは、配列番号１〜配列番号２２に列挙され
るヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ
抗原のエピトープあるいは保存的置換および／または改変のみが異なるその改変
体を含む。配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコ
ードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の少なくとも１つのエピト
ープあるいは保存的置換および／または改変のみが異なるその改変体、ならびに
ＴｃＤエピトープ、ＴｃＥエピトープ、ＰＥＰ−２エピトープ、および保存的置
換および／または改変のみが異なるそれらの改変体からなる群より選択される少
なくとも１つのエピトープを含む組合せポリペプチドもまた提供される。このよ
うな組合せポリペプチドは、合成手段によって、または組換えＤＮＡ技術を用い
てのいずれかで調整され得る。
【００１７】 関連する局面において、生物学的サンプルにおけるＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出
するための方法が提供され、この方法は（ａ）生物学的サンプルを、上記の組合
せポリペプチドの少なくとも１つと接触させる工程、および（ｂ）生物学的サン
プル中で組合せポリペプチドに結合する抗体の存在を検出する工程を包含する。
【００１８】 本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参
照すれば明らかになる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、各々を個々
に援用したかのように、本明細書においてその全体が参考として援用される。
【００１９】 （発明の詳細な説明） 上記のように、本発明は、一般に、個体および血液供給品のＴ．ｃｒｕｚｉ感
染を検出および予防する化合物および方法に関する。本発明の化合物は、一般に
、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の１つ以上のエピトープを含む。特に、配列番号１〜配列
番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有
するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープを含むポリペプチドが好ましい。本明細書
において使用される用語「ポリペプチド」は、全長（すなわち、天然の）抗原を
含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。従って、エピトープを含むポリペプチ
ドは、エピトープからのみなり得るか、またはさらなる配列を含み得る。さらな
る配列は、天然の抗原由来であってもよいし、または異種性であってもよい。そ
してこのような配列は抗原性であり得る（が抗原性である必要はない）。特定の
アミノ酸配列を「有する」タンパク質は、その全長配列内に列挙された配列を含
むタンパク質である。このようなタンパク質はさらなるアミノ酸配列を含んでも
よいし、含まなくてもよい。さらなるＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質由来の一つ以上
のエピトープの使用もまた、本明細書中に列挙された配列の一つ以上のエピトー
プに優先してまたは組合わせて、診断の感度および特異性を増強するために意図
される。
【００２０】 本明細書中で使用される「エピトープ」は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染個体の血清と
反応するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の部分である（すなわち、エピトープは特異的にこ
のような血清内の一つ以上の抗体によって結合される）。本願中に記載される抗
原のエピトープは、一般に当業者に公知である方法（例えば、Ｐａｕｌ， Ｆｕ
ｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，２４３−２４７ （Ｒａ
ｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびそこで引用された参考文献において要約
された方法）を使用して同定され得る。例えば、天然のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原由来
のポリペプチドは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染患者から得られるプールされた血清と反
応する能力についてスクリーニングされ得る。Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染血清との反応
性を評価するために適切なアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ
））は、以下に、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８においてより詳細に記載される。ポリ
ペプチドのエピトープは、全長ポリペプチドの反応性と実質的に同様なレベルで
このような抗血清と反応する部分である。言い換えれば、エピトープは、抗体結
合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）において全長ポリペプチドによって生成され
る応答の少なくとも約８０％、および好ましくは少なくとも約１００％で生じ得
る。
【００２１】 本発明の化合物および方法はまた、上記ポリペプチドの改変体を包含する。本
明細書中で用いられる「改変体」は、列挙されたポリペプチドと保存的置換また
は保存的改変においてのみ異なり、その結果列挙されたポリペプチドの抗原性性
質を保持するポリペプチドである。「保存的置換」は、あるアミノ酸が、類似の
性質を有する別のアミノ酸に置換され、その結果ペプチド化学の当業者がポリペ
プチドの二次構造および疎水親水指数の性質が実質的に変化しないと予期するよ
うな置換である。一般に、以下の群のアミノ酸が保存的交換を示す：（１）ａｌ
ａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２
）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、
ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ
、ｔｒｐ、ｈｉｓ。改変体はまた、あるいは、他の保存的改変を含み、これらは
、ポリペプチドの抗原性性質、二次構造および疎水親水指数の性質に対して最小
の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含み得る。例えば、ポリペプチドは
、合成を容易にするために、または固体支持体へのポリペプチドの結合を増大す
るために、リンカーまたはその他の配列と結合され得る。
【００２２】 関連する局面において、複数のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープを含む組合せ
ポリペプチドが、開示される。「組合せポリペプチド」は異なったＴ．ｃｒｕｚ
ｉ抗原のエピトープ、またはその改変体が、例えば単一アミノ酸鎖にペプチド結
合を介して結合されるポリペプチドである。こうして形成されたアミノ酸鎖は、
直線状か、または分枝状であり得る。エピトープは、直接結合され得（すなわち
、アミノ酸を介在することなしに）、またはエピトープの抗原性性質を有意に変
えないリンカー配列（例えば、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）によって結合され得る
。ペプチドエピトープはまた、非ペプチド結合（例えば、ペプチドエピトープ上
の特異的官能基間を（例えば、アミノ基、カルボキシル基、またはスルフヒドリ
ル基を介して）化学的にまたは光化学的にカップリングするヘテロまたはホモ二
官能性薬剤）を介して結合され得る。本発明の組合せポリペプチドにおいて有用
に利用され得る二官能性薬剤は、当業者に周知である。エピトープはまた、溶液
中かまたは固層中のいずれかで、一つ以上のエピトープがリガンド／抗リガンド
対の第一のメンバーに結合され、次いでリガンド／抗リガンド対の相補的なメン
バーに結合されるアビジン／ビオチンのような相補的なリガンド／抗リガンド対
よって結合され得る。組合せポリペプチドは、本明細書中に記載されるようなポ
リペプチドの複数のエピトープを含み得、および／または本明細書中に記載され
るエピトープに結合される一つ以上の他のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原（例えば、ＴｃＤ
、ＴｃＥ、またはＰＥＰ−２）のエピトープを含み得る。
【００２３】 一般に、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原およびこのような抗原をコードするＤＮＡ配列は
、任意の種々の手順を使用して調製され得る。例えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉ ｃＤＮ
ＡまたはゲノムＤＮＡ発現ライブラリーは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染個体由来の血清
のプールでスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングは、一般に、当
業者に周知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載される技術）を使用して実施され得る。簡単に
述べれば、バクテリオファージライブラリーをプレートし、そしてフィルターに
移し得る。次いで、このフィルターを血清および検出試薬とインキュベートし得
る。本発明の文脈では、「検出試薬」は、抗体−抗原複合体に結合し得る任意の
化合物であり、次いで、この複合体は、当業者に公知の任意の種々の手段により
検出され得る。スクリーニング目的のための代表的な検出試薬は、レポーター基
に結合した、プロテインＡ、プロテインＧ、ＩｇＧ、またはレクチンのような「
結合因子」を含む。好適なレポーター基は、酵素、基質、コファクター、インヒ
ビター、色素、放射性核種、化学発光基、蛍光基、およびビオチンを含むがこれ
らに限定されない。より好適には、レポーター基は、テトラメチルベンジジンま
たは２，２'−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸のような基 質とのインキュベーションにより検出され得る西洋ワサビペルオキシダーゼであ
る。血清中の抗体に結合するタンパク質を発現するｃＤＮＡを含むプラークは、
当業者に公知の技術により単離および精製され得る。適切な方法は、例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に
見出され得る。
【００２４】 配列番号１〜配列番号１８に列挙されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子
は、上記のように、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染個体由来の血清のプールを用いてＴ．ｃ
ｒｕｚｉゲノム発現ライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得
る。より詳細には、配列番号１〜配列番号１６に列挙されるヌクレオチド配列を
有するＤＮＡ分子は、米国特許第５，３０４，３７１号および１９９５年３月１
４日に出願された米国特許出願第０８／４０３，３７９号に記載される寄生生物
溶解産物、ならびに／またはＴ．ｃｒｕｚｉ抗原ＴｃＤおよびＴｃＥの一方もし
くは両方と血清学的反応性を（ＥＬＩＳＡまたはウェスタンアッセイにおいて）
示す血清のプールを用いてライブラリーをスクリーニングすることによって単離
され得る。次いで、引き続くスクリーニングが、検出可能な抗ＴｃＤ抗体を欠く
患者血清を用いて行われる。配列番号１７（５’末端）および配列番号１８（３
’末端）に列挙されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子は、溶解物、ＴｃＤ
、およびＴｃＥとのより低い血清学的反応性を示す（すなわち、ＥＬＩＳＡまた
はウェスタンアッセイにおいてバックグラウンドの反応性を超えて３標準偏差よ
り少ないシグナルを検出する）血清のプールを用いてゲノム発現ライブラリーを
スクリーニングし、その後引き続き検出可能な抗ＴｃＤ抗体を欠く患者血清を用
いて次のスクリーニングすることによって単離され得る。
【００２５】 配列番号１９〜配列番号２２に列挙される配列を有するＤＮＡ分子は、Ｔ．ｃ
ｒｕｚｉ感染個体由来の血清（より高いおよびより低い血清学的反応性の両方）
を用いて非増幅Ｔ．ｃｒｕｚｉ ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングす
ることによって、上記のように、得られ得る。
【００２６】 あるいは、配列番号１〜配列番号２２に列挙される配列を有するＤＮＡ分子は
、Ｔ．ｃｒｕｚｉゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応を介し
て増幅され得る。このアプローチのために、配列番号１〜配列番号２２に提供さ
れる配列に基づいて配列特異的プライマーが設計され得、そして購入または合成
され得る。次いで、ＤＮＡ配列の増幅部分は周知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載の技術）
を使用して全長ゲノムまたはｃＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。
【００２７】 上記ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有する抗原のエピトープ
が、一般に、天然の抗原の部分を含むポリペプチドを産生し、そしてＴ．ｃｒｕ
ｚｉ感染個体由来の血清を用いてポリペプチドの反応性を評価することによって
、上記のように同定され得る。多くの場合、天然の抗原において見出された一つ
以上の反復配列を含むペプチドは、エピトープを含む。このような反復配列は、
上記のヌクレオチド配列の調査に基づいて同定され得る。上記のＤＮＡ配列によ
ってコードされる抗原についての代表的な反復配列は、配列番号２３〜配列番号
３６および配列番号４７〜配列番号４９において提供される。より詳細には、配
列番号３に列挙される配列についての反復配列は、配列番号２３（フレーム１）
、配列番号２４（フレーム２）、および配列番号２５（フレーム３）において提
供される。配列番号４に列挙される配列についての反復配列は、配列番号２６（
フレーム１）および配列番号２７（フレーム３）において提供される。そして配
列番号９についての反復配列は、配列番号４７（フレーム１）、配列番号４８（
フレーム２）、および配列番号４９（フレーム３）において提供される。配列番
号１２については、反復配列は、配列番号２８（フレーム１）、配列番号２９（
フレーム２）、および配列番号３０（フレーム３）において提供される。配列番
号３１は、配列番号１５についての反復配列を列挙する。配列番号１６について
は、反復配列は、配列番号３２（フレーム２）および配列番号３３（フレーム３
）において提供される。最後に、配列番号１８についての反復配列は、配列番号
３４（フレーム１）、配列番号３５（フレーム２）、および配列番号３６（フレ
ーム３）において提供される。
【００２８】 本明細書中に記載のポリペプチドは、当業者に周知の技術を用いて生成され得
る。約１００より少ないアミノ酸、そして、一般に、約５０より少ないアミノ酸
を有するポリペプチドは、例えば、伸長するアミノ酸鎖にアミノ酸が連続的に添
加される、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相合成法を用いて合成され得る。Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６、１９
６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡのような供給者から市販されている。従って、例えば、上
記の反復配列またはそれらの部分を含むポリぺプチドは、この方法により合成さ
れ得る。同様に、他の天然の抗原またはそれらの改変体のエピトープは、自動合
成機を用いて調製され得る。
【００２９】 あるいは、本発明のポリペプチドは、培養した宿主細胞における、このポリペ
プチドをコードする組換えＤＮＡの発現により調製され得る。好ましくは、宿主
細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、昆虫細胞株（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａまた
はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）、またはＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＮＳ−１を含む
（が、これらに制限されない）哺乳動物細胞株である。この様式で発現されるＤ
ＮＡ配列は、天然に存在するタンパク質（例えば、配列番号１〜配列番号２２の
ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有する全長抗原）、天然に存在
するタンパク質の部分、またはこのようなタンパク質の改変体をコードし得る。
このようなＤＮＡ配列によってコードされる代表的なポリぺプチドは、配列番号
３７〜配列番号４６、配列番号５２、および配列番号６５において提供される。
【００３０】 本発明の発現されたポリペプチドは、一般に、実質的に純粋な形態で単離され
る。ポリペプチドは、好ましくは少なくとも８０重量％の純度まで、より好まし
くは少なくとも９５重量％の純度まで、そして最も好ましくは少なくとも９９重
量％の純度まで単離される。一般に、このような精製は、例えば、硫酸アンモニ
ウム分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィ
ーの標準的技術を用いて達成され得る。
【００３１】 本発明の別の局面では、個体および血液供給品のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出す
る方法が開示される。１つの実施態様において、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染は、抗体を
含む任意の生物学的試料中で検出され得る。好ましくは、試料は、血液、血清、
血漿、唾液、脳脊髄液、または尿である。より好ましくは、試料は、患者または
血液供給品から得た血液または血清試料である。簡単に述べれば、Ｔ．ｃｒｕｚ
ｉ感染は、上記の任意の１つ以上のポリペプチド、またはそれらの改変体を用い
て検出され得、試料中のポリぺプチドに対する抗体の存在または非存在が、予め
決定したカットオフ値と比較して決定され得る。
【００３２】 試料中の抗体を検出するために精製抗原を用いる当業者に公知の種々のアッセ
イフォーマットが存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。好ましい実施
態様において、このアッセイは、固体支持体上に固定化されたポリペプチドの使
用を含み、試料から抗体を結合し、そして取り除く。次いで、結合した抗体は、
抗体／ペプチド複合体に結合し、そして検出可能なレポーター基を含む検出試薬
を用いて検出され得る。適切な検出試薬は、抗体／ペプチド複合体およびレポー
ター基で標識された遊離のポリペプチドに結合する抗体を含む（例えば、半競合
アッセイにおいて）。あるいは、競合アッセイが利用され得、そこでは、ポリペ
プチドに結合する抗体がレポーター基で標識され、そして試料との抗原のインキ
ュベーションの後、固定化抗原に結合させる。試料の成分が、標識抗体のポリペ
プチドへの結合を阻害する程度は、試料と固定化ポリペプチドとの反応性の指標
である。
【００３３】 固体支持体は、抗原が結合し得る、当業者に公知の任意の固体材料であり得る
。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェル、またはニ
トロセルロース膜もしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、支持体は、ガラ
ス、ファイバーガラス、ラテックス、またはプラスチック材料（例えば、ポリス
チレンまたはポリビニルクロライド）のような、ビーズまたはディスクであり得
る。支持体はまた、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるよう
な、磁気粒子またはファイバー光学センサーであり得る。
【００３４】 ポリペプチドは、特許および科学的文献に詳細に記載されている、当業者に公
知の種々の技術を用いて固体支持体に結合され得る。本発明の文脈では、用語「
結合」は、吸着のような非共有結合的会合、および共有結合（これは、抗原と支
持体上の官能基との間の直接結合であってもよいし、または架橋剤による結合で
あってもよい）の両者をいう。マイクロタイタープレート中のウェルまたは膜へ
の吸着による結合が好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中のポリ
ペプチドを、適切な時間の間、固体支持体と接触させることにより達成され得る
。接触時間は、温度により異なるが、代表的には、約１時間と１日との間である
。一般に、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまた
はポリビニルクロライド）のウェルを、約１０ｎｇ〜約１μｇの範囲の量（そし
て、好ましくは約１００ｎｇ）のポリペプチドと接触させれば、適切な量の抗原
を結合するに十分である。ニトロセルロースは、１ｃｍ3あたり約１００μｇの タンパク質を結合する。
【００３５】 固体支持体へのポリペプチドの共有結合は、一般に、最初、支持体を、支持体
およびポリペプチド上のヒドロキシル基またはアミノ基のような官能基の両方と
反応する二官能性試薬と反応させることにより達成され得る。例えば、ポリペプ
チドは、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、ベンゾキノンを用いて
、または支持体上のアルデヒド基とポリペプチド上のアミンおよび活性水素との
縮合により結合され得る（例えば、ＰｉｅｒｃｅＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙＣａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９１）、Ａ１２−Ａ１３
を参照のこと）。
【００３６】 特定の実施態様では、このアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）である。このアッセイは、最初、通常はマイクロタイタープレートのウェル
である固体支持体上に固定化されたポリペプチド抗原を、試料と、試料内のポリ
ペプチドに対する抗体が、固定化ポリペプチドに結合することが可能であるよう
に、接触させることにより実施され得る。次いで、非結合試料を、固定化ポリペ
プチドから除去し、そして固定化抗体−ポリペプチド複合体に結合し得る検出試
薬が添加される。次いで、固体支持体に結合したままの検出試薬の量を、特定の
検出試薬に適切な方法を用いて測定する。
【００３７】 一旦、ポリペプチドが支持体上に固定化されれば、残存する支持体上のタンパ
ク質結合部位は、代表的には、ブロックされる。任意の適切なブロッキング剤が
当業者に公知であり、例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ ２０TM（
ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）がある。次いで
、固定化ポリペプチドを、試料とインキュベートし、そして（試料中に存在すれ
ば）抗体を抗原に結合させる。試料は、インキュベーションの前に、リン酸緩衝
化生理食塩水（ＰＢＳ）のような適切な希釈剤で希釈され得る。一般に、適切な
接触時間（すなわちインキュベーション時間）は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染試料内の
Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体の存在を検出するのを可能にするに十分である時間である。
好ましくは、接触時間は、結合抗体と非結合抗体との間の平衡で達成される結合
レベルの少なくとも９５％である結合レベルを達成するに十分である。当業者は
、平衡を達成するために必要な時間は、経時的に生じる結合のレベルをアッセイ
することにより容易に決定され得ることを認識する。室温では、約３０分間のイ
ンキュベーション時間が一般に十分である。
【００３８】 次いで、非結合試料は、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０TMを含むＰＢＳのような
適切な緩衝液で固体支持体を洗浄することにより除去され得る。次いで、検出試
薬を固体支持体に添加し得る。適切な検出試薬は、固定化抗体−ポリペプチド複
合体に結合し、しかも当業者に公知の任意の種々の手段により検出され得る、任
意の化合物である。好ましくは、検出試薬は、レポーター基に結合した結合因子
（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン、レクチンまたは遊離
の抗原など）を含む。好適なレポーター基は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ）、基質、コファクター、インヒビター、染料、放射性核種、発光基
、蛍光基、およびビオチンを含む。結合因子のレポーター基への結合は、当業者
に公知の標準的な方法を用いて達成され得る。通常の結合因子はまた、多くの供
給元（例えば、ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ
ｃｏ，ＣＡおよびＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から、種々のレポー
ター基に結合して購買し得る。
【００３９】 次いで、検出試薬を、固定化抗体−ポリペプチド複合体と、結合抗体を検出す
るに十分な時間インキュベートする。適切な時間は、一般に、製造者の指示から
、または経時的に生じる結合のレベルをアッセイすることにより決定され得る。
次いで、非結合検出試薬を除去し、そして結合検出試薬をレポーター基を用いて
検出する。レポーター基を検出するために用いる方法は、レポーター基の性質に
依存する。放射活性基については、シンチレーションカウンティングまたはオー
トラジオグラフ法が一般に適切である。分光学的方法を用いて、染料、発光基、
および蛍光基を検出し得る。ビオチンは、異なるレポーター基（通常、放射活性
または蛍光基または酵素）に結合したアビジンを用いて検出され得る。酵素レポ
ーター基は、一般に、基質を添加し（一般に特定の時間で）、その後反応生成物
の分光学的分析またはその他の分析により検出され得る。
【００４０】 試料中のＴ．ｃｒｕｚｉ抗体の存在または非存在を決定するために、固体支持
体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルを、一般には、予め決
定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較する。好ましくは、このカット
オフ値は、固定化抗原を、非感染患者からの試料とインキュベートしたときに得
られる平均の平均シグナル（ａｖｅｒａｇｅ ｍｅａｎ ｓｉｇｎａｌ）である
。一般に、平均値を３標準偏差超えるシグナルを生成する試料を、Ｔ．ｃｒｕｚ
ｉ抗体およびＴ．ｃｒｕｚｉ感染について陽性であると考える。代わりの好まし
い実施態様では、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐ
ｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０６〜７頁（Ｌｉｔｔｌｅ ＢｒｏｗｎおよびＣ
ｏ．，１９８５）の方法に従って、レシーバーオペレーター曲線（Ｒｅｃｅｉｖ
ｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃｕｒｖｅ）を用いて決定される。簡単に述べれば、
本実施態様では、カットオフ値は、診断試験の結果についての各々の可能なカッ
トオフ値に対応する、真陽性の割合（すなわち、感度）および偽陽性の割合（１
００％特異性）の対のプロットから決定され得る。上方左手の隅に最も近いプロ
ット上のカットオフ値（すなわち、最大面積を包囲する値）が、最も正確なカッ
トオフ値であり、そして本方法により決定されたカットオフ値より高いシグナル
を生成する試料は、陽性であると考えられ得る。あるいは、カットオフ値は、プ
ロットに沿って左側にシフトされ、偽陽性の割合を最小化し得るか、または右側
にシフトされて偽陰性の割合を最小化し得る。一般に、本方法により決定された
カットオフ値よりも高いシグナルを生成する試料は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染につい
て陽性と考えられる。
【００４１】 関連する実施態様では、アッセイは、フロースルーまたは細片試験フォーマッ
トで実施され、そこでは、抗原は、ニトロセルロースのような膜上に固定化され
る。フロースルー試験では、試料内の抗体は、試料が膜を通過するにつれて固定
化ポリペプチドに結合する。次いで、検出試薬（例えば、プロテインＡ−コロイ
ド金）が、検出試薬を含む溶液が膜を通過して流れるにつれ、抗体−ポリペプチ
ド複合体に結合する。次いで、結合した検出試薬の検出を上記のように実施し得
る。細片試験フォーマットでは、ポリペプチドが結合する膜の一端を、試料を含
む溶液中に浸漬する。試料は、膜に沿って検出試薬を含む領域を通って固定化ポ
リペプチドの領域まで移動する。ポリペプチドにおける検出試薬の濃度は、試料
中のＴ．ｃｒｕｚｉ抗体の存在を示す。このような試験は、代表的には、極少量
（例えば一滴）の患者血清または血液を用いて実施され得る。
【００４２】 上記のアッセイは、本明細書中に記載される１つ以上のポリぺプチドを用いて
実施され得る。あるいは、感度は、１つ以上のさらなるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエ
ピトープを、上記のポリぺプチド（単数または複数）との組合せで用いることに
よって改善され得る。特に、ＴｃＤのエピトープ（例えば、米国特許第５，３０
４，３７１号において開示される）、ＰＥＰ−２および／またはＴｃＥ（これら
の両方が、例えば、１９９５年３月１４日に出願された米国特許出願第０８／４
０３，３７９号に開示される）は、上記のポリぺプチド（単数または複数）と共
に使用され得る。ＰＥＰ−２抗原性エピトープはまた、Ｐｅｒａｌｔａら，Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：９７１−７４，１９９４において議論さ
れる。ＴｃＤの配列は、配列番号５０において提供される。ＴｃＥの配列は、配
列番号５１において提供される。ＴｃＤ抗原性エピトープは、好ましくは、アミ
ノ酸配列Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（配列番号５３）ま
たはアミノ酸配列Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ（配列番号
５４）を有する。ＴｃＥエピトープは、好ましくは、アミノ酸配列Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌ
ａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒ
ｏ Ａｌａ（配列番号５５）またはアミノ酸配列Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌ
ａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒ
ｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ（配列
番号５６）を有し、そしてＰＥＰ２エピトープは、好ましくは、アミノ酸配列Ｇ
ｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａ
ｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ（配列番号５７）を有する。
【００４３】 さらなるエピトープは、同一のポリぺプチド内に（すなわち、組み合せポリぺ
プチド内に）存在し得るか、または別々のポリぺプチドに含まれ得る。組み合せ
ポリペプチドは、以下の実施例２に記載されるように合成的に調製され得るか、
または以下の実施例７に記載のように組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る
。好ましくは、ポリぺプチドは、上記のようにマイクロタイタープレートのウェ
ルまたは膜のような固体支持体上への吸着によって固定化され、その結果、ほぼ
同様の量の各ポリぺプチドが、支持体と接触し、そしてその結果、支持体と接触
しているポリぺプチドの総量が、約１ｎｇ〜約１０μｇの範囲にある。残りの工
程は、一般に上記のように実施され得る。
【００４４】 上記のポリぺプチドはまた、ＴｃＤ、ＴｃＥおよび／またはＰＥＰ２由来の一
つ以上のエピトープを用いる診断の後に用いられ得る。本実施態様では、本発明
のポリぺプチドは、ＴｃＤ、ＴｃＥ、および／またはＰＥＰ２でのスクリーニン
グに基づいて、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の診断を確認するために用いられる。ＴｃＤ
、ＴｃＥ、および／またはＰＥＰ２由来のエピトープを用いるＴ．ｃｒｕｚｉ感
染の診断は、１９９５年３月１４日に出願された米国特許出願第０８／４０３，
３７９号に記載されている。
【００４５】 本発明のなお別の局面では、上記のように、１つ以上のエピトープに対する単
一特異性抗体（これはポリクローナルまたはモノクローナルであり得る）を用い
て、生物学的試料中のＴ．ｃｒｕｚｉを検出するための方法が提供される。精製
または合成ポリペプチドに対する抗体は、当業者に公知の種々の任意の技術によ
り調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。このような技術の１つ
では、抗原性ポリペプチドを含む免疫原を、最初、広範な種々の哺乳動物（例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびヤギ）のいずれかに注入する。こ
の工程では、本発明のポリペプチドを、改変なしで免疫原として供し得る。ある
いは、比較的短いポリペプチドでは特に、ポリペプチドが、ウシ血清アルブミン
またはキーホールリンペットヘモシアニンのようなキャリアタンパク質に結合さ
れる場合、優れた免疫応答が惹起され得る。免疫原は、動物宿主中に、好ましく
は、１つ以上の追加免疫を取り入れた予め決定されたスケジュールに従って注入
され、そして動物から定期的に採血する。次いで、ポリペプチドに特異的なポリ
クローナル抗体が、例えば、適切な固体支持体に結合したポリペプチドを用いる
アフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る
。
【００４６】 目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈ
ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５
１９，１９７６の技術、およびそれに対する改良を用いて調製され得る。簡単に
述べれば、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの
反応性）を有する抗体を生成し得る不死化細胞株の調製を含む。このような細胞
株は、例えば、上記のように免疫化された動物から得た脾臓細胞から生成され得
る。次いで、脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー（好ましくは
、免疫化された動物と同系であるパートナー）との融合により不死化される。種
々の融合技術が用いられ得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、非イ
オン性界面活性剤を用いて数分間結合され得、次いで、ハイブリッド細胞の増殖
は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地上に低密度でプレート
され得る。好適な選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジン）選択を用いる。十分な時間の後（通常約１〜２週間）、ハイブリッドのコ
ロニーが観察される。単一のコロニーを選択し、そしてポリペプチドに対する結
合活性を試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい
。
【００４７】 モノクローナル抗体は、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離
され得る。さらに、種々の技術（例えば、マウスのような適切な脊椎動物宿主の
腹膜腔中へのハイブリドーマ細胞株の注入）を用いて、収率を増大させ得る。次
いで、モノクローナル抗体を腹水液または血液から回収し得る。混入物は、クロ
マトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出のような従来技術により、抗体か
ら除去され得る。
【００４８】 本明細書中に記載の１つ以上のポリペプチドのエピトープに対する単一特異性
抗体を使用して、直接的または競合的であり得る、任意の種々の免疫アッセイを
用いて、生物学的試料のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出し得る。本発明のこの局面に
おける使用に適切な生物学的試料は、上記の通りである。簡単に述べれば、１つ
の直接アッセイフォーマットでは、単一特異性抗体は、（上記のような）固体支
持体上に固定化され、そして試験される試料と接触され得る。非結合試料を除去
した後、レポーター基で標識された第２の単一特異性抗体を添加し、そして結合
抗原を検出するために用い得る。例示的な競合アッセイでは、試料は、適切なレ
ポーター基で標識されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体と組み合わさ
れ得る。次いで、試料と抗体との混合物は、適切な固体支持体上に固定化された
ポリペプチド抗原と組み合わされ得る。試料中の抗原に結合しなかった抗体を固
定化抗原に結合させ、そして残りの試料および抗体を除去する。固体支持体に結
合した抗体のレベルは、試料中の抗原レベルと逆に相関する。従って、固体支持
体に結合した抗体のより低いレベルは、試料中のＴ．ｃｒｕｚｉの存在を示す。
Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合し
たままのレポーター基から検出されるシグナルは、一般的に、予め決定されたカ
ットオフ値に対応するシグナルと比較される。このようなカットオフ値は、一般
的に上記のように決定され得る。ＥＬＩＳＡの状況において上記で論議した任意
のレポーター基を用いて、単一特異性抗体を標識し得、そして結合は用いたレポ
ーター基に適切である任意の種々の技術により検出され得る。試料中のＴ．ｃｒ
ｕｚｉを検出するために単一特異性抗体を用いる他のフォーマットは、当業者に
明らかであり、そして上記のフォーマットは例示目的にのみ提供される。
【００４９】 本発明の別の局面では、ワクチンおよび薬学的組成物が、哺乳動物におけるＴ
．ｃｒｕｚｉ感染およびその合併症の予防のために提供される。薬学的組成物は
、一般に、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の１つ以上のエピトープを含む１つ以上の
ポリペプチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む。ワクチンは、１つ
以上の上記ポリペプチドおよび免疫応答の増大のためのアジュバントを含む。
【００５０】 投与の経路および頻度ならびにポリペプチド用量は、個体により変化し、そし
て他の原生動物感染に対する免疫で現在用いられているそれらに準じ得る。一般
に、薬学的組成物およびワクチンは、注入（例えば、筋肉内、静脈内、または皮
下）、鼻腔内（例えば吸入による）または経口により投与され得る。１〜４用量
が２〜６週間の間に投与され得る。好ましくは、２用量は、第２回目の用量が第
１回目より２〜４週間後で投与される。適切な用量は、ある期間の間、Ｔ．ｃｒ
ｕｚｉ感染から哺乳動物を保護するに十分である、処置動物で抗体を惹起するた
めに有効であるポリペプチドの量である。一般に、１用量に存在するポリペプチ
ドの量は、宿主１ｋｇあたり約１ｐｇ〜約１００ｍｇ、代表的には、約１０ｐｇ
〜約１ｍｇ、そして好ましくは、約１００ｐｇ〜約１μｇの範囲である。適切な
用量サイズは、動物のサイズとともに変化するが、代表的には、１０〜６０ｋｇ
の動物について、約０．０１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【００５１】 当業者に公知の任意の適切なキャリアが本発明の薬学的組成物に用いられ得る
が、キャリアのタイプは、投与様式に依存して変化する。皮下注射のような非経
口投与では、好ましくは、キャリアは、水、生理食塩水、アルコール、脂質、ワ
ックス、または緩衝液を含む。経口投与では、上記のキャリアまたは固体キャリ
ア（例えば、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム
、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、お
よび炭酸マグネシウム）のいずれかが用いられ得る。生分解性のマイクロスフェ
ア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）もまた、本発明の薬学的組成物用のキャリア
として用いられ得る。
【００５２】 種々のアジュバントのいずれかを本発明のワクチンで使用して、免疫応答を非
特異的に増強し得る。大部分のアジュバントは、急速な異化作用から抗原を保護
するために設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油、およびリ
ピドＡ、Ｂｏｒｄｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのような免疫応答の非特異的刺激剤）を含む。
このようなアジュバントは、例えば、フロイントの不完全アジュバントおよび完
全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍ
Ｉ）ならびにＭｅｒｃｋ Ａｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）として市販されている。
【００５３】 以下の実施例は、限定のためではなく、例示のために提供される。
【００５４】 （実施例） （実施例１） （Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原をコードするＤＮＡの調製） 本実施例は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原をコードするゲノムＤＮＡ分子およびｃＤＮ
Ａ分子の調製を説明する。
【００５５】 （Ａ．ゲノムクローンの調製） ゲノム発現ライブラリーを、ラムダＺＡＰ発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を製造者の指示に従って用いて、ランダムに剪断したＴ
．ｃｒｕｚｉゲノムＤＮＡ（Ｔｕｌａｈｕｅｎ Ｃ２株）から構築した。１つの
スクリーニングにおいて、ライブラリーを、寄生生物溶解産物、ならびに／また
は米国特許第５，３０４，３７１号および１９９５年３月１４日に出願された米
国特許出願第０８／４０３，３７９号に記載されるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原ＴｃＤお
よびＴｃＥの一方もしくは両方と高い反応性を示す５人の患者由来の血清プール
を用いてスクリーニングした。５人の患者の血清のそれぞれを、ウェスタンおよ
びＥＬＩＳＡアッセイに基づいて、全溶解産物および／またはＴｃＤもしくはＴ
ｃＥと反応性であると決定した。抗Ｅ．ｃｏｌｉ反応性を、スクリーニングの前
に、吸着により血清から除去した。５０，０００ｐｆｕの非増幅ライブラリーを
、血清プールを用いてスクリーニングし、そしてこの血清と反応するタンパク質
を発現するプラークを、プロテインＡ−西洋ワサビペルオキシダーゼを（ＡＢＴ
Ｓ基質とともに）用いて検出した。次いで、その後のスクリーニングを、組換え
体ＴｃＤを用いるウェスタンおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出可能な抗Ｔ
ｃＤ抗体を欠く３人の患者由来の血清プールを用いて行なった。
【００５６】 同様のスクリーニングを、溶解産物、ＴｃＤ、およびＴｃＥと低い反応性を示
す（すなわち、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンアッセイにおいてバックグラウンド
反応性を３標準偏差超えないシグナルを検出した）血清プールを用いて行ない、
続いて上記のように検出可能な抗ＴｃＤ抗体を欠く患者血清を用いてその後のス
クリーニングを行なった。
【００５７】 次いで、上記のスクリーニングの少なくとも１つにおいて両方の血清プールと
反応するタンパク質を発現した２８クローンを単離した。ｐＢＳＫ（−）ファー
ジミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の切り出
しを、製造者のプロトコルに従って実施した。重複するクローンを、エキソヌク
レアーゼＩＩＩ消化により作製し、そして１本鎖テンプレートを、ＶＣＳＭ １
３ヘルパーファージを用いる感染の後に単離した。ＤＮＡを、ジデオキシチェー
ンターミネーション法またはＴａｑジ−ターミネーター系により、Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ自動配列決定機３７３Ａ型を用いて配列決定した。
【００５８】 ２８クローンのうち、５個は以前に報告されており、２個は同一であり、そし
て８個は縮重４２塩基対反復により示される同一のペプチド配列を含んでいた。
配列番号１６は、４２塩基対の反復配列を含むプロトタイプクローンを示す。従
って、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原をコードする、１４個の新規のＤＮＡ配列を、反応性
の血清プールで上記のスクリーニングを用いて調製した（配列番号１から配列番
号１６に示す、ここで、配列番号４および配列番号５は、それぞれ、単一クロー
ンの５’末端および３’末端を示し、配列番号９および配列番号１０は、それぞ
れ、単一クローンの５’末端および３’末端を示す）。１つの新規配列は、低い
反応性を有する血清を用いるスクリーニングで得られた（配列番号１７（５’末
端）および配列番号１８（３’末端）に示す））。
【００５９】 （Ｂ．ｃＤＮＡクローンの調製） ポリＡ＋ＲＮＡを、細胞内無鞭毛型期のＴ．ｃｒｕｚｉ（Ｔｕｌａｈｕｅｎ
Ｃ２株）から精製した。ＲＮＡを逆転写し、そして製造者の指示に従ってラムダ
ＵｎｉＺａｐ発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
中の一方向性ｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築に用いた。５０，０００ｐｆｕの
非増幅ライブラリーを、高いおよび低い血清学的反応性の両方を示す患者血清を
含む血清プールを用いてスクリーニングし、その後、上記のように、検出可能な
抗ＴｃＤ抗体を欠く患者血清を用いて引き続くスクリーニングを行なった。計３
２個のクローンをこのスクリーニングにより単離した。これらのクローンのうち
の２５個は、高度に免疫原性であると以前に同定された、翻訳装置のタンパク質
であり、そしていずれも、ゲノム発現ライブラリーをスクリーニングすることに
より同定されたクローンとは異なっていた。残りの７個は、配列番号１９〜配列
番号２２に提供される配列により示される。配列番号２２に記載の配列は、Ｔ．
ｃｒｕｚｉユビキチンの配列である。
【００６０】 （実施例２） （合成ポリペプチドの合成） 本実施例は、本明細書中に記載のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に由来する配列を有する
ポリペプチドの合成を説明する。
【００６１】 ポリペプチドは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ９０５０ペプチド合成機で、ＨＢＴＵ
（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキ
サフルオロホスフェート（Ｏ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ
’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ）活性化を用いるＦＭＯＣ化学を用いて合成され得る。ｇｌｙ−ｃｙｓ−
ｇｌｙ配列を、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に結合して、ペプ
チドの結合または標識方法を提供し得る。固体支持体からのペプチドの切断は、
以下の切断混合物を用いて実施され得る：トリフルオロ酢酸：エタンジオール：
チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間の切断後、
ペプチドを、冷メチル−ｔ−ブチル−エーテル中で沈降させ得る。次いで、ペプ
チドペレットを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有水中に溶解させ、そ
してＣ１８逆相ＨＰＬＣによる精製の前に凍結乾燥し得る。水（０．１％ＴＦＡ
含有）中の０％〜６０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の勾配を用いて
、ペプチドを溶出し得る。純粋な画分の凍結乾燥の後、エレクトロスプレー質量
分析法を用いて、およびアミノ酸分析によりペプチドを特徴付けする。
【００６２】 この手順を用いて、以下の配列を有するペプチド（例えば、Ｔｃｃ２２−１、
Ｔｃｃ２２−１＋、Ｔｃｃ２２−２．１（配列番号４１に含まれる）、ＴｃＬｏ
１．１、１．２および１．３（配列番号３４、３５、および３６に含まれる）、
ならびにＴｃＨｉ１０．１および１０．３（配列番号２６および２７））を合成
した：
【００６３】
【化１】 （実施例３） （Ｔ．ｃｒｕｚｉ組換え抗原の血清学的反応性） 本実施例は、血清学的に活性であることが見出された、いくつかの組換え抗原
の診断的特性を説明する。これは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性および陰性血清との反応
性の研究、ならびに他の疾患の患者からの血清との交差反応性の研究を含む。
【００６４】 アッセイを、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｅａｓｉｗａｓｈ Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において実施した。ウェルを、５０μｌの炭酸
コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中でコートした。Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解産物に
ついては１００ｎｇ／ウェルを用い、そして各組換え抗原については、２００ｎ
ｇ／ウェルを用いた。ウェルを、４℃にて一晩（または３７℃にて２時間）コー
トした。次いで、プレートの中身を除去し、そしてウェルを２００μｌのＰＢＳ
／１％ＢＳＡで２時間ブロックした。ブロッキング工程の後、ウェルをＰＢＳ／
０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０TMで５回洗浄した。次いで、ＰＢＳ／０．１％ Ｔ
ｗｅｅｎ ２０／０．１％ＢＳＡ中に１：５０で希釈した５０μｌの血清（Ｔ．
ｃｒｕｚｉ感染について陽性または陰性のいずれか）を、各ウェルに添加し、そ
して室温にて３０分間インキュベートした。次いで、プレートを再度ＰＢＳ／０
．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０TMで５回洗浄した。
【００６５】 次いで、酵素結合体（西洋ワサビペルオキシダーゼ−プロテインＡ，Ｚｙｍｅ
ｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ
２０TM／０．１％ＢＳＡ中に１：２０，０００で希釈し、そして５０μｌの希釈
結合体を各ウェルに添加し、そして室温にて３０分間インキュベートした。イン
キュベーションの後、ウェルを再度ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０TMで５
回洗浄した。１００μｌのペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジン（Ｋｉ
ｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を希釈せずに、各ウェルに添加し、そして１５分間イ
ンキュベートした。反応を、１００μｌの１Ｎ Ｈ2ＳＯ4を各ウェルに添加する
ことにより停止し、そしてプレートを４５０ｎｍで読みとった。
【００６６】 図１は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解産物の反応性と比較した、組換えｒＴｃｃ６（配
列番号３９）の反応性を示す。陰性の平均＋３標準偏差のカットオフに基づいて
、５０個の血清試料のうち４９個が溶解産物に陽性であり、そして５０個のうち
３４個がｒＴｃｃ６について陽性であった。同様の研究（図２に示す）において
、組換えｒＴｃｃ２２（配列番号４１）は、７９．２％（４８個の血清試料のう
ち３８個が陽性）の感度を有することが見出された。同様の基準を用いるＴ．ｃ
ｒｕｚｉ溶解産物を用いる組換えｒＴｃｃ３８（配列番号３８）の比較研究は、
溶解産物についての３９／３９と比較して、２４／３９が陽性であることを示し
た（図３）。Ｔｃｃ３８は、潜在的に交差反応する血清で試験した場合、Ｔ．ｃ
ｒｕｚｉ溶解産物を上回る、改善された特異性を示した。
【００６７】 組換えＴｃＨｉ１２（配列番号３７）はまた、６２．５％（１５／２４）の感
度を有して免疫反応性であることが見出された（図２）。
【００６８】 （実施例４） （Ｔ．ｃｒｕｚｉ合成ペプチド抗原の血清学的反応性） 本実施例は、実施例２に記載のいくつかのペプチドの診断学的特性を説明する
。これらのペプチドを、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性および陰性血清との反応性について
、そしていくつかの場合には、他の潜在的に交差反応性の疾患の患者由来の血清
との交差反応性について試験した。
【００６９】 第１の群のペプチドは、最も反応性な反復配列を決定するために異なるリーデ
ィングフレームを含んでいた。試験したペプチドは、配列番号１８に提供される
ＤＮＡ配列のリーディングフレーム１、２、および３を表す、ＴｃＬｏ１．１（
配列番号３４に含まれる）、ＴｃＬｏ１．２（配列番号３５に含まれる）、およ
びＴｃＬｏ１．３（配列番号３６に含まれる）、ならびにＴｃＨｉ１０配列（配
列番号５に示される）についての２つのリーディングフレームを示す、ＴｃＨｉ
１０．１（配列番号２６）およびＴｃＨｉ１０．３（配列番号２７）であった。
データを図４に示す。ＴｃＬｏフレームの場合、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性および陰性
個体由来の血清に関して試験した場合、ＴｃＬｏ１．１および１．２ペプチドは
両方とも強く反応したが、ＴｃＬｏ１．２はノイズに対してシグナルが優れてい
た。ＴｃＬｏ１．３は、より低いシグナルを有したが、バックグラウンドもまた
低かった。この研究において、溶解産物は、２４／２４陽性を検出し、ＴｃＬｏ
１．１は２１／２４を検出し、ＴｃＬｏ１．２は２３／２４を検出し、そしてＴ
ｃＬｏ１．３は１５／２４を検出した。同じ研究において、２つのフレームＴｃ
Ｈｉ１０．１および１０．３は、それぞれ、１９／２４および１４／２４陽性を
検出したが、ＴｃＬｏ１についてよりもシグナルは低かった。これらの異なるリ
ーディングフレームについての交差反応性研究は、ＴｃＬｏ１．２が、Ｔ．ｃｒ
ｕｚｉ溶解産物と比較して、試験した血清との最小の交差反応性を有することを
実証する（図５）。
【００７０】 実施例２において議論するように、ｒＴｃｃ２２についての重複ペプチドをま
た合成して、活性なエピトープを決定した。ペプチドＴｃｃ２２−１、１＋、お
よび２を、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性および陰性血清を用いて試験した。結果を図２に
示す。Ｔｃｃ２２−１＋およびＴｃｃ２２−２．１ペプチドは、Ｔｃｃ２２−１
ペプチドよりも反応性であった。第１の実験において、Ｔｃｃ２２−１およびＴ
ｃｃ２２−１＋は、３８／４８陽性を検出した組換え体Ｔｃｃ２２と比較して、
２９／４８および３６／４８陽性を検出した。その後の実験において、Ｔｃｃ２
２−２．１はまた、反応性であるが、同じプレートコーティングレベルでＴｃｃ
２２−１＋よりもシグナルが少ないことが示された。
【００７１】 ＴｃＨｉｌ５フレーム３反復配列（配列番号４９）を有するポリペプチドをま
た、合成し、そしてＥＬＩＳＡアッセイにおいて２００ｎｇ／ウェルのコーティ
ングレベルを用いて試験した。計４８個のＴ．ｃｒｕｚｉ陽性血清および２６個
の陰性血清を、このペプチド配列の反応性を決定するために試験した。この研究
において、ペプチドは、６８．７５％（４８個の陽性のうち３３個を検出）の感
度および９２．３％（３６個の陰性のうち２４個）の特異性を有した。このこと
は、このポリペプチドが、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の検出における潜在的な重要性を
有することを示す。このアッセイの結果を以下の表１に示す。
【００７２】
【表１】 （実施例５） （ペプチドの組合せの血清学的反応性） 本実施例は、いくつかのペプチドの組合せの診断的特性を説明する。
【００７３】 ＴｃＬｏ１．２ペプチド（配列番号３５に含まれる）を、合成ペプチドＴｃＤ
、ならびにまた、二重エピトープペプチドＤ／２（これは、ＴｃＤおよびＰＥＰ
−２配列を含む）およびＤ／Ｅ（これは、ＴｃＤおよびＴｃＥ配列を含む）と組
み合わせて試験した。これらの組合せを、個々のペプチドならびにトリペプチド
２／Ｄ／Ｅ（これはＴｃＤ、ＴｃＥ、およびＰＥＰ−２を含む）と比較した。使
用したＴｃＤ配列は、Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（配列
番号５３）であり、ＴｃＥ配列は、Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ（配列番号５５）で
あり、そしてＰＥＰ２配列は、Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒ
ｏ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙ
ｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ（配列番号５７
）であった。
【００７４】 データを図６に示す。結果は、表２においてまとめたように、ＴｃＬｏ１．２
が、ＴｃＤ、Ｄ／２、およびＤ／Ｅの反応性を増大させ得ることを示す。
【００７５】
【表２】 これらの結果は、本明細書中に記載されるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の使用が、他の
抗原の血清診断特性を増強し得ることを実証する。
【００７６】 （実施例６） （ＴｃＥ反復配列の血清学的反応性） 本実施例は、いくつかのＴｃＥ反復配列の診断的特性を説明する。
【００７７】 組換え体ＴｃＥの反復配列領域は、Ａ（アラニン）、Ｔ（トレオニン）、また
はＩ（イソロイシン）が反復配列中に存在し得る残基をもたらす、いくつかの縮
重を含む。すべての縮重を示すために、合成ＴｃＥペプチドについての元の配列
を、３つの反復を含む単一のペプチドにおいて、Ａ、Ｔ、およびＩで作製した（
実施例５を参照のこと）。反復領域をさらにエピトープマッピングするため、お
よび血清学的活性に必要とされる反復数を決定するために、以下のペプチドを実
施例２に記載のように調製した：
【００７８】
【化２】 次いで、これらのペプチドの血清学的反応性を比較した。計２４個の陽性およ
び２１個の陰性の血清を、実施例３に記載のように実施したＥＬＩＳＡアッセイ
における固相としてＴｃＥ改変体のそれぞれを用いて２５ｎｇ／ウェルのペプチ
ドを用いて試験した。異なるペプチドの反応性を、図７に示す。最大の反応性は
、それぞれの反復が縮重残基にＡを含んだ３回反復ペプチド（ＴｃＥ（３Ａ））
で観察された。このペプチドは、３回反復においてＡ、Ｔ、およびＩ残基を含む
元のＴｃＥ配列よりもさらに高い反応性を示した。対照的に、３Ｉおよび３Ｔ改
変体は、試験したＴ．ｃｒｕｚｉ陽性サンプルで本質的に陰性であった。２回反
復にＡを含む配列（ＴｃＥ（２Ａ））は、３Ａ配列よりも明らかに反応性が小さ
く、そしてＡおよびＴを有する２回反復配列（ＴｃＥ（ＡＴ））は陰性であった
。陰性の平均＋３標準偏差のカットオフに基づいて、元のＴｃＥ（Ａ，Ｔ，Ｉ）
は、２４個のポジティブのうち１７個を検出し、そして３Ａ改変体は、２４個の
ポジティブのうち１９個を検出した。最大の血清学的活性を得るためには、少な
くとも３回反復が必要であるようでもある。
【００７９】 （実施例７） （複数エピトープペプチドの組合せの血清学的反応性） 本実施例は、いくつかの複数エピトープペプチドの組合せの診断的特性を説明
する。
【００８０】 ２つのジペプチドＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ１．２（これは、ＰＥＰ−２（配列番
号５７）およびＴｃＬｏ１．２（配列番号３５）配列を含む）、ならびにＴｃＤ
／ＴｃＥ（これは、ＴｃＤ（配列番号５３）およびＴｃＥ（配列番号５５）配列
を含む）を、上記の実施例２に記載のように合成した。これらの２つのジペプチ
ドとＴ．ｃｒｕｚｉ抗体陽性血清との反応性を、トリペプチド２／Ｄ／Ｅの反応
性と比較した。ＥＬＩＳＡを、実施例３に記載のように、ＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ
１．２を２５０ｎｇ／ウェルで用い、そしてＴｃＤ／ＴｃＥを５０ｎｇ／ウェル
で用いて実施した。この研究の結果を図８に示す。トリペプチド２／Ｄ／Ｅと反
応しないことが見出された１つのＴ．ｃｒｕｚｉ陽性血清を、ＴｃＬｏ１．２エ
ピトープのスクリーニングに用いた。この血清は、予想されたように、ＴｃＬｏ
１．２エピトープにより、そしてまたジペプチド混合物（ＴｃＤ／ＴｃＥと一緒
のＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ１．２）により検出された。
【００８１】 線状配列中に４つの免疫反応性Ｔ．ｃｒｕｚｉエピトープ（ＰＥＰ−２、Ｔｃ
Ｄ、ＴｃＥ、およびＴｃＬｏ１．２）を含有するテトラペプチド（本明細書中で
は、以下２／Ｌｏ／２Ｅ／Ｄ（配列番号６３）という）を、実施例２に記載のよ
うに合成した。このテトラペプチドを、１００ｎｇ／ウェルでコートし、そして
Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性および陰性血清とのその反応性を実施例３に記載のようにア
ッセイした。テトラペプチド２／Ｌｏ／２Ｅ／Ｄの反応性を、図８に示す。トリ
ペプチド２／Ｄ／Ｅと反応しないことが見出された１つのＴ．ｃｒｕｚｉ陽性血
清は、予想されたようにテトラペプチドにより検出された。
【００８２】 ４つの免疫反応性Ｔ．ｃｒｕｚｉエピトープ（ＰＥＰ−２、ＴｃＤ、ＴｃＥ、
およびＴｃＬｏ１．２）はまた、リジンコア残基から始まる「分枝」ペプチドの
使用により１つの試薬に連結され得る。例えば、α−アミノ基上の９−フルオレ
ニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびεーアミノ基上の１−（４，４−ジ
メチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）を用
いるリジンの直交保護を使用して、その他のアミノ基の存在下における１つのア
ミノ基の選択的脱保護を行い、その結果リジン上のα−基またはε−基のいずれ
かから第１のペプチド鎖を合成させた。この第１のペプチド鎖は、第２のペプチ
ド鎖の合成の過程の間に除去されない保護基で終結する。例えば、ｔｅｒｔ−ブ
トキシカルボニル（Ｂｏｃ）アミノ酸は、ＤｄｅおよびＦｍｏｃの組合せととも
に用いられ得た。次いで、残りのリジンアミノ保護基は、第２のアミノ酸鎖が第
２のアミノ部分から合成される前に除去される。例えば、ε−Ｄｄｅは、２０％
ヒドラジンを用いて除去される。固相支持体からの分枝ペプチドの切断、および
Ｎ−α−Ｂｏｃ部分の除去は、標準的なプロトコルに従って、トリフルオロ酢酸
を用いて実施される。このアプローチを用いて、２つの独立したアミノ酸配列を
、以下に示すように、「コア」リジン残基から構築して、その結果ＴｃＤ、Ｔｃ
Ｅ、ＰＥＰ２、ＴｃＬｏ１．２、および他のエピトープの種々の組合せをコア残
基にカップリングし得る。得られるペプチドの精製を、実施例２に記載のように
実施する。
【００８３】
【化３】 （実施例８） （組換えＤＮＡ技術を使用する複数エピトープペプチドの組合せの調製） 本実施例は、組換えＤＮＡ技術を使用する、ペプチドＰＥＰ−２（配列番号５
７）、ＴｃＤ（配列番号５３）、ＴｃＥ（配列番号５５）、およびＴｃＬｏ１．
２（配列番号３５）の融合ポリペプチド（本明細書以後、ＴｃＦとよぶ）の調製
を説明する。
【００８４】 ＴｃＦポリペプチド融合物を、重複リン酸化オリゴヌクレオチドを合成し、マ
ッチしたオリゴヌクレオチド対をアニールさせて二本鎖ＤＮＡを作製し、アニー
ルした対を適切な酵素で切断したベクターＤＮＡとライゲーションし、そして配
列決定に適切な細菌宿主株（ＸＬ２、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ
、ＣＡ）へ形質転換することにより、作製した。一旦、正確な配列を得ると、そ
の構築物を改変ｐＥＴ２８ベクターへサブクローニングし、そして発現および精
製のためにＢＬＲ ｐＬＹＳ Ｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）へ
形質転換した。
【００８５】 ＰＥＰ２−ＴｃＤ融合物の構築のために、オリゴヌクレオチドＰＤＭ−９５（
配列番号６６）およびＰＤＭ−９８（配列番号６７）；ＰＤＭ−９６（配列番号
６８）およびＰＤＭ９９（配列番号６９）；ならびにＰＤＭ−９７（配列番号７
０）およびＰＤＭ−１００（配列番号７１）のマッチした対を合成し、キナーゼ
処理し、アニールさせた。次いで、これら３対のアニールしたオリゴを、ライゲ
ーションし、ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ、ＭＡ）で消化し、そして改変Ｔベクター構築物へＥｃｏ７２１およびＥ
ｃｏＲＩを用いてクローニングした。ＰＥＰ２−ＴｃＤ−ＴｃＥ融合物の構築の
ために、以下のオリゴヌクレオチドのマッチした対を、合成し、キナーゼ処理し
、アニールさせた：ＰＤＭ−１０３（配列番号７２）およびＰＤＭ−１０５（配
列番号７３）；ならびにＰＤＭ−１０４（配列番号７４）およびＰＤＭ−１０６
（配列番号７５）。これら２対のアニールしたオリゴを、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＥｃｏＲＩで切断したｐＴ７Δ
Ｌ２ＰＥＰ２−ＴｃＤ構築物へライゲーションした。
【００８６】 ＰＥＰ２−ＴｃＤ−ＴｃＥ−Ｌｏ１．２融合物の構築のために、マッチした２
対のオリゴヌクレオチドＰＤＭ−１０８（配列番号７６）およびＰＤＭ−１１０
（配列番号７７）；ならびにＰＤＭ−１０９（配列番号７８）およびＰＤＭ−１
１１（配列番号７９）を、合成し、キナーゼ処理し、アニールさせた。ＥａｇＩ
で切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端のための処理をし、次いでＥｃｏ
ＲＩで切断したｐＴ７ΔＬ２ＰＥＰ２−ＴｃＤ−ＴｃＥ構築物に、これら２対の
アニールしたオリゴヌクレオチドをライゲーションした。ｐＴ７ΔＬ２ベクター
の内部ＥａｇＩ部位が原因で、全長ＰＥＰ２−ＴｃＤ−ＴｃＥ−Ｌｏ１．２構築
物をクローニングするために、鋳型としてライゲーション混合物を用いて、ＰＣ
Ｒ反応を実施した。ＰＣＲは、以下の条件を使用し、プライマーＰＤＭ−１０１
およびＰＤＭ−１０７（それぞれ、配列番号８０および８１）を用いて遂行した
： ９６℃２分 ９６℃１５秒、６１℃１５秒、７２℃１分×４０サイクル ７２℃４分。 Ｐｆｕ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃ
Ａ）を、ＰＣＲ反応のために使用した。ＰＣＲに続き、このＤＮＡをエタノール
沈殿に供し、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてＥｃｏ７２１およびＥ
ｃｏＲＩで消化した改変Ｔベクター構築物へライゲーションした。
【００８７】 生じたクローンを、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｂ
ｕｒｇ、ＭＤ）およびＳｐｈＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で
消化し、平滑末端のためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いで、ベクター
の内部のＥａｇＩおよびＮｓｉＩを除去するために再ライゲーションした。次い
で、この新しいクローンを、Ｅａｇ ＩおよびＮｓｉ Ｉで消化し、平滑末端の
ためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そしてＴｃＬｏ１．２配列の端に、イ
ンフレームに終止コドンを作製するために再ライゲーションした。このクローン
を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで切
断した改変ｐＥＴ２８ｂベクターへサブクローニングした。
【００８８】 生じた発現構築物を、ＢＬＲ ｐＬｙｓ Ｓ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎｏｖａｇｅｎ
）へ形質転換し、そしてカナマイシン（３０ｕｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ、ＭＯ）およびクロラムフェニコール（３４ｕｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）
を含むＬＢブロス中で一晩増殖させた。一晩培養物（１２ｍｌ）を使用して、カ
ナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む５００ｍｌの２×ＹＴに接種し、
そしてこの培養物を、０．３〜０．６のＯＤ５６０の時点で、最終濃度１．０
ｍＭにしたＩＰＴＧを用いて誘導した。誘導の４時間後、この細菌を回収し、そ
して２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｄ
ＯＣ、２０ ｕｇ／ｍｌロイペプチンおよび２０ ｍＭ ＰＭＳＦ中で超音波処
理し、その後２６，０００×ｇで遠心分離した。この融合タンパク質を、超音波
処理後の可溶性上清中に見出した。この上清を、Ｐｒｏ−ｂｏｎｄニッケル樹脂
カラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に結合させた。この
カラムを、５０ｍｌの２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）、１００ ｍＭ ＮａＣ
ｌ洗浄緩衝液で洗浄し、そしてイミダゾール濃度を増加して溶出した。具体的に
は、この溶出は、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）、１００ ｍＭ ＮａＣｌ洗
浄緩衝液中５０ ｍＭ、１００ ｍＭおよび５００ ｍＭのイミダゾールで行っ
た。目的のタンパク質を含む溶出物をプールし、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（８
．０）に対して透析した。
【００８９】 透析後、このタンパク質を濃縮し、滅菌濾過し、そしてエンドトキシンについ
て試験した。試験結果は、高レベルのエンドトキシンの混入を示した。従って、
滅菌濾過したタンパク質を、Ｈｉｇｈ Ｑ陰イオン交換カラム（Ｂｉｏｒａｄ、
Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を通じて精製した。これは、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（
８．０）中で結合させ、そして１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）中１ＭまでのＮ
ａＣｌ勾配により溶出した。目的のタンパク質を含むこの溶出物をプールし、そ
して１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（８．０）に対して透析した。透析後、このタンパク
質を再濃縮し、滅菌濾過し、そしてＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ、ＩＬ）を行ってタンパク質濃度を決定した。
【００９０】 Ｔ．ｃｒｕｚｉ患者由来の血清および通常のドナー由来の血清との、この組換
え融合ポリペプチドＴｃＦの反応性を、上記のようにＥＬＩＳＡにより調べた。
図１１に示すように、ＴｃＦの反応性が分枝合成テトラペプチド２／Ｄ／Ｅ／Ｌ
ｏ１．２の反応性と非常に類似していることを、見出した。
【００９１】 組換え融合ポリペプチドＴｃＦ中のペプチドの順序は、このポリペプチドの活
性を有意に変化させることなく変化し得ることが、想像される。また、合成テト
ラペプチド２／Ｌｏ／２Ｅ／Ｄにおいて使用されたような、このペプチド間のＧ
ｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ結合の包含が、このポリペプチドの活性に有意に影響する
ことなく固相結合を増強し得る。
【００９２】 （実施例９） （ＴｃＨｉ２９およびＴｃＥの血清学的反応性の比較） 抗原ＴｃＨｉ２９（配列番号５２）は、ＴｃＥ反復配列の多型であることが示
された。ＴｃＥに比較して以下の配列を有するＴｃＨｉ２９ペプチドを合成した
。
【００９３】
【化４】 図９は、これらの２つの関連する配列と、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性患者由来の血清
ならびに他の疾患カテゴリー由来の血清との、上記の手順を用いるＥＬＩＳＡに
より決定した反応性の比較を示す。データは、試験した他の疾患群とはほとんど
または全く反応性がないが、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性血清間の反応性の分布が２つの
ペプチドについて部分的に重複したことを示す。試験した５３個のコンセンサス
な陽性サンプルのうち、ＴｃＥは、３１／５３を検出し、そしてＴｃＨｉ ２９
は３６／５３を検出した。この群内では、ＴｃＥおよびＴｃＨｉ２９は両方とも
２４個の同じ血清を検出した。ＴｃＥは、ＴｃＨｉ２９により検出されない７個
の陽性血清を検出した。これは次いで、ＴｃＥにより見逃された１２個の陽性血
清を検出した。ジペプチドＴｃＤ／ＴｃＨｉ２９をまた合成し、そしてＥＬＩＳ
Ａ（１００ｎｇ／ウェル ＴｃＤ／ＴｃＨｉ２９、２５０ｎｇ／ウェル ＰＥＰ
−２／ＴｃＬｏ１．２）においてＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ１．２ジペプチドとの組
合せで使用し、そしてＴｃＤ／ＴｃＥ＋ＰＥＰ−２／ＴｃＬｏ１．２ジペプチド
の組合せと比較した。図１０に示すように、データは、２つの混合物の全活性が
、研究したＴ．ｃｒｕｚｉ陽性および陰性集団の両方について同様であることを
示し、そしてこのようなペプチドの組合せにおいて、ＴｃＨｉ２９がＴｃＥの代
替品と考えられ得ることを示唆する。
【００９４】 前述より、本発明の特定の実施態様を例示の目的で本明細書中に記載したが、
本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理
解される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染（Ｐｏｓ）および非感染（Ｎｅｇ）個体からの血
清を使用して実施されたＥＬＩＳＡアッセイにおける、Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解物お
よび本発明の代表的なポリペプチド（ｒＴｃｃ６）の反応性を比較するグラフで
ある。縦線は、±１標準偏差を示す。
【図２】 図２は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染（Ｐｏｓ）および非感染（Ｎｅｇ）個体からの血
清を使用して実施されたＥＬＩＳＡアッセイにおける、本発明の代表的なポリペ
プチドの反応性の比較を示すグラフである。実験１は、ｒＴｃｃ２２、ならびに
ペプチドＴｃｃ２２−１およびＴｃｃ２２−１＋の比較を示す；実験２は、ｒＴ
ｃｃ２２、ｒＴｃＨｉ１２、ならびにペプチドＴｃｃ２２−１、Ｔｃｃ２２−１
＋およびＴｃｃ２２−２．１の比較を示す。縦線は、±１標準偏差を示す。
【図３】 図３は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染（Ｐｏｓ）および非感染（Ｎｅｇ）個体からの血
清を使用して、ならびに内臓リーシュマニア症（ＶＬ）、皮膚リーシュマニア症
（ＣＬ）、結核（ＴＢ）、およびマラリアに罹患している個体からの血清を使用
して実施されたＥＬＩＳＡアッセイにおける、Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解産物および代
表的なポリペプチド（Ｔｃｃ３８）の反応性の比較を示すグラフである。縦線は
、±１標準偏差を示す。
【図４】 図４は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染（Ｐｏｓ）および非感染（Ｎｅｇ）個体からの血
清を使用して実施されたＥＬＩＳＡアッセイにおける、Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解物お
よび本発明のいくつかのポリペプチド（これらは、ＴｃＬｏ１およびＴｃＨｉ１
０抗原の異なったリーディングフレームを表す）の反応性の比較を示すグラフで
ある。縦線は、±１標準偏差を示す。
【図５】 図５は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染（Ｐｏｓ）および非感染（Ｎｅｇ）個体からの血
清、ならびに内臓リーシュマニア症（ＶＬ）、皮膚リーシュマニア症（ＣＬ）、
マラリア、および結核（ＴＢ）に罹患している個体からの血清を使用して実施さ
れたＥＬＩＳＡアッセイにおける、Ｔ．ｃｒｕｚｉ溶解物および代表的なポリペ
プチド（ＴｃｃＬｏ１．２）の反応性を比較するグラフである。
【図６】 図６は、一連のポリペプチドの組合せとＴ．ｃｒｕｚｉ陽性および陰性血清と
のＥＬＩＳＡ反応性を示すグラフである。
【図７】 図７は、一連のＴｃＥポリペプチド改変体とＴ．ｃｒｕｚｉ陽性および陰性血
清とのＥＬＩＳＡ反応性を示すグラフである。
【図８】 図８は、本発明の二つのジペプチド、一つのトリペプチド、および一つのテト
ラペプチドと、Ｔ．ｃｒｕｚｉ陽性および陰性血清とのＥＬＩＳＡ反応性を比較
するグラフである。
【図９】 図９は、本発明の代表的なポリペプチド（ＴｃＨｉ２９）およびＴｃＥの、正
常個体、Ｔ．ｃｒｕｚｉ患者、および他の疾患に罹患した患者からの血清とのＥ
ＬＩＳＡ反応性を示すグラフである。
【図１０】 図１０は、二つの代表的なジペプチド混合物とＴ．ｃｒｕｚｉ陽性および陰性
血清とのＥＬＩＳＡ反応性を比較するグラフであり、一方の混合物はＴｃＥエピ
トープを含み、他方は本発明のＴｃＨｉ２９エピトープを含む。
【図１１】 図１１は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ患者由来および正常ドナー由来の血清を用いて、合
成側鎖テトラペプチド２／Ｄ／Ｅ／Ｌｏｌ．２．の反応性と、組換え融合ポリペ
プチドＴｃＦのＥＬＩＳＡ反応性を比較するグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 15/09 ＺＮＡ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/566 33/53 33/577 Ａ 33/566 Ｃ０７Ｋ 16/20 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ０７Ｋ 16/20 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スケイキー， ヤサー エイ． ダブリュ ー． アメリカ合衆国 ワシントン 98107， シアトル， 25ティーエイチ アベニュー ノースウエスト 8327 (72)発明者 ロデス， マイケル ジェイ． アメリカ合衆国 ワシントン 98126， シアトル， 36ティーエイチ アベニュー サウスウエスト 9223 (72)発明者 ホートン， レイモンド エル． アメリカ合衆国 ワシントン 98021， ボセル， 242エヌディー プレイス サ ウスイースト 2636 (72)発明者 スミス， ジョン エム． アメリカ合衆国 ワシントン 98208， エバレット， 116ティーエイチ プレイ ス サウスイースト 208 (72)発明者 マックネイル， パトリシア ディー． アメリカ合衆国 ワシントン 98198， デス モイネス， エス．248ティーエイ チ ストリート 1421

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための方
    法であって、以下： （ａ）該生物学的サンプルを、配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレ
    オチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエ
    ピトープ、あるいは保存的置換および／または改変のみが異なる該抗原の改変体
    を含むポリペプチドと接触させる工程；ならびに （ｂ）該生物学的サンプル中の該ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し
    、そこから該生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出する工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記生物学的サンプルが、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液
    、および尿からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ポリペプチドが固体支持体に結合される、請求項１に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 前記固体支持体が、ニトロセルロース、ラテックス、またはプ
    ラスチック材料を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 請求項３に記載の方法であって、前記検出する工程が、以下：
    （ａ）前記固体支持体から非結合サンプルを除去する工程； （ｂ）該固体支持体に検出試薬を添加する工程；および （ｃ）所定のカットオフ値と比較して、該固体支持体に結合された検出試薬のレ
    ベルを測定し、そしてそこから前記生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を
    検出する工程、 を包含する、方法。
  6. 【請求項６】 前記検出試薬が、結合剤に結合されたレポーター基を含む、請
    求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記結合剤が、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテイン
    Ａ、およびレクチンからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記レポーター基が、放射性同位元素、蛍光基、発光基、酵素
    、ビオチン、および色素粒子からなる群より選択される、請求項６に記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 配列番号１〜配列番号２１に列挙されるヌクレオチド配列によ
    ってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープ、ある
    いは保存的置換および／または改変のみが異なる該抗原の改変体を含む、ポリペ
    プチド。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載のポリペプチドをコードする、単離されたＤ
    ＮＡ配列。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のＤＮＡ配列を含む、組換え発現ベクター
    。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換またはトランス
    フェクトされた宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、昆虫細胞株、および
    哺乳動物細胞株からなる群より選択される、請求項１２に記載の宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための
    診断キットであって、以下： （ａ）配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコード
    されるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープ、あるいは保存的
    置換および／または改変のみが異なる該抗原の改変体を含むポリペプチド；なら
    びに （ｂ）検出試薬、 を含む、診断キット。
  15. 【請求項１５】 前記ポリペプチドが固体支持体に結合される、請求項１４に
    記載のキット。
  16. 【請求項１６】 前記固体支持体が、ニトロセルロース、ラテックス、または
    プラスチック材料を含む、請求項１５に記載のキット。
  17. 【請求項１７】 前記検出試薬が、結合剤に結合されたレポーター基を含む、
    請求項１４に記載のキット。
  18. 【請求項１８】 前記結合剤が、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテイ
    ンＡ、およびレクチンからなる群より選択される、請求項１７に記載のキット。
  19. 【請求項１９】 前記レポーター基が、放射性同位元素、蛍光基、発光基、酵
    素、ビオチン、および色素粒子からなる群より選択される、請求項１７に記載の
    キット。
  20. 【請求項２０】 生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための
    方法であって、以下： （ａ）生物学的サンプルを、配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチ
    ド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピト
    ープ、あるいは保存的置換および／または改変のみが異なる該抗原の改変体に結
    合するモノクローナル抗体と接触させる工程；ならびに （ｂ）該生物学的サンプル中の該モノクローナル抗体に結合するＴ．ｃｒｕｚｉ
    寄生生物の存在を検出し、そこから該生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染
    を検出する工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 前記モノクローナル抗体が固体支持体に結合される、請求項
    ２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、前記検出する工程が、以
    下： （ａ）前記固体支持体から非結合サンプルを除去する工程； （ｂ）該固体支持体に検出試薬を添加する工程；および （ｃ）所定のカットオフ値と比較して、該固体支持体に結合された検出試薬のレ
    ベルを測定し、そこから前記生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出す
    る工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 前記検出試薬が抗体に結合されたレポーター基を含む、請求
    項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 薬学的組成物であって、以下： （ａ）配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコード
    されるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープ、あるいは保存的
    置換および／または改変のみが異なる該抗原の改変体を含む、ポリペプチド；な
    らびに （ｂ）生理学的に受容可能なキャリア、 を含む、薬学的組成物。
  25. 【請求項２５】 Ｔ．ｃｒｕｚｉに結合する抗体の産生を刺激するためのワク
    チンであって、以下： （ａ）配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列によってコード
    されるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピトープ、あるいは保存的
    置換および／または改変のみが異なる該抗原の改変体を含む、ポリペプチド；な
    らびに （ｂ）アジュバント、 を含む、ワクチン。
  26. 【請求項２６】 請求項２４に記載の薬学的組成物であって、患者においてシ
    ャーガス病に対する防御免疫を誘導するための医薬の製造における使用のための
    、薬学的組成物。
  27. 【請求項２７】 請求項２５に記載のワクチンであって、患者においてシャー
    ガス病に対する防御免疫を誘導するための医薬の製造における使用のための、ワ
    クチン。
  28. 【請求項２８】 生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための
    方法であって、以下： （ａ）該生物学的サンプルを、配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオ
    チド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピ
    トープ、あるいは保存的置換および／または改変のみが異なる該抗原の改変体を
    含む第１のポリペプチドと接触させる工程； （ｂ）該生物学的サンプルを、ＴｃＤのエピトープ、あるいは保存的置換および
    ／または改変のみが異なるその改変体を含む第２のポリペプチドと接触させる工
    程；ならびに （ｃ）該生物学的サンプル中の、１つ以上の該ポリペプチドに結合する抗体の存
    在を検出し、そこから該生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出する工
    程、 を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための
    方法であって、以下： （ａ）該生物学的サンプルを、配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオ
    チド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピ
    トープ、あるいは保存的置換および／または改変のみが異なる該抗原の改変体を
    含む第１のポリペプチドと接触させる工程； （ｂ）該生物学的サンプルを、ＴｃＤのエピトープ、あるいは保存的置換および
    ／または改変のみが異なるその改変体を含む第２のポリペプチドと接触させる工
    程； （ｃ）該生物学的サンプルを、ＴｃＥのエピトープ、あるいは保存的置換および
    ／または改変のみが異なるその改変体を含む第３のポリペプチドと接触させる工
    程； （ｄ）該生物学的サンプル中の、１つ以上の該ポリペプチドに結合する抗体の存
    在を検出し、そこから該生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出する工
    程、 を包含する、方法。
  30. 【請求項３０】 生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための
    方法であって、以下： （ａ）該生物学的サンプルを、配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオ
    チド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピ
    トープ、あるいは保存的置換および／または改変のみが異なる該抗原の改変体を
    含む第１のポリペプチドと接触させる工程； （ｂ）該生物学的サンプルを、ＴｃＤのエピトープ、あるいは保存的置換および
    ／または改変のみが異なるその改変体を含む第２のポリペプチドと接触させる工
    程； （ｃ）該生物学的サンプルを、ＰＥＰ−２のエピトープ、あるいは保存的置換お
    よび／または改変のみが異なるその改変体を含む第３のポリペプチドと接触させ
    る工程；および （ｄ）該生物学的サンプル中の、１つ以上の該ポリペプチドに結合する抗体の存
    在を検出し、そこから該生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出する工
    程、 を包含する、方法。
  31. 【請求項３１】 生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための
    方法であって、以下： （ａ）該生物学的サンプルを、配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオ
    チド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原のエピ
    トープ、あるいは保存的置換および／または改変のみが異なる該抗原の改変体を
    含む第１のポリペプチドと接触させる工程； （ｂ）該生物学的サンプルを、ＴｃＥのエピトープ、あるいは保存的置換および
    ／または改変のみが異なるその改変体を含む第２のポリペプチドと接触させる工
    程；および （ｃ）該生物学的サンプル中の、１つ以上の該ポリペプチドに結合する抗原の存
    在を検出し、そこから該生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出する工
    程、 を包含する、方法。
  32. 【請求項３２】 請求項３１に記載の方法であって、前記第２のポリペプチド
    が、アミノ酸配列 Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ（配列番号５６）を含む、方法。
  33. 【請求項３３】 請求項９に記載の２つ以上のポリペプチドを含む、組合せポ
    リペプチド。
  34. 【請求項３４】 配列番号１〜配列番号２２に列挙されるヌクレオチド配列に
    よってコードされるアミノ酸配列を有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の少なくとも１つ
    のエピトープ、あるいは保存的置換および／または改変のみが異なる該抗原の改
    変体、ならびにＴｃＤのエピトープ、ＴｃＥのエピトープ、ＰＥＰ−２のエピト
    ープならびに保存的置換および／または改変のみが異なるそれらの改変体からな
    る群より選択される少なくとも１つのエピトープを含む、組合せポリペプチド。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の組合せポリペプチドであって、ここでＴ
    ｃＤのエピトープ、ＴｃＥのエピトープ、ＰＥＰ−２のエピトープならびに保存
    的置換および／または改変のみが異なるそれらの改変体からなる群より選択され
    るエピトープが、配列番号５５〜配列番号５６に列挙されるアミノ酸配列を有す
    る、組合せポリペプチド。
  36. 【請求項３６】 請求項３４に記載の組合せポリペプチドであって、ここでＴ
    ｃＤのエピトープ、ＴｃＥのエピトープ、ＰＥＰ−２のエピトープならびに保存
    的置換および／または改変のみが異なるそれらの改変体からなる群より選択され
    るエピトープが、配列番号５３〜配列番号５４に列挙されるアミノ酸配列を有す
    る、組合せポリペプチド。
  37. 【請求項３７】 請求項３４に記載の組合せポリペプチドであって、ここでＴ
    ｃＤのエピトープ、ＴｃＥのエピトープ、ＰＥＰ−２のエピトープ、ならびに保
    存的置換および／または改変のみが異なるそれらの改変体からなる群より選択さ
    れるエピトープが、配列番号５７に列挙されるアミノ酸配列を有する、組合せポ
    リペプチド。
  38. 【請求項３８】 前記ポリペプチドが組換えＤＮＡ技術を使用して調製される
    、請求項３４に記載の組合せポリペプチド。
  39. 【請求項３９】 前記ポリペプチドが合成的に調整される、請求項３４に記載
    の組合せポリペプチド。
  40. 【請求項４０】 生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉ感染を検出するための
    方法であって、以下： （ａ）該生物学的サンプルを、請求項３３〜３９のいずれか１つに記載の組合せ
    ポリペプチドと接触させる工程；および （ｂ）該生物学的サンプル中の該組合せポリペプチドに結合する抗体の存在を検
    出し、そこから該生物学的サンプル中のＴ．ｃｒｕｚｉを検出する工程、 を含む、方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010507100A (ja) * 2006-10-19 2010-03-04 アボット・ラボラトリーズ トリパノソーマ・クルージ感染の検出および診断方法
JP2017533913A (ja) * 2014-11-06 2017-11-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 遺伝子組み換えトリパノソーマ・クルージｊｌ７抗原変異型およびシャーガス病を検出するためのその使用
JP2017227644A (ja) * 2007-12-27 2017-12-28 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体及び使用方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6375955B1 (en) * 1995-09-22 2002-04-23 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
US6228372B1 (en) 1997-04-15 2001-05-08 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection and prevention of T. cruzi infection
US6419933B1 (en) * 1995-11-14 2002-07-16 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection and prevention of T.cruzi infection
CA2628315C (en) * 2005-11-03 2013-04-16 Inbios International, Inc. Compositions and methods for the detection of trypanosoma cruzi infection
ES2628743T3 (es) 2008-07-03 2017-08-03 Infectious Disease Research Institute Proteínas de fusión y su uso en el diagnóstico y tratamiento de la leishmaniasis

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4870006A (en) 1986-07-24 1989-09-26 Codon Antigenic material for a chagas' disease detection system
WO1990002564A1 (en) 1988-09-12 1990-03-22 Codon Vaccine diagnostic employing proteins homologous to heat shock proteins of trypanosoma cruzi
BR9006039A (pt) 1990-11-28 1992-07-14 Fundacao Oswaldo Cruz Processo para preparacao de antigeno conjugado a atividade enzimatica,composicao a base de conjugado enzima-antigeno para utilizacao em diagnostico imunologico e kits de diagnostico imunologico da doenca de chagas a base da dita composicao,para aplicacao individual e/ou em inqueritos epidemiologicos
US5304371A (en) 1992-02-14 1994-04-19 Lasys Corporation Peptide for diagnosing and immunizing against T. cruzi infection
TW246717B (ja) 1992-07-10 1995-05-01 Abbott Lab
US5756662A (en) 1995-03-14 1998-05-26 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection of T. cruzi infection
US5916572A (en) 1995-11-14 1999-06-29 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection and prevention of T. cruzi infection
US6228372B1 (en) 1997-04-15 2001-05-08 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection and prevention of T. cruzi infection

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010507100A (ja) * 2006-10-19 2010-03-04 アボット・ラボラトリーズ トリパノソーマ・クルージ感染の検出および診断方法
JP2017227644A (ja) * 2007-12-27 2017-12-28 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体及び使用方法
JP2017533913A (ja) * 2014-11-06 2017-11-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 遺伝子組み換えトリパノソーマ・クルージｊｌ７抗原変異型およびシャーガス病を検出するためのその使用
JP2021098746A (ja) * 2014-11-06 2021-07-01 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 遺伝子組み換えトリパノソーマ・クルージｊｌ７抗原変異型およびシャーガス病を検出するためのその使用
JP7173732B2 (ja) 2014-11-06 2022-11-16 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 遺伝子組み換えトリパノソーマ・クルージｊｌ７抗原変異型およびシャーガス病を検出するためのその使用
JP7356467B2 (ja) 2014-11-06 2023-10-04 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 遺伝子組み換えトリパノソーマ・クルージｊｌ７抗原変異型およびシャーガス病を検出するためのその使用

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