CN105753980B - 一种hpv18 e6单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种hpv18 e6单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HPV18 E6单克隆抗体及其制备方法和应用，本发明利用生物信息学人工选择优势抗原表位肽，该多肽与BSA偶联后免疫原性良好，用该多肽制备的抗体效价高达106，本发明还对HPV18E6蛋白进行了原核表达，Westernbolt结果表明本发明制备的HPV18E6多肽抗体可与HPV18 E6蛋白特异性结合，可用于Westernbolt检测，应用价值较高。本发明成功预测了HPV18 E6的多肽抗原表位，获得了理想的多肽片段，同时制备了相应的单克隆抗体，该抗体可以特异性识别HPV18E6抗原，为研究该蛋白的研究以及HPV18检测方法的建立奠定了基础，促进了HPV18相关疾病的诊断和治疗。

Description

一种HPV18 E6单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及单克隆抗体制备领域，尤其涉及一种HPV18 E6单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
HPV是引起宫颈癌及其癌前病变的主要因素，是唯一可以完全确认的致癌病毒。目前研究已经证实，几乎所有宫颈癌患者的宫颈组织内都可检测到高危型的HPV，在我国妇女宫颈癌组织中HPV感染率大于95％。其中高危型HPV 18是常见高致病性HPV之一。E6蛋白是人乳头瘤病毒编码的主要早期蛋白之一，在子宫颈恶性病变的发生和发展中起重要作用。研究表明宫颈癌组织以及血液中都存在HPV抗原、抗体，肿瘤的发生与HPV E6表达增加有关，Garcia、Rubenstein等对HPV16 E6抗体进行检测，HPV 16E6有助于评估宫颈癌的发生的危险性，认为HPV病毒E6检测可作为宫颈癌诊断、疗效观察和预后的标志物。然而目前对于HPV18 E6抗原抗体的检测研究还较少，因此表达HPV18E6抗原、制备特异性针对HPV18E6抗体对于具重大意义。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题，设计HPV18 E6特异性优势抗原表位肽，提供一种制备高特异性HPV18 E6单克隆抗体的方法及其相关应用。
本发明第一个方面提供了一种HPV18 E6单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，
步骤一，合成序列如SEQ NO.1的HPV18 E6特异性多肽，并与蛋白载体偶联获得蛋白载体偶联的HPV18 E6特异性多肽；
步骤二，免疫，采用的抗原为所述步骤一中得到的蛋白载体偶联的HPV18 E6特异性多肽；
步骤三，细胞融合，得到杂交瘤细胞；
步骤四，对所述步骤三得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，得到特异性HPV18E6单克隆抗体杂交瘤细胞；
步骤五，利用步骤四所得的特异性HPV18 E6单克隆抗体杂交瘤细胞制得HPV18 E6单克隆抗体。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，上述步骤一中蛋白载体为BSA或KLH，HPV18 E6特异性多肽与蛋白载体欧联后获得BSA-HPV18 E6或KLH-HPV18 E6。
优选地，上述步骤二中免疫使用8周龄BALB/C小鼠，免疫过程为：首次免疫使用BSA-HPV18E6，注射剂量为0.05mg/只，加完全福氏完全佐剂；然后每2周加强免疫1次，注射剂量0.05mg/只，加福氏不完全佐剂；如此加强免疫3次，再间隔2周后使用0.05mg BSA-HPV18 E6水剂作冲击免疫。
优选地，上述步骤四中阳性克隆的筛选为以KLH-HPV 18 E6为抗原包被的酶标板，间接ELISA法筛选阳性克隆。
本发明第二个方面提供一种根据上述的制备方法制备得到的HPV18 E6单克隆抗体。
优选地，上述HPV18 E6单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ NO.4所示；所述HPV18E6单克隆抗体的重链CDR2序列如SEQ NO.5所示；所述HPV18 E6单克隆抗体的重链CDR3序列如SEQ NO.6所示；所述HPV18 E6单克隆抗体的轻链CDR1序列如SEQ NO.7所示；所述HPV18E6单克隆抗体的轻链CDR2序列如SEQ NO.8所示；所述HPV18 E6单克隆抗体的轻链CDR3序列如SEQ NO.9所示。
优选地，上述HPV18 E6单克隆抗体的重链序列如SEQ NO.2所示；所述HPV18 E6单克隆抗体的轻链序列如SEQ NO.3所示。
第三个方面，本发明还提供上述的HPV18 E6单克隆抗体在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
最后一方面，本发明还提供一种检测HPV18 E6的试剂盒，包括上述的HPV18 E6单克隆抗体。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
申请人将HPV各型进行同源性比较分析发现，HPV E6高危型和低危型的 同源性分别为50.55％和56.59％，共同比较的同源性为51.96％，连续氨基酸的同源性很低，正是在此基础上，申请人利用生物信息学人工选择优势抗原表位肽，结果证明该多肽与BSA偶联后免疫原性良好，用该多肽制备的抗体效价高达106。但是除抗体的效价外，抗体与抗原的结合能力及其特异性是检测抗体好坏的另一标准，部分肽段形成的抗原决定簇在变性条件下会受到破坏，使抗这些肽段的抗体将不能用于Westernbolt实验，在制备抗人工合成多肽的抗体后有必要对其进行鉴定。因此申请人还对HPV18E6蛋白进行了原核表达，Westernbolt结果表明本发明制备的HPV18 E6多肽抗体可与HPV18 E6蛋白特异性结合，该抗体可用于Westernbolt检测，应用价值较高。本发明成功预测了HPV18 E6的多肽抗原表位，获得了理想的多肽片段，同时，制备了相应的单克隆抗体，该抗体可以特异性识别HPV18E6抗原，为研究该蛋白的研究以及HPV18检测方法的建立奠定了基础，促进了HPV18相关疾病的诊断和治疗。
附图说明
图1为抗HPV18E6多肽抗体纯化效果SDS-PAGE鉴定图；
图2为HPV18E6基因扩增琼脂糖凝胶电泳分析图；
图3重组菌SDS-PAGE分析图；
图4为Western Blot鉴定重组蛋白及抗体结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种HPV18 E6单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，
步骤一，合成序列如SEQ NO.1的HPV18 E6特异性多肽，并与蛋白载体偶联获得蛋白载体偶联的HPV18 E6特异性多肽；
步骤二，免疫，采用的抗原为所述步骤一中得到的蛋白载体偶联的HPV18 E6特异性多肽；
步骤三，细胞融合，得到杂交瘤细胞；
步骤四，对所述步骤三得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，得到特异性HPV18E6单克隆抗体杂交瘤细胞；
步骤五，利用步骤四所得的特异性HPV18 E6单克隆抗体杂交瘤细胞制得 HPV18E6单克隆抗体。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一 HPV18 E6单克隆抗体的制备和相关鉴定
1、材料与方法
1.1材料
HPV18感染病人分泌物标本取自上海市普陀区中心医院门诊病人，并经PCR方法确认；pMD18-T克隆载体、pET28a(+)表达载体、大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21(DE3)、sp2/0细胞株由本实验室保存；病毒DNA提取试剂盒、DNA Fragment纯化试剂盒、切胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性内切酶Nde I及EcoR I、Taq酶、T4连接酶均购自天根生物科技有限公司；HT、HAT购自Gibco公司；His-Tag小鼠单抗、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体购自Abmart公司；ProtienA抗体纯化柱购自GE公司；多肽合成及偶联服务由吉尔生化(上海)公司提供，其他试剂均为国产分析纯。
1.2HPV18 E6多肽抗原表位设计与合成
从NCBI获取HPV18 E6蛋白序列，采用ABCpred和Bcepred在线分析软件综合预测HPV18E6蛋白可能的特异性多肽序列(SEQ NO.1)：Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg ArgPro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys，委托吉尔生化(上海)公司进行多肽合成，并与BSA、KLH偶联为BSA-HPV18 E6、KLH-HPV18 E6。
1.3单克隆抗体制备
用BSA-HPV 18 E6免疫8周龄BALB/C小鼠。免疫方式为：首次免疫以皮下注射BSA-HPV18E6(注射剂量0.05mg/只，加完全福氏完全佐剂)，其后每2周加强免疫1次(注射剂量0.05mg/只，加福氏不完全佐剂)，如此加强免疫3次，再间隔2周后皮下注射0.05mg BSA-HPV18 E6水剂作冲击免疫，3d后,取小鼠脾细胞与SP 2/0细胞融合。10d后，以KLH-HPV 18 E6为抗原包被的酶标板，间接ELISA法筛选阳性克隆。
1.4小鼠腹水的制备及单克隆抗体的纯化
以0.5mL/只的剂量腹腔注射石蜡油，2周后腹腔注射杂交瘤细胞(1×106 个细胞/只)，接种细胞7-10d后，抽取腹水，12 000×g离心收集上清液，用ProteinA亲和层析柱纯化抗体，SDS-PAGE电泳检测纯化后抗体的纯度。制备得到的抗体各个部分序列如SEQ NO.4～SEQ NO.9所示。
1.5HPV18 E6引物设计
根据Genbank发布的HPV18 E6参考序列，使用Primer 5软件设计一对特异性引物。上游引物(SEQ NO.10)：5’-GAGCG TCAT/ATGGCGCGCTTTGAGGATCCAAC-3’(划线部分为Nde I酶切位点)；下游引物(SEQ NO.11)：5’-CTCGAA/TTCCTATTATACTTGTGTTTCTCTG-3’(划线部分为EcoRI酶切位点)，引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1.6HPV18 E6基因扩增
按照天根生物科技有限公司病毒基因组提取试剂盒说明书提取HPV18阳性分泌物病毒DNA，并以此为模板进行PCR获得HPV 18 E6基因片段。反应体系如下：10×PCR buffer2μl，MgCL2(25mmol/L)1.5ul，dNTP 0.4μl，上下游引物各0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.2μl，去离子水13.9μl；反应条件：94℃预变性5min，94℃，45s→56℃，45s→72℃，45s，30个循环，72℃延伸7min。
1.7HPV18E6表达载体构建及诱导表达
PCR产物用琼脂糖凝胶(10g/L)电泳进行鉴定。回收PCR产物，连接至载体pMD18-T中，转化至感受态大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，测序正确后将质粒pMD18-T/18 E6、pET28a(+)载体用Nde I、EcoR I双酶切，16℃连接过夜，并将重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)。0.1g/L卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，用终浓度为1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。
1.8SDS-PAGE及Weastern-blot检测
将诱导后BL21/pET28a/HPV18 E6菌体进行SDS-PAGE电泳，用湿转印法将蛋白质转印至硝酸纤维膜上，50g/L脱脂奶粉封闭1h，加分别入1：2 000稀释的小鼠抗His-Tag单克隆抗体以及抗HPV18 E6多肽单克隆抗体，4℃湿盒孵育过夜，用TBST(含有0.5％吐温-20的TBS)洗膜3次，每次5min，然后加入1∶2 000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育1h，洗膜3次，ECL 显色。
2、结果
2.1单克隆抗体制备及鉴定
以BSA-HPV18 E6为抗原免疫小鼠血清抗体效价达1*104以上(如表1)，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，经筛选共获得三株阳性细胞株，选择1株抗体效价最高的细胞制备腹水，ELISA方法测定腹水效价可达1*106(如表2)。用ProteinA亲和层析柱对腹水抗体进行纯化，纯化后抗体通过SDS-PAGE鉴定，在55kDa、25kDa处有两条条带，分别为抗体重链、轻链，且纯化后抗体无其他杂带，抗体纯化效果较好，如图1所示(注：M.Marker 1.未纯化小鼠腹水 2.ProteinA亲和层析柱纯化后抗体)。
表1免疫小鼠效价测定表
表2小鼠腹水效价测定表
2.2HPV18 E6基因扩增及测序
以HPV18阳性患者分泌物病毒DNA为模板，PCR扩增获得477bp的基因片段，片段大小与预期结果相符，如图2所示(注：M.Marker；1.HPV18阳性分泌物)。将PCR产物与PMD18T载体连接后交由公司测序，测序结果证明该序列与GeneBank公布的HPV18 E6的DNA序列一致。
2.3表达产物鉴定
BL21/pET28a/HPV18 E6菌体经终浓度为1mM的IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析，可见在相对分子量19kDa处出现明显区别于阴性对照组的蛋白条带，如图3所示(注：M.Marker；1.pET28a/BL21；2.pET28a-HPV18E6-BL21转化菌)，分子量大小与预测的目的蛋白分子量相同。经Western Blot证实，该蛋白是带有His标签的重组融合蛋白，如图4中A所示(注：一抗为抗His标签的小鼠单抗；M.Marker；1.pET28a/BL21；2.BL21/pET8a/HPV18E6)。
2.4单克隆抗体鉴定将诱导后的BL21/pET28a、BL21/pET28a/HPV18 E6菌体进行SDS-PAGE电泳，以自制抗HPV18 E6抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体为二抗进行Western Blot分析，发现抗HPV18 E6多肽抗体可特异性与18E6抗原结合，如图4中B所示(注：一抗为抗HPV18E6多肽抗体；M.Marker；1.pET28a/BL21；2.BL21/pET8a/HPV18 E6)。
通过上述实施例可知，申请人利用生物信息学人工选择优势抗原表位肽，结果证明该多肽与BSA偶联后免疫原性良好，用该多肽制备的抗体效价高达106。申请人还对HPV18E6蛋白进行了原核表达，Westernbolt结果表明本发明制备的HPV18 E6多肽抗体可与HPV18 E6蛋白特异性结合，该抗体可用于Westernbolt检测，应用价值较高。本发明成功预测了HPV18 E6的多肽抗原表位，获得了理想的多肽片段，同时，制备了相应的单克隆抗体，该抗体可以特异性识别HPV18E6抗原，为研究该蛋白的研究以及HPV18检测方法的建立奠定了基础，促进了HPV18相关疾病的诊断和治疗。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (4)

1.一种HPV18E6单克隆抗体，其特征在于，所述HPV18E6单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO: 4所示；所述HPV18E6单克隆抗体的重链CDR2序列如SEQ ID NO: 5所示；所述HPV18E6单克隆抗体的重链CDR3序列如SEQ ID NO: 6所示；所述HPV18E6单克隆抗体的轻链CDR1序列如SEQ ID NO: 7所示；所述HPV18E6单克隆抗体的轻链CDR2序列如SEQ ID NO: 8所示；所述HPV18E6单克隆抗体的轻链CDR3序列如SEQ ID NO: 9所示。
2.根据权利要求1所述的HPV18E6单克隆抗体，其特征在于，所述HPV18E6单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO: 2所示；所述HPV18E6单克隆抗体的轻链序列如SEQ ID NO: 3所示。
3.如权利要求1-2任意一项所述的HPV18E6单克隆抗体在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
4.一种检测HPV18E6的试剂盒，其特征在于包括如权利要求1-2任意一项所述的HPV18E6单克隆抗体。
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