JP7356467B2 - 遺伝子組み換えトリパノソーマ・クルージjl7抗原変異型およびシャーガス病を検出するためのその使用 - Google Patents
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Description
iol,1554-1560を参照のこと)。Silveiraら(上記)も、ELISAアッセイにおいて使用するための様々な追加のT.クルージ抗原のいくつかの混合物において、FRA(JL7)について記載している。しかし、特異的JL7関連ポリペプチドについては開示されていない。
開示されるアミノ酸配列の説明
配列番号1は、FRA、Ag1、H49としても知られる、T.クルージタンパク質の部分配列JL7(UniProtエントリ:Q4CS87)を示している(完全記述名:カルパインシステインペプチダーゼ(推定上))。配列番号1は、上記のUniProtデータベースエントリのアミノ酸位置62~287を示しており、結果として226のアミノ酸長さを有するポリペプチドを示す。当該全長タンパク質は、1~1275のアミノ酸を含む。
にも関する。
a)トリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドをコードする作動可能に連結された遺伝子組み換えDNA分子を含む発現ベクターによってトランスフォームされたホスト細胞を培養するステップ、
b)トリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドの発現ステップ、および
c)トリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドの精製ステップ
を含む方法にも関する。
L7ポリペプチド、または上記において定義される方法によって得られるトリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチド、またはまさにその説明されたトリパノソーマ・クルージポリペプチドの組成物が、当該トリパノソーマ・クルージ抗体に対する捕捉試薬および/または結合パートナーとして使用される、方法である。
a)体液試料を、本発明によるトリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチド、または既に説明した組成物、または本明細書の先行の段落において説明した方法によって得られるトリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドと混和することによって免疫反応混和物を形成するステップ、
b)ポリペプチド試料の上記組成物に対する、当該体液試料中に存在する抗体を、トリパノソーマ・クルージポリペプチドの当該組成物と免疫反応させて、免疫反応生成物を形成させるのに十分な期間、当該免疫反応混和物を維持するステップ、および
c)いかなる免疫反応生成物についてもその存在および/または濃度を検出するステップ
を含む方法である。
a)単離された試料に、固相に直接的または間接的に結合することができ、かつバイオアフィン結合対の一部であるエフェクター基を有する第1のトリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドと、検出可能な標識を有する第2のトリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドとを加えるステップであって、第1および第2のトリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドが、上記抗トリパノソーマ・クルージ抗体に特異的に結合する、ステップ、
b)第1のトリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチド、試料抗体、および第2のトリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドを含む免疫反応混和物を形成するステップであって、上記バイオアフィン結合対における対応するエフェクター基を有する固相が、免疫反応混和物を形成する前、形成中、または形成後に加えられる、ステップ、
c)体液試料中の第1および第2のトリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドに対するトリパノソーマ・クルージ抗体を、第1および第2のトリパノソーマ・クルージポリペプチドと免疫反応させて、免疫反応生成物を形成させるのに十分な期間、免疫反応混和
物を維持するステップ、
d)固相から液相を分離するステップ、
e)固相もしくは液相またはその両方において、いかなる免疫反応生成物についてもその存在を検出するステップ
を含む。
免疫診断試験におけるその適用に好適な、T.クルージJL7抗原の最小サイズを調査するために、1つまたは2つの反復ユニットからなるいくつかの変異型を作製した。
発現を誘発させた。誘発の4時間後、遠心分離(5000×gで20分間)によって細胞を収穫し、冷凍して、-20℃で保存した。細胞溶解物に対しては、緩衝液50ml中における25mMのpH8.5のリン酸ナトリウム、6mMのMgCl2、10U/mlのBenzonase(登録商標)、1タブレットのComplete(登録商標)、および1タブレットのComplete(登録商標)EDTA-フリー(プロテアーゼ阻害剤カクテル)に凍結ペレットを再懸濁させ、結果として得られる懸濁液を高圧ホモジナイゼーションによって溶解させた。粗溶解物に、50mMのリン酸ナトリウム、10mMのイミダゾールとなるようにこれらを補った。遠心分離後、当該上澄みを、緩衝液A(50mMのpH8.5のリン酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム、10mMのイミダゾール)で事前に平衡化させたNi-NTA(ニッケル-ニトリロトリアセテート)カラム上に適用した。溶離の前に、汚染タンパク質を除去するためにイミダゾール濃度を40mMまで上げた。次いで、250mMの濃度のイミダゾールを適用することによって、タンパク質を溶離させた。最終的に、当該タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィにかけて、タンパク質含有分画をプールして濃縮した。
円偏光二色性分光法(CD)は、タンパク質における二次構造を評価するための最適の方法である。アミド範囲(190~250nm)における楕円率は、タンパク質骨格における規則的な反復要素、すなわち、二次構造を反映する。
び222nmの信号帯域)を有するタンパク質を指し示している。JL7short1、JL7short2、およびJL7short3+4のスペクトルは、高度な不規則構造を有するタンパク質を表している(200nm付近の信号帯域)。
遺伝子組み換えタンパク質のリジンε-アミノ基を、約10mg/mlのタンパク質濃度において、それぞれ、N-ヒドロキシ-スクシンイミド活性化ビオチンおよびルテニウム標識によって修飾した。標識/タンパク質のモル比は、それぞれビオチンおよびルテニウム標識コンジュゲーションに対して、5:1および15:1に調節した。反応緩衝液は、50mMのリン酸カリウム(pH8.5)、150mMのKCl、0.5mMのEDTAであった。当該反応を室温において30分間実施し、緩衝されたL-リシンを10mMの最終濃度まで加えることによって当該反応を止めた。当該カップリング反応後、粗タンパク質コンジュゲートをゲルろ過カラム(Superdex 200 HI Load)を通すことによって未反応の遊離標識を除去した。
異なるタンパク質の免疫学的反応性を、自動化されたcobas(登録商標) e601アナライザ(Roche Diagnostics GmbH)において評価した。測定は、二重抗原サンドイッチ形式において実施した。それにより、ビオチン-コンジュゲート(すなわち、捕捉抗原)が、ストレプトアビジンをコーティングした磁性ビーズの表面に固定され、その一方で、当該検出抗原は、シグナリング部分として、錯体化されたルテニウムカチオンを有する。cobas(登録商標) e601におけるシグナル検出は、電気化学ルミネセンスに基づいている。
表2の全ての試料を、製造元の取扱説明書に従って、いくつかのT.クルージ抗原を使用するがJL7は使用しない市販のシャーガス病アッセイ(Biokit S.A.のbioelisa Chagas)によって試験した。
Claims (10)
- 単離された生体試料におけるトリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)に対する抗体を検出する方法において使用するためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドがJL7特異的アミノ酸配列を含み、前記JL7特異的アミノ酸配列が、下記アミノ酸配列:
- 更なるトリパノソーマ・クルージ特異的アミノ酸配列が、配列番号1~6または請求項1に記載のアミノ酸配列で表される配列の1以上のものである、請求項1に記載のポリペプチド。
- JL7エピトープのみが前記ポリペプチド上で提示される、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 単離された生体試料におけるトリパノソーマ・クルージ抗原に対する抗体の検出に好適なポリペプチドの組成物であって、請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチドと、1F8、クルジパイン、KMP-11、およびPAR-2からなる群より選択される少なくとも1つのトリパノソーマ・クルージポリペプチドとを含む、前記組成物。
- 可溶性で免疫反応性のトリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドを製造する方法であって、
a)請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする作動可能に連結された遺伝子組み換えDNA分子を含む発現ベクターによってトランスフォームされたホスト細胞を培養するステップと、
b)前記トリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドの発現ステップと、
c)前記トリパノソーマ・クルージJL7ポリペプチドの精製ステップと
を含む、前記方法。 - 単離された試料においてトリパノソーマ・クルージ抗原に対して特異的な抗体を検出する方法であって、請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項5に記載の方法によって得られるポリペプチド、または請求項4に記載の組成物が、トリパノソーマ・クルージ抗体に対する捕捉試薬および/または結合パートナーとして使用される、前記方法。
- 単離された試料においてトリパノソーマ・クルージ抗原に特異的な抗体を検出する方法であって、
a)体液試料を、請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項4に記載の組成物、または請求項5に記載の方法によって得られるポリペプチドと混和することによって、免疫反応混和物を形成すること、
b)ポリペプチド試料の組成物に対する体液試料中に存在する抗体を、トリパノソーマ・クルージポリペプチドの前記組成物と免疫反応させて免疫反応生成物を形成させるのに十分な期間、免疫反応混和物を維持すること、および、
c)いかなる免疫反応生成物についてもその存在および/または濃度を検出すること、
を含む、前記方法。 - 請求項7に記載の単離された試料においてトリパノソーマ・クルージ抗原に特異的な抗体を検出する方法であって、前記免疫反応が、
a)前記試料に、固相に直接的または間接的に結合することができ、かつバイオアフィン結合対の一部であるエフェクター基を有する第1の請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチドと、検出可能な標識を有する第2の請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチドとを加えるステップであって、第1および第2のポリペプチドを、抗トリパノソーマ・クルージ抗体に特異的に結合させること、
b)第1のポリペプチド、試料抗体、および第2のポリペプチドを含む免疫反応混和物を形成すること、ここで前記バイオアフィン結合対に対応するエフェクター基を有する固相が、免疫反応混和物を形成する前、形成中、または形成後に加えられる、
c)体液試料中の第1および第2のポリペプチドに対するトリパノソーマ・クルージ抗体を第1および第2のポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成させるのに十分な期間、免疫反応混和物を維持すること、
d)固相から液相を分離すること、および、
e)固相もしくは液相またはその両方において、いかなる免疫反応生成物についてもその存在を検出すること、
を含む、二重抗原サンドイッチ形式において実施される、前記方法。 - 前記第1のポリペプチドがビオチン部分を有し、および前記第2のポリペプチドが、電気化学ルミネセンス性のルテニウム錯体によって標識されている、請求項8に記載のトリパノソーマ・クルージに特異的な抗体を検出する方法。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項4に記載の組成物、または請求項5の方法によって得られるポリペプチドを含む、抗トリパノソーマ・クルージ抗体の検出のための試薬キット。
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