CN109796531A - 猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其抗原表位和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由保藏号为CCTCC NO：C2017257的杂交瘤细胞株分泌的猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体。本发明还公开了包含该单克隆抗体的检测猪Delta冠状病毒的试剂盒。本发明还公开了猪Delta冠状病毒N蛋白抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。本发明的猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体，能特异性识别PDCoV的N蛋白，可用于快速、灵敏地检测诊断出猪Delta冠状病毒。

Description

猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其抗原表位和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其抗原表位和应用。

背景技术

猪Delta冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus,PDCoV)是一种能够引起仔猪腹泻的新型冠状病毒，PDCoV最早在2012年报道于中国香港，研究人员从仔猪的排泄物样品中首次检测出存在呈现PDCoV阳性的样品，并完成了对其中两份样品中PDCoV毒株的全长基因的测序(HKU15-44株和HKU15-155株)，证实该病毒属于一种新型的冠状病毒，但对该病毒的致病性尚不得知。2014年该病毒在美国发生仔猪腹泻的猪群粪便样品中被检测到，证实该病毒能够造成仔猪和成年猪出现水样腹泻，并可导致哺乳仔猪发病死亡，之后在美国其他20多个州也纷纷报道有该病流行。目前，加拿大、中国、韩国、老挝和泰国等国家也相继报道猪群中有PDCoV感染。PDCoV毒株是2015年在美国被率先报道成功分离获得，命名为OH-FD22株，我国是在2016年成功分离获得PDCoV毒株，分析发现该毒株与美国和韩国等报道的毒株亲缘关系较近。

近几年来，在我国猪群中仔猪腹泻疫情频发，且呈季节性流行，经研究证实，近年来能够引起仔猪腹泻的冠状病毒主要是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV) 和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)。二者均属于α-冠状病毒亚群(Alphacoronavirus)的成员。而新发现的PDCoV属于一种新型的冠状病毒，即δ-冠状病毒亚群(DeltaCoronavirus)，尽管在我国发生仔猪腹泻疫情的猪群中PDCoV的检出率没有 PEDV的检出率高，但是已经证实该病毒感染在我国猪群中已经流行，其感染所导致的临床症状与PEDV和TGEV感染非常相近，在临床上人们很难通过肉眼判断对其进行鉴别诊断，目前尚无可用于PDCoV治疗的有效药物或疫苗，也没有用于鉴别诊断PDCoV病毒感染的特异性抗体。

发明内容

本发明要解决目前没有鉴别诊断PDCoV病毒感染的特异性抗体的技术问题，提供一种猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体，该抗体能特异性识别PDCoV的核蛋白(N蛋白)，可用于快速、灵敏地检测诊断出猪Delta冠状病毒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种由保藏号为CCTCC NO：C2017257的杂交瘤细胞株分泌的猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体。

所述猪Delta冠状病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核酸序列如SEQID NO.1所示。

优选的，所述单克隆抗体针对猪Delta冠状病毒N蛋白的抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

在本发明的另一方面，还提供了一种分泌猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO：C2017257。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测猪Delta冠状病毒的试剂盒，其包含上述的单克隆抗体。

在本发明的另一方面，还提供了一种一种双特异性抗体，包含上述抗体或其抗原结合部分、和第二抗体或其抗原结合部分。

在本发明的另一方面，还提供了一种组合物，包含上述的单克隆抗体或其抗原结合部分、以及载体或稀释剂。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述单克隆抗体在制备诊断猪Delta冠状病毒的产品中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种猪Delta冠状病毒N蛋白抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

在本发明的另一方面，还提供了一种抗猪Delta冠状病毒N蛋白抗体，其特异性结合上述猪Delta冠状病毒N蛋白抗原表位，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

本发明的猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体，能特异性识别PDCoV的核蛋白(N蛋白)，为建立PDCoV的抗原诊断方法提供了重要工具，也为临床上快速准确地鉴别诊断出猪Delta 冠状病毒提供了保障。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的PDCoV N蛋白及其N1、N2分段蛋白的表达与鉴定结果图；

图2是本发明实施例1针对PDCoV N蛋白单克隆抗体筛选的ELISA检测结果图；

图3是本发明实施例1的PDCoV N蛋白单克隆抗体的IFA检测结果图；

图4是本发明实施例2的PDCoV N1基因分段截短后各片段蛋白的表达图；

图5是本发明实施例2单克隆抗体抗原表位ELISA鉴定结果图；

图6是本发明实施例2单抗DN-7的抗原表位DN-EP7在不同PDCoV毒株间氨基酸序列比较分析图。

本发明的抗猪Delta冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株DN-7，已于2017年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心)，保藏号为CCTCC NO：C2017257。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

猪Delta冠状病毒N蛋白是位于PDCoV 3’末端的N基因编码病毒的核蛋白，在病毒粒子中含量丰富，该N蛋白基因在不同PDCoV毒株中其编码的氨基酸序列相对保守，且抗原性较强，在感染猪体内可诱导较高的抗体水平，因此针对该基因建立相应的检测方法有利于对该病毒感染的鉴别诊断。

本发明利用RT-PCR的方法扩增获得PDCoV N基因，并构建其原核表达重组质粒pCold I-N，经诱导获得融合表达的N蛋白，并利用纯化后的PDCoV N蛋白为抗原，免疫Balb/c小鼠，利用杂交瘤细胞融合技术，成功筛选获得到了1株能稳定分泌抗PDCoV N蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，并利用重叠蛋白表达和ELISA检测等鉴定出该单抗所针对的抗原表位，为建立PDCoV的抗原诊断方法提供了重要工具。

实施例1 猪Delta冠状病毒核蛋白(PDCoV N蛋白)抗体的制备

1.材料和方法

1.1材料

1.1.1毒株、细胞和实验动物

PDCoV毒株JS株、ST细胞、SP2/0细胞由均中国农业科学院上海兽医研究所保存；3-4 周龄雌性Balb/c小鼠购自上海斯莱克公司。

1.1.2主要试剂与抗体

DMEM购自Gbico，细胞培养用胎牛血清购自BI公司；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、 HT、HAT、PEG2000购自Sigama-Aldrich；反转录试剂盒、蛋白预染Marker、BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo Fisher；pCold I、pCold TF、E.coli BL21感受态细胞、LA Taq Premix、In-Fiusion HD Cloning Kit、T4 Ligase购自Takara公司；Ni-NTA购自Merck公司；His 标签抗体购自Abcam公司，ELISA包被反应板购自Costar公司，HRP标记山羊抗小鼠的IgG 购自ProteinTech公司；PBST、SDS蛋白上样缓冲液、TMB显色液购自碧云天生物有限公司。RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；His标签重组蛋白纯化磁珠购自Biotool公司。

1.2方法

1.2.1 PDCoV N基因的RT-PCR扩增

以从NCBI公开的PDCoV参考毒株序列(基因登录号：KP757892)为模板，分别设计扩增PDCoV毒株完整的N基因以及将N基因分成相互重叠的两段的N1和N2基因的引物 DN-U/DN-L、DN1-U/DN1-L和DN2-U/DN2-L(其中上游引入限制性酶切位点XhoI，下游引入限制性酶切位点EcoRI，引物序列见下表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。取300μLPDCoV毒株JS株的储存液，按照RNA提取试剂盒操作说明书提取病毒RNA，并按照反转录试剂盒操作说明书合成cDNA模板；然后，分别利用合成的引物DN-U/DN-L、 DN1-U/DN1-L和DN2-U/DN2-L，对PDCoV的N基因及其分段基因进行PCR扩增，使用LA Taq Premix建立50μL的PCR反应体系，包含：25μL LA Taq Premix，22μL ddH2O，上、下游引物各1μL，cDNA模板1μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min；然后98℃变性10s， 53℃退火30s，72℃延伸60s，共计30个循环；最有72℃延伸10min,4℃保存备用，获得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

1.2.2 N基因及N1、N2基因表达载体的构建及鉴定

将获得的PDCoV N基因、N1和N2基因PCR产物经胶回收试剂盒进行纯化，利用引入的限制性内切酶XhoI/EcoRI对回收纯化的N基因、N1和N2基因进行双酶切后，用T4连接酶于16℃过夜连接，将其克隆至经同样酶切处理pCold-I原核表达载体上，将连接产物转化于E.coli BL21感受态细胞，在37℃振荡培养45min后，菌液经8000rpm离心1分钟，用 200μLLB培养基重悬，涂布于含有50μg/mL氨苄抗性的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，然后挑取单菌落在含50μg/mL的氨苄抗性的LB培养基中进行培养，利用DN-U/DN-L、 DN1-U/DN1-L和DN2-U/DN2-L引物进行菌液PCR鉴定，获得的阳性克隆，提取质粒后送生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.2.3蛋白表达、纯化和鉴定

将上述测序鉴定正确的pColdI-N、pCold-N1和pCold-N2阳性菌种，在含有氨苄抗性的LB液体培养基中37℃震荡培养至OD600约为0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，在16℃条件下继续震荡培养诱导16h，将诱导后的菌液经8000rpm 4℃离心，弃上清，收获菌体，使用PBS重悬菌体。取40μL重悬菌体与10μL SDS蛋白上样缓冲液混合均匀，煮沸5min，利用10％的SDS-PAGE进行蛋白电泳，凝胶经考马斯亮蓝染色后和脱色后观察蛋白表达结果。

将上述获得表达的菌体利用超声波破碎仪进行菌体裂解，然后，将裂解后的菌体经4℃ 7500rpm 4℃离心10min，取上清。将表达产物的上清液在4℃条件下与预先装好的Ni-NTA 亲和层析柱结合3h，使用Wash Buffer清洗Ni-NTA亲和层析柱两次，再使用ElutionBuffer 将结合在Ni-NTA亲和层析柱上的蛋白洗脱下来，然后对各部分洗脱液进行SDS-PAGE电泳观察，并按照Pierce BCA Protein Assay Kit操作说明测定纯化后的蛋白浓度，分装保存于-80℃备用。

1.2.4小鼠免疫及杂交瘤细胞融合

取200μg纯化后的PDCoV N蛋白与弗氏完全佐剂按照1:1的比例混合，进行乳化，然后以50μg/只的剂量对3-4周龄的雌性Balb/c小鼠进行皮下多点注射；首免两周后，将纯化后的PDCoV N蛋白与弗氏不完全佐剂按照相同方式乳化，并以50μg/只的剂量进行二次免疫，间隔两周再进行三次免疫；三免后两周，使用不添加佐剂的纯化的N蛋白按照20μ g/只的剂量，通过尾静脉注射的方式对小鼠进行加强免疫。加强免疫三天后，取一只正常 Balb/c鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞铺于96孔细胞培养板，用含有10％FBS的DMEM培养液在37℃细胞培养箱中预先培养24h。然后在无菌条件下取免疫小鼠的脾脏，用DMEM冲洗小鼠的脾细胞，将其与预先培养好的SP2/0细胞分别进行细胞计数，再将脾细胞与SP2/0 细胞细胞以10:1的比例混合均匀，经800rpm室温条件下离心5min，尽弃上清。细胞沉淀放置于37℃水浴中，按照文献报道的方法在1min内边摇边滴加入1mL 37℃预热的PEG2000，并在37℃水浴中细胞融合8min,然后加入15ml预热的无血清DMEM，终止融合反应，经过 1000r/min离心去上清，将细胞沉淀用添加1％HAT和20％FBS的DMEM选择培养基进行重悬，以100μl/孔加入到已经在96孔细胞培养板中生长良好的饲养层细胞中。37℃CO₂培养箱中培养约一周左右，观察杂交瘤细胞的形成，并取培养上清液进行ELISA检测筛选。

1.2.5单克隆杂交瘤细胞株的ELISA筛选

分别将纯化后的N蛋白以及分段表达的N1、N2蛋白和pColdI空载体诱导产物利用包被缓冲液进行稀释，以100ng/孔的剂量加入到ELISA反应板，4℃包被过夜，PBST洗涤三遍，5min/次，经5％的脱脂乳37℃封闭3h，PBST洗涤3次，5min/次，取融合细胞中的培养基上清作为一抗，加入到ELISA反应板中对融合后的细胞上清液进行间接ELISA检测，37℃孵育1h，PBST洗涤三遍，5min/次，加入1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，37℃反应1h，PBST洗涤三遍，5min/次，每孔加入100μL TMB显色液，避光反应 15min，加入终止液，利用酶标仪测定OD450吸光值。

1.2.6单克隆杂交瘤细胞株的IFA鉴定

预先将生长良好的ST细胞接种于96孔细胞培养板中，待形成单层后，将稀释后的PDCoV JS毒株接种于ST细胞中，在37℃CO₂培养箱中继续培养，待细胞出现病变后，弃培养液，用PBS温和的洗涤两遍，在加入预冷的80％乙醇，4℃固定1h，弃去冷乙醇，用PBS温和的洗涤两遍后用于间接免疫荧光(IFA)检测，将上述经ELISA筛选为阳性的单克隆细胞株上清作为一抗，100μL/孔，在37℃孵育1h，PBS洗涤3遍，再加入1:800倍稀释的FITC标记的驴抗鼠IgG荧光二抗，37℃避光孵育1h，PBS洗涤3遍，将反应板置于倒置荧光显微镜下观察检测结果。

1.2.7单克隆杂交瘤细胞株克隆纯化及冻存

将经上述ELISA和IFA鉴定为阳性的杂交瘤细胞株，利用有限稀释法进行3次单克隆培养纯化，期间分别利用上述的ELISA和IFA方法对培养的杂交瘤细胞株分泌的上清进行检测，最终选择能够稳定分泌抗PDCoV抗体的单克隆细胞株进行冻存。为了鉴定杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性，复苏在液氮中过夜冻存的杂交瘤细胞株进行传代培养，并利用上述ELISA和IFA方法对培养的杂交瘤细胞株分泌的上清进行检测，以确定杂交瘤细胞株的稳定性。

2.结果

2.1 PDCoV N蛋白及其分段蛋白的表达与纯化

经过RT-PCR扩增获得大小约为1029bp的N基因片段(SEQ ID NO.2)以及大小为510bp 和531bp的N1和N2基因片段，分别将其克隆至pCold I原核表达载体上，经质粒PCR和基因测序鉴定正确的阳性菌株分别命名为：pCold I-N、pCold I-N1和pCold I-N2。将上述菌株利用IPTG分别进行低温诱导表达，同时设空载体pCold I诱导表达的蛋白为阴性对照，进行SDS-PAGE电泳观察，结果显示pCold I-N、pCold I-N1和pCold I-N2均成功获得表达，利用抗His标签抗体对其进行Western Blot检测，结果显示，与His标签重组表达的N蛋白、N1蛋白和N2蛋白均可被His标签抗体特异性识别，其中N蛋白约40kDa，N1 蛋白约20kDa，N1蛋白约23kDa，与预测大小相符(图1)。

2.2 PDCoV N蛋白抗体的制备

为了获得针对PDCoV N蛋白的特异性单抗，用纯化的PDCoV N蛋白免疫BALB/c小鼠。将SP20细胞与经免疫小鼠的脾细胞进行融合获得杂交瘤细胞。利用HAT和HT选择培养基对融合细胞进行选择培养，然后分别利用ELISA和IFA的方法，筛选针对PDCoV N蛋白的杂交瘤细胞系。结果利用间接ELISA的方法,筛选得到1株针对PDCoV N蛋白的特异性的阳性克隆，将该能够稳定分泌抗PDCoV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为DN-7，其分泌的单抗为DN-mAb7，该DN-mAb7可特异性识别分段表达的DN1蛋白(图2)。IFA检测结果显示，该单抗可特异性识别针对PDCoV JS株感染的ST细胞(图3)。

本发明分泌抗PDCoV N蛋白单克隆抗体的这株杂交瘤细胞株，即抗猪Delta冠状病毒N 蛋白杂交瘤细胞株DN-7，已于2017年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心)，保藏号为CCTCC NO：C2017257。

实施例2 单克隆抗体抗原表位的鉴定

1.方法

1.1 PDCoV N蛋白的分段扩增和克隆

根据上述试验结果，继续将PDCoV N蛋白分段后的N1基因分别再进行深入的截短和分段，其中N1片段分为3个相互重叠的小片段，各片段分别命名为N1-1、N1-2、N1-3。针对每个片段分别设计相应的同源重组引物(各片段的长度和引物序列见表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，为了便于克隆和鉴定在每条上游和下游引物分别引入了XhoI和EcoR I限制性酶切位点。然后分别利用针对各截短片段的引物对，以上述PDCoV的N 基因为模板，对各个分段基因进行PCR扩增，PCR反应体系均为50μL，包含：25μL LA TaqPremix，22μL ddH2O，上、下游引物各1μL，cDNA模板1μL。PCR扩增的反应程序为： 95℃预变性5min；然后98℃变性10s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共计30个循环；最有72℃延伸10min,4℃保存备用，获得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

表1 PDCoV N基因及其分段基因RT-PCR扩增引物序列及位置

将获得的PDCoV N基因截短后的各个分段基因PCR产物经胶回收试剂盒分别进行纯化，同时预先使用XhoI和EcoRI限制性内切酶将pColdTF载体进行双酶切，并利用胶回收试剂盒回收酶切后的pCold TF载体。然后利用In-Fusion HD Cloning Kit将各个基因片段与线性化的原核表达载体pCold TF进行同源重组，连接体系为10μL，主要包括：基因片段 6μL，载体2μL，同源重组酶2μL，将连接体系混匀后，置于50℃连接15min,在将连接产物转化于E.coli BL21感受态细胞，在37℃振荡培养45min后，菌液经8000rpm离心1 分钟，用200μLLB培养基重悬，涂布于含有氨苄抗性的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，然后挑取单菌落在含氨苄抗性的LB培养基中进行培养，利用针对各片段的引物对进行菌液 PCR鉴定，获得的阳性克隆，提取质粒后送生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.2 PDCoV N蛋白各基因片段的表达

将上述经PCR和测序鉴定正确的各基因片段阳性菌种，分别在含有氨苄抗性的LB液体培养基中37℃震荡培养至OD600约为0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，在16℃条件下继续震荡培养诱导16h，将诱导后的菌液经8000rpm 4℃离心，弃上清，收获菌体，用PBS重悬,利用超声波破碎仪进行菌体裂解，然后取40μL裂解后的菌体与10μL SDS 蛋白上样缓冲液混合均匀，煮沸5min，利在经10％的SDS-PAGE进行蛋白电泳，凝胶经考马斯亮蓝染色后和脱色后观察蛋白表达结果。

1.3单克隆抗体的表位鉴定

分别将表达纯化后的N蛋白以及各个分段表达的蛋白为检测抗原，同时以pColdI和 pCold TF空载体诱导产物作为对照，包被ELISA反应板，按照1.2.5描述的方法，对上述实施例1鉴定为阳性的单克隆抗体进行ELISA检测，以确定单抗针对N蛋白的抗原表位。

1.4单克隆抗体抗原表位的分析

为了确定鉴定的抗原表位的保守性和特异性，选取24株同位于delta冠状病毒亚群的其他PDCoV代表毒株(表2)，利用MegAlign Clustal W的方法(DNASTAR Lasergene)对鉴定的抗原表位氨基酸序列进行多重比对分析。

表2 PDCoV参考序列来源及相关信息

2.结果

2.1 PDCoV N系列分段基因的表达

将N1分成相互重叠的基因片段，克隆至pCold TF表达载体获得了pColdTF-N1-1、pColdTF-N1-2、pColdTF-N1-3阳性表达质粒，分别取上述3个阳性表达菌株进行低温诱导表达，同时设空载体诱导对照，表达产物经过10％的SDS-PAGE电泳观察，结果显示，N1-1、 N1-2、N1-3均获得表达(图4)。图4中，1.蛋白分子量Maeker,2.pCold I-N1诱导对照， 3.pColdTF-N1-1诱导产物，4.pCold TF-N1-2诱导产物，5.pCold TF-N1-3诱导产物， 6.pCold TF空载体诱导对照，7.pCold I空载体诱导对照。

2.2单抗抗原表位的鉴定

为了确定上述DN-7单抗所识别的抗原表位，将表达的N蛋白及系列截短的蛋白作为检测抗原，利用ELISA方法对单抗继续进行鉴定。结果显示，针对N1基因区域的DN-7单克隆抗体，仅能够特异性识别N1-1(1-65aa)，不识别N1-2(46-130aa),分析该结果确定单抗DN-7识别的抗原表位位于1-45aa区域(SEQ ID NO.15),将该表位命名为DN-EP7(图5)。

2.3抗原表位分析

为了分析表位DN-EP7在不同PDCoV流行毒株中的保守性，选择来自GenBank的24个代表性毒株和本单位用的JS株，利用DNASTAR对上述表位进行氨基酸序列比对分析，结果表明，在表位DN-EP7中，仅在少部分毒株中存在1-2个氨基酸的突变(即在DN-EP7中的V43变为A,25T变为S)。表明DN-EP7是PDCoV高度保守的抗原表位(图6)。而且这个抗原表位区域在PEDV和TGEV两个可引起仔猪腹泻的冠状病毒之间具有较好的特异性，故有利于对PDCoV 的鉴别诊断。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所

<120> 猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其抗原表位和应用

<141> 2017-11-15

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 342

<212> PRT

<213> 猪Delta冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus)

<400> 1

Met Ala Ala Pro Val Val Pro Thr Thr Asp Ala Ser Trp Phe Gln Val

1 5 10 15

Leu Lys Ala Gln Asn Lys Lys Ala Thr His Pro Gln Phe Arg Gly Asn

20 25 30

Gly Val Pro Leu Asn Ser Ala Ile Lys Pro Val Glu Asn His Gly Tyr

35 40 45

Trp Leu Arg Tyr Thr Arg Gln Lys Pro Gly Gly Thr Pro Ile Pro Pro

50 55 60

Ser Tyr Ala Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Arg Gly Asn Leu Lys

65 70 75 80

Tyr Gly Glu Leu Pro Pro Asn Asp Thr Pro Ala Thr Thr Arg Val Thr

85 90 95

Trp Val Lys Gly Ser Gly Ala Asp Thr Ser Ile Lys Pro His Val Ala

100 105 110

Lys Arg Asn Pro Asn Asn Pro Lys His Gln Leu Leu Pro Leu Arg Phe

115 120 125

Pro Thr Gly Asp Gly Pro Ala Gln Gly Phe Arg Val Asp Pro Phe Asn

130 135 140

Ala Arg Gly Arg Pro Gln Glu Arg Gly Ser Gly Pro Arg Ser Gln Ser

145 150 155 160

Val Asn Ser Arg Gly Thr Gly Asn Gln Pro Arg Lys Arg Asp Gln Ser

165 170 175

Ala Pro Ala Ala Val Arg Arg Lys Thr Gln His Gln Ala Pro Lys Arg

180 185 190

Thr Leu Pro Lys Gly Lys Thr Ile Ser Gln Val Phe Gly Asn Arg Ser

195 200 205

Arg Thr Gly Ala Asn Val Gly Ser Ala Asp Thr Glu Lys Thr Gly Met

210 215 220

Ala Asp Pro Arg Ile Met Ala Leu Ala Arg His Val Pro Gly Val Gln

225 230 235 240

Glu Met Leu Phe Ala Gly His Leu Glu Ser Asn Phe Gln Ala Gly Ala

245 250 255

Ile Thr Leu Thr Phe Ser Tyr Ser Ile Thr Val Lys Glu Gly Ser Pro

260 265 270

Asp Tyr Glu Arg Leu Lys Asp Ala Leu Asn Thr Val Val Asn Gln Thr

275 280 285

Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Pro Thr Lys Asp Lys Lys Pro Asp Lys Gln

290 295 300

Asp Gln Ser Ala Lys Pro Lys Gln Gln Lys Lys Pro Lys Lys Val Thr

305 310 315 320

Leu Pro Ala Asp Lys Gln Asp Trp Glu Trp Asp Asp Ala Phe Glu Ile

325 330 335

Lys Gln Glu Ser Ala Ala

340

<210> 2

<211> 1029

<212> DNA

<213> 猪Delta冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus)

<400> 2

atggccgcac cagtagtccc tactactgac gcgtcttggt ttcaggtgct caaagctcaa 60

aacaaaaagg ctactcatcc tcagtttcgt ggcaatggag ttccgcttaa ctccgccatc 120

aaacccgttg aaaaccatgg ctactggctg cgttacacca gacaaaagcc aggtggcact 180

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ttctcttact caatcacagt caaggagggt tctcctgact atgagagact taaggatgcg 840

ctcaatacgg tcgttaacca gacctatgag ccacccacca aaccaactaa ggacaagaag 900

cctgacaaac aagaccagtc tgctaaaccc aaacagcaga agaaacctaa aaaggtaact 960

ctgccagcag acaaacagga ttgggagtgg gatgatgctt ttgagataaa gcaggaatca 1020

gcagcgtag 1029

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ctcgagatgg ccgcaccagt agtccc 26

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tctagattac tacgctgctg attcctgctt ta 32

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

ctcgagatgg ccgcaccagt agtccc 26

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

tctagattag ggctgattgc ctgtgcctct 30

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

ggtaccatga caggcaatca gcccaggaaa cgcga 35

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

tctagattac tacgctgctg attcctgctt ta 32

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

ctcggtaccc tcgagatggc cgcaccagt 29

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

gacaagcttg aattcggatg gaggaatc 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

ctcggtaccc tcgagcatgg ctactggc 28

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

gacaagcttg aattcggttg ggaatcgga 29

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

ctcggtaccc tcgaggttgc caaacgca 28

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

gacaagcttg aattcgggct gattgcc 27

<210> 15

<211> 45

<212> PRT

<213> 猪Delta冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus)

<400> 15

Met Ala Ala Pro Val Val Pro Thr Thr Asp Ala Ser Trp Phe Gln Val

1 5 10 15

Leu Lys Ala Gln Asn Lys Lys Ala Thr His Pro Gln Phe Arg Gly Asn

20 25 30

Gly Val Pro Leu Asn Ser Ala Ile Lys Pro Val Glu Asn

35 40 45

Claims (10)

1.一种由保藏号为CCTCC NO：C2017257的杂交瘤细胞株分泌的猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体。

2.一种分泌猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2017257。

3.一种检测猪Delta冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述猪Delta冠状病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体针对猪Delta冠状病毒N蛋白的抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

6.一种双特异性抗体，包含权利要求1所述抗体或其抗原结合部分、和第二抗体或其抗原结合部分。

7.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分、以及载体或稀释剂。

8.权利要求1所述单克隆抗体在制备诊断猪Delta冠状病毒的产品中的应用。

9.一种猪Delta冠状病毒N蛋白抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

10.一种抗猪Delta冠状病毒N蛋白抗体，其特异性结合权利要求9所述的猪Delta冠状病毒N蛋白抗原表位，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。