CN102432676A

CN102432676A - 一种检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN102432676A
Application number: CN2011103002306A
Authority: CN
Inventors: 任瑞文; 唐博恒; 张培; 洪文艳; 于德宪
Original assignee: DISEASE CONTROL AND PREVENTION CENTER OF GUANGZHOU MILITARY AREA PLA
Current assignee: DISEASE CONTROL AND PREVENTION CENTER OF GUANGZHOU MILITARY AREA PLA
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2012-05-02

Abstract

一种检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白是以登革病毒的原核表达抗原Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2等量混合而成。本发明还公开了该重组抗原蛋白的制备方法。另外，本发明公开的登革病毒的检测试剂盒中包括抗体检测板和ELISA反应液，该抗体检测板上包被有以登革病毒的原核表达抗原Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2等量混合而成重组抗原蛋白。本发明的重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与登革病毒抗体具有极高亲和力，能够快速、准确地检测登革病毒抗体，从而诊断登革病毒的感染情况。

Description

一种检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种诊断登革病毒抗体的重组抗原蛋白及其制备方法，以及以该抗原蛋白作为包被抗原的登革病毒检测试剂盒。

背景技术

登革病毒(Dengue virus，DV)隶属黄病毒科，包括1～4个血清型，据世界卫生组织统计，目前全世界超过100个国家的25亿人正受登革病毒威胁，每年感染人口多达5000万～1亿，其中有25～50万人属于严重的登革出血热，平均死亡率为5％，是仅次于疟疾的重要热带病。我国南方各省为登革热高发区，监测表明，1990～2010年间我国每年都有登革热流行，种种迹象表明我国已成为登革病毒的疫源地。因此，登革病毒的预防与控制日益紧迫。而该类病毒防制的关键在于及时发现，并尽早隔离，故而对登革病毒及时、有效地检测对于该病的检疫和防止具有非常重要的意义。目前国内外关于登革病毒检测方法一般采取病毒分离、核酸检测及免疫学检测。其中病毒分离及核酸杂交法操作都较繁琐，对仪器要求较高，而且其周期都较长，且病毒分离还受标本抽取时间、临床用药等因素的影响，达不到早期快速诊治的目的，很难在实践中得到应用；建立在PCR基础上的快检方法近年进展较快，但对设备及操作人员的要求较高，容易产生假阳性、假阴性结果。免疫学检测主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)及胶体金等方法，速度快，对实验要求不高，不需要无菌操作，可以自动化、高通量的检测大量样品，同时也比较灵敏、可靠，并且已经在不同的病原检测中得到广泛应用，其操作已被广大基层卫生防疫人员熟练掌握，有其他方法无法代替的优势。

从现有技术中公开的登革病毒血清学诊断方面的资料来看，主要存在以下方面的问题：(1)不同黄病毒之间存在严重的血清学交叉反应，在那些存在多种黄病毒流行的区域，由于混合感染，患者体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困难。(2)由于IgG抗体可以在宿主体内存在很长时间，有的还会超过10个月，甚至终生携带，使得鉴别过去、最近还是现在感染登革病毒十分困难。(3)登革病毒为小RNA病毒，具有较高的突变率，因此采用单抗原检测时其覆盖面往往受到限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供一种检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白及其制备方法，该重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与登革病毒抗体具有极高亲和力。

本发明的所解决的技术问题在于提供一种登革病毒的检测试剂盒，利用所制备的重组抗原蛋白，建立登革病毒抗体的ELISA快速检测技术。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供一种检测登革病毒的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白包括具有如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的Den-Ag5。

优选地，所述Den-Ag5的编码基因序列具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

优选地，所述重组抗原蛋白还包括具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的Den-Ag1和/或具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列Den-Ag2；所述Den-Ag1的编码基因序列具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的编码基因序列具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步优选地，所述重组抗原蛋白为Den-Ag5、Den-Ag1、Den-Ag2等量混合而成。

该重组抗原蛋白是通过选择登革病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，并将相应的目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表达而制备得到，而目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。

另一方面，本发明具体实施方式中还提供了一种检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

一、选择登革病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段包含如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；

二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列。

优选地，所述目的基因片段还包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的Den-Ag1；如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列编码具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的Den-Ag2。

优选地，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下：

扩增SEQ ID NO.1核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGAATTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGA<SEQ ID NO.7>

反向引物：ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAT<SEQ ID NO.8>；

扩增SEQ ID NO.3核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT<SEQ ID NO.9>，

反向引物：ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG<SEQ ID NO.10>；

扩增SEQ ID NO.5核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA<SEQ ID NO.11>，

反向引物：ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC<SEQ ID NO.12>。

优选地，在本发明的一个具体实施例中所述原核表达载体选用pET32a或pMAL c2x原核表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。

对于本发明的重组抗原蛋白，其具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与登革病毒抗体具有极高亲和力。在本发明的实施例中，通过将表达获得的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，验证了本发明的重组抗原蛋白具有极高的特异性，并获取了能高效表达登革病毒特异性重组抗原的基因工程菌株，同时结合采用了该重组抗原蛋白的登革病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验和对具体临床标本的测试试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白在用于检测登革病毒时表现出的高灵敏度、高特异性的优势。

对于本发明的重组抗原蛋白制备方法，由于其选择了登革病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，而目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠，同时结合上述方案中涉及的专用引物，有效地获取了该目的基因，同时结合该方法中采用的原核表达载体和表达宿主菌，使重组抗原蛋白具备高效的表达效果。另外，在本发明的实施例中，通过将表达获得的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，同时结合采用了该重组抗原蛋白的登革病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验和对具体临床标本的测试试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白的制备方法在高效表达重组抗原蛋白、以及保证本发明重组抗原蛋白的高灵敏度、高特异性方面表现出的优势。

另外，本发明还提供了一种登革病毒的检测试剂盒，包括抗体检测板和ELISA反应液，所述抗体检测板上包被有检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白，而所述重组抗原蛋白即为本发明上述方案中揭示的重组抗原蛋白。

其中，试剂盒中ELISA反应液包括：酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，酶结合物工作液，阳性对照为登革病毒抗体标准品，阴性对照为登革病毒抗体阴性血清。

优选地，在本发明具体实施例中所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG。

优选地，所述抗体检测板的制备过程包括如下步骤：

一、按照本发明上述方案中揭示的重组抗原蛋白制备方法制备重组抗原蛋白；

二、将纯化后的重组抗原蛋白固定于酶联板，该过程包括将步骤一中纯化得到的重组抗原蛋白分别以梯级浓度包被酶联板，每孔50-200ul，4℃包被过夜，而后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤1-2分钟；将其拍干后，用5％牛血清白蛋白溶液于37℃封闭1-3小时，晾干后即得到所述抗体检测板；而所述重组抗体为即为本发明上述方案中揭示的检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白。

优选地，在本发明的一个具体实施例中，所述重组抗原蛋白为Den-Ag5、Den-Ag1、Den-Ag2等量混合而成。

结合本发明的优选实施例中揭示的实验内容可以看出，实验中在保证反应原性的基础上，尽量缩短了抗原片段长度，确保所筛选的原核表达抗原具备良好的特异性，与所测试的流行性乙型脑炎、黄热、西尼罗河、基孔肯亚、辛德毕斯、西门利克、马雅罗、罗斯河、鹭山及盖塔病毒均无交叉反应。同时，所建立的制备方法及登革病毒的检测试剂盒均具备较高灵敏度及检出范围，以登革病毒小鼠免疫血清进行的实验表明，在血清1∶1～1∶12800倍稀释范围内，均可获得阳性结果，而且无非特异性结果。以登革病毒患者血清进行的实验表明，在血清1∶50～1∶200倍稀释范围内，均可获得阳性结果，检测OD值在0.25以上，S/N比值在15以上。

另外，还需要说明的是，本发明的优选实施例中包被于抗体检测板上的重组抗原蛋白由三段登革病毒原核表达抗原混合而成，既包括病毒NS1早期蛋白，可用于早期诊断，也包括病毒E包膜蛋白，具备较高的敏感性，并且多检测位点也提高了检测方法的覆盖面。但本发明的所要求保护的内容并不仅限于该技术方案，实验数据表明，仅含有Den-Ag5的重组抗原蛋白即可实现该检测，而该实施例中的方式通过等量的三种混合抗原，保证了试剂盒较高的敏感性和有效性。

另一方面，结合本发明的重组抗原蛋白用于登革病毒的检测试剂盒的具体实施方式，充分说明了本发明的重组抗原蛋白在制备诊断登革病毒试剂盒中的运用，并能够保证登革病毒诊断过程中的灵敏度和特异性。相对于全病毒抗原，重组抗原蛋白纯度高、特异性强，便于质量控制，可以去掉不与抗体结合的无关区段，将使得检测灵敏度和特异性增加，并且成本也较低，在病毒检测中具有较大优势。

附图说明

图1是本发明实施例1中登革1-4型病毒、黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒多克隆抗体与原核表达抗原的western blot杂交结果。a：SDS PAGE电泳图；b：登革1型病毒多克隆抗体Western blot结果；c：登革2型病毒多克隆抗体Western blot结果；d：登革3型病毒多克隆抗体Wester blot结果；e：登革4型病毒多克隆抗体Western blot结果；f：黄热病毒多克隆抗体Western blot结果；g：流行性乙型脑炎病毒多克隆抗体Western blot结果。1.未诱导对照；2.pMAL c2x空载体诱导；3.Den-Ag1+pMAL c2x；4.Den-Ag2+pET32a；5.Den-Ag3+pMAL c2x；6.Den-Ag4+pMAL c2x；M.蛋白分子量Marker(分子量由上至下分别为170、130、95、72、55、43、34、26、17kDa)；7.Den-Ag5+pET32a。

图2是本发明实施例中ELISA方法及其应用；其中，a：抗原包被浓度实验，A1～A2，B1～B2，C1～C2，D1～D2，E1～E2，F1～F2，G1～G2分别为三种重组抗原等量混合后20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml、0.3125ug/ml包被，H1、H2为未包被对照；b：ELISA敏感性实验，正交法法将鼠抗登革2型病毒多克隆抗体进行稀释，测定ELISA方法敏感性；c：ELISA特异性实验，A1，A2孔加登革1型病毒多克隆抗体，B1，B2为登革2型病毒多克隆抗体，C1，C2为登革3型病毒多克隆抗体，D1，D2为登革4型病毒多克隆抗体，E1，E2为流行性乙型脑炎病毒多克隆抗体，F1，F2为黄热病度多克隆抗体，G1，G2为西尼罗河病毒多克隆抗体；H1，H2基孔肯雅病毒多克隆抗体；A3，A4为玛雅罗病毒多克隆抗体；B3，B4为罗斯河病毒多克隆抗体，C3，C4为鹭山病毒多克隆抗体，D3，D4为盖塔病毒多克隆抗体；E3，E4，辛德毕斯病毒多克隆抗体；F3，F4，西门利克病毒病毒多克隆抗体；G3，G4为阴性血清对照；H3，H4为阳性血清对照；d：临床标本检测结果，A1～A4：1号患者血清50、100、400、800倍稀释后的检测结果，B1～B4，2号患者血清50、100、200、400倍稀释后的检测结果，C1～C4，3号患者血清50、100、200、400倍稀释后的检测结果，D1～D4，4号患者血清50、100、200、400倍稀释后的检测结果，E1～E4，5号患者血清50、100、200、400倍稀释后的检测结果，F1～F4，6号患者血清50、100、200、400倍稀释后的检测结果；G1～G4，阴性血清50、100、200、400倍稀释后的检测结果，H1～H4，阳性血清2000、4000、8000、16000倍稀释后的检测结果。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。

本发明的下列实施例中，选用的登革病毒为登革病毒1型(Hawaii株，DV1)，登革病毒2型(NGC株，DV2)，登革病毒3型(H87株，DV3)，登革病毒4型(H241株，DV4)，申请人实验室内有毒株样本；而实验中用的内切酶、连接酶、T载体购自大连TaKaRa公司。凝胶纯化回收及质粒快速提取试剂盒购自OMEGA公司。Trizol及反转录试剂购自Invitrogen公司。pET32a表达载体及其重组蛋白纯化试剂购自Novagen公司，pMAL-C2x表达载体购自New England Biolabs公司，Amylose Resin亲和层析试剂购自NEB公司，表达宿主菌Rosetta(DE3)由本实验室传代保存。

实施例1、检测登革病毒的重组抗原蛋白的制备

按照如下步骤制备检测登革病毒的重组抗原蛋白：

步骤一、选择登革病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。其中，目的基因片段包括Den-Ag5的编码序列、Den-Ag1的编码序列和Den-Ag2的编码序列，Den-Ag1的编码基因序列具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的编码基因序列具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述Den-Ag5的编码基因序列具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

步骤二、设计PCR扩增引物，并通过PCR分别扩增步骤一种三个不同的目的基因片段。其中，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下：

扩增SEQ ID NO.1核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGAATTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGA<SEQ ID NO.7>

反向引物：ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAT<SEQ ID NO.8>；

扩增SEQ ID NO.3核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT<SEQ ID NO.9>，

反向引物：ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG<SEQ ID NO.10>；

扩增SEQ ID NO.5核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA<SEQ ID NO.11>，

反向引物：ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC<SEQ ID NO.12>。

步骤三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

步骤四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白。

具体实现实现时，上述步骤一中，参考登革病毒登革2型病毒NGC株基因组序列，利用DNAstar及ANTHEPROT软件对其编码蛋白疏水性、抗原性、可及性及可塑性进行详细分析，并参考Genbank中的序列信息，对预测的抗原表位进行比对，初步筛选可能的抗原性片段5段。

步骤二中，根据步骤一种所选的抗原性片段，并结合多肽结构中需要的延伸区段，并通过优化设计与各区段对应的引物，通过PCR扩增相应的目的基因片段，从而使由延伸区段编码柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。为此，在本步骤的优选过程中，设计PCR扩增引物5对，如表一所示：

表一抗原片段克隆所用引物序列

其中，引物设计过程为根据抗原性分析结果设计表一中所述的引物5对，并分别于引物5’末端及3’末端导入BamH I及Hind III酶切位点。

作为获取目的基因片度的预先步骤，还需反转录登革病毒的基因组，该反转录过程为：登革2型病毒NGC株经C6/36细胞培养传代培养，采用Invitrogen的Trizol试剂提取病毒RNA，采用常规方法进行反转录获得其cDNA。

而后按如下条件进行PCR：取cDNA2μl，10×PCR缓冲液5μl，正向引物、反向引物各2μl、dNTP 8μl、Taq 2U，补水至总体积50μl进行PCR扩增。反应参数为：95℃5min，然后94℃30s，55℃40s，72℃60s，共32次循环，最后一次循环后72℃延伸7min，扩增片段经纯化、回收后，-20℃保存备用。

步骤三中、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有目的基因片段的重组表达质粒。在本发明实施例中，所述原核表达载体为pET32a或pMAL c2x原核表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。本步骤具体如下：

酶切：各取10ul经纯化的扩增产物，分别加入Buffer K 3ul，BamH I及Hind III各1ul(10U)，灭菌去离子水15ul，37℃酶切过夜。另取pET32a或pMAL c2x表达载体质粒2ug，加入Buffer K 3ul，BamH I及Hind III各1ul(10U)，灭菌去离子水补至30ul，37℃酶切过夜。酶切产物分别用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒纯化回收。

连接：取2ul经以上处理的pET32a或pMAL c2x载体(约130ng)，5ul酶切目的片段(约40ng)，45℃加热5min，以使退火的粘端解链，立即冰浴10sec，加入T4DNA连接酶0.5U，连接酶Buffer 1ul，用灭菌四馏水补至10ul，16℃连接过夜。取重组质粒5ul转化感受态菌DH5a，加入无抗生素的LB液体培养基300ul，37℃复苏45min后，取100ul涂氨苄青霉素(100ug/ml)平皿，37℃培养18h。

重组子鉴定：挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定，PCR反应体：10×PCR缓冲液2μl，正向引物、反向引物各1μl、dNTP 0.4μl、Taq 2U，补水至总体积20μl进行PCR扩增。PCR反应条件同步骤二，阳性克隆送生物工程(上海)有限公司测序确认。经测序确认获正确重组表达质粒5组，并提取质粒，并-20℃保存备用。

步骤四中、将重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养表达宿主细胞，并检测其重组蛋白表达情况，在本实施例中本步骤具体为：挑经转化重组表达载体的表达宿主菌单菌落分别接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养 4h，当OD值达0.6时，吸取未诱导对照菌1ml，并向剩余菌中加入诱导物IPTG使其终浓度为0.5mmol/L，于37℃振荡培养4h，冰浴5min后，4℃、12000g离心2min收菌，并进行SDS-PAGE检测，参照分子克隆实验指南，配制好反应液体，积层胶浓度为4％，分离胶浓度为12％，积层胶恒流10mA，分离胶恒流25mA电泳，电泳完毕后，考马斯亮蓝染色，验证重组蛋白表达情况。经本步实验，所构建的5个重组表达载体均获高效表达。

而后、对所获重组表达抗原进行western blot分析，以验证其免疫反应原性及免疫学反应的特异性，在本实施例中本步骤具体为：SDS-PAGE电泳同步骤四，电泳完毕后，电转硝酸纤维素膜，登革1型病毒、登革2型病毒、登革3型病毒、登革4型病毒、黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒多克隆抗体1∶5000稀释，进行蛋白质印迹(western-blot)，验证表达抗原的反应特异性，获能高效表达登革病毒特异性重组抗原的基因工程菌株五株，结果如图一所示。

另外，通过此高效表达菌株进行上述重组抗原蛋白的表达纯化实验，获取适合用于ELISA实验的重组抗原蛋白，本实施例中本步骤具体为：表达菌过夜培养物10ml接种1L LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃振荡培养2～3小时，待OD值达0.6时，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续37℃振荡培养4小时后，离心收获细菌，并用PBS洗涤两次，50mlPBS重悬，超声波破碎细菌后，采用NEB公司Amylose Resin亲和层析柱纯化纯化重组蛋白，核酸蛋白分析仪测定其浓度分别为Den-Ag13523μg/ml、Den-Ag21627μg/ml、Den-Ag51872μg/ml。

如图1所示，进行SDS-PAGE实验和蛋白质印迹，参照分子克隆实验指南，配制好反应液体，积层胶浓度为4％，分离胶浓度为12％，积层胶恒流10mA，分离胶恒流25mA电泳，电泳完毕后，电转硝酸纤维素膜，登革1型病毒、登革2型病毒、登革3型病毒、登革4型病毒、黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒多克隆抗体1∶5000稀释，进行蛋白质印迹(western-blot)，验证表达抗原的反应特异性，，并获得能高效表达登革病毒特异性重组抗原的基因工程菌株。而后通过此高效表达菌株进行上述重组抗原蛋白的表达纯化实验，获取适合用于 ELISA实验的重组抗原蛋白。

实施例2、重组抗原蛋白的包被实验

在本实施例中需要对本发明的重组抗原蛋白的包被条件和浓度进行优化；为了达到此目的还需要先对试剂盒中ELISA反应液成分进行说明：

酶结合物工作液：辣根过氧化物酶标记的抗人IgG多克隆抗体；

阳性对照：登革热患者血清。

阴性对照：登革病毒抗体阴性人血清。

样品稀释液：10mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；

浓缩洗涤液：0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；

显色液A：0.02％H2O2；用0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠，PH4.5～5.0稀释。

显色液B：0.4‰TMB-HCl：用50mM柠檬酸钠，浓HCl调PH值为2.8的溶液溶解。

终止液：2M H₂SO₄

将上述实施例1中获取的纯化重组抗原蛋白Den-Ag1、Den-Ag2、Den-Ag5纯化抗原等量混合后，抗原分别以20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125ug/ml浓度(指3种蛋白混合后的总浓度)包被酶联板，每孔用量100ul，4℃包被过夜，PBST洗涤3分钟，拍干，5％BSA 37℃封闭2小时，鼠抗登革病毒多克隆抗体1∶5000倍稀释后取100ul加入反应孔，37℃反应1小时，PBST洗涤4次，每次1分钟，拍干，HRP标记抗鼠二抗1∶10000倍稀释后，每孔加入100ul，37℃反应40分钟，PBST洗涤4次，每次1分钟，拍干，每孔加入TMB底物溶液100ul，37℃反应15分钟，加入50ul 2M H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，如表二所示，结果显示在包被浓度2.5～20ug/ml范围内，实验OD值无明显差别，最终选择抗原包被浓度为10ug/ml。

表二抗原包被浓度实验

实施例3、ELISA反应条件优化

对抗原包被条件及ELISA反应条件进行系统优化，最终确定最佳ELISA反应条件为：重组抗原100ul(浓度为10ug/ml)4℃包被过夜，PBST洗涤3分钟，拍干，5％BSA 37℃封闭2小时，待检血清1∶100倍稀释后取100ul加入反应孔，37℃反应1小时，PBST洗涤4次，每次1分钟，拍干，HRP标记二抗1∶10000倍稀释后，每孔加入100ul，37℃反应40分钟，PBST洗涤4次，每次1分钟，拍干，每孔加入TMB底物溶液100ul，37℃反应15分钟，加入50ul 2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定OD值。

实施例4、试剂盒的特异性实验

采用实施例3中的优化条件进行ELISA实验，选择含有辛德毕斯、西门利克、马雅罗、罗斯河、鹭山、盖塔、基孔肯雅病毒、流行性乙型脑炎、黄热及西尼罗河病毒的样品作为特异性实验参考样品，如表二所示，本发明的登革病毒的检测试剂盒及其采用的重组抗原蛋白具有良好的特异性，与上述参考样品均无交叉反应。

表三登革病毒ELISA检测方法特异性实验

实施例5、试剂盒的灵敏度实验

将实施例1中获取的纯化重组抗原蛋白以10ug/ml包被酶联板，通过正交法法对鼠抗登革2型病毒多克隆抗体进行稀释，采用实施3中的优化条件进行ELISA实验，如表三所示，测定其检出下限为1∶12800。

表三登革病毒ELISA检测方法敏感性实验

实施例5、试剂盒的灵敏度实验

利用本发明实施例2和3中公开的试剂盒及实验方法进行ELISA实验，对6份2010年东莞市登革病毒患者血清进行检测，检测结果见表四所示，在患者血清1∶50～1∶200倍稀释范围内，阳性血清ELISA反应OD值在0.25以上，S/N比值均在15以上。

表四临床标本检测情况

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋白包括具有如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的Den-Ag5，所述Den-Ag5的编码基因序列具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋白还包括具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的Den-Ag1和/或具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列Den-Ag2；所述Den-Ag1的编码基因序列具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的编码基因序列具有如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋白为Den-Ag5、Den-Ag1、Den-Ag2等量混合而成。

4.一种检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述目的基因片段还包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的Den-Ag1；如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列编码具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的Den-Ag2。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下：

扩增SEQ ID NO.1核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGAATTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGA<SEQ ID NO.7>

反向引物：ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAT<SEQ IDNO.8>；

扩增SEQ ID NO.3核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT<SEQ IDNO.9>，

反向引物：ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG<SEQ IDNO.10>；

扩增SEQ ID NO.5核苷酸序列的引物：

正向引物：CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA<SEQ ID NO.11>，

反向引物：ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC<SEQ IDNO.12>。

7.一种登革病毒的检测试剂盒，包括抗体检测板和ELISA反应液，其特征在于：所述抗体检测板上包被有检测登革病毒抗体的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白为权利要求1-3中任意一项中所述的重组抗原蛋白。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中ELISA反应液包括：酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，酶结合物工作液，阳性对照为登革病毒抗体标准品，阴性对照为登革病毒抗体阴性血清，所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG。

9.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体检测板的制备过程包括如下步骤：

一、以权利要求4-6中任意一项所述的制备方法制备重组抗原蛋白；

二、将纯化后的重组抗原蛋白固定于酶联板，该过程包括将步骤一中纯化得到的重组抗原蛋白分别以梯级浓度包被酶联板，每孔50-200ul，4℃包被过夜，而后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤1-2分钟；将其拍干后，用5％牛血清白蛋白溶液于37℃封闭1-3小时，晾干后即得到所述抗体检测板；所述重组抗体为如权利要求1-4中任意一项中所述的重组抗原蛋白。

10.如权利要求1-3中任意一项所述的重组抗原蛋白在制备诊断登革病毒试剂盒中的运用。