CN108650889B - 用于诊断病毒感染的免疫测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断疾病的多肽，优选地其二聚体和/或六聚体，更优选地二聚体，其包含从包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9或其变体的组中选择的序列，优选地SEQ ID NO:1或其变体；在诊断学上有用的承载体，其包含用于特异性地捕获在来自受试者的样品中的针对SEQ ID NO:1的抗体的工具；试剂盒，其包含所述在诊断学上有用的承载体；和方法，优选地用于诊断疾病的方法，其包括在来自受试者的样品中检测针对SEQ ID NO:1的抗体的存在或不存在的步骤。

Description

用于诊断病毒感染的免疫测定法
技术领域
本发明的方面涉及用于诊断疾病的多肽，其包含从包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:19和SEQ ID NO:9或其变体的组中选择的序列，优选地SEQ ID NO:1或其变体，优选地其二聚体和/或六聚体，更优选地其二聚体；在诊断学上有用的承载体，其包含用于特异性地捕获在来自受试者的样品中的针对SEQ ID NO:1的抗体的工具；试剂盒，其包含所述在诊断学上有用的承载体；和方法，优选地用于诊断疾病的方法，其包括在来自受试者的样品中检测针对SEQ ID NO:1的抗体的存在或不存在的步骤。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus；ZIKV)是一种新出现的经蚊子传播的黄病毒，其目前在南美洲和中美洲以及在加勒比地区引起大的流行病。它与黄病毒家族的其他的人致病性成员例如登革病毒(DENV)、西尼罗病毒(WNV)、玻瓦散病毒(PWV)、日本脑炎病毒(JEV)、乌苏土病毒和黄热病毒(YFV)紧密相关。除了其结构相似之外，这些病毒中的大多数共享部分地重叠的地理分布，其中热带和亚热带地区是主要媒介(伊蚊属(Aedes)的蚊子)的有利环境。
在临床上，寨卡热类似于登革热，但是通常较不严重。由于超过80％的感染是无症状的，因而大多数病例未被注意。症状包括发热、疹、关节痛和结膜炎，并且感染通常是自限性的。相反地，在5％的DENV感染中，严重的并发症导致登革休克综合征或登革出血热，其具有高的死亡率。目前的ZIKV流行病(特别是在巴西)证实了关于在密克罗尼亚的2007年爆发期间最初所怀疑的两个在ZIKV感染中的潜在的严重并发症的猜疑。首先，通过感染触发了罕见的吉-巴综合征(GBS)(一种导致外周神经髓鞘质的损害的自身免疫性疾病)的病例的显著上升。第二，在来自巴西高度地方性流行地区的新生儿中小头畸形病例的20倍增加，以及随后在两名携带具有小头畸形的胎儿的孕妇的羊膜液中和在子宫内诊断出小头畸形后流产的胎儿的脑中ZIKV基因组检测的首次报道，提供了在胎儿异常与早期妊娠期间ZIKV感染之间的强烈的因果联系。
除了来自黄病毒家族的这两个代表外，在鉴别诊断中还应当考虑基孔贡亚病毒(CHIKV)(甲病毒家族的成员)。CHIKV由相同的蚊子媒介传播并且在相同的地区地方性流行。共同分布和相似的临床表现，以及与之相结合的疾病结果的高多样性和被ZIKV、DENV和CHIKV感染的患者的差异化治疗的必要性，证实了对于特异性且可靠的诊断可能性的需要。
目前，ZIKV感染的诊断是具有挑战性的，因为唯一的特殊工具是使用基于核酸的测试来直接证明病毒血症，但是病毒血症阶段通常在症状发作后持续仅至多七天。因此，到患者咨询其医生时，诸如RT-PCR的方法可能已经给出了阴性结果。噬斑减少中和测试(plaque-reduction neutralization tests，PRNT)可以测量病毒特异性中和抗体，和辨别交叉反应性抗体。这在其中两种或更多种黄病毒共出现的地区是高度意义重大的。但是，PRNT是耗时的，难以施行的，并且不顺应于测试大量的血清。相反地，病毒特异性抗体应答的基于ELISA的测量是快速的、可改变规模的且在技术上成熟的方法。如所报道的，在症状发作后四至七天开始产生IgM抗体，而IgG抗体在几天后出现。
用于诊断黄病毒感染的常规血清学测定法例如基于糖蛋白E(gpE)的那些的一个主要限制是其在黄病毒属内的广泛的交叉反应性。
另一个限制是这样的事实：一系列患者(特别是具有过去的黄病毒感染的背景的)似乎缺乏IgM，其是可以先于可检测水平的IgG类别抗体在黄病毒感染的早期出现的抗体类别。在这样的患者中，基于IgM的诊断测试(其经常用于诊断黄病毒感染)的结果给出假阴性结果，这严重牵连所述患者和(如果她们是怀孕的)她们的婴儿的健康。
另一个限制(其涉及进入黄病毒例如寨卡病毒感染的领域中的研究，例如黄病毒感染的诊断或治疗或者任何基础研究)是，来自具有经确认的寨卡病毒感染的患者的血清供不应求。相当经常地，不是仅需要一个样品，而是需要数个在感染或症状发作后的一系列时间点获取的样品，例如如果探究疾病的动力学，或者需要对照样品以用于与在感染早期的治疗性发明相关的研究。
发明内容
因此，作为本发明基础的问题是提供这样的诊断测定法，其克服了任何与用于诊断黄病毒例如寨卡病毒的现有技术测定法(特别是基于检测针对黄病毒抗原的抗体的那些)相关联的缺点。
作为本发明基础的另一个问题是提供这样的测定法，其允许特异性地诊断感染，优选地黄病毒感染，更优选地寨卡病毒感染，更特别地，区别寨卡病毒感染与相关黄病毒(例如从包括登革病毒、黄热病毒、蜱传脑炎病毒、乌苏土(Usutu)病毒、西尼罗病毒和日本脑炎病毒的组中选择的那些，优选地登革病毒)感染。
作为本发明基础的另一个问题是提供用于检测黄病毒感染的测定法和试剂，其中相比于现有技术测定法而言，灵敏度和/或特异性得到改善，特别是关于感染早期。
作为本发明基础的另一个问题是提供针对黄病毒，优选地寨卡病毒感染的疫苗。
作为本发明基础的另一个问题是提供用于区分黄病毒感染与另一种疾病的资源高效型的但在诊断学上可靠的测试。
作为本发明基础的另一个问题是提供这样的测试，其提供更长的对于诊断的时间窗口。
作为本发明基础的另一个问题是提供这样的测试，其需要更低量的患者样品。
作为本发明基础的另一个问题是提供这样的测定法，其用于区分黄病毒(特别是寨卡病毒)急性感染与疫苗接种或者相同或另一种黄病毒(优选地登革病毒)的先前感染。
作为本发明基础的另一个问题是提供针对黄病毒，优选地寨卡病毒感染的疫苗。
作为本发明基础的另一个问题是提供用于区分黄病毒感染与另一种疾病的资源高效型的但在诊断学上可靠的测试。
作为本发明基础的另一个问题是提供这样的测试，其可以在最初暴露或症状发作和获得用于诊断的样品那天之间的更长的时间窗口期间进行使用。
作为本发明基础的另一个问题是提供这样的测试，其用于区分在原发黄病毒感染(优选地除寨卡病毒之外的其他黄病毒的感染)与继发黄病毒感染(优选地寨卡病毒感染)，所述方法比现有技术方法在诊断学上更可靠，特别是关于避免假阳性或阴性结果，并且可以理想地应用于来自具有IgM缺乏的患者的样品。
通过所附的独立和从属权利要求的主题解决了作为本发明基础的问题。
在第一个方面，作为本发明基础的问题通过用于诊断疾病的多肽而得到解决，所述多肽包含从包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9或其变体的组中选择的序列，优选地SEQ ID NO:1或其变体，优选地二聚体和/或六聚体，更优选地二聚体。
在第二个方面，所述问题通过在诊断学上有用的承载体而得到解决，所述承载体包含用于特异性地捕获在来自受试者的样品中的针对SEQ ID NO:1的抗体的工具。
在一个优选的实施方案中，所述承载体进一步包含一种或多于一种工具，该工具用于特异性地捕获针对从包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9的组中选择的抗原的抗体。
在一个优选的实施方案中，所述承载体选自包括下列各项的组：珠粒，优选地顺磁性颗粒；测试条；微量滴定板；印迹，其优选地选自包括Western印迹、线印迹(line blot)和斑点印迹的组；侧流测试；玻璃表面；载玻片；生物芯片；和膜，并且优选地为珠粒、线印迹或微量滴定板，更优选地微滴定板。
在第三个方面，所述问题通过试剂盒而得到解决，所述试剂盒包含根据本发明的在诊断学上有用的承载体，任选地以及用于特异性地检测所捕获的抗体的工具。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含在诊断学上有用的承载体，其进一步包含一种或多种工具，该工具用于特异性地捕获针对从包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQID NO:9的组中选择的一种或多种进一步的抗原的抗体，其中将所述用于特异性地捕获针对SEQ ID NO:1的抗体的工具和所述用于特异性地捕获针对一种或多种进一步的抗原的抗体的工具包被在分开的承载体上，优选地共价连接至分开的承载体。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含在诊断学上有用的承载体，其进一步包含一种或多种工具，该工具用于特异性地捕获针对从包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQID NO:9的组中选择的一种或多种进一步的抗原的抗体，其中将所述用于特异性地捕获针对SEQ ID NO:1的抗体的工具和所述用于特异性地捕获针对一种或多种进一步的抗原的抗体的工具包被在一个承载体上，优选地共价连接至一个承载体。
在第四个方面，所述问题通过方法，优选地用于诊断疾病的方法而得到解决，其包括在来自受试者的样品中检测针对SEQ ID NO:1的抗体的存在或不存在的步骤。
在一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括在来自受试者的样品，优选地血液或CSF样品中检测针对一种或多种进一步的抗原的抗体的存在或不存在的步骤，所述一种或多种进一步的抗原选自包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9的组。
在一个优选的实施方案中，同时检测针对SEQ ID NO:1的抗体的存在或不存在，和针对从包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9的组中选择的一种或多种进一步的抗原的抗体的存在或不存在。
在一个优选的实施方案中，在空间上分开的结合反应中检测针对SEQ ID NO:1的抗体的存在或不存在和针对一种或多种进一步的抗原的抗体的存在或不存在。
在一个优选的实施方案中，在单罐反应中检测针对SEQ ID NO:1的抗体的存在或不存在和针对一种或多种进一步的抗原的抗体的存在或不存在。
在一个优选的实施方案中，所述方法包括使根据本发明的在诊断学上有用的承载体与来自受试者的样品相接触的步骤。
在一个优选的实施方案中，所述受试者罹患或被怀疑罹患感染性疾病，优选地病毒感染，更优选地黄病毒(优选地从包括寨卡病毒、登革病毒、黄热病毒、TBEV、乌苏土病毒、玻瓦散病毒、西尼罗病毒和JEV的组中选择的黄病毒，优选地寨卡病毒)感染。
在一个优选的实施方案中，所述抗体为哺乳动物抗体，优选地人抗体，更优选地人IgA、IgM或IgG类别抗体，优选地IgG。
在第五个方面，作为本发明基础的问题通过在诊断学上有用的承载体而得到解决，所述承载体被构造成用于捕获在来自受试者的样品中的针对来自黄病毒(优选地寨卡病毒)的NS1的IgA类别抗体，优选地用于诊断黄病毒感染，更优选地用于区分原发与继发黄病毒感染，优选地寨卡病毒感染。
在一个优选的实施方案中，所述承载体另外被构造成用于捕获和特异性地检测针对来自所述黄病毒的NS1的IgM和/或IgG类别抗体，优选地IgM类别抗体，和/或另外被构造成用于捕获针对黄病毒的包膜糖蛋白的抗体。
在另一个优选的实施方案中，所述在诊断学上有用的承载体与针对来自黄病毒的NS1的IgA类别抗体相复合。
在另一个优选的实施方案中，所述复合体进一步包含来自黄病毒的NS1或其变体，和优选地进一步包含检测标记物，该检测标记物更优选地与待检测的抗体或者来自黄病毒的NS1或其变体相联合。
在另一个优选的实施方案中，所述在诊断学上有用的承载体包含所述黄病毒的NS1的二聚体或六聚体。
在第六个方面，所述问题通过包含根据本发明的在诊断学上有用的承载体的试剂盒而得到解决。
在第七个方面，所述问题通过用于诊断黄病毒感染，优选地用于区分原发与继发黄病毒感染的方法而得到解决，所述方法包括下述步骤：
a)在来自受试者的第一样品中检测针对所述黄病毒的NS1的IgA类别抗体。
在另一个优选的实施方案中，使用根据本发明的在诊断学上有用的承载体。
在另一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括下述步骤：
b)在来自所述受试者的第二样品中检测针对所述黄病毒的NS1的IgA类别抗体，
其中所述第二样品比所述第一样品晚至少三天从所述受试者获得。
在另一个优选的实施方案中，另外还检测针对所述黄病毒的NS1的IgM类别抗体，作为步骤a)和/或步骤b)，优选地步骤a)的一部分。
在另一个优选的实施方案中，在步骤a)和/或步骤b)，优选地步骤a)中另外还检测针对所述黄病毒的NS1的IgG类别抗体。
在另一个优选的实施方案中，在步骤a)和/或步骤b)，优选地步骤a)中另外还检测至少一种类别的针对所述黄病毒的包膜糖蛋白的抗体，其中优选地，所述至少一种类别的针对所述黄病毒的包膜糖蛋白的抗体选自包括IgG、IgM和IgA的组，优选地IgA和IgM，或IgA和IgG，或IgM和IgG，更优选地IgA。
在另一个优选的实施方案中，在空间上分开的结合反应中检测每种抗体，根据待检测的抗原和抗体类别来相分开。
在另一个优选的实施方案中，所述黄病毒选自包括下列各项的组：寨卡病毒、登革病毒、黄热病毒、蜱传脑炎病毒、乌苏土病毒、西尼罗病毒和日本脑炎病毒，优选地寨卡病毒。
在第八个方面，所述问题通过这样的用途而得到解决：即针对来自黄病毒，优选地寨卡病毒的NS1的IgA类别抗体，或者用于固定化和任选地检测所述抗体的在诊断学上有用的承载体，用于区分原发与继发黄病毒感染，优选地寨卡病毒感染的用途。
在第九个方面，所述问题通过这样的用途而得到解决：即针对来自黄病毒，优选地寨卡病毒的NS1的IgA类别抗体，或者用于固定化和任选地检测所述抗体的在诊断学上有用的承载体，用于在IgM-缺乏的受试者中诊断黄病毒感染，优选地寨卡病毒感染的用途。
在第十个方面，所述问题通过这样的用途而得到解决：即针对来自黄病毒，优选地寨卡病毒的NS1的IgA类别抗体，或者用于固定化和任选地检测所述抗体的在诊断学上有用的承载体，用于增加用于诊断黄病毒感染，优选地寨卡病毒感染(更优选地在感染的早期)的诊断测定法的诊断可靠性，优选地灵敏度的用途。
本发明提出了检测针对来自寨卡病毒的NS1(SEQ ID NO:1)的抗体，作为在来自被怀疑罹患感染，优选地黄病毒感染，更优选地寨卡病毒感染的患者的样品上施行的诊断方法的一部分。
本发明人已经令人惊讶地发现，寨卡病毒感染可以通过在来自患者的样品中检测抗体来进行诊断和与其他黄病毒感染相区分，其中具有令人惊讶地高的诊断可靠性程度，特别是相对于源自其他黄病毒的NS1抗原，具有出人意料的低的交叉反应性程度。
本发明人还已经令人惊讶地发现，有些患者(尽管已暴露于黄病毒)并不具有允许监测感染过程的IgM滴度，但是具有可以使用的令人惊讶地动态的针对所述黄病毒的NS1的IgA的滴度。更令人惊讶地，这些IgA抗体不显示出交叉反应性程度，正如所预期的那样，所述交叉反应性将会使得区分急性寨卡病毒感染与先前的黄病毒感染(优选地除寨卡病毒之外的其他黄病毒的感染)是不足够可靠的。
本发明人还已经令人惊讶地发现，寨卡病毒NS1抗原以寡聚体形式和复合物(其具有对于在诊断测定法中应用来说意义重大的令人惊讶的特性)存在，在它们之中包括单体、二聚体和六聚体，以及与哺乳动物载脂蛋白(其当与寨卡病毒NS1相复合时，增强该抗原的诊断可靠性和稳定性)的复合物生成。
本发明涉及在诊断学上有用的承载体，其优选地为由人工材料例如玻璃或塑料制成的固体承载体，用于使工具(所述工具与所述承载体相联合，所述工具用于特异性地捕获抗体)与来自受试者，优选地哺乳动物受试者，更优选地人受试者的体液样品相接触。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“捕获的”或“特异性地捕获的”意指，在用于特异性地进行捕获的工具和待捕获的抗体之间的结合比以1×10-5M，更优选地1×10-7M，更优选地1×10-8M，更优选地1×10-9M，更优选地1×10-10M，更优选地1×10-11M，更优选地1×10-12M的解离常数为特征的结合反应更强，所述解离常数通过使用Biacore设备在25℃下在pH 7的PBS缓冲液中经由表面等离子体共振来测定。所述在诊断学上有用的承载体可以包含一个或多个对照，其优选地选自确认样品已被添加的对照和/或确认二抗已被添加的对照。
在一个优选的实施方案中，被特异性地捕获的抗体可以是来自某一抗体类别的抗体，所述抗体类别优选地选自IgG、IgM和IgA，更优选地IgA。在另一个优选的实施方案中，被特异性地捕获的抗体可以是针对黄病毒抗原的抗体，所述黄病毒抗原优选地选自包括NS1和包膜糖蛋白的组，优选地NS1。在一个更优选的实施方案中，被特异性地捕获的抗体为针对SEQ ID NO:1，优选地针对对于被抗体识别来说足够长的来自SEQ ID NO:1的表位的IgM或IgA，优选地IgA类别抗体，所述表位(相关于SEQ ID NO:1而言)包含一个或多个从包括Arg62、Ile66、Arg69、Glu72、Gly73(其中的后者可以被丝氨酸或丙氨酸置换)的组中选择的氨基酸，优选地包含序列Arg62至Gly73的肽；一个或多个从包括Gln102、Pro105(其中的后者可以被中性和短侧链氨基酸例如Ser或Ala置换)和Glu110的组中选择的氨基酸，优选地包含序列Gln102至Glu110的肽；包含残基Ser121至Thr129的肽、包含残基Asp138至Lys141的肽、包含残基Asp174至Glu178的肽和包含Ser322至Lys326的肽。在一个优选的实施方案中，所述固体承载体为诊断装置，其更优选地选自包括珠粒(优选地顺磁性颗粒)、测试条、微量滴定板、印迹、玻璃表面、生物芯片和膜的组，更优选地选自包括珠粒、印迹、测试条和微量滴定板的组。
所述在诊断学上有用的承载体可以为包含被构造成用于免疫测定法例如ELISA测定法的一系列孔的微量滴定板。在一个优选的实施方案中，术语“微量滴定板”为诊断装置，其优选地由玻璃或塑料，更优选地塑料制成，其包含一个或多个，优选地多于一个，更优选地至少8个孔，在所述孔中在液体缓冲液中的反应可以分开地运行而没有交叉污染。所述孔中的至少一个包被有多肽，优选地可以用于特异性地捕获在诊断学上有用的抗体的抗原性多肽。如果使用多于一种用于特异性地检测抗原的工具，那么优选地，每种工具在与其他工具分开的孔中。所述微量滴定板可以用于平行地运行数个样品，优选地以自动化的方式。所述孔优选地与至少一种常规检测技术例如比色法、免疫荧光、酶促活性检测、化学发光、放射性等相容。合适的微量滴定板是商购可得的。如果所述在诊断学上有用的承载体为微量滴定板，那么优选的是，至少50％、60％、70％、80％或90％，优选地50％的任何黄病毒NS1，优选地寨卡病毒NS1，为六聚体或二聚体，优选地二聚体。
所述在诊断学上有用的承载体可以为被构造成用于免疫测定法的珠粒，其含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽。在一个更优选的实施方案中，所述珠粒为顺磁性微颗粒，其可以通过施加磁场而被从溶液中移除，并被集中，优选地在容器的表面上。所述珠粒包含通过共价或非共价键与所述珠粒相连接的抗原。如果使用多于一种珠粒，那么珠粒制备物可以通过向所述珠粒共价地附着通用配体来制作，所述通用配体与可以通过基因工程而融合至一种或多种根据本发明的多肽的标签强烈地结合。然后，可以将所述珠粒制备物分成多于一个批次，并且使每个批次与不同的与标签相融合的多肽相接触以便产生一系列承载体，每个具有不同的经固定化的多肽。可以制备珠粒混合物，例如所述珠粒之一携带包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽，并且至少再有一个珠粒携带包含从包括SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:9的组中选择的序列的多肽。如果所述在诊断学上有用的承载体为珠粒，那么优选的是，至少50％、60％、70％、80％或90％，优选地50％的任何黄病毒NS1，优选地寨卡病毒NS1，为单体、六聚体或二聚体，优选地单体。
所述在诊断学上有用的承载体可以为线印迹(Raoult,D.和Dasch,G.A.(1989),The line blot:an immunoassay for monoclonal and otherantibodies.Itsapplication to the serotyping of gram-negative bacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65；WO2013041540)。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“线印迹”是指测试条，更优选地基于膜的测试条，其已经包被了一种或多种用于捕获抗体的工具，优选地每种多肽。如果使用两种或更多种工具，那么它们优选地在承载体上是在空间上分开的。优选地，条带的宽度为测试条的宽度的至少30％，更优选地40％、50％、60％、70％或80％。所述测试条可以包含一个或多个对照条带，其用于确认测试条已经时间足够长地并且在合适的条件下(特别是在人血清、抗体缀合物或两者的存在下)与样品进行了接触。许多线印迹是商购可得的，例如来自EUROIMMUN AG,Lübeck,Germany。如果所述在诊断学上有用的承载体为线印迹，那么优选的是，至少50％、60％、70％、80％或90％，优选地50％的任何黄病毒NS1，优选地寨卡病毒NS1，为六聚体或二聚体，优选地六聚体。
所述在诊断学上有用的承载体可以为包被有细胞的载玻片，所述细胞优选地为真核细胞，更优选地昆虫细胞或哺乳动物细胞，优选地表达黄病毒NS1(优选地包含SEQ IDNO:1的多肽)的人细胞。所述细胞可以是活细胞，但优选地是固定细胞。然后，可以使用免疫荧光来检测抗体。优选地，所述细胞为过表达黄病毒NS1的重组细胞。所述黄病毒NS1可以定位于细胞膜，优选地在细胞的表面上。如果所述在诊断学上有用的承载体为载玻片，那么优选的是，至少50％、60％、70％、80％或90％，优选地50％的任何黄病毒NS1，优选地寨卡病毒NS1，为六聚体或二聚体，优选地二聚体。
根据本发明，所述在诊断学上有用的承载体被构造成用于捕获针对黄病毒抗原的抗体。所述承载体包含一种或多种用于特异性地捕获抗体的工具，优选地一种或多种，更优选地两种或更多种，更优选地三种或更多种，更优选地四种或更多种这样的工具，它们中的每一种能够特异性地捕获不同的抗体。备选地，可以使用一种或多种承载体，优选地两种或更多种、三种或更多种或者四种或更多种承载体，每种承载体包含用于特异性地捕获抗体的工具。所述用于特异性地捕获抗体的工具可以为与某一Ig类别(其优选地选自包括IgG、IgM和IgA的组，更优选地IgA类别抗体)的所有抗体相结合的抗体。所述工具优选地固定化在所述承载体上。在一个优选的实施方案中，所述用于特异性地捕获抗体的工具为多肽，优选地二聚体和/或六聚体，更优选地二聚体，其包含从包括下列各项的组中选择的抗原或由从包括下列各项的组中选择的抗原组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9或其变体，优选地SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9或其变体，和至少一种，最优选地，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或其变体之一。在另一个优选的实施方案中，使用包含SEQ ID NO:1的多肽，包含SEQ IDNO:6的多肽，包含SEQ ID NO:7的多肽，包含SEQ ID NO:8的多肽，和从包括包含SEQ ID NO:2的多肽、包含SEQ ID NO:3的多肽、包含SEQ ID NO:4的多肽和包含SEQ ID NO:5的多肽或其变体的组中选择的至少一种多肽，优选地所有多肽。在另一个优选的实施方案中，使用包含SEQ ID NO:1的多肽、包含SEQ ID NO:2的多肽、包含SEQ ID NO:3的多肽、包含SEQ IDNO:4的多肽、包含SEQ ID NO:5的多肽和包含SEQ ID NO:6的多肽或其变体。优选地，对于每种承载体使用至少0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10或100μg的多肽，作为用于特异性地捕获抗体的工具。
在一个优选的实施方案中，所述在诊断学上有用的承载体包含一种或多种用于特异性地捕获针对黄病毒包膜糖蛋白的抗体的工具，优选地包含从包括SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18和SEQ ID NO:27及其变体的组中选择的序列的抗原性多肽。
所述在诊断学上有用的承载体可以包含一种或多种工具，每种工具用于捕获针对从包括黄病毒的NS1和黄病毒的包膜糖蛋白的组中选择的黄病毒抗原的抗体，优选地包含用于捕获两种抗体的两种工具，一种抗体针对NS1和一种抗体针对来自相同黄病毒的包膜糖蛋白，更优选地一种抗体针对来自寨卡病毒的NS1和一种抗体针对来自寨卡病毒的包膜糖蛋白(分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:11)。
所述抗原，与它所附着至的不可溶的承载体一起，可以以直接了当的方式，例如通过过滤、离心、磁力或滗析，与来自受试者的样品相分开。所述抗原可以以可逆或不可逆的方式进行固定化。例如，如果所述分子通过离子相互作用(其可以通过添加高浓度的盐来掩蔽)与所述承载体相互作用，或者如果所述分子通过可切割的共价键或非共价键而结合，那么所述固定化是可逆的。相反地，如果所述分子通过在水溶液中不能切割的共价键而系连至所述承载体，那么所述固定化是不可逆的。所述多肽可以间接地固定化，例如通过使具有对于所述多肽的亲和力的抗体或其他实体固定化，随后为所述多肽的添加和多肽-抗体复合物的形成。非共价键可以通过下述方式来制备：将配体以化学方式附着至所述承载体，优选地通过共价键，并且将具有对于所述配体的亲和力的多肽融合至根据本发明的多肽。在一个优选的实施方案中，所述配体选自包括下列各项的组：生物素(在该情况下所述具有亲和力的多肽可以为链霉抗生物素蛋白或与生物素结合的其变体)、谷胱甘肽(所述具有亲和力的多肽：谷胱甘肽-S-转移酶)、镍(所述具有亲和力的多肽：His标签)、Flag标签(所述具有亲和力的多肽：抗-flag抗体)、碳水化合物例如麦芽糖或纤维素(所述具有亲和力的多肽：麦芽糖或纤维素结合蛋白)；和优选地为生物素。
包含SEQ ID NO:1或其变体的根据本发明的多肽，或者另外还有包含从包括SEQID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ IDNO:8，SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9及其变体的组中选择的序列的多肽，可以通过待检测的在诊断学上意义重大的抗体(其通过直接附着至所述承载体的另一种抗体而固定化在所述承载体上)来固定化。所述另一种抗体可以为Ig类别特异性抗体，其优选地选自包括IgM、IgG和IgA类别特异性抗体的组，更优选地IgA类别特异性抗体。这样的类别特异性抗体(其是商购可得的)的结合位点可以是人抗体的恒定区。
本发明的教导不仅可以通过使用多肽(其具有在本申请中明确地(例如通过功能、名称、序列或登录号)或含蓄地提及的精确序列)，例如SEQ ID NO:1，任选地与一种或多种进一步的抗原例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9相组合地，来实施；而且还可以通过使用此类多肽的变体来实施。
在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“变体”可以是指所提及的全长序列的至少一个片段，更特别地，一种或多种相对于全长序列而言在一个或两个末端处截短了一个或多个氨基酸的氨基酸或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原始序列或其变体的至少10、15、25、50、75、100、150、200、250或300个连续氨基酸的肽。所述变体的总长度可以为25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸。
在另一个优选的实施方案中，术语“变体”不仅涉及至少一个片段，而且还涉及包含与所提及的参考氨基酸序列或其片段至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的氨基酸序列的多肽或其片段，优选地包含至少25个，更优选地50个，更优选地200个，更优选地300个连续氨基酸的片段，其中除对于生物学活性(例如特异性地结合目的抗体的能力)或者所述多肽的折叠或结构来说必需的那些之外的其他氨基酸被缺失或置换，和/或一个或多个此类必需的氨基酸以保守的方式被替换，和/或添加或缺失氨基酸，从而所述多肽的生物学活性至少部分地被保留。已知的方法包括可以用于比对两个给定的核酸或氨基酸序列并计算出同一性程度的各种方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,Oxford University Press,2008,第3版。在一个优选的实施方案中，使用ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007):Clustal W and Clustal X version2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)，其中应用默认设置。
在一个优选的实施方案中，变体另外还可以包含化学修饰，例如同位素标记物或共价修饰例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧基化、瓜氨酸化、羟基化等。本领域技术人员熟悉用于修饰多肽的方法。此外，变体也可以通过与其他已知的多肽或其变体相融合来产生。
所述多肽的变体具有生物学活性。在一个优选的实施方案中，这样的生物学活性为结合(优选地，特异性地捕获)各自抗体的能力，如果所述变体为具有从包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27的组中选择的序列的变体，优选地SEQ ID NO:1的变体。例如，SEQ ID NO:1的变体具有特异性地结合在从被怀疑罹患病毒感染的受试者获得的样品中的针对SEQ ID NO:1的抗体的能力。此类变体具有至少一个被待捕获的抗体所识别的表位，例如在SEQ ID NO:1中的一个表位，如果捕获针对SEQ ID NO:1的抗体。本领域技术人员能够通过下述方式来设计变体：从原始SEQ ID NO:1序列开始，引入修饰例如点突变、截短等，和随后通过测试所述变体是否结合在从罹患待被诊断的疾病，优选地感染，更优选地病毒感染，更优选地黄病毒感染，最优选地寨卡病毒感染的受试者获得的样品中的针对SEQ ID NO:1的抗体来确认所述变体仍然具有生物学活性。寨卡病毒NS1和相关黄病毒的3D蛋白质结构已经发表，并且可以用于在变体的设计和可以进行变化而不损害生物学活性的序列的选择中进行指导，和将它们与重要的表位相区分(例如Xu等人,Contribution of intertwined loop to membraneassociation revealed by Zika virus full-length NS1structure,EMBO J.，2016年8月30日发表,开放获取；Akey等人,Flavivirus NS1 structures reveal surfaces forassociations with membranes and the immune system,Science 21；343(6173):881-5.doi:10.1126/science；WO2015/095735)。例如，关于SEQ ID NO:1，对于寨卡病毒NS1来说独特的且不应当被置换(特别地不以非保守的方式)的区域包括残基62至73，优选地包含Arg62、Ile66、Arg69、Glu72、Gly73(其可以被中性氨基酸置换)的那些；残基102至110，优选地Gln102、Pro105(其可以被中性氨基酸和短侧链氨基酸例如Ser或Ala置换)和Glu110；残基121至129；残基138至141；残基174至178；和残基322至326。根据本发明所提供和使用的哺乳动物(优选地牛)载脂蛋白的生物学活性为结合包含黄病毒NS1(优选地SEQ ID NO:1)的多肽并与之形成复合物的能力。变体可以通过下述方式来进行鉴定：鉴定源自全长蛋白质或其前体的此类载脂蛋白的天然出现的片段，例如通过使用NS1作为亲和配体来纯化它们，随后为N-末端Edman测序和/或胰蛋白酶消化(与质谱法相组合)，并使用它们来实施本发明。保守氨基酸置换可以用于所有变体。
如果使用多肽作为用于特异性地捕获抗体的工具，那么所述多肽(其优选地包含一个或多个从包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27的组中选择的序列，优选地SEQ ID NO:1)当用于实施本发明的教导时，可以以任何形式和以任何纯化程度来提供，从包含以内源形式的所述多肽的组织或细胞，更优选地过表达所述多肽的细胞，此类细胞的粗制的或经富集的裂解物，到经纯化和/或分离的多肽(其可以是基本上纯的)。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“过表达”意指，所述细胞，优选地真核细胞，更优选地哺乳动物细胞或昆虫细胞，更优选地哺乳动物细胞，更优选地人细胞，最优选地HEK293或HEK293T细胞，已经进行了基因工程改造，从而它比未改造的野生型细胞表达更多的目的蛋白质。在一个优选的实施方案中，所述多肽为天然多肽，其中在本文中所使用的术语“天然多肽”是指包含至少15、30、50、100、150、200、300或350个氨基酸，优选地多于30个氨基酸的折叠多肽，更优选地是指从组织或细胞中，更优选地从哺乳动物细胞或组织中，任选地从非重组的组织或细胞中纯化的折叠多肽。在另一个优选的实施方案中，所述多肽为具有至少7个，更优选地至少10个氨基酸残基的线性肽。如果使用天然多肽，那么它优选地相比于其天然状态而言是经富集的。重组多肽可以包含用于亲和纯化、固定化或检测的C-末端或N-末端标签，例如His标签，如由SEQ ID NO:10所例示的，或链霉抗生物素蛋白标签，优选地链霉抗生物素蛋白，所述标签可以优选地通过使用分别识别在该标签和N-末端或C-末端之间的多肽连接体中的蛋白酶切割位点的蛋白酶进行切割来去除，作为纯化或方法的一部分。随后，可以将经切割的多肽附着至在诊断学上有用的承载体，从而产生根据本发明的在诊断学上有用的承载体。在另一个优选的实施方案中，所述用于特异性地捕获抗体的工具为被寨卡病毒感染的真核细胞，优选地人细胞。这样的细胞可以通过荧光显微术来进行评价。所述细胞可以是被瞬时地或稳定地转染的，优选地被瞬时地转染的。
根据本发明，提供了编码根据本发明的多肽例如包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽的核酸，其任选地具有诱导型启动子，所述多肽优选地是为了用于诊断疾病或者制备用于此类用途的试剂盒或试剂。所述核酸可以为载体，其优选地用于表达所述核酸。还提供了包含该载体和优选地表达由所述载体所编码的多肽的真核细胞或原核细胞，优选地真核细胞。所述核酸、载体和细胞可以用于制备用于根据本发明的用途的试剂盒，例如针对NS1的抗体，优选地针对来自黄病毒，优选地寨卡病毒的NS1的IgA类别抗体，或者用于固定化和任选地检测所述抗体的在诊断学上有用的承载体，用于区分原发与继发感染，优选地寨卡病毒感染的用途；针对来自黄病毒，优选地寨卡病毒的NS1的IgA类别抗体，或者用于固定化和任选地检测所述抗体的在诊断学上有用的承载体，用于在IgM-缺乏的受试者中诊断黄病毒感染，优选地寨卡病毒感染的用途；例如，针对来自黄病毒，优选地寨卡病毒的NS1的IgA类别抗体，或者用于固定化和任选地检测所述抗体的在诊断学上有用的承载体，用于增加用于诊断黄病毒感染，优选地寨卡病毒感染(更优选地在感染的早期)的诊断测定法的诊断可靠性，优选地灵敏度的用途，或者例如用于区分原发与继发感染，优选地寨卡病毒感染的用途，或者例如用于增加用于诊断黄病毒感染，优选地寨卡病毒感染(更优选地在感染的早期)的诊断测定法的诊断可靠性，优选地灵敏度的用途。可以使所述核酸表达，纯化并使用所编码的多肽，优选地将其包被在在诊断学上有用的承载体上，以便制备根据本发明的在诊断学上有用的承载体。在一个优选的实施方案中，术语“早期”是指在症状发作后的前60天，优选地前40天之前的时间段，其中更优选地，可以观察到没有IgG类别抗体的增加。
根据本发明在方法中或作为承载体的一部分进行提供或使用的或者以任何其他方式进行使用的多肽可以是经糖基化的或非糖基化的，优选地经糖基化的。经糖基化的包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:9或者其变体的多肽可以通过从真核细胞，优选地HEK293或HEK293T细胞中纯化所述多肽来获得。经均质地糖基化的多肽可以通过从真核细胞的胞质级分中纯化所述多肽来获得，经异质地糖基化的多肽可以通过在培养表达所述多肽的真核细胞后从细胞培养物上清液介质中纯化所述多肽来获得。非糖基化的多肽可以通过对从真核细胞中纯化出的多肽进行酶促去糖基化或者通过纯化在原核细胞中表达的多肽来获得。
在一个优选的实施方案中，包含从包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQID NO:9或其变体的组中选择的序列(优选地SEQ ID NO:1或其变体)的多肽可以作为根据本发明的在诊断学上有用的承载体、方法或用途的一部分来进行提供或使用，以包含一个或多于一个单体，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个单体的各种寡聚体形式；并且可以用作例如用于捕获针对黄病毒NS1(优选地包含SEQ ID NO:1或其变体)的抗体，任选地针对黄病毒NS1的IgA类别抗体的工具，以单体、二聚体或六聚体，优选地二聚体的形式。在一个优选的实施方案中，所述单体、二聚体或六聚体，优选地二聚体，已经从真核细胞，优选地重组真核细胞，例如HEK293T或HEK293细胞中纯化出来，优选地从细胞质级分(其包含二聚体形式)或其中细胞进行生长的细胞培养基(其包含分泌到培养基中的六聚体形式)中纯化，优选地从胞质级分中纯化。在另一个优选的实施方案中，使用寡聚体形式的混合物(其优选地从真核细胞中纯化)，其中二聚体与六聚体的摩尔比为至少0.1:1，优选地0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、5:1或10:1。在另一个优选的实施方案中，使用寡聚体形式的混合物(其优选地从真核细胞中纯化)，其中六聚体与二聚体的摩尔比为至少0.1:1，优选地0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、5:1或10:1。在一个优选的实施方案中，使用六聚体作为用于捕获IgG类别抗体的工具。在另一个优选的实施方案中，使用二聚体来捕获IgM类别抗体。
备选地，可以使用原核细胞或化学合成来表达或获得以及纯化多肽寡聚体，优选地二聚体或六聚体，任选地通过化学交联和分离寡聚体，优选地二聚体或六聚体。本领域技术人员熟悉用于分离或富集某些寡聚体形式的技术，例如使用大小排阻色谱法。引起单体联合成寡聚体的在寡聚体形式中的单体的界面优选地由SEQ ID NO:1或其变体(其是在所述寡聚体形式中的单体的序列的一部分)构成。
包含多于一个单体的寡聚体可以通过在所述两个或更多个形成这样的寡聚体的单体之间的非共价或共价键，优选地共价键来稳定化。在一个优选的实施方案中，所述寡聚体通过一个或多个在单体之间的经由一个或多个半胱氨酸侧链的共价键来稳定化。所述共价键可以为二硫键，或者包含含有两个与硫羟基团反应的官能团的连接体，所述连接体在所述两个官能团与两个硫羟基团进行反应后连接两个侧链残基。在一个更优选的实施方案中，该共价键在两个在所述蛋白质的天然自然状态下通常不形成二硫键的半胱氨酸残基侧链之间，如在Xu等人(Contribution of intertwined loop to membrane associationrevealed by Zika virus full-length NS1 structure,EMBO J.,2016年8月30日发表,公开获取)中所提及的。在另一个优选的实施方案中，所述寡聚体通过在单体之间的非共价键来稳定化，并且至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个半胱氨酸残基被氧化，从而形成单体间二硫键。
在一个优选的实施方案中，黄病毒NS1，优选地SEQ ID NO:1或其变体，与脂质相复合，所述脂质优选地源自细胞膜，更优选地源自真核细胞膜例如HEK293细胞膜。
当实施本发明时，寡聚体形式例如二聚体或六聚体可以以均质或异质寡聚体的形式进行使用，其中均质寡聚体包含两个或更多个不同的单体，其任选地源自从包括下列各项的组中选择的不同的黄病毒序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9或其变体，优选地SEQ ID NO:1或其变体。例如，异质二聚体可以含有包含SEQ ID NO:1的单体和包含SEQ ID NO:2的单体。相反地，异质寡聚体包含两个单体，其均源自相同的从包括下列各项的组中选择的序列，并且任选地是相同的：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9或其变体，优选地SEQ ID NO:1或其变体。
在一个优选的实施方案中，待检测的抗体可以为针对从包括下列各项的组中选择的多肽的单体、二聚体和/或六聚体，优选地二聚体的抗体：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9或其变体，优选地SEQ ID NO:1或其变体。所述抗体或者与从包括SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9或其变体的组中选择的多肽(优选地SEQ ID NO:1或其变体)相结合的抗体可以作为分离的和/或重组的抗体或抗体片段来提供，不论寡聚体状态如何。
在另一个优选的实施方案中，在与哺乳动物多肽，优选地非人多肽例如牛多肽，例如哺乳动物载脂蛋白A-I，更优选地人(NCBI参考序列:NP_000030.1)或牛载脂蛋白A-I(GenBank:AAI02942.1；在该文献中所引用的所有数据库编号是指在优先权日时在各自数据库中的条目)，或人(NCBI:NP_000375.2)或牛载脂蛋白B-100同种型X1(NCBI:XP_015329038.1或其变体)，最优选地牛载脂蛋白A-I或其变体的混合物中，使用包含从包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9及其变体的组中选择的序列(优选地SEQ ID NO:1或其变体)的多肽，优选地二聚体和/或六聚体，优选地六聚体。所述混合物可以包含由下列组分形成的复合物：包含从包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQID NO:9及其变体的组中选择的序列(优选地SEQ ID NO:1或其变体)的多肽，优选地二聚体和/或六聚体，优选地六聚体；和作为该复合物的第二个组分，哺乳动物载脂蛋白A-I，更优选地人(NCBI参考序列:NP_000030.1)或牛载脂蛋白A-I(GenBank:AAI02942.1)，最优选地牛载脂蛋白A-I或其变体，所述复合物可以用于实施本发明，例如用于诊断疾病，更特别地用作用于捕获抗体的工具。在所述混合物，优选地所述复合物中，多肽单体和哺乳动物载脂蛋白A-1之间的摩尔比可以为至少1:1、2:1、5:1、6:1、10:1、50:1或100:1。
根据本发明，所述多肽可以为重组蛋白质，其中在本文中所使用的术语“重组(的)”是指在产生过程的任何阶段通过使用基因工程方法而产生的多肽，例如通过将编码所述多肽的核酸与用于在细胞或组织中进行过表达的强启动子相融合，或者通过改造所述多肽本身的序列。本领域技术人员熟悉用于改造核酸和所编码的多肽的方法(例如，在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning,CSH中或在Brown T.A.(1986),Gene Cloning–an introduction,Chapman&Hall中所描述的)，和用于产生和纯化天然或重组多肽的方法(例如，由GE Healthcare Life Sciences公开的手册“Strategies for Protein Purification”、“Antibody Purification”，和在Burgess,R.R.,Deutscher,M.P.(2009):Guide to Protein Purification中)。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的并用于本发明的各种实施方案的多肽是分离的多肽，其中在本文中所使用的术语“分离的”意指，该多肽相比于在使用生物技术或合成方法来产生后的其状态而言是已经经富集的，并且优选地是纯的，即在各自样品中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的多肽由所述多肽组成，如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及随后的考马斯蓝染色和目视检查所判断的。
根据本发明的受试者为产生抗体，优选地IgA、IgM和/或IgG类别抗体的生物，其更优选地来自哺乳动物，最优选地人。根据本发明，针对SEQ ID NO:1的IgM和IgG类别抗体可以在分开的测定法反应中进行检测，例如以便测定受试者首次被感染时的时间。
包含用于特异性地捕获针对抗原例如SEQ ID NO:1的抗体的工具的在诊断学上有用的承载体在本发明的范围之内。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“特异性地捕获抗体”是指这样的的能力：即特异性地结合目的抗体，优选地IgA、IgM或IgG类别抗体，以便它被结合并从样品中移除，而其他抗体(优选地来自相同类别和/或针对另一种抗原)则基本上不被结合并留在样品中。所述抗体优选地为仅结合目的抗原(例如由SEQ IDNO:1所表示的抗原)，而不结合来自其他病毒的其他同源抗原(例如由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所表示的那些抗原)的抗体。
根据本发明的在诊断学上有用的承载体充当关于所述一种或多种用于特异性地捕获抗体(优选地针对黄病毒抗原例如由SEQ ID NO:1所表示的抗原的在诊断学上意义重大的抗体)的工具的支架。所述承载体适合于实施诊断方法。通过使用承载体而不是游离的、可溶性的用于特异性地捕获抗体的工具，可以更直接了当地从样品中分离和分开包含所述工具和抗体的复合物并且洗涤所述复合物，例如为了去除任何与所述工具、复合物或承载体非特异性地结合的分子的目的。在一个优选的实施方案中，所述在诊断学上有用的承载体为诊断装置，其优选地选自包括珠粒(优选地顺磁性颗粒)、测试条、微量滴定板、印迹和膜的组，和优选地为线印迹或微量滴定板，更优选地微量滴定板。
在一个优选的实施方案中，所述在诊断学上有用的装置为微量滴定板，其包含包被有用于特异性地捕获针对SEQ ID NO:1的抗体的工具的孔，所述工具优选地为包含SEQID NO:1或其变体的多肽。另外，所述孔包含用于检测针对SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4和SEQ ID NO:5中的至少一个(优选地它们全部)的抗体的工具，优选地包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5或其他变体中的至少一个的多肽。另外，所述孔包含用于特异性地捕获针对SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中的每一个的抗体的工具，优选地包含SEQ ID NO:6或其变体、SEQ ID NO:7或其变体、SEQID NO:8或其变体和SEQ ID NO:9或其变体的多肽。另外，分开的孔可以包含一种或多种用于检测基孔贡亚病毒感染的抗原。
在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“特异性地检测所捕获的抗体”意指，在捕获后检测与用于特异性地捕获抗体的工具(优选地包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽)特异性地结合的抗体，而不是在样品中存在的任何其他抗体。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“特异性地结合”意指，所述结合比以1×10-5M，更优选地1×10- 7M，更优选地1×10-8M，更优选地1×10-9M，更优选地1×10-10M，更优选地1×10-11M，更优选地1×10-12M的解离常数为特征的结合反应更强，所述解离常数通过使用Biacore设备在25℃下在pH 7的PBS缓冲液中经由表面等离子体共振来测定。
在一个优选的实施方案中，所述用于特异性地捕获针对SEQ ID NO:1的抗体的工具和所述用于特异性地捕获针对一种或多种进一步的抗原(其优选地选自包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:19和SEQ ID NO:9的组)的抗体的工具在分开的承载体上。这意味着，所述工具不是附着至单个承载体，而是附着至一个或多个分开的和/或在不损坏它们的情况下可分开的承载体上。例如，所述用于特异性地捕获针对SEQ ID NO:1的抗体的工具可以附着至第一测试条，而所述用于特异性地捕获针对SEQ ID NO:2的抗体的工具附着至与所述第一测试条分开的另一测试条。
在一个优选的实施方案中，所述用于特异性地捕获针对SEQ ID NO:1的抗体的工具和所述用于特异性地捕获针对一种或多种进一步的抗原(其优选地选自包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:19和SEQ ID NO:9的组)的抗体的工具在一个承载体上，优选地共价连接至一个承载体。这意味着，所述工具附着至一个承载体，其不可以在不损坏该承载体的情况下被拆开，从而所述工具在分开的承载体上。例如，所述工具可以都包被在一个测试条上，特别是以线印迹的形式。
根据本发明，提供了用于特异性地检测所捕获的抗体的工具，任选地作为试剂盒的一部分。
本发明的教导提供了试剂盒，其优选地用于诊断感染，更优选地用于诊断黄病毒感染，最优选地寨卡病毒感染。这样的试剂盒是一种容器，其包含对于实施本发明的方法来说所需要的特殊试剂，特别是根据本发明的在诊断学上有用的承载体，任选地除了一种或多种对于实施本发明方法来说所需要的溶液之外，所述溶液优选地选自或所有均来自包括下列各项的组：样品稀释缓冲液，洗涤缓冲液，以及包含用于检测任何被特异性地捕获的抗体的工具(例如二抗)和任选地用于检测被特异性地捕获的抗体的工具(其可以任选地附着至二抗)(例如发荧光的、具有酶促活性的、放射性的、化学发光的(优选地电化学发光的)标记物或者自旋标记物)的缓冲液。所述试剂盒可以包含用于实施检测反应的化学溶液，例如用于比色反应的3,3',5,5'-四甲基联苯胺、磷酸对硝基苯酯、2,2'-连氮基-双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]或邻苯二胺二盐酸盐，用于电化学发光反应的三丙胺。进一步地，它可以包含使用说明书，其详细说明了如何使用该试剂盒，和如何使用用于使本发明的多肽与来自受试者(优选地人受试者)的体液样品相接触的本发明的在诊断学上有用的承载体例如线印迹，其中本发明的用于特异性地捕获SEQ ID NO:1的工具，优选地包含fSEQ ID NO:1或其变体的多肽，被固定化在线印迹上。进一步地，所述试剂盒可以包含阳性对照，例如已知与SEQ ID NO:1相结合的重组抗体；和阴性对照，例如不具有可检测的对于SEQ ID NO:1的亲和力的蛋白质。最后，所述试剂盒可以包含标准溶液，其包含用于制作校准曲线的结合SEQID NO:1的抗体。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含装置，优选地基于印迹的装置，例如包被有用于特异性地捕获针对SEQ ID NO:1的抗体和任选地针对一种或多种进一步的抗原(例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:9)的抗体的工具的线印迹。所述试剂盒可以包含一种或多种进一步的对照，其选自确认样品已被添加的对照和/或确认二抗已被添加的对照。
根据本发明，可以使用用于检测所述一种或多种所捕获的抗体的工具。本领域技术人员知道许多可以使用的方法，其也描述在现有技术中，例如在Zane,H.D.(2001),Immunology–Theoretical&Practical Concepts in Laboratory Medicine,W.B.SaundersCompany中，特别是在第14章中。在一个优选的实施方案中，使用与所述一种或多种所捕获的抗体(其是相应的一抗)的恒定区相结合的二抗，所述二抗可以与直接了当地进行检测的标记物相联合。备选地，抗原性多肽(其优选地选自包含这样的序列的多肽的组，所述序列选自包括下列各项的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9及其变体，优选地SEQ ID NO:1或其变体)可以用于检测在诊断学上意义重大的抗体，优选地在其固定化之后，其中所述多肽优选地包含直接了当地进行检测的标记物。这样的抗原性多肽可以与任何经固定化的在诊断学上有用的抗体相结合，以允许特异性的检测。直接了当地进行检测的标记物可以选自包括直接了当地进行检测的标记物的组，例如发荧光的、化学发光的(例如电化学发光的)、放射性的标记物，自旋标记物，或具有酶促活性的标记物，后者可以催化化学发光反应，或者它可以通过使用比色法、荧光检测(例如荧光显微术)、光电倍增或光谱学或者另一种分析方法而导致产生可检测的分子或信号例如光子。
在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“诊断”是指任何类型的旨在下列目的的程序：获得在评估患者是否在过去、在诊断之时或在未来罹患或可能罹患或比平均或比较受试者(其优选地具有相似的症状)更可能罹患某种疾病或病症之中有帮助的信息；发现疾病如何正在进展或在未来可能如何进展；或者评价患者对于某一治疗(例如，施用合适的药物，例如用于使变态反应性患者脱敏的药物)的应答性。换言之，术语“诊断”不仅包括诊断，而且还包括预测和/或监测疾病或病症的过程。
因此，术语“诊断”优选地并不暗示根据本发明的诊断方法或试剂将会是决定性的并且足以基于单个测试(更不用说参数)来完成诊断，而是可以是指对于所谓的“鉴别诊断”(即在一系列诊断参数的基础上考虑一系列可能状况的可能性的系统性诊断程序)的贡献。术语“诊断”还可以是指用于为患者选择最具希望的治疗方案的方法或试剂。换言之，所述方法或试剂可以涉及为受试者选择治疗方案。
本发明涉及包括下述步骤的方法：在来自受试者的样品中检测针对抗原性多肽(例如包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽)的抗体的存在或不存在。该方法优选地包括使所述抗体固定化，随后为特异性地检测所述抗体，例如通过下列步骤：a)提供来自受试者的样品；b)使所述样品与根据本发明的在诊断学上有用的承载体在与包含所述在诊断学上有用的承载体和所述抗体(更特别地，所述用于特异性地捕获抗体的工具和所述抗体)的复合物的形成相容的条件下相接触；c)分离任何所述复合物，例如通过去除样品；d)任选地，洗涤所述复合物；和e)任选地，检测所述复合物。所述方法优选地为体外方法。用于根据本发明的预后、诊断、方法或测试试剂盒的复合物的检测包括使用从包括下列各项的组中选择的方法：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定法，凝集技术，标记免疫测定法例如从包括放射性标记免疫测定法的组中选择的那些，酶免疫测定法例如比色测定法，化学发光法优选地电化学发光法，免疫测定法，和免疫荧光技术。本领域技术人员熟悉这些方法，其也描述在现有技术中，例如在Zane,H.D.(2001),Immunology–Theoretical&PracticalConcepts in Laboratory Medicine,W.B.Saunders Company中，特别是在第14章中。所述方法可以进一步涉及测试在样品中的针对SEQ ID NO:1的抗体，优选地针对SEQ ID NO:1的抗体的亲和力。
在实施本发明的方法时获得的产品为在诊断学上有用的承载体，其包含与针对SEQ ID NO:1的抗体相复合的用于特异性地检测针对SEQ ID NO:1的抗体的工具，和任选地用于特异性地检测针对SEQ ID NO:1的抗体的工具例如二抗。如果所述针对SEQ ID NO:1的抗体为IgM类别抗体，那么所述二抗为经标记的与IgM类别抗体的恒定区相结合的抗体。如果所述针对SEQ ID NO:1的抗体为IgG类别抗体，那么所述二抗为经标记的与IgG类别抗体的恒定区相结合的抗体。如果所述针对SEQ ID NO:1的抗体为IgA类别抗体，那么所述二抗为经标记的与IgA类别抗体的恒定区相结合的抗体。所述在诊断学上有用的承载体可以为具有一个或多于一个孔的微量滴定板，其中一个孔包含用于特异性地捕获针对SEQ ID NO:1的抗体的工具，和至少一个或更多个，两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个孔每个包含用于特异性地捕获针对从包括下列各项的组中选择的序列的抗体的工具：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:19和/或SEQ ID NO:9。
在许多情况下，检测抗体的不存在或存在(其任选地意指确定在样品中抗体的浓度是否超过某个阈值，所述阈值常常由检测极限所提示)对于所述诊断来说是足够的。如果可以检测到所述抗体，那么这可以是用于临床医生的诊断的信息，并且指明了增加的患者罹患疾病的可能性。在一个优选的实施方案中，可以测定相比于可以在平常健康受试者中发现的水平而言，在血清中的抗体的相对浓度。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“检测存在或不存在”意指，它足以核查是否可以通过使用合适的复合物检测方法来检测充分超过任何背景水平的信号，所述复合物检测方法表明存在目的抗体或者存在比在健康受试者中将会有的更多的目的抗体。在一个更优选的实施方案中，这可以涉及测定所述浓度是否是在平常健康受试者中所发现的目的抗体的浓度的至少0.1，优选地0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、50、100、200、500、1000、10000或100000倍。
待诊断的疾病为感染，优选地病毒感染，更优选地黄病毒感染，最优选地寨卡病毒感染。优选地，可以将寨卡病毒感染与另一种黄病毒感染区分开，更优选地与从包括下列各项的组中选择的黄病毒的感染区分开：登革病毒、黄热病毒、蜱传脑炎病毒、乌苏土病毒、西尼罗病毒和日本脑炎病毒或它们全部，优选地登革病毒。
本发明可以用于提供关于孕妇的新生儿是否可能罹患畸形的预后，如果测试来自孕妇的样品。优选地，所述孕妇可以具有暗示她可能罹患黄病毒感染或可能完全实际上罹患感染的症状。
本发明可以用于诊断在儿童中的畸形(例如小头畸形)是否是先前的寨卡病毒感染的结果。
本发明可以用于诊断受试者是否正罹患或可能罹患(在感染发作后)自身免疫性疾病例如吉-巴综合征。更特别地，如果在来自受试者的样品中检测到针对SEQ ID NO:1的抗体，那么所述受试者比不具有针对SEQ ID NO:1的抗体的受试者更可能罹患自身免疫性疾病。
本发明可以用于测试包含自身免疫抗体例如ANA自身抗体(其可以掩盖通过使用常规测定法所获得的结果)的样品，因此本发明可以与包括来自受试者的样品中检测ANA自身抗体的步骤的方法相组合地进行使用。可以使用商购可得的试剂盒来检测ANA，例如EUROPLUS ANA Mosaic 20A，ANA screen 11，ANA Profile 3或Anti-ENA ProfilePlus。这可以允许区分自身免疫性疾病与病毒感染，或者涉及自身免疫性疾病的抗体和涉及病毒感染的那些。
本发明可以用于区分黄病毒感染与其他病毒感染，优选地甲病毒感染，更优选地基孔贡亚病毒感染。
本发明可以用于就先前感染来筛选由献血者所给出的血液。
在一个优选的实施方案中，同时地即在相同的时间，检测一种或多种抗体(例如针对SEQ ID NO:1的抗体)的不存在或存在。这在有效的诊断程序方面是方便的，因为在给定的时间段中获得最大的诊断信息。当然，前提是对于运行所有反应来说有充足的容量可用。
在一个优选的实施方案中，在空间上分开的反应中检测至少两种抗体的不存在或存在，所述至少两种抗体例如为针对SEQ ID NO:1的抗体和一种或多种针对从包括下列各项的组中选择的抗原的抗体：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:27。这意味着，这些反应在分开的容器(例如，微量滴定板的分开的孔，或每个包含不同珠粒的分开的区室，或随后用多于一种珠粒进行使用的相同区室)中的不同的反应混合物中运行。
如果多于一种抗体待检测，那么在另一个优选的实施方案中，所述方法可以在单罐反应中进行。优选地，在本文中所使用的术语“单罐反应”意指，在一个反应容器中在相同的反应混合物中(在反应之间没有物理屏障)，进行两个或更多个反应，优选地所有反应，以为了检测抗体的存在或不存在的目的，这与设想了在分开的溶液和反应容器中进行至少两个反应的实验设置不同。
本发明提供了药用组合物或疫苗，所述组合物或免疫原性组合物例如疫苗含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽，其任选地与一种或多种进一步的抗原，例如一种或多种从包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:9的组中选择的抗原相组合，优选地除了以前使用的抗原例如寨卡病毒包膜糖蛋白，其优选地包含序列AHL16749.1(在优先权日时在线的UNIPROT数据库)或其变体或SEQ ID NO:11，优选地SEQ ID NO:11或其变体，和/或寨卡病毒外。此外，所述组合物或免疫原性组合物可以含有包含从包括下列各项的组中选择的序列的抗原：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27及其变体或其变体。免疫原性组合物或疫苗可以包含这样的组分，其用于灭活病毒或细菌和使疫苗稳定化，从而有助于保存疫苗并防止其随时间而丧失其效能。向疫苗添加佐剂以刺激针对该疫苗的抗体的产生，从而使其更有效。佐剂可以是有机的或无机的。用于人疫苗的最常见的无机佐剂包括磷酸铝和氢氧化铝。有机佐剂可以基于有机化合物角鲨烯，并且可以使用水包油[角鲨烯]佐剂。免疫原性组合物可以包含帮助该疫苗在储存期间保持其功效的稳定剂，例如MgCl2、MgSO4、乳糖-山梨糖醇或山梨糖醇-明胶，和防止细菌和真菌生长的防腐剂，例如硫柳汞、甲醛或苯酚衍生物、抗生素。所述组合物优选地适合于施用给受试者，优选地哺乳动物受试者，更优选地人。这样的药用组合物可以包含在药学上可接受的承载体。所述药用组合物可以例如以口服方式、以肠胃外方式、通过吸入喷雾剂、以局部方式、通过滴眼剂、以经直肠方式、以经鼻方式、以经颊方式、以经阴道方式或经由植入型储库来进行施用，其中在本文中所使用的术语“以肠胃外方式”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、损伤内和颅内注射或输注技术。所述药用组合物可以以合适的剂型来提供，例如胶囊、片剂以及水性悬浮液和溶液，优选地以无菌的形式。它可以在治疗疾病的方法中进行使用，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的多肽。
用于诊断黄病毒感染，优选地用于区分原发与继发黄病毒感染的本发明的方法，可以包括在来自受试者的第一样品中检测针对黄病毒的NS1的IgA类别抗体的步骤，任选地进一步包括在所述第一样品中检测针对黄病毒的NS1(更优选地SEQ ID NO:1)的IgM和/或IgG类别，优选地IgM类别抗体。在一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括在从所述受试者获得的第二样品中检测针对所述黄病毒的NS1的IgA类别抗体的步骤，任选地进一步包括在所述第二样品中检测针对黄病毒的NS1(例如SEQ ID NO:1)的IgM和/或IgG类别，优选地IgM类别抗体，任选地进一步包括在所述第一样品中检测针对黄病毒的NS1(更优选地SEQID NO:1)的IgM和/或IgG类别，优选地IgM类别抗体。
在IgG类别抗体出现(即血清转变)之前相对于背景而言显著地增加和降低的针对黄病毒的NS1(优选地针对SEQ ID NO:1)的IgA或IgM(优选地IgA)类别抗体的动态滴度可以指明急性寨卡病毒感染，其是原发黄病毒感染。相反地，IgA和IgG(尽管后者以更高的水平)的平行增加可以指明急性寨卡病毒感染，其是继发黄病毒感染。在一个优选的实施方案中，所述第一样品在受试者暴露于或被怀疑暴露于黄病毒后至少3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周时获得。在一个优选的实施方案中，所述第一样品在症状发作后两周内获取。可以测定抗体的存在或不存在，以及其随时间的相对水平。所述第二样品可以在比所述第一样品晚至少3天、4天、5天、6天、1周、2周、4周、6周、8周、12周、16周、20周、24周、28周或32周，优选地至少3天，更优选地至少7天时获得。可以获取至少2、3、4、5或6个样品的总数目，优选地至少2个样品，任选地每个样品在前一个样品后至少1天、3天、一周，优选地一周。另外，可以测定IgG、IgM和/或IgA，优选地IgM的总浓度，例如以便排除机能不全。这样，可以随时间监测各自抗体的滴度。
在一个优选的实施方案中，针对NS1(优选地针对SEQ ID NO:1)的IgM、IgG和/或IgA，优选地IgA和IgG，更优选地IgA的滴度通过下述方式来进行监测：检测存在或不存在，或者优选地随时间的相对水平，持续至少3、4、5、6、10、14、21、28、35或42天，优选地至少6天的时间段，其中所述第一样品在症状发作后至少5天，优选地至少7天时获取。血清转变可以通过监测针对NS1(优选地SEQ ID NO:1)的IgG类别抗体的存在或不存在或者随时间的相对水平来检测。这可以帮助鉴定其中将会预期到IgM和/或IgA类别抗体的增加和降低的时间窗口，或者得出该时间窗口已经过去了的结论。
本发明的方法、试剂盒和承载体可以用于区分原发与继发黄病毒感染。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“原发感染”是指从未具有所述黄病毒或另一种黄病毒，优选地所述黄病毒，更优选地寨卡病毒的感染的人的感染，这与在以前已经暴露于病毒或源自其的免疫原性组合物的患者中的继发感染不同。在一个优选的实施方案中，这可以涉及区分原发寨卡病毒感染与另一种黄病毒的继发感染，所述另一种黄病毒优选地选自包括下列各项的组：登革病毒、黄热病毒、蜱传脑炎病毒、乌苏土病毒、西尼罗病毒和日本脑炎病毒，优选地登革病毒。
本发明通过下面的实施例、序列和附图(从其中可以获取本发明的进一步的特征、实施方案、方面和优点)来进一步举例说明。在本发明的实施或测试中可以使用所有与在本文中所描述的那些相似或等价的方法和材料，其中合适的方法和材料描述在本文中。在本文中所述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过提及而以其整体合并入本文，如优先权申请EP16000422.2、EP16000442.0、EP16000454.5和EP16000454.5那样。进一步地，所述材料、方法和实施例仅是举例说明性的，而不并意图是限制性的，除非另外具体说明。
附图说明
图1显示了1μg经纯化的重组sNS1和mNS1(后者是纯的并且与牛载脂蛋白A1相复合)的SDS-PAGE和考马斯蓝染色。对于每个泳道，在4-12％变性NuPage Bis-Tris凝胶上分开1μg蛋白质，证明了高蛋白质纯度。在左边指明了分子量标准参照物。
图2显示了用于检测抗-ZIKV IgM和IgG的ELISA的接受者操作特征(ReceiverOperating Characteristic，ROC)分析。图版A显示了关于ZIKV感染(n＝29)的诊断性能，相对于其他黄病毒的感染或疫苗接种而言(DENV，n＝38；YFV，n＝12；WNV，n＝34；JEV，n＝25)。图版B显示了关于ZIKV感染(n＝29)的诊断性能，相对于健康对照而言(孕妇，n＝100；阿根廷献血者，n＝99；美国献血者，n＝100；德国献血者，n＝500)。AUC，曲线下面积。
图3显示了通过ELISA测定的在不同组群中的抗-ZIKV反应性。基于NS1抗原通过ELISA就抗-ZIKV IgM(图版A)和抗-ZIKV IgG(图版B)分析了来自被ZIKV、DENV、WNV、JEV或CHIKV感染的或者针对YFV进行疫苗接种的患者的血清，以及来自孕妇(PREG)、阿根廷献血者(BD1)、美国献血者(BD2)和德国献血者(BD3)的样品。所标绘的数据点代表比率(患者样品的消光/校准品的消光)。关于临界结果(≥0.8)和阳性结果(≥1.1)的截止值通过水平虚线来指明。阳性病例和总病例在括号中指明。三角形指明了具有经确认的ZIKV感染的患者，其具有低于截止值的关于抗-ZIKV IgM或IgG的比率(<1.1)，但分别在IgG或IgM测试中具有相应的阳性结果。图版C显示了在ZIKV-感染的患者的组群中抗-ZIKV IgM与IgG检测之间的比较。图版D描绘了在代表性的ZIKV-感染的患者的血清中抗-ZIKV IgM和IgG抗体水平的时间过程。
图4显示了旨在分离在实施例2中所制成的寨卡病毒NS1寡聚体的凝胶过滤的结果。
图5显示了在各种条件下寨卡病毒NS1单体和二聚体(具SDS抗性的)的产生。
图6显示了两份患者血清与单体和二聚体mNS1和sNS1的反应。二聚体NS1显示出是更灵敏的。
图7显示了稳定性研究(更特别地，暴露于严苛的缓冲液交换条件)的结果。包含sNS1和牛载脂蛋白AI的复合物比不是这样的复合物的一部分的NS1更稳定。单独的mNS1和sNS1可以在冰上或在室温下进行温育后部分地形成粒状沉淀，这表明30-50％的总蛋白质量形成聚集体。
图8显示了用于比较各种NS1制备物的反应性的ELISA的结果。可以显示出相比于sNS1而言更高的mNS1和sNS1+ApoAI的反应性。
图9.在具有经RT-PCR确认的(n＝27)和疑似的(n＝85)ZIKV感染的患者中的抗-ZIKV反应性，其是就(A)IgM和(B)IgG通过ELISA测定的a；在来自(C)从哥伦比亚返回的德国患者(可能的原发ZIKV感染)b和(D)具有经RT-PCR确认的ZIKV感染的哥伦比亚患者(可能的继发黄病毒感染)c的随访样品中的抗-ZIKV抗体水平的时间过程分析。
RT-PCR：反转录-PCR；US：美国；WHO:世界卫生组织；ZIKV：寨卡病毒。
a每名患者，就抗-ZIKV IgM和IgG抗体来检查一个样品。所标绘的数据点代表比率值(消光样品/消光校准品)。关于临界结果(≥0.8至<1.1)和阳性结果(≥1.1)的截止值通过水平虚线来指明。阳性病例和总病例在括号中指明。三角形指明了这样的样品，其具有低于截止值的关于抗-ZIKV IgM或IgG的比率(<1.1)，但分别在IgG或IgM测试中具有相应的阳性结果。
b样品由WHO虫媒病毒和出血热参考和研究协作中心(WHO Collaborating Centrefor Arbovirus and Haemorrhagic Fever Reference and Research)(汉堡,德国)提供。截止比率：≥1.1。
c样品由Biomex US LLC,Coconut Creek,Florida,US提供。截止比率：≥1.1。
图10.在潜在地具有交叉反应性的样品(n＝252)和健康对照(n＝1015)中的抗-ZIKV反应性，其是就(A)IgM和(B)IgG通过ELISA测定的d,e，该研究评价了新的基于NS1的ELISA(Germany 2016)。
ARG：阿根廷；CHIKV：基孔贡亚病毒；CHIL：儿童；DENV：登革病毒；GER：德国；JEV：日本脑炎病毒；NS：非结构蛋白；PLAS：疟原虫(Plasmodium)；PREG：孕妇；US：美国；WNV：西尼罗病毒；YFV：黄热病毒；ZIKV：寨卡病毒；ZIM：津巴布韦。
d所标绘的数据点代表比率值(消光样品/消光校准品)；每名患者一个数据点。关于临界结果(≥0.8至<1.1)和阳性结果(≥1.1)的截止值通过水平虚线来指明。阳性病例和总病例在括号中指明。
e为了提供高的潜在地具有交叉反应性的抗-DENV IgM和IgG抗体的水平，将DENV-感染的患者分成两个组：DENVa，高中值比率(3.9)抗-DENV IgM，在79％的病例中抗-DENVIgM比率≥3.0(小图，图版A)；DENVb，高中值比率(3.9)抗-DENV IgG，在80％的病例中抗-DENV IgG比率≥3.0(小图，图版B)。截止比率(抗-DENV ELISA，EUROIMMUN)：≥1.1.
图11A和11B显示了在两名哥伦比亚患者的顺次样品中的针对ZIKV-NS1抗原的IgG、IgA和IgM抗体的测量结果。
图12显示了Zika IgM Capture ELISA和基于NS1的抗寨卡病毒ELISA IgM和IgG的结果。
序列描述
SEQ ID NO:1：寨卡病毒NS1抗原
SEQ ID NO:2：登革病毒1NS1抗原
SEQ ID NO:3：登革病毒2NS1抗原
SEQ ID NO:4：登革病毒3NS1抗原
SEQ ID NO:5：登革病毒4NS1抗原
SEQ ID NO:6：西尼罗病毒NS1抗原
SEQ ID NO:7：蜱传脑炎病毒NS1抗原
SEQ ID NO:8：日本脑炎病毒NS1抗原
SEQ ID NO:9：黄热病毒NS1抗原
SEQ ID NO:10：具有C-末端His标签的寨卡病毒NS1抗原
SEQ ID NO:11：寨卡病毒包膜糖蛋白
SEQ ID NO:12：登革病毒1包膜糖蛋白
SEQ ID NO:13：登革病毒2包膜糖蛋白
SEQ ID NO:14：登革病毒3包膜糖蛋白
SEQ ID NO:15：登革病毒4包膜糖蛋白
SEQ ID NO:16：西尼罗病毒包膜糖蛋白
SEQ ID NO:17：蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白
SEQ ID NO:18：日本脑炎病毒包膜糖蛋白
SEQ ID NO:19：玻瓦散病毒NS1抗原
SEQ ID NO:20：具有C-末端His标签和额外的所融合的肽的寨卡病毒NS1抗原
SEQ ID NO:21：寨卡病毒NS1表位
SEQ ID NO:22：寨卡病毒NS1表位
SEQ ID NO:23：寨卡病毒NS1表位
SEQ ID NO:24：寨卡病毒NS1表位
SEQ ID NO:25：寨卡病毒NS1表位
SEQ ID NO:26：寨卡病毒NS1表位
SEQ ID NO:27：黄热病毒包膜糖蛋白
具体实施方式
实施例1:研究基于寨卡病毒NS1的ELISA的诊断性能
方法
人血清样品
在本研究中检查来自具有ZIKV感染的患者(n＝29)和具有其他黄病毒或非黄病毒感染以及黄热病疫苗接种的患者(n＝128)的血清样品。来自健康孕妇(n＝100)和生活在黄病毒流行和非流行地区的献血者(n＝699)的血清充当阴性对照。来自具有在哥伦比亚停留期间染上的在临床上和在血清学上经确认的ZIKV感染的德国患者的随访样品由WHO虫媒病毒和出血热参考和研究协作中心(汉堡,德国)进行测试，并用于抗-ZIKV抗体水平的时间过程分析。将所有血清储存于-20℃直至进行检定。所述样品匿名地进行使用以保持机密性，并且所述研究实验方案符合德国中央伦理委员会的建议。
蛋白质表达和纯化
基于pTriEx-1质粒通过使用标准克隆和表达方法在HEK293T细胞中表达重组NS1[ZIKV]，其具有人工信号序列和C-末端His标签(SEQ ID NO:20)。将经转染的细胞在37℃和8.5％CO2下在具有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养三至五天。收获细胞，重悬浮在20mM Tris-HCl pH 7.4、10％(w/v)蔗糖、5mMEDTA、1mM PMSF中，并储存于-80℃直至进一步使用。
将细胞重悬浮在20mmol/l tris盐酸盐(pH 8.0)、600mmol/l氯化钠、20mmol/l氯化镁、20mmol/l咪唑、1mmol/l PMSF、0.5mmol/l二硫苏糖醇、0.1％Triton X-100中，并通过匀浆来进行裂解。通过在4℃下以100,000xg离心60分钟来去除细胞碎片。将可溶性蛋白质级分施加至用5mmol/l tris盐酸盐(pH 8.0)、150mmol/l氯化钠、0.015％(w/v)Triton X-100、0.5mmol/l二硫苏糖醇、20mmol/l咪唑进行平衡的Nickel Rapid Run(Agarose BeadTechnologies,Miami,FL,USA)，并通过将咪唑浓度增加至150mmol/l来进行洗脱。汇集洗出液，用两个体积的20mmol/l tris盐酸盐(pH 8.5)、5mmol/l EDTA、1mmol/l PMSF、0.015％(w/v)Triton X-100、1mmol/l二硫苏糖醇进行稀释，并通过在4℃下以100,000xg离心60分钟来进行澄清。将上清液加载到用20mmol/l tris盐酸盐(pH 8.5)、2.5mmol/l EDTA、1mmol/l PMSF、0.015％(w/v)Triton X-100、1mmol/l二硫苏糖醇、50mmol/l氯化钠进行平衡的HiTrap Q FF柱(GE Lifesciences,Freiburg,Germany)上，进行洗涤，并用具有从50至1000mmol/l逐步增加的氯化钠的20mmol/l tris盐酸盐(pH 8.5)、2.5mmol/lEDTA、1mmol/lPMSF、0.015％(w/v)Triton X-100、1mmol/l二硫苏糖醇进行洗脱。汇集所有包含NS1[ZIKV]的级分，并通过超滤(VivaSpin,Sartorius,
Figure GDA0003542313510000391
Germany)来进行浓缩。将最终制备物储存于-80℃直至进一步使用。
酶联免疫吸附测定法
如由制造商所推荐的那样来使用经NS1包被的微量滴定板(Nunc,Roskilde,Denmark)和来自商购可得的抗寨卡病毒IgG和IgM ELISA(EUROIMMUN,Lübeck,Germany)的标准化试剂。简而言之，将在PBS+0.1％(w/v)酪蛋白中经1:101稀释的血清添加至孔中，并让其在37℃下反应60分钟。在IgM检测的情况下，将血清与类风湿因子吸收剂一起预温育10分钟。通过下述方式来检测被结合的抗体：施加兔抗人IgG过氧化物酶缀合物或山羊抗人IgM过氧化物酶缀合物30分钟，随后用四甲基联苯胺染色15分钟。通过添加一个体积的0.5mol/l硫酸来终止酶促反应。在450nm(参考620nm)处以光度法来测定光密度。除非另外指明，所有测定法程序在室温下进行。
对关于阳性的截止值进行验证，并通过接受者操作特征(ROC)来进行优化。稀释高度阳性指数患者血清，以产生在每个实验中进行温育的截止值校准品。计算患者样品的消光值与校准品的消光值的比率。
统计学
使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA,USA)和SigmaPlot 13.0分析软件(SSI,San Jose,CA,USA)来进行统计学分析。按照经改进的Wald方法来计算置信区间(CI 95％)。
结果
ZIKV-特异性NS1的真核表达和纯化
将ZIKV-特异性NS1在人细胞系HEK293T中进行表达，并从细胞裂解物(mNS1)或培养物上清液(sNS1)中进行纯化。当通过SDS-PAGE来进行分开时，mNS1和sNS1基本上按照它们的所预测的分子量来进行迁移(43.9kDa；图1)。
基于NS1的抗-ZIKV ELISA的开发
将经纯化的重组mNS1和sNS1分别在用于检测抗-ZIKV IgM和IgG的ELISA中用作固相抗原。基于29份来自具有ZIKV感染的患者的血清和908份对照(包括109名具有黄病毒感染或疫苗接种的患者、100名孕妇和699名献血者)进行ROC分析。曲线下面积(IgM，≥0.979；IgG，≥0.956)表明了优异的诊断性能(图2)。将关于测定法阳性的截止比率[OD患者样品/OD校准品]设置在≥1.1，对于任一Ig类别。该阈值超过了具有最大的灵敏度和特异性之和的截止水平，以确保高的测定法特异性。将在≥0.8至<1.1的范围内的比率归类为临界。
抗-ZIKV ELISA的诊断性能
灵敏度：在来自具有在临床上和在血清学上经确认的ZIKV感染的患者的29个血清样品中，24个(82.8％)关于抗-ZIKV IgM是阳性的，20个(69.0％)关于IgG是阳性的，和28个(96.6％)关于IgM和/或IgG是阳性的(图3A和3B)。16份血清显示出关于IgM和IgG这两者的阳性反应性，而12份血清关于IgM或IgG是阳性的。因此，最高的诊断灵敏度通过平行测试这两个Ig类别来实现(图3C)。该方法还允许通过疾病状态(急性或既往感染)来对患者进行分类。例如，来自在从哥伦比亚停留返回后显示出临床症状的患者的随访样品的分析揭示出在16周的时间段内抗-ZIKV IgM的降低和IgG水平的显著增加，这确认了急性感染(图3D)。
特异性：在799名健康对照中，发现仅1/99(1.0％)阿根廷献血者和1/500(0.2％)德国献血者是抗-ZIKV IgM阳性的，而100名健康美国献血者和100健康孕妇是阴性的。抗-ZIKV IgG存在于1/100(1.0％)美国献血者和1/500(0.2％)德国献血者中，但不存在于健康的阿根廷献血者和孕妇的组群中。因此，对于任一Ig类别，总特异性总计为99.7％(图3A和3B)。
交叉反应性：分析了来自128名具有高的针对黄病毒(DENV、YFV、WNV或JEV)和CHIKV的IgM和/或IgG类别抗体滴度的在临床上和在血清学上经充分表征的患者或受疫苗接种者的血清小组。在1/34(2.9％)被WNV感染的患者中可检测到抗-ZIKV IgM反应性，和在1/25(4.0％)被JEV感染的患者中可检测到抗-ZIKV IgG(图3A和3B)。在这两种情况下，均不能排除双感染，因而ELISA阳性是归因于与针对其他黄病毒的抗体的交叉反应(假阳性)还是归因于ZIKV的共感染(真阳性)仍是不清楚的。考虑到关于任一Ig类别的1/128(0.8％)的总阳性率，当使用基于NS1的ELISA时，可以几乎完全排除交叉反应性。
实施例2：寨卡病毒NS1抗原的制备
基于pTriEx-1质粒通过使用标准克隆和表达方法在HEK293T细胞中表达重组NS1[ZIKV]，其具有人工信号序列和C-末端His标签(SEQ ID NO:20)。将经转染的细胞在37℃和8.5％CO2下在具有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养三至五天。滗析出细胞培养物上清液并进行储存直至进一步使用。收获细胞，重悬浮在20mM Tris-HCl pH 7.4、10％(w/v)蔗糖、5mM EDTA、1mM PMSF中，并储存于-80℃直至进一步使用。
为了制备mNS1，将细胞重悬浮在20mmol/l tris盐酸盐(pH 8.0)、600mmol/l氯化钠、20mmol/l氯化镁、20mmol/l咪唑、1mmol/lPMSF、0.5mmol/l二硫苏糖醇、0.1％Triton X-100中，并通过匀浆来进行裂解。通过在4℃下以100,000xg离心60分钟来去除细胞碎片。将可溶性蛋白质级分施加至用5mmol/l tris盐酸盐(pH 8.0)、150mmol/l氯化钠、0.015％(w/v)Triton X-100、0.5mmol/l二硫苏糖醇、20mmol/l咪唑进行平衡的Nickel Rapid Run(Agarose Bead Technologies,Miami,FL,USA)，并通过将咪唑浓度增加至150mmol/l来进行洗脱。汇集洗出液，用两个体积的20mmol/l tris盐酸盐(pH8.5)、5mmol/l EDTA、1mmol/lPMSF、0.015％(w/v)Triton X-100、1mmol/l二硫苏糖醇进行稀释，并通过在4℃下以100,000xg离心60分钟来进行澄清。将上清液加载到用20mmol/l tris盐酸盐(pH 8.5)、2.5mmol/l EDTA、1mmol/l PMSF、0.015％(w/v)Triton X-100、1mmol/l二硫苏糖醇、50mmol/l氯化钠进行平衡的HiTrap Q FF柱(GE Lifesciences,Freiburg,Germany)上，进行洗涤，并用具有从50至1000mmol/l逐步增加的氯化钠的20mmol/l tris盐酸盐(pH 8.5)、2.5mmol/l EDTA、1mmol/l PMSF、0.015％(w/v)Triton X-100、1mmol/l二硫苏糖醇进行洗脱。汇集所有包含NS1[ZIKV]的级分，并通过超滤(VivaSpin,Sartorius,
Figure GDA0003542313510000421
Germany)来进行浓缩。将最终制备物储存于-80℃直至进一步使用。
为了制备sNS1，将细胞培养物上清液调整至5mmol/l tris盐酸盐(pH 8.0)、164mmol/l氯化钠、50mmol/l氯化镁、20mmol/l咪唑、0.1％Triton X-100，通过在4℃下以17,600xg离心30分钟来进行澄清，施加至用5mmol/l tris盐酸盐(pH 8.0)、300mmol/l氯化钠、20mmol/l咪唑进行平衡的Nickel Rapid Run(Agarose Bead Technologies,Miami,FL,USA)，并通过将咪唑浓度增加至150mmol/l来进行洗脱。汇集所有包含NS1[ZIKV]的级分，并通过超滤(VivaSpin,Sartorius,
Figure GDA0003542313510000422
Germany)来进行浓缩。将最终制备物储存于-80℃直至进一步使用。
为了制备与牛载脂蛋白AI相复合的sNS1，将细胞培养物上清液调整至5mmol/ltris盐酸盐(pH 8.0)、164mmol/l氯化钠、50mmol/l氯化镁、20mmol/l咪唑，通过在4℃下以17,600xg离心30分钟来进行澄清，施加至用5mmol/l tris盐酸盐(pH 8.0)、300mmol/l氯化钠、20mmol/l咪唑进行平衡的Nickel Rapid Run(Agarose Bead Technologies,Miami,FL,USA)，并通过将咪唑浓度增加至150mmol/l来进行洗脱。汇集所有包含NS1[ZIKV]/Apo AI[家牛(Bos taurus)]复合物的级分，并通过超滤(VivaSpin,Sartorius,
Figure GDA0003542313510000431
Germany)来进行浓缩。将最终制备物储存于-80℃直至进一步使用。
当通过SDS-PAGE来进行分开时，NS1基本上按照它的所预测的分子量(43.9kDa)来进行迁移。蛋白质身份通过质谱法来进行证实。
实施例3：NS1寡聚体的制备
使用在20mmol/l tris盐酸盐(pH 8.5)、2.5mmol/l EDTA、1mmol/l PMSF、0.015％(w/v)Triton X-100、1mmol/l二硫苏糖醇、300mmol/l氯化钠或者5mmol/l tris盐酸盐(pH8.0)、300mmol/l氯化钠、150mmol/l咪唑中的Superdex 200pg柱(GE Healthcare,Munich,Germany)，通过分析型凝胶过滤来分析在实施例2中所制备的mNS1和sNS1的蛋白质制备物。具有已知分子量的蛋白质混合物分开地进行走样，并且用作校准品。将独个峰的保留时间用于计算所观察的NS1群体的分子量，并且通过使用在还原条件下的变性/非变性凝胶电泳以及随后的银染色来分析洗出液级分。
图4显示了代表性的凝胶过滤运行的结果。主要mNS1和sNS1峰的保留时间揭示了212kDa(mNS1)和227kDa(sNS1)的分子量，这与六聚体群体很好地相一致(MW[NS1单体]＝43.9kDa)。mNS1显示出额外的在44kDa处的峰，其最可能地像其单体形式。该解释由级分的电泳迁移率所支持：经热变性的和未变性的等分试样这两者均迁移至低于50kDa的相同位置，而在未经热变性的等分试样中二聚体NS1将会迁移至70kDa，如果存在于该群体中的话。
用或不用16mmol/l二硫苏糖醇处理mNS1和sNS1的蛋白质制备物，并且在70℃下或在室温下温育10分钟，随后为SDS凝胶电泳和考马斯蓝染色。图5显示了在各种条件下单体和二聚体(具SDS抗性的)的产生。
二聚体mNS1或sNS1群体也可以通过六聚体群体的去污剂处理(例如，0.1％TritonX-100或0.2％十二烷基硫酸钠)来产生。分析型凝胶过滤清楚地显示，mNS1和sNS1在体外主要作为六聚体存在(具有稍微高于200kDa的分子量)，但是只有以70kDa的表观分子量进行迁移的具SDS抗性的二聚体可以在包含SDS的凝胶中显现。通过热变性将二聚体进一步转变成单体(MW[NS1单体]＝43.9kDa)。该过程不依赖于二硫键。
实施例4：NS1单体和二聚体可以用于通过Western印迹法来在患者血清中检测抗体
用或不用16mmol/l二硫苏糖醇处理在实施例2中所制备的mNS1和sNS1的蛋白质制备物，并且在70℃下或在室温下温育10分钟，以获取单体或寡聚体NS1。混合这两个群体，并通过使用SDS电泳来分开，随后转移至硝酸纤维素膜。将蛋白质要么通过丽春红S染色来非特异性地进行染色以显现出以单体和二聚体形式的NS1，要么与作为阳性对照的抗-His抗体、作为阴性对照的没有血清的缓冲液和四份人血清(稀释度1:51)(它们中的两份来自健康献血者，和两份来自罹患寨卡病毒感染的患者)一起进行温育。
图6显示，这两份患者血清均与单体和二聚体mNS1和sNS1反应，但二聚体NS1是更灵敏的。用二硫苏糖醇还原单体NS1导致变性并进一步降低灵敏度。如在随后的实验中所显示的，在Western印迹中，经还原的NS1单体的分析灵敏度比未还原的单体的分析灵敏度低至少10倍。
实施例5：在牛载脂蛋白AI存在下NS1抗原稳定性增加
下面的实验显示，包含SEQ ID NO:1的多肽和哺乳动物载脂蛋白的复合物在溶液中比该多肽本身更稳定。因此，哺乳动物载脂蛋白可以用于使所述多肽和包含它的装置和试剂盒稳定化。
通过使用脱盐旋转柱(Zeba Spin,ThermoFisher Scientific,Waltham,USA)，将mNS1、sNS1和由sNS1和牛载脂蛋白AI组成的复合物的蛋白质制备物(后者通过如在实施例1中那样制备蛋白质并随后添加包含载脂蛋白的色谱法级分来制作)转移到50mmol/l磷酸钠(pH 7.4)、150mmol/l氯化钠中。将每个制备物的等分试样保持在冰上或在室温下过夜，以允许非PBS可溶的蛋白质沉淀。将等分试样在4℃下以100,000xg离心30分钟，并且通过使用在还原条件下的变性凝胶电泳以及随后的考马斯蓝染色来分析上清液和粒状沉淀(重悬浮在等体积的50mmol/l磷酸钠(pH 7.4)、150mmol/l氯化钠、8mol/l尿素中)。
选择严苛的缓冲液交换条件来引起潜在地不稳定的蛋白质的聚集。
图7显示，单独的mNS1和sNS1可以在冰上或在室温下进行温育后部分地形成粒状沉淀，这表明30-50％的总蛋白质量形成聚集体。
另一方面，全部的与牛载脂蛋白AI相复合的sNS1在离心后仍留在上清液中，这表明了对于sNS1的稳定化效应。
实施例6：比较各种NS1制备物的反应性
进行下面的实验以在用于在人血清中检测抗寨卡病毒抗体的间接ELISA中评价寨卡病毒NS1抗原的不同制备物的反应性。它显示，与哺乳动物载脂蛋白相复合增加了NS1的反应性，并因此增加了该测定法的灵敏度。
经包被的微量滴定板的制备
使用三种不同的寨卡病毒NS1制备物：sNS1(从细胞培养物上清液中纯化的可溶性NS1)，mNS1(从细胞中纯化的膜NS1)，sNS1+ApoAI(从细胞培养物上清液中纯化的可溶性NS1，其与牛ApoAI相复合)。
为了在微量滴定ELISA中进行使用，将这三种NS1制备物分别在PBS中稀释至0.5、1.0和2.0μg/ml的最终浓度。用100μl抗原稀释物/孔来包被微量滴定板。
样品的温育：
将一个套组的抗寨卡病毒NS1 IgM阳性或阴性人血清用于评价不同抗原制备物的反应性。在温育期间所使用的所有试剂都包括在每个用于感染诊断学的EUROIMMUN IgMELISA Test试剂盒(例如，EI 2668-9601M)中。将血清在包含IgG/RF吸收剂的IgM样品缓冲液中以1:101进行稀释，并且在室温下温育10分钟以吸收类风湿因子和IgG。将样品施加至微量滴定板并进行温育，如对于商业EUROIMMUN抗寨卡病毒ELISA(IgM)(EI 2668-9601M)所描述的那样。简而言之，在37℃下60分钟；使用EUROIMMUN洗涤缓冲液的3个洗涤步骤；每个孔添加100μl的经过氧化物酶标记的抗人IgM缀合物(山羊)；在室温下温育30分钟；使用EUROIMMUN洗涤缓冲液的3个洗涤步骤；每个孔添加100μl的生色团/底物溶液(TMB/H2O2)；在室温下温育15分钟；添加100μl的终止溶液(0.5M硫酸)；在450nm处测量光密度。
结果的解释：
图8显示了结果，更具体地相比于sNS1而言更高的mNS1和sNS1+ApoAI的反应性。mNS1和sNS1+ApoAI显示出相当的关于阳性血清的反应性。关于阴性血清，sNS1+ApoAI显示出相比于mNS1而言更低的反应性(甚至在最高的所施加的包被浓度下)，这暗示了经复合的抗原的更高的特异性。NS1还可以显示出形成了牛载脂蛋白B-100同种型X1复合物，其也可以用于使该抗原稳定化。
实施例7：基于NS1的ELISA测定法性能的多组群研究显示缺乏与登革病毒抗体的交叉反应性
通过使用来自具有经实验室确认的ZIKV感染的从ZIKV流行地区返回的旅行者和患者的血清，来自具有黄病毒感染和其他感染的患者的潜在地具有交叉反应性的样品，以及来自具有不同年龄和地理来源的献血者的对照小组，来检查根据本发明的测定法的诊断性能。
方法
人血清
该研究包括来自27名已经通过反转录RCR(RT-PCR)就ZIKV RNA被测试为阳性的患者的血清样品：组1：从流行地区返回的旅行者(n＝8)；组2：ZIKV流行地区的居民(n＝19)。基于病原体基因组的直接检测，这些病例被称为具有经RT-PCR确认的ZIKV感染。已经基于全病毒抗原通过抗-ZIKV间接免疫荧光测定法(IIFA；EUROIMMUN,Lübeck,Germany)预表征了来自另外85名患者的样品，其中显示出关于抗-ZIKV IgM和/或IgG的反应性：组3：从流行地区返回的旅行者(n＝26)；组4：ZIKV流行地区的居民(n＝59)。由于不能排除归因于该IIFA的交叉反应性的假阳性结果，因此这些病例被称为具有疑似的ZIKV感染(表1)。
按照泛美卫生组织(Pan American Health Organization；PAHO)/世界卫生组织(World Health Organization；WHO)关于在美洲的ZIKV监视的建议，归类成三个ZIKV感染阶段：症状发作后≤5天，初始阶段；症状发作后6–20天，活动阶段；症状发作后>20天，晚期阶段。来自从流行地区返回的旅行者的样品由它们被送往以进行常规诊断测试的诊断机构(在表1中所列出的)提供。来自居住在拉丁美洲(即多米尼加共和国和哥伦比亚)的患者的样品购买自Boca Biolistics(Coconut Creek,Florida,United States(United States(US))、Allied Research Society(Miami Lakes,Florida,US)和Biomex GmbH(Heidelberg,Germany)。如由这些机构和公司所确认的，已经从所有患者获得了书面知情同意书，并且对于使用所述样品没有法律或伦理限制。
为了评价交叉反应性，使用来自252名具有YFV疫苗接种后状态(n＝12)或者具有其他黄病毒(DENV＝93；WNV＝34；JEV＝25)、非黄病毒(CHIKV＝19)和疟原虫属物种(Plasmodium spp.)(PLAS：n＝69)感染的患者的样品。在来自DENV-感染的患者的样品中，基于NS1抗原检测，确认DENV为感染因子。来自1015名生活在黄病毒流行和非流行地区的健康个体(孕妇、献血者和儿童)的血清充当阴性对照。在表2中报道了关于所有对照组群的预表征数据。据作者所知，这些样品中没有一个在以前的研究中被分析过。
Figure GDA0003542313510000491
Figure GDA0003542313510000501
Figure GDA0003542313510000511
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Figure GDA0003542313510000571
Figure GDA0003542313510000581
Figure GDA0003542313510000591
Figure GDA0003542313510000601
对于实验免疫学研究所(Institute for Experimental Immunology)(隶属于EUROIMMUN)是匿名的。所有血清储存于-20℃直至进行检定。该研究按照德国中央伦理委员会的建议来进行[29]。
酶联免疫吸附测定法
如由制造商所建议的那样来使用抗寨卡病毒IgM和IgG ELISA(EUROIMMUN)。这些试剂盒测定法基于标准化试剂和包被有重组ZIKV-NS1的微量滴定板。简而言之，将在样品缓冲液中经1:101稀释的血清添加至孔中，并让其在37℃下反应60分钟。在IgM检测前，将血清与包含IgG/类风湿因子(RF)吸收剂(EUROIMMUN)的样品缓冲液一起进行预温育，以从样品中去除IgG类别抗体和IgM类别RF。该步骤防止特异性的IgG从抗原中替代IgM(这导致假IgM-阴性结果)和防止RF-IgM与被特异性地结合的IgG进行反应(这导致假IgM-阳性结果)。通过下述方式来检测被结合的抗体：在室温下施加山羊抗人IgM过氧化物酶缀合物或兔抗人IgG过氧化物酶缀合物30分钟，随后用四甲基联苯胺染色15分钟。通过添加一个体积的0.5mol/L硫酸来终止酶促反应。与测试试剂盒一起提供校准品(鸡-人嵌合ZIKV抗体，其浓度经调整以给出划定未感染的人的参考范围的上限的消光值)以及阳性和阴性对照，并且在每轮测试中进行检定。在450nm(参考620nm)处以光度法来测定酶促反应的颜色强度，这导致消光值。对于每个样品计算信号与截止值的比率(消光样品/消光校准品)。
基于阳性和阴性样品的初始验证数据集的接受者操作特征(ROC)分析由制造商来进行，以评价在每个可能的截止值处的测定法性能，其中在0.8(IgM)和0.6(IgG)的比率值下展现出最佳的灵敏度和特异性。为了确保高的特异性，在最高阴性和最低阳性验证样品之间建立临界范围(≥0.8至<1.1)，这导致≥1.1的阳性截止值。
使用抗登革病毒IgM和IgG ELISA(EUROIMMUN)。
统计学
使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc.,La Jolla,California,US)和SigmaPlot 13.0(SSI,San Jose,California,US)来进行统计学分析。将灵敏度计算为通过该测定法被鉴定为阳性的ZIKV患者(涉及所示的组1-4)的比例。将特异性计算为在健康对照中获得的阴性测试结果的比例。根据经改进的Wald方法，我们计算出95％置信区间(CI)。该研究依照诊断准确性报告标准(Standards for Reporting of Diagnostic accuracy；STARD)声明来进行。
结果
酶联免疫吸附测定法的灵敏度
在来自27名具有经RT-PCR确认的ZIKV感染的患者(其已被分成从ZIKV流行地区返回的旅行者和流行地区居民这些亚组)的血清中评价了新的基于NS1的抗-ZIKV ELISA的灵敏度。在八名被感染的从ZIKV流行地区返回的旅行者(组1)中，分别在七个(87.5％)和三个(37.5％)病例中发现了阳性的抗-ZIKV IgM和IgG反应性。在19名被感染的流行地区的居民(组2)中，六名(31.6％)对于抗-ZIKV IgM是阳性的和15名(79.0％)对于IgG是阳性的。另外，检查了来自85名具有疑似的ZIKV感染的患者的血清。在此，在26名被感染的从ZIKV流行地区返回的旅行者(组3)中，21名(80.8％)对于抗-ZIKV IgM是阳性的和18名(69.2％)对于IgG是阳性的；而在59名被感染的流行地区的居民(组4)中，六名(10.2％)显示出对于抗-ZIKV IgM的阳性反应性和53名(89.9％)显示出对于IgG的阳性反应性。对于所有的经RT-PCR确认的和疑似的病例，综合的ELISA灵敏度(IgM和/或IgG)分别总计为23/27(85.2％)和78/85(91.8％)。
在将血清学评价的时间点限制于ZIKV感染的活动期和晚期(即症状发作后≥6天)的情况下，分别在10/17(58.8％)的具有阳性ZIKV-RT-PCR的患者和3/38(7.9％)的具有疑似的ZIKV感染的患者中观察到抗-ZIKV IgM反应性，而分别在15/17(88.2％)和34/38(89.5％)的病例中可检测到抗-ZIKV IgG。因此，综合灵敏度(IgM和/或IgG)在经RT-PCR确认的病例中达到17/17(100％)，和在疑似的病例中达到34/38(89.5％)(表3)。
Figure GDA0003542313510000641
Figure GDA0003542313510000651
Figure GDA0003542313510000661
Figure GDA0003542313510000671
通过比较ZIKV-感染的从流行地区返回的旅行者(组1和3)与被感染的这些地区的居民(组2和4)，可以观察到不同ZIKV抗体动力学的倾向：在大多数返回的旅行者中，在感染的活动期中可检测到高的IgM比率值(中值5.6；四分位数间距(IQR)：4.6-6.9)和中等的IgG比率(中值2.2；IQR 0.9-2.8)(截止比率：1.1)。相反地，在活动期期间，大多数流行地区居民具有有着非常高的IgG比率(中值4.8；IQR 3.3-5.9)的感染，而IgM比率是可变的，但主要地是阴性的或低的(中值0.5；IQR 0.2-1.3)(图9A和9B)。
在从哥伦比亚停留返回后显示出临床症状的德国患者的时间过程分析揭示了在第一次测试(症状发作后第10天)时的非常高的抗-ZIKV IgM比率，而IgG比率在感染的急性期期间和其后增加至中等水平(图9C)。另一方面，从具有经RT-PCR确认的ZIKV感染的哥伦比亚居民中获取的随访样品指出了在症状发作后第3天和第15天之间ZIKV-特异性IgG应答的显著上升，随后为缓慢降低；而抗-ZIKV IgM在症状发作后3天是阴性的并且保持在检测阈值之下14周(图9D)。
酶联免疫吸附测定法的交叉反应性
首先在来自93名已通过阳性DENV-NS1检测确证了其诊断的DENV-感染的患者的血清中分析交叉反应性。将该组群分成具有高的抗-DENV IgM(中值比率3.9)的一个组(DENVa)和具有高的抗-DENV IgG(中值比率3.9)的另一个组(DENVb)，从而确保高水平的潜在地具有交叉反应性的抗体的存在。在这两个组中，抗-ZIKV反应性均在阈值之下，这表明在这些样本中不存在交叉反应性。进一步的测试(在补充的基础上)包括159份来自关于针对YFV、WNV、JEV、CHIKV或PLAS的IgM和/或IgG阳性的患者的血清。抗-ZIKV IgM在1/34(2.9％)的被WNV感染的患者和1/69(1.4％)的被PLAS感染的患者中是阳性的。在1/25(4.0％)的被JEV感染的患者中发现抗-ZIKV IgG。对于总共252份潜在地具有交叉反应性的样品，总阳性率总计为2/252(0.8％)(关于IgM)和1/252(0.4％)(关于IgG)(表4)。
酶联免疫吸附测定法的特异性
通过测试1015份来自健康对照的血清来评估测定法特异性。发现仅1/99(1.0％)的阿根廷献血者和1/500(0.2％)的德国献血者是抗-ZIKV IgM阳性的，而所有128名津巴布韦献血者和100名美国献血者以及100德国孕妇和88名在德国的儿童是阴性的。抗-ZIKVIgG在1/100(1.0％)的美国献血者和1/500(0.2％)的德国献血者中存在，但在津巴布韦和阿根廷献血者、孕妇和儿童的组群中不存在。因此，对于任一Ig类别，总特异性总计为99.8％(表4，图10A和10B)。
讨论
由于与其他黄病毒的交叉反应、继发感染和先前的疫苗接种(这些使得解释复杂化，有时导致不可靠的或假阳性的结果)，ZIKV感染的血清学诊断是具有挑战性的。在此，我们评价了用重组ZIKV-NS1蛋白作为固相抗原的新开发的ELISA。Huzly等人(2016年4月21日；21(16).doi:10.2807/1560-7917)最近提供了证据证明，该测定法是高度特异性的，如在有限数目的具有DENV、YFV、蜱传脑炎病毒(TBEV)或丙型肝炎病毒感染的欧洲患者上所证明的。在本研究中，对于在症状发作后(即在病毒血期后)≥6天时收集的样品进行的测试揭示了关于经RT-PCR确认的ZIKV感染病例的100％的综合灵敏度(IgM/IgG)，以99.8％特异性。在疑似的ZIKV病例中，综合灵敏度总计为89.5％。尤其是，在我们的分析(除了时间过程分析外)中我们对于每一名所研究的患者包括了仅一个血清样品。但是，对于患者的血清学诊断，随访样品的评价是重要的并且被建议用于证明血清转变或抗体滴度的4倍增加。在27个经RT-PCR确认的ZIKV病例中的四个之中，样品关于针对ZIKV-NS1的IgM和IgG两者都是阴性的，这据推测可能是因为它们全部都是在症状发作后仅≤4天(即当抗体还未达到可检测的水平时)获取的。在85名疑似的ZIKV患者中，过早的取样可以解释说明两个具有阴性IgM和IgG的病例，而其余五个双阴性病例可能归因于ZIKV感染的不存在(预表征的不足)或者假阴性结果。
不可检测到与高水平DENV抗体的交叉反应性，并且根据用有限数量的样品进行的初步分析，没有关于依赖于DENV血清型的在交叉反应性方面的差异的指示(数据未显示)。为了更好地判断在流行地区中的测定法性能，应当在进一步的评估中包括来自经历了多次DENV(和其他黄病毒)感染的流行地区居民的样品，因为这些样品具有关于增加的交叉反应性的可能性。对于所有潜在地具有交叉反应性的样本进行的分析导致0.8％(IgM)和0.4％(IgG)的阳性率，其由具有低水平抗-ZIKV IgM的各具有WNV和PLAS的一个病例和具有低水平抗-ZIKV IgG的一个JEV病例引起。但是，在这些病例中，不能排除双感染，因此ELISA阳性是由于归因于ZIKV的共感染的ZIKV抗体的存在(真阳性)还是由于交叉反应性(假阳性)而产生仍是不清楚的。在PLAS感染的情况下，PLAS-诱导的多克隆B-细胞激活可以引起潜在地具有交叉反应性的抗体的产生。在具有正在发生的PLAS感染的患者中，使用所展示的基于NS1的ELISA，报道了直至30％的假阳性或临界反应，这与在本研究中的仅1.4％不同，并且可能通过下述事实来解释：我们的组群主要由具有既往PLAS感染状态的个体构成。因此，当应用该测定法时，应当考虑可能的干扰。
在来自从ZIKV流行地区返回的旅行者的血清中，我们观察到在感染的活动期期间ZIKV-特异性IgM以高的比率出现的倾向，伴随有IgG的中等上升。相反地，大多数的流行地区的居民具有高的抗-ZIKV IgG和低的/阴性的IgM比率值，不论他们的样品是在感染的初始期、活动期还是晚期获取的。在从ZIKV流行地区返回的旅行者中的IgM应答倾向于相比于此类地区的居民而言更高，而IgG-阳性率在后一个亚组中更高。还通过在两名代表性患者中的抗体水平的时间过程分析举例说明了在ZIKV抗体动力学方面的此类差异，这可能反映了从ZIKV流行国家返回的旅行者主要具有原发黄病毒/ZIKV感染，而大多数居民可能作为继发黄病毒感染而染上ZIKV。对于在密克罗尼西亚ZIKV流行病中的原发和继发感染和对于DENV-感染的患者描述了类似的动力学，这暗示特异性IgM和IgG这两者的检测是在诊断学上重要的并且对于分辨原发与继发感染来说是意义重大的。但是，关于我们对于居住在流行国家的患者与旅行者进行的比较，不能排除在这些人群的背景方面的系统差异(例如，遗传的、人种的)。
我们的研究的另一个限制是，它不包括具有另外的测定法(例如Zika MAC-ELISA(疾病控制与预防中心(CDC),Atlanta,Georgia,US)或PRNT)的并行测试，以提供关于这些现有测试的比较数据。另外，关于所有ZIKV样品的预表征的统一的血清学参考标准的非故意的缺乏导致高数目的疑似的ZIKV感染病例。
虽然ZIKV通常引起相当轻微的感染，但是存在有与神经元损伤例如新生儿小头畸形和GBS的因果联系的令人信服的证据[37]。此外，存在有研究显示DENV NS1抗体具有这样的潜力，即在继发感染中诱导自身抗体(其可能由在血小板和内皮细胞上的抗原的交叉反应性结合所介导)，随后为细胞损伤和炎症激活。需要基础研究以充分阐明神经元病症和ZIKV感染之间的因果关系。孕妇及其婴儿以及从流行地区返回的旅行者的流行病学评估、所献血液的监视以及流行和非流行地区的ZIKV患病率的调查可以提供至关重要的信息。这些研究需要可靠、快速且易于操作的诊断测试，其具有低的交叉反应性并且允许明确的诊断。
总之，我们的研究揭示了，基于NS1的抗-ZIKV ELISA是用于ZIKV感染的血清诊断的灵敏且高度特异性的工具，其消除了与针对DENV和其他黄病毒的抗体的交叉反应。该测定法样式适合于在全世界的常规实验室中进行使用，这使得在地方性流行的情景下进行高通量测试成为可能。ZIKV感染的血清学鉴定通过关于IgM和IgG的平行测试而最大化。进一步的研究对于下列将会是必需的：在一个更大套组的定义明确的样品中测定该测定法和其他现有测定法的准确性，和澄清ZIKV感染如何触发GBS、新生儿小头畸形和其他神经学表现。实施例8：抗寨卡病毒IgA可以在抗寨卡病毒IgM-阴性患者中指出急性感染
该实施例显示，针对SEQ ID NO:1的IgA以及相关的试剂和方法可以用于区分急性感染与既往感染，和因此区分原发与继发感染。
方法
在数个时间点，从两名具有既往黄病毒感染背景的哥伦比亚人和两名德国旅行者(都呈现出具有经确认的ZIKV感染)中获取血清样品。使用商业的基于NS1的抗寨卡病毒ELISA(Euroimmun AG,Germany)来测量抗-ZIKV IgM和IgG的滴度。另外，将基于被ZIKV感染的细胞的间接免疫荧光测试(Arbovirus Fever Mosaic 2,IgM,截止值≥1:10,EuroimmunAG,Germany)用于IgM测量。对于抗-ZIKV IgA的测定，采用相应的ELISA，其中应用缀合有过氧化物酶的抗人IgA。在所有测定法中，将截止值设置为1.1的比率。
结果
在德国旅行者中，分别在第9天和第16天检测到抗-ZIKV IgM，不论方法为何。随后，通过抗-ZIKV IgG血清转变确认了活动感染。在除了一个之外的所有样品中，IgA测量结果在1.1之上，其中显示了最初的增加和随后的下降(表5)。
Figure GDA0003542313510000721
Figure GDA0003542313510000731
在两名哥伦比亚患者的顺次样品中(在图11A和11B中所显示的结果)，针对ZIKV-NS1抗原的IgM抗体的测量结果持久地在截止值之下。相一致地，关于针对全寨卡病毒的IgM的测试在所有样品中都是阴性的，除了在一个样品中是弱阳性的之外(1:10)。在这两名患者中抗-ZIKV IgG在第一周内已经是阳性的。但是，IgA显示出滴度增加，其中在再次降落至低于阈值之前在第三和第四周达到高于截止值的峰值。
结论
当用基于NS1的测定法或基于全病毒的测定法都不可检测到特异性IgM时(如在哥伦比亚患者中所观察到的)，抗-ZIKV IgA的测量结果可以允许辨别急性感染与既往感染。
实施例9：在具有经确认的寨卡病毒感染的患者中在症状发作后第六周不存在特异性IgM
该实施例显示，检测针对SEQ ID NO:1的IgG和IgM这两者的存在或不存在以及相关的试剂和方法可以用于增加用于诊断寨卡病毒感染的测定法的诊断可靠性，相比于基于检测来自仅一个类别的Ig的测定法而言。
引言
在美洲的寨卡病毒(ZIKV)感染严重爆发之后，CDC建议在症状发作后两周内收集的样品中进行核酸测试。应当就抗-ZIKV IgM抗体来对在第14天直至第84天后收集的血清样品进行测试，假定这些抗体在从症状发作后差不多第四天直至十二周的任何时间存在。
但是，在具有继发登革病毒(DENV)感染的患者中常常报道了特异性IgM的不存在，由于DENV和ZIKV是相关的黄病毒，因而在ZIKV感染中免疫学应答可能是相当的。
方法
另外，就特异性IgM和IgG抗体来对具有ZIKV感染(在首次症状出现后五天通过RT_PCR确认的)的42岁哥伦比亚女性进行测试。按照制造商的说明书，使用基于全病毒抗原的ZIKV IgM Capture ELISA(截止比率1.8；InBios,USA)和基于NS1的抗寨卡病毒ELISA IgM以及IgG(截止比率1.1；Euroimmun AG,Germany)，分析了在症状发作后第5天和第41天获取的血清样品。
结果
结果显示在图12和表6中。在这两个IgM测定法中所述两个血清样品均揭示了阴性结果。在IgM Capture ELISA中的比率从0.81(第5天)至0.12(第41天)变动，而用抗寨卡病毒ELISA IgM的测量结果揭示了0.1(第5天)和0.4(第41天)的比率。相反地，关于IgG的测试在第5天(比率1.9)以及在第41天(比率5.6)产生了阳性结果。
结论
该患者的这两份可用的血清样品的日期均来自所建议的抗-ZIKV IgM-阳性时间范围(12周)，但是经测试是IgM-阴性的，不依赖于所使用的抗原底物(全病毒或NS1)。
取而代之，这两个样品揭示了渐增的IgG滴度，这暗示应当在两个连续的血清样品中进行关于抗-ZIKV IgM和IgG的平行测试，以检测血清转变或显著的IgG滴度增加，以便避免遗漏被测试为抗-ZIKV IgM-阴性的患者。
表6
Figure GDA0003542313510000751
序列表
<110> EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG
<120> 用于诊断病毒感染的免疫测定法
<130> 16PP026WO
<160> 27
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO1: 寨卡病毒NS1抗原
<400> 1
Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly
1 5 10 15
Thr Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr
20 25 30
Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln
35 40 45
Ala Trp Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu
50 55 60
Asn Ile Met Trp Lys Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu
65 70 75 80
Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro
85 90 95
Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro
100 105 110
His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys
115 120 125
Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro
130 135 140
Leu Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe
145 150 155 160
Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser
165 170 175
Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu
180 185 190
Ala Ala His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp
195 200 205
Thr Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu
210 215 220
Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Val Glu Glu Ser Asp
225 230 235 240
Leu Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr
245 250 255
Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Val Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu
275 280 285
Glu Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser
290 295 300
Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro
305 310 315 320
Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met Val Thr Ala
340 345 350
<210> 2
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO2: 登革病毒1 NS1抗原
<400> 2
Asp Ser Gly Cys Val Ile Asn Trp Lys Gly Arg Glu Leu Lys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ile Phe Val Thr Asn Glu Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr
20 25 30
Lys Phe Gln Ala Asp Ser Pro Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Gly Lys
35 40 45
Ala Trp Glu Glu Gly Val Cys Gly Ile Arg Ser Ala Thr Arg Leu Glu
50 55 60
Asn Ile Met Trp Lys Gln Ile Ser Asn Glu Leu Asn His Ile Leu Leu
65 70 75 80
Glu Asn Asp Met Lys Phe Thr Val Val Val Gly Asp Ala Ser Gly Ile
85 90 95
Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln Pro Met Glu His Lys
100 105 110
Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys Ala Lys Ile Ile Gly Ala Asp Ile
115 120 125
Gln Asn Thr Thr Phe Ile Ile Asp Gly Pro Asp Thr Pro Glu Cys Ser
130 135 140
Asp Asp Gln Arg Ala Trp Asn Ile Trp Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe
145 150 155 160
Gly Ile Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Asp Ser Tyr Thr
165 170 175
Gln Met Cys Asp His Arg Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Ser Lys
180 185 190
Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Glu
195 200 205
Thr Trp Lys Leu Ala Arg Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Thr Cys Ile
210 215 220
Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu
225 230 235 240
Met Ile Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Gly Pro Ile Ser Gln His Asn Tyr
245 250 255
Arg Pro Gly Tyr Phe Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Phe Asp Leu Cys Glu Gly Thr Thr Val Ile Val Asp
275 280 285
Glu His Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Val Thr
290 295 300
Gly Lys Ile Ile His Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro
305 310 315 320
Leu Arg Phe Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Val Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Lys Ser Met Val Ser Ala
340 345 350
<210> 3
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO3: 登革病毒2 NS1抗原
<400> 3
Asp Ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr
20 25 30
Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys
35 40 45
Ala Gln Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu
50 55 60
Asn Leu Met Trp Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ala
65 70 75 80
Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile
85 90 95
Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys
100 105 110
Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser
115 120 125
His Asn Gln Thr Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro
130 135 140
Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe
145 150 155 160
Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Lys Glu Lys Gln Asp
165 170 175
Ala Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg
180 185 190
Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp
195 200 205
Thr Trp Lys Ile Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Asn Cys His
210 215 220
Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu
225 230 235 240
Met Ile Ile Pro Lys Asn Leu Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr
245 250 255
Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Ile Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys
260 265 270
Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Asp Gly Thr Thr Val Val Val Thr
275 280 285
Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser
290 295 300
Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro
305 310 315 320
Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala
340 345 350
<210> 4
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO4: 登革病毒3 NS1抗原
<400> 4
Asp Met Gly Cys Val Ile Asn Trp Lys Gly Lys Glu Leu Lys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ile Phe Val Thr Asn Glu Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr
20 25 30
Lys Phe Gln Ala Asp Ser Pro Lys Arg Leu Ala Thr Ala Ile Ala Gly
35 40 45
Ala Trp Glu Asn Gly Val Cys Gly Ile Arg Ser Thr Thr Arg Met Glu
50 55 60
Asn Leu Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asn Glu Leu Asn His Ile Leu Trp
65 70 75 80
Glu Asn Asn Ile Lys Leu Thr Val Val Val Gly Asp Ile Ile Gly Val
85 90 95
Leu Glu Gln Gly Lys Arg Thr Leu Thr Pro Gln Pro Met Glu Leu Lys
100 105 110
Tyr Ser Trp Lys Ile Trp Gly Lys Ala Lys Ile Val Thr Ala Glu Thr
115 120 125
Gln Asn Ser Ser Phe Ile Ile Asp Gly Pro Asn Thr Pro Glu Cys Pro
130 135 140
Ser Ala Ser Arg Ala Trp Asn Val Trp Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe
145 150 155 160
Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Val Tyr Thr
165 170 175
Gln Ser Cys Asp His Arg Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Glu Arg
180 185 190
Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Gln Lys Asn Gly
195 200 205
Ser Trp Lys Leu Glu Lys Ala Ser Leu Ile Glu Val Lys Thr Cys Thr
210 215 220
Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Asp
225 230 235 240
Met Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Ile Ser Gln His Asn His
245 250 255
Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Phe Asn Tyr Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Ile Thr
275 280 285
Glu Asn Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Val Ser
290 295 300
Gly Lys Leu Ile His Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro
305 310 315 320
Leu Arg Tyr Met Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Ile Asn Glu Lys Glu Glu Asn Met Val Lys Ser Leu Ala Ser Ala
340 345 350
<210> 5
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO5: 登革病毒4 NS1抗原
<400> 5
Asp Thr Gly Cys Ala Val Ser Trp Ser Gly Lys Glu Leu Lys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ile Phe Val Val Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr
20 25 30
Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ala Arg Leu Ala Ser Ala Ile Leu Asn
35 40 45
Ala His Lys Asp Gly Val Cys Gly Ile Arg Ser Thr Thr Arg Leu Glu
50 55 60
Asn Val Met Trp Lys Gln Ile Thr Asn Glu Leu Asn Tyr Val Leu Trp
65 70 75 80
Glu Gly Gly His Asp Leu Thr Val Val Ala Gly Asp Val Lys Gly Val
85 90 95
Leu Thr Lys Gly Lys Arg Ala Leu Thr Pro Pro Val Asn Asp Leu Lys
100 105 110
Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Lys Ile Phe Thr Pro Glu Ala
115 120 125
Arg Asn Ser Thr Phe Leu Ile Asp Gly Pro Asp Thr Ser Glu Cys Pro
130 135 140
Asn Glu Arg Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe
145 150 155 160
Gly Met Phe Thr Thr Asn Ile Trp Met Lys Phe Arg Glu Gly Ser Ser
165 170 175
Glu Val Cys Asp His Arg Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Gln Lys
180 185 190
Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ser Lys Asn Gln
195 200 205
Thr Trp Gln Ile Glu Lys Ala Ser Leu Ile Glu Val Lys Thr Cys Leu
210 215 220
Trp Pro Lys Thr His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Gln
225 230 235 240
Met Leu Ile Pro Lys Ser Tyr Ala Gly Pro Phe Ser Gln His Asn Tyr
245 250 255
Arg Gln Gly Tyr Ala Thr Gln Thr Val Gly Pro Trp His Leu Gly Lys
260 265 270
Leu Glu Ile Asp Phe Gly Glu Cys Pro Gly Thr Thr Val Thr Ile Gln
275 280 285
Glu Asp Cys Asp His Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser
290 295 300
Gly Lys Leu Val Thr Gln Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Met Pro Pro
305 310 315 320
Leu Arg Phe Leu Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Leu Ser Glu Lys Glu Glu Asn Met Val Lys Ser Gln Val Ser Ala
340 345 350
<210> 6
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO6: 西尼罗病毒NS1抗原
<400> 6
Asp Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Gly Arg Gln Glu Leu Arg Cys Gly
1 5 10 15
Ser Gly Val Phe Ile His Asn Asp Val Glu Ala Trp Met Asp Arg Tyr
20 25 30
Lys Phe Tyr Pro Glu Thr Pro Gln Gly Leu Ala Lys Ile Ile Gln Lys
35 40 45
Ala His Ala Glu Gly Val Cys Gly Leu Arg Ser Val Ser Arg Leu Glu
50 55 60
His Gln Met Trp Glu Ala Ile Lys Asp Glu Leu Asn Thr Leu Leu Lys
65 70 75 80
Glu Asn Gly Val Asp Leu Ser Val Val Val Glu Lys Gln Asn Gly Met
85 90 95
Tyr Lys Ala Ala Pro Lys Arg Leu Ala Ala Thr Thr Glu Lys Leu Glu
100 105 110
Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Ile Ile Phe Ala Pro Glu Leu
115 120 125
Ala Asn Asn Thr Phe Val Ile Asp Gly Pro Glu Thr Glu Glu Cys Pro
130 135 140
Thr Ala Asn Arg Ala Trp Asn Ser Met Glu Val Glu Asp Phe Gly Phe
145 150 155 160
Gly Leu Thr Ser Thr Arg Met Phe Leu Arg Ile Arg Glu Thr Asn Thr
165 170 175
Thr Glu Cys Asp Ser Lys Ile Ile Gly Thr Ala Val Lys Asn Asn Met
180 185 190
Ala Val His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp Ile Glu Ser Gly Leu Asn Asp
195 200 205
Thr Trp Lys Leu Glu Arg Ala Val Leu Gly Glu Val Lys Ser Cys Thr
210 215 220
Trp Pro Glu Thr His Thr Leu Trp Gly Asp Gly Val Leu Glu Ser Asp
225 230 235 240
Leu Ile Ile Pro Ile Thr Leu Ala Gly Pro Arg Ser Asn His Asn Arg
245 250 255
Arg Pro Gly Tyr Lys Thr Gln Asn Gln Gly Pro Trp Asp Glu Gly Arg
260 265 270
Val Glu Ile Asp Phe Asp Tyr Cys Pro Gly Thr Thr Val Thr Ile Ser
275 280 285
Asp Ser Cys Glu His Arg Gly Pro Ala Ala Arg Thr Thr Thr Glu Ser
290 295 300
Gly Lys Leu Ile Thr Asp Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro
305 310 315 320
Leu Arg Phe Gln Thr Glu Asn Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Thr Arg His Asp Glu Lys Thr Leu Val Gln Ser Arg Val Asn Ala
340 345 350
<210> 7
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO7: 蜱传脑炎病毒NS1抗原
<400> 7
Asp Val Gly Cys Ala Val Asp Thr Glu Arg Met Glu Leu Arg Cys Gly
1 5 10 15
Glu Gly Leu Val Val Trp Arg Glu Val Ser Glu Trp Tyr Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Tyr Tyr Pro Glu Thr Pro Gly Ala Leu Ala Ser Ala Ile Lys Glu
35 40 45
Thr Phe Glu Glu Gly Thr Cys Gly Ile Val Pro Gln Asn Arg Leu Glu
50 55 60
Met Ala Met Trp Arg Ser Ser Ala Thr Glu Leu Asn Leu Ala Leu Ala
65 70 75 80
Glu Gly Asp Ala Asn Leu Thr Val Val Val Asp Lys Leu Asp Pro Thr
85 90 95
Asp Tyr Arg Gly Gly Ile Pro Gly Leu Leu Lys Lys Gly Lys Asp Ile
100 105 110
Lys Val Ser Trp Lys Ser Trp Gly His Ser Met Ile Trp Ser Ile Pro
115 120 125
Glu Ala Pro Arg Arg Phe Met Val Gly Thr Glu Gly Ser Ser Glu Cys
130 135 140
Pro Leu Glu Arg Arg Lys Thr Gly Val Phe Thr Val Ala Glu Phe Gly
145 150 155 160
Val Gly Leu Arg Thr Lys Val Phe Leu Asp Phe Arg Gln Glu Ser Thr
165 170 175
His Glu Cys Asp Thr Gly Val Met Gly Ala Ala Val Lys Asn Gly Met
180 185 190
Ala Val His Thr Asp Gln Ser Leu Trp Met Lys Ser Val Arg Asn Asp
195 200 205
Thr Gly Thr Tyr Ile Val Glu Leu Leu Val Thr Asp Leu Arg Asn Cys
210 215 220
Ser Trp Pro Ala Ser His Thr Ile Asp Asn Ala Glu Val Val Asp Ser
225 230 235 240
Glu Leu Phe Leu Pro Ala Ser Leu Ala Gly Pro Arg Ser Trp Tyr Asn
245 250 255
Arg Ile Pro Gly Tyr Ser Glu Gln Val Lys Gly Pro Trp Lys Tyr Ser
260 265 270
Pro Ile Arg Val Thr Arg Glu Glu Cys Pro Gly Thr Arg Val Thr Ile
275 280 285
Asn Ala Asp Cys Asp Lys Arg Gly Ala Ser Val Arg Ser Thr Thr Glu
290 295 300
Ser Gly Lys Val Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Thr Cys Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Val Thr Phe Arg Thr Gly Thr Asp Cys Trp Tyr Ala Met Glu Ile
325 330 335
Arg Pro Val His Asp Gln Gly Gly Leu Val Arg Ser Met Val Val Ala
340 345 350
<210> 8
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO8: 日本脑炎病毒NS1抗原
<400> 8
Asp Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Thr Arg Lys Glu Met Arg Cys Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ile Phe Val His Asn Asp Val Glu Ala Trp Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Lys Tyr Leu Pro Glu Thr Pro Arg Ser Leu Ala Lys Ile Val His Lys
35 40 45
Ala His Gln Glu Gly Val Cys Gly Val Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu
50 55 60
His Gln Met Trp Glu Ser Val Arg Asp Glu Leu Asn Val Leu Leu Lys
65 70 75 80
Glu Asn Ala Val Asp Leu Ser Val Val Val Asn Lys Pro Val Gly Arg
85 90 95
Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr Gln Glu Lys Phe Glu
100 105 110
Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Ile Leu Phe Ala Pro Glu Leu
115 120 125
Ala Asn Ser Thr Phe Val Val Asp Gly Pro Glu Thr Lys Glu Cys Pro
130 135 140
Asp Glu Arg Arg Ala Trp Asn Ser Met Gln Ile Glu Asp Phe Gly Phe
145 150 155 160
Gly Ile Thr Ser Thr Arg Val Trp Leu Lys Ile Arg Glu Glu Asn Thr
165 170 175
Asp Glu Cys Asp Gly Ala Ile Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly His Val
180 185 190
Ala Val His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp Ile Glu Ser Arg Leu Asn Asp
195 200 205
Thr Trp Lys Leu Glu Arg Ala Val Phe Gly Glu Val Lys Ser Cys Thr
210 215 220
Trp Pro Glu Thr His Thr Leu Trp Gly Asp Gly Val Glu Glu Ser Glu
225 230 235 240
Leu Ile Ile Pro His Thr Ile Ala Gly Pro Arg Ser Lys His Asn Arg
245 250 255
Arg Glu Gly Tyr Lys Thr Gln Asn Gln Gly Pro Trp Asp Glu Asn Gly
260 265 270
Ile Val Leu Asp Phe Asp Tyr Cys Pro Gly Thr Lys Val Thr Ile Thr
275 280 285
Glu Asp Cys Gly Lys Arg Gly Pro Ser Ile Arg Thr Thr Thr Asp Ser
290 295 300
Gly Lys Leu Ile Thr Asp Trp Cys Cys Arg Ser Cys Ser Leu Pro Pro
305 310 315 320
Leu Arg Phe Arg Thr Glu Asn Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Val Arg His Asp Glu Thr Thr Leu Val Arg Ser Gln Val Asp Ala
340 345 350
<210> 9
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO9: 黄热病毒NS1抗原
<400> 9
Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr
20 25 30
Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala
35 40 45
Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu
50 55 60
His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala Asp Glu Ile Asn Ala Ile Leu Glu
65 70 75 80
Glu Asn Glu Val Asp Ile Ser Val Val Val Gln Asp Pro Lys Asn Val
85 90 95
Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro Phe Ser Arg Ile Arg Asp Gly Leu Gln
100 105 110
Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly Lys Asn Leu Val Phe Ser Pro Gly Arg
115 120 125
Lys Asn Gly Ser Phe Ile Ile Asp Gly Lys Ser Arg Lys Glu Cys Pro
130 135 140
Phe Ser Asn Arg Val Trp Asn Ser Phe Gln Ile Glu Glu Phe Gly Thr
145 150 155 160
Gly Val Phe Thr Thr Arg Val Tyr Met Asp Ala Val Phe Glu Tyr Thr
165 170 175
Ile Asp Cys Asp Gly Ser Ile Leu Gly Ala Ala Val Asn Gly Lys Lys
180 185 190
Ser Ala His Gly Ser Pro Thr Phe Trp Met Gly Ser His Glu Val Asn
195 200 205
Gly Thr Trp Met Ile His Thr Leu Glu Ala Leu Asp Tyr Lys Glu Cys
210 215 220
Glu Trp Pro Pro Thr His Thr Ile Gly Thr Ser Val Glu Glu Ser Glu
225 230 235 240
Met Phe Met Pro Arg Ser Ile Gly Gly Pro Val Ser Ser His Asn His
245 250 255
Ile Pro Gly Tyr Lys Val Gln Thr Asn Gly Pro Trp Met Gln Val Pro
260 265 270
Leu Glu Val Lys Arg Glu Ala Cys Pro Gly Thr Ser Val Ile Ile Asp
275 280 285
Gly Asn Cys Asp Gly Arg Gly Lys Ser Thr Arg Ser Thr Thr Asp Ser
290 295 300
Gly Lys Ile Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Met Pro Pro
305 310 315 320
Val Ser Phe His Gly Ser Asp Gly Cys Trp Tyr Pro Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Arg Lys Thr His Glu Ser His Leu Val Arg Ser Trp Val Thr Ala
340 345 350
<210> 10
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO10: 具有C-末端His标签的寨卡病毒NS1抗原
<400> 10
Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly
1 5 10 15
Thr Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr
20 25 30
Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln
35 40 45
Ala Trp Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu
50 55 60
Asn Ile Met Trp Lys Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu
65 70 75 80
Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro
85 90 95
Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro
100 105 110
His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys
115 120 125
Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro
130 135 140
Leu Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe
145 150 155 160
Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser
165 170 175
Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu
180 185 190
Ala Ala His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp
195 200 205
Thr Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu
210 215 220
Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Val Glu Glu Ser Asp
225 230 235 240
Leu Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr
245 250 255
Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Val Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu
275 280 285
Glu Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser
290 295 300
Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro
305 310 315 320
Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met Val Thr Ala
340 345 350
Leu Glu His His His His His His His His
355 360
<210> 11
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 11: 寨卡病毒包膜糖蛋白
<400> 11
Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser
1 5 10 15
Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr
20 25 30
Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr
35 40 45
Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser
50 55 60
Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu
85 90 95
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100 105 110
Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Thr Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys
115 120 125
Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His
130 135 140
Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Gly Tyr Glu Thr Asp Glu Asp Arg
145 150 155 160
Ala Lys Val Glu Val Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala Glu Ala Thr Leu
165 170 175
Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro Arg Thr Gly Leu
180 185 190
Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn Lys His Trp Leu
195 200 205
Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro Trp His Ala Gly
210 215 220
Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu Ala Leu Val Glu
225 230 235 240
Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val Val Leu Gly Ser
245 250 255
Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Leu Glu Ala Glu
260 265 270
Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Phe Ser Gly His Leu Lys Cys Arg
275 280 285
Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys
290 295 300
Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Val Pro Ala Glu Thr Leu His Gly
305 310 315 320
Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys
325 330 335
Ile Pro Val Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly
340 345 350
Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser
355 360 365
Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val
370 375 380
Ile Gly Val Gly Asp Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly
385 390 395 400
Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg Gly Ala Lys Arg
405 410 415
Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly
420 425 430
Val Phe Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile Phe Gly Ala Ala
435 440 445
Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser Gln Ile Leu Ile
450 455 460
Gly Thr Leu Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys Asn Gly Ser Ile
465 470 475 480
Ser Leu Thr Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Met Ile Phe Leu Ser Thr
485 490 495
Ala Val Ser Ala
500
<210> 12
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO12: 登革病毒1包膜糖蛋白
<400> 12
Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Ser Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser
1 5 10 15
Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr
20 25 30
Thr Met Ala Lys Asp Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr
35 40 45
Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys
50 55 60
Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala
65 70 75 80
Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Ala Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe
85 90 95
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100 105 110
Leu Leu Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys
115 120 125
Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val Ile Val Thr Val His
130 135 140
Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Thr Glu His Gly Thr
145 150 155 160
Ile Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Ser Glu Ile Gln Leu Thr
165 170 175
Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp
180 185 190
Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys Glu Lys Ser Trp Leu Val
195 200 205
His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala
210 215 220
Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe
225 230 235 240
Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln
245 250 255
Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr
260 265 270
Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys
275 280 285
Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly
290 295 300
Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val
305 310 315 320
Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Arg Leu Ile Thr
340 345 350
Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Thr
355 360 365
Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys
370 375 380
Ala Leu Lys Gln Cys Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met
385 390 395 400
Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp
405 410 415
Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly
420 425 430
Lys Leu Val His Gln Val Phe Gly Thr Ala Tyr Gly Val Leu Phe Ser
435 440 445
Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Gly Ile Gly Ile Leu Leu Thr Trp
450 455 460
Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Met Thr Cys Ile Ala
465 470 475 480
Val Gly Met Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala
485 490
<210> 13
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO13: 登革病毒2包膜糖蛋白
<400> 13
Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr
20 25 30
Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Glu Thr
35 40 45
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys
50 55 60
Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro
65 70 75 80
Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met
85 90 95
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly
100 105 110
Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys Lys Asn Met Lys Gly Lys
115 120 125
Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His
130 135 140
Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys
145 150 155 160
Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr
165 170 175
Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp
180 185 190
Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val
195 200 205
His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala
210 215 220
Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe
225 230 235 240
Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln
245 250 255
Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met
260 265 270
Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg
275 280 285
Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly
290 295 300
Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile
305 310 315 320
Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro
325 330 335
Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile
340 345 350
Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu
355 360 365
Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro
370 375 380
Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln
385 390 395 400
Met Ile Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly
405 410 415
Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser Ile
420 425 430
Gly Lys Ala Leu His Gln Val Phe Gly Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Phe
435 440 445
Ser Gly Val Ser Trp Ile Met Lys Ile Leu Ile Gly Val Ile Ile Thr
450 455 460
Trp Ile Gly Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val
465 470 475 480
Leu Val Gly Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala
485 490 495
<210> 14
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO14: 登革病毒3包膜糖蛋白
<400> 14
Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser
1 5 10 15
Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr
20 25 30
Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Gln Lys Thr
35 40 45
Glu Ala Thr Gln Leu Ala Thr Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Gly Lys
50 55 60
Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala
65 70 75 80
Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Val Cys Lys His Thr Tyr
85 90 95
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100 105 110
Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln Cys Leu Glu Ser Ile Glu Gly Lys
115 120 125
Val Val Gln His Glu Asn Leu Lys Tyr Thr Val Ile Ile Thr Val His
130 135 140
Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Gln Gly Val Thr Ala
145 150 155 160
Glu Ile Thr Ser Gln Ala Ser Thr Ala Glu Ala Ile Leu Pro Glu Tyr
165 170 175
Gly Thr Leu Gly Leu Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn
180 185 190
Glu Met Ile Leu Leu Thr Met Lys Asn Lys Ala Trp Met Val His Arg
195 200 205
Gln Trp Phe Phe Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala Thr Thr
210 215 220
Lys Thr Pro Thr Trp Asn Arg Lys Glu Leu Leu Val Thr Phe Lys Asn
225 230 235 240
Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr Ser Gly
260 265 270
Gly Thr Ser Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp
275 280 285
Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe
290 295 300
Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile
305 310 315 320
Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser
325 330 335
Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala
340 345 350
Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu
355 360 365
Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala
370 375 380
Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe
385 390 395 400
Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr
405 410 415
Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Val Leu Asn Ser Leu Gly Lys
420 425 430
Met Val His Gln Ile Phe Gly Ser Ala Tyr Thr Ala Leu Phe Ser Gly
435 440 445
Val Ser Trp Ile Met Lys Ile Gly Ile Gly Val Leu Leu Thr Trp Ile
450 455 460
Gly Leu Asn Ser Lys Asn Thr Ser Met Ser Phe Ser Cys Ile Ala Ile
465 470 475 480
Gly Ile Ile Thr Leu Tyr Leu Gly Val Val Val Gln Ala
485 490
<210> 15
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO15: 登革病毒4包膜糖蛋白
<400> 15
Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr
20 25 30
Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Thr Lys Thr
35 40 45
Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr Tyr Cys Ile Glu Ala Ser
50 55 60
Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro
65 70 75 80
Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile Cys Arg Arg Asp Val
85 90 95
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly
100 105 110
Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser Gly Lys Ile Thr Gly Asn
115 120 125
Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Val Val Thr Val His
130 135 140
Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp Thr Ser Asn His Gly Val
145 150 155 160
Thr Ala Met Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser Val Glu Val Lys Leu Pro
165 170 175
Asp Tyr Gly Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp
180 185 190
Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Lys Lys Lys Thr Trp Leu Val
195 200 205
His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ala Gly Ala
210 215 220
Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn Tyr Lys Glu Arg Met Val Thr Phe
225 230 235 240
Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr Val Leu Gly Ser Gln
245 250 255
Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Ala Gly Ala Thr Glu Val Asp Ser
260 265 270
Gly Asp Gly Asn His Met Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Lys Val Arg
275 280 285
Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly
290 295 300
Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr
305 310 315 320
Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro
325 330 335
Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile
340 345 350
Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu
355 360 365
Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asn
370 375 380
Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys
385 390 395 400
Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly
405 410 415
Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Leu Phe Thr Ser Leu
420 425 430
Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Ser Val Tyr Thr Thr Met Phe
435 440 445
Gly Gly Val Ser Trp Met Ile Arg Ile Leu Ile Gly Phe Leu Val Leu
450 455 460
Trp Ile Gly Thr Asn Ser Arg Asn Thr Ser Met Ala Met Thr Cys Ile
465 470 475 480
Ala Val Gly Gly Ile Thr Leu Phe Leu Gly Phe Thr Val Gln Ala
485 490 495
<210> 16
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO16: 西尼罗病毒包膜糖蛋白
<400> 16
Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val Thr
20 25 30
Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn Met
35 40 45
Glu Ala Ala Asn Leu Ala Asp Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala Ser
50 55 60
Val Ser Asp Leu Ser Thr Arg Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala
65 70 75 80
His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Lys Gln Gly Val
85 90 95
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100 105 110
Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Thr Thr Lys Ala Thr Gly Trp
115 120 125
Ile Ile Gln Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His
130 135 140
Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Lys Ile Gly Ala Thr Gln Ala
145 150 155 160
Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ser Ala Pro Ser Tyr Thr Leu Lys Leu
165 170 175
Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile
180 185 190
Asp Thr Ser Ala Tyr Tyr Val Met Ser Val Gly Glu Lys Ser Phe Leu
195 200 205
Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn Leu Pro Trp Ser Ser Ala
210 215 220
Gly Ser Thr Thr Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu Met Glu Phe Glu Glu
225 230 235 240
Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro Val Glu Phe Ser Ser
260 265 270
Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Val Lys Met
275 280 285
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala
290 295 300
Phe Lys Phe Ala Arg Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
305 310 315 320
Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
325 330 335
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
340 345 350
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ser Lys Val Leu
355 360 365
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
370 375 380
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
385 390 395 400
Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Arg Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala
405 410 415
Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Val Phe Thr
420 425 430
Ser Val Gly Lys Ala Ile His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Ser
435 440 445
Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Leu Gly Ala Leu
450 455 460
Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Met Thr
465 470 475 480
Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe Leu Ser Val Asn Val His
485 490 495
Ala
<210> 17
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO17: 蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白
<400> 17
Ser Arg Cys Thr His Leu Glu Asn Arg Asp Phe Val Thr Gly Thr Gln
1 5 10 15
Gly Thr Thr Arg Val Thr Leu Val Leu Glu Leu Gly Gly Cys Val Thr
20 25 30
Ile Thr Ala Glu Gly Lys Pro Ser Met Asp Val Trp Leu Asp Ala Ile
35 40 45
Tyr Gln Glu Lys Pro Ala Lys Thr Arg Glu Tyr Cys Leu His Ala Lys
50 55 60
Leu Ser Asp Thr Lys Val Ala Ala Arg Cys Pro Thr Met Gly Pro Ala
65 70 75 80
Thr Leu Thr Glu Glu His Gln Gly Gly Thr Val Cys Lys Arg Asp Gln
85 90 95
Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn His Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100 105 110
Ile Val Ala Cys Val Lys Ala Ala Cys Glu Ala Lys Lys Lys Ala Thr
115 120 125
Gly His Val Tyr Asp Ala Asn Arg Ile Val Tyr Thr Val Lys Val Glu
130 135 140
Pro His Thr Gly Asp Tyr Val Ala Ala Asn Glu Thr His Ser Gly Arg
145 150 155 160
Lys Thr Ala Ser Phe Thr Val Ser Ser Glu Lys Thr Ile Leu Thr Met
165 170 175
Gly Glu Tyr Gly Asp Val Ser Leu Leu Cys Arg Val Ala Ser Gly Val
180 185 190
Asp Leu Ala Gln Thr Val Ile Leu Glu Leu Asp Lys Thr Val Glu His
195 200 205
Leu Pro Thr Ala Trp Gln Val His Arg Asp Trp Phe Asn Asp Leu Ala
210 215 220
Leu Pro Trp Lys His Glu Gly Ala Gln Asn Trp Asn Asn Ala Glu Arg
225 230 235 240
Leu Val Glu Phe Gly Ala Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Tyr Asn
245 250 255
Leu Gly Asp Gln Thr Gly Val Leu Leu Lys Ala Leu Ala Gly Val Pro
260 265 270
Val Ala His Ile Glu Gly Thr Lys Tyr His Leu Lys Ser Gly His Val
275 280 285
Thr Cys Glu Val Gly Leu Glu Lys Leu Lys Met Lys Gly Leu Thr Tyr
290 295 300
Thr Met Cys Asp Lys Thr Lys Phe Thr Trp Lys Arg Ala Pro Thr Asp
305 310 315 320
Ser Gly His Asp Thr Val Val Met Glu Val Thr Phe Ser Gly Thr Lys
325 330 335
Pro Cys Arg Ile Pro Val Arg Ala Val Ala His Gly Ser Pro Asp Val
340 345 350
Asn Val Ala Met Leu Ile Thr Pro Asn Pro Thr Ile Glu Asn Asn Gly
355 360 365
Gly Gly Phe Ile Glu Met Gln Leu Pro Pro Gly Asp Asn Ile Ile Tyr
370 375 380
Val Gly Glu Leu Ser His Gln Trp Phe Gln Lys Gly Ser Ser Ile Gly
385 390 395 400
Arg Val Phe Gln Lys Thr Lys Lys Gly Ile Glu Arg Leu Thr Val Ile
405 410 415
Gly Glu His Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ala Gly Gly Phe Leu Ser Ser
420 425 430
Ile Gly Lys Ala Val His Thr Val Leu Gly Gly Ala Phe Asn Ser Ile
435 440 445
Phe Gly Gly Val Gly Phe Leu Pro Lys Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu
450 455 460
Ala Trp Leu Gly Leu Asn Met Arg Asn Pro Thr Met Ser Met Ser Phe
465 470 475 480
Leu Leu Ala Gly Gly Leu Val Leu Ala Met Thr Leu Gly Val Gly Ala
485 490 495
<210> 18
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO18: 日本脑炎病毒包膜糖蛋白
<400> 18
Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr
20 25 30
Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile
35 40 45
Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser
50 55 60
Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala
65 70 75 80
His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe
85 90 95
Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100 105 110
Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg
115 120 125
Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His
130 135 140
Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Val Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile
165 170 175
Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro
180 185 190
Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser
195 200 205
Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro
210 215 220
Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met
225 230 235 240
Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly
245 250 255
Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val
260 265 270
Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg
275 280 285
Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys
290 295 300
Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly
305 310 315 320
Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys
325 330 335
Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly
340 345 350
Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser
355 360 365
Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val
370 375 380
Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly
385 390 395 400
Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg
405 410 415
Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly
420 425 430
Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala
435 440 445
Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met
450 455 460
Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile
465 470 475 480
Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr
485 490 495
Asn Val His Ala
500
<210> 19
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO19: 玻瓦散病毒NS1抗原
<400> 19
Asp Tyr Gly Cys Ala Ile Asp Pro Glu Arg Met Glu Ile Arg Cys Gly
1 5 10 15
Glu Gly Leu Val Val Trp Lys Glu Val Ser Glu Trp Tyr Asp Gly Tyr
20 25 30
Ala Tyr His Pro Glu Ser Pro Asp Thr Leu Ala Gln Ala Leu Arg Glu
35 40 45
Ala Phe Glu Arg Gly Val Cys Gly Val Val Pro Gln Asn Arg Leu Glu
50 55 60
Met Ala Met Trp Arg Ser Thr Ala Pro Glu Leu Asn Leu Val Leu Ser
65 70 75 80
Glu Gly Glu Ala Asn Leu Thr Ile Val Val Asp Lys Thr Asp Pro Ala
85 90 95
Asp Tyr Arg Gly Gly Thr Pro Met Val Leu Lys Lys Thr Gly Lys Glu
100 105 110
Ser Lys Val Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys Ser Ile Leu Trp Ser Val
115 120 125
Pro Asp Ser Pro Arg Arg Met Met Met Gly Val Asp Gly Val Gly Glu
130 135 140
Cys Pro Leu Tyr Arg Arg Ala Thr Gly Val Phe Thr Val Ala Glu Phe
145 150 155 160
Gly Val Gly Leu Arg Thr Lys Val Phe Leu Asp Leu Arg Gly Glu Ala
165 170 175
Ser Lys Glu Cys Asp Thr Gly Val Met Gly Ala Ala Val Lys Asn Gly
180 185 190
Lys Ala Ile His Thr Asp Gln Ser Met Trp Met Ser Ser Phe Arg Asn
195 200 205
Asp Thr Gly Thr Tyr Ile His Glu Leu Ile Leu Thr Asp Leu Arg Asn
210 215 220
Cys Thr Trp Pro Ala Ser His Thr Ile Asp Asn Asp Gly Val Leu Asp
225 230 235 240
Ser His Leu Phe Leu Pro Val Thr Leu Ala Gly Pro Arg Ser Lys Tyr
245 250 255
Asn Arg Ile Pro Gly Tyr Ser Glu Gln Val Arg Gly Pro Trp Asp Gln
260 265 270
Thr Pro Leu Arg Val Val Arg Asp His Cys Pro Gly Thr Ser Val Arg
275 280 285
Ile Asp Ser His Cys Asp Lys Arg Gly Ala Ser Val Arg Ser Thr Thr
290 295 300
Glu Ser Gly Lys Ile Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Ala Cys Glu Leu
305 310 315 320
Pro Pro Val Thr Phe Arg Ser Gly Thr Asp Cys Trp Tyr Ala Met Glu
325 330 335
Ile Arg Pro Val His Ser Gln Gly Gly Leu Val Arg Ser Met Val Val
340 345 350
Ala
<210> 20
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO20: 具有C-末端His标签和额外的所融合的肽的寨卡病毒NS1抗原
<400> 20
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gly Pro Met Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys
20 25 30
Lys Glu Thr Arg Cys Gly Thr Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu
35 40 45
Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu
50 55 60
Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Trp Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Ser Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Lys Ser Val Glu Gly Glu
85 90 95
Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val
100 105 110
Gly Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val
115 120 125
Pro Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr
130 135 140
Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp
145 150 155 160
Thr Leu Lys Glu Cys Pro Leu Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu
165 170 175
Val Glu Asp His Gly Phe Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys
180 185 190
Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr
195 200 205
Ala Val Lys Gly Lys Glu Ala Ala His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile
210 215 220
Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile
225 230 235 240
Glu Met Lys Thr Cys Glu Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp
245 250 255
Gly Val Glu Glu Ser Asp Leu Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro
260 265 270
Leu Ser His His Asn Thr Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Val Lys Gly
275 280 285
Pro Trp His Ser Glu Glu Leu Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly
290 295 300
Thr Lys Val His Val Glu Glu Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu
305 310 315 320
Arg Ser Thr Thr Ala Ser Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg
325 330 335
Glu Cys Thr Met Pro Pro Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp
340 345 350
Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val
355 360 365
Arg Ser Met Val Thr Ala Leu Glu His His His His His His His His
370 375 380
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO21: 寨卡病毒NS1表位
<400> 21
Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Lys Ser Val Glu Gly
1 5 10
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO22: 寨卡病毒NS1表位
<400> 22
Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO23: 寨卡病毒NS1表位
<400> 23
Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr
1 5
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO24: 寨卡病毒NS1表位
<400> 24
Asp Thr Leu Lys
1
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO25: 寨卡病毒NS1表位
<400> 25
Asp Tyr Ser Leu Glu
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO26: 寨卡病毒NS1表位
<400> 26
Ser Phe Arg Ala Lys
1 5
<210> 27
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO27: 黄热病毒包膜糖蛋白
<400> 27
Ala His Cys Ile Gly Ile Thr Asp Arg Asp Phe Ile Glu Gly Val His
1 5 10 15
Gly Gly Thr Trp Val Ser Ala Thr Leu Glu Gln Asp Lys Cys Val Thr
20 25 30
Val Met Ala Pro Asp Lys Pro Ser Leu Asp Ile Ser Leu Glu Thr Val
35 40 45
Ala Ile Asp Gly Pro Ala Glu Ala Arg Lys Val Cys Tyr Asn Ala Val
50 55 60
Leu Thr His Val Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr Gly Glu Ala
65 70 75 80
His Leu Ala Glu Glu Asn Glu Gly Asp Asn Ala Cys Lys Arg Thr Tyr
85 90 95
Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100 105 110
Ile Val Ala Cys Ala Lys Phe Thr Cys Ala Lys Ser Met Ser Leu Phe
115 120 125
Glu Val Asp Gln Thr Lys Ile Gln Tyr Val Ile Arg Ala Gln Leu His
130 135 140
Val Gly Ala Lys Gln Glu Asn Trp Asn Thr Asp Ile Lys Thr Leu Lys
145 150 155 160
Phe Asp Ala Leu Ser Gly Ser Gln Glu Ala Glu Phe Thr Gly Tyr Gly
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Glu Cys Gln Val Gln Thr Ala Val Asp Phe Gly Asn
180 185 190
Ser Tyr Ile Ala Glu Met Glu Lys Glu Ser Trp Ile Val Asp Arg Gln
195 200 205
Trp Ala Gln Asp Leu Thr Leu Pro Trp Gln Ser Gly Ser Gly Gly Val
210 215 220
Trp Arg Glu Met His His Leu Val Glu Phe Glu Pro Pro His Ala Ala
225 230 235 240
Thr Ile Arg Val Leu Ala Leu Gly Asn Gln Glu Gly Ser Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Leu Thr Gly Ala Met Arg Val Thr Lys Asp Thr Asn Asp Asn Asn
260 265 270
Leu Tyr Lys Leu His Gly Gly His Val Ser Cys Arg Val Lys Leu Ser
275 280 285
Ala Leu Thr Leu Lys Gly Thr Ser Tyr Lys Met Cys Thr Asp Lys Met
290 295 300
Ser Phe Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met
305 310 315 320
Gln Val Lys Val Pro Lys Gly Ala Pro Cys Lys Ile Pro Val Ile Val
325 330 335
Ala Asp Asp Leu Thr Ala Ala Ile Asn Lys Gly Ile Leu Val Thr Val
340 345 350
Asn Pro Ile Ala Ser Thr Asn Asp Asp Glu Val Leu Ile Glu Val Asn
355 360 365
Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly Thr Gly Asp Ser Arg
370 375 380
Leu Thr Tyr Gln Trp His Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys Leu Phe
385 390 395 400
Thr Gln Thr Met Lys Gly Ala Glu Arg Leu Ala Val Met Gly Asp Ala
405 410 415
Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr Ser Val Gly Lys
420 425 430
Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly Leu Phe Gly Gly
435 440 445
Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile Trp Val
450 455 460
Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Val
465 470 475 480
Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala
485 490

Claims (11)

1.在诊断学上有用的承载体在制备用于区分寨卡病毒急性感染与相同或另一种黄病毒的先前感染的试剂盒中的用途，所述承载体包含用于特异性地捕获在来自受试者的样品中的针对SEQ ID NO:1的抗体的工具，和与IgA类别抗体的恒定区相结合的二抗。
2.根据权利要求1的用途，其中所述承载体选自包括下列各项的组：珠粒；测试条；微量滴定板；印迹；侧流测试；玻璃表面；载玻片；生物芯片；和膜。
3.根据权利要求2的用途，其中所述珠粒为顺磁性颗粒。
4.根据权利要求2的用途，其中所述印迹选自包括Western印迹、线印迹和斑点印迹的组。
5.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中在空间上分开的结合反应中检测针对SEQID NO:1的抗体的存在或不存在和针对一种或多种进一步的抗原的抗体的存在或不存在。
6.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中所述针对SEQ ID NO:1的抗体为哺乳动物抗体。
7.根据权利要求6的用途，其中所述哺乳动物抗体为人抗体。
8.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中所述针对SEQ ID NO:1的抗体通过使用从包括下列各项的组中选择的方法来进行检测：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定法，凝集技术，标记免疫测定法，酶免疫测定法，化学发光法，免疫测定法，和免疫荧光技术。
9.根据权利要求8的用途，其中所述标记免疫测定法为放射性标记免疫测定法。
10.根据权利要求8的用途，其中所述酶免疫测定法为比色测定法。
11.根据权利要求8的用途，其中所述化学发光法为电化学发光法。
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