CN110964104B - 可结合hpv18病毒的蛋白质及其应用 - Google Patents

可结合hpv18病毒的蛋白质及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可结合HVP18的蛋白质，包括VH区和VL区，其中，所述VH区包括三个CDR区，序列为SEQ ID NO:5或11、SEQ ID NO:6或12以及SEQ ID NO:7或13；所述VL区包括三个CDR区，序列为SEQ ID NO:8或14、SEQ ID NO:9或15以及SEQ ID NO:10或16。本发明获得了表达抗HPV18 VLP且可中和HPV18病毒的抗体的杂交瘤细胞株，并克隆了抗HPV18 VLP抗体的可变区核苷酸序列。本发明的抗HPV18 VLP抗体可与HPV18 VLP颗粒特异性结合，且可中和HPV18假病毒颗粒，因此可以应用于HVP18型感染病人的检测和治疗。

Description

可结合HPV18病毒的蛋白质及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可特异性中和HPV18病毒的单克隆抗体及其应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是世界范围内一组极为常见的病毒。是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的宿主特异性，只有人类会被HPV感染。两种类型的人乳头瘤病毒(16型和18型)引起70％的宫颈癌和宫颈癌前病变。几乎所有宫颈癌病例都是由人乳头瘤病毒感染导致。全球每年宫颈癌的新发病例为52.8万。在中国大陆已上市两种HPV疫苗(二价和四价)，均可用于预防高危型HPV，但目前接种率仍较低，部分个体即使接种疫苗仍无抗病毒抗体产生，且疫苗不能治疗人乳头瘤病毒感染或宫颈癌等与人乳头瘤病毒有关的疾病。
目前，临床上尚无直接针对HPV的特异性治疗药物，主要通过物理治疗及干扰素等辅助治疗，难以彻底清除体内病毒，易于复发。因此，需要研发出专门针对HPV病毒的抗体，作为宫颈癌等于HPV有关的疾病的治疗药物。
发明内容
本发明通过用抗原免疫Balb/c小鼠，获取单克隆抗体，用于治疗HPV18感染。基于这些研究，本发明提供了一种可结合HVP18的蛋白质，包括VH区和VL区，其中，所述VH区包括三个CDR区，序列分别为SEQ ID NO:5或11、SEQ ID NO:6或12以及SEQ ID NO:7或13；所述VL区包括三个CDR区，序列分别为SEQ ID NO:8或14、SEQ ID NO:9或15以及SEQ ID NO:10或16。
在一个具体实施方案中，所述VH区序列如SEQ ID NO:1或3所示，所述VL区序列如SEQ ID NO:2或4所示。
需要说明的是尽管本发明提供了FR序列来与CDR序列连接，获得SEQ ID NO:1或3所示的VH序列和SEQ ID N0:2和4所示的VL序列，但是，抗体与抗原的结合本质上取决于CDR序列，本领域技术人员在阅读了本发明的后可容易地根据上述CDR序列在组装成各种VH和VL，只需要改动FR序列或使用不同来源的FR序列即可，这些改变均为本领域技术人员根据本发明的内容在本领域公知技术上做出的改变，应落在本发明的保护范围内。
在一个具体实施方案中，所述蛋白质为免疫球蛋白。
在一个具体实施方案中，所述VH区和VL区分别位于不同多肽链上。
在一个具体实施方案中，所述蛋白质为单链抗体，所述VH区和VL区位于同一条多肽链上。
本发明还提供了上述蛋白质在制备HPV18检测剂中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质在制备HPV18感染治疗药物中的应用。
本发明还提供了一种核编码上述蛋白质酸。
本发明还提供了上述核酸在制备基因治疗药物中的应用。例如，可通过将上述核酸序列搭载在AAV系统中，用于基因治疗。
本发明针对高危病毒HPV18进行中和抗体药物开发，通过制备HPV18 VLP、免疫Balb/c小鼠、利用电融合技术平台等，筛选到特异性结合HPV18 VLP的单克隆抗体鉴定了其CDR序列。本发明为HPV18病毒感染的临床治疗提供潜在的抗体新药。
附图说明
图1为3免后小鼠抗血清效价检测曲线；
图2为融合后杂交瘤克隆上清以HPV18VLP进行ELISA初筛的结果汇总图；
图3为单克隆抗体2A12和8H4的分型统计图；
图4为单克隆抗体2A12和8H4与9个HPV亚型VLP蛋白ELISA反应性的统计图；
图5为单克隆抗体2A12和8H4与9个HPV亚型VLP颗粒结合的荧光显微照片；
图6为单克隆抗体2A12和8H4与9个HPV亚型VLP颗粒结合的流式分析统计图；
图7为不同浓度的单克隆抗体2A12和8H4对HPV18假病毒中和活性的统计图；
图8为单克隆抗体2A12和8H4对HPV18假病毒中和活性检测的浓度-抑制率曲线。
具体实施方式
1.免疫原的制备
我们应用HPV18 VLP包装载体,转染293TT细胞后，裂解细胞，成熟、包装并纯化得到HPV18 VLP。
2.小鼠免疫与抗血清的获得
用50μg HPV18 VLP蛋白与50μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对6-8周龄Balb/c小鼠进行初免，在第21天、42天用25μg HPV18 VLP蛋白与50μl弗氏不完全佐剂加强免疫2次，第2次加强免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第2次加强免疫3周后进行冲击免疫，腹腔注射50μg HPV18 VLP，3天后，取小鼠脾脏进行杂交瘤电融合。
抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.2μg/ml的HPV18 VLP蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前小鼠血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-mouse IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
结果如图1所示，3免后5只小鼠血清效价均≥1.09X106,可见该抗原可诱导小鼠产生特异性针对HPV18 VLP蛋白的高滴度抗血清，其中M1号小鼠效价最高，为9.84X106。。
3.杂交瘤的制备
取效价最高的M1号小鼠，经腹腔注射50μg HPV18 VLP进行冲击免疫，3天后，取小鼠脾脏细胞进行杂交瘤电融合。在无菌环境下，取小鼠脾脏，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，制成脾细胞悬液后与SP2/O细胞按照2：1比例混合，以电融合缓冲液洗涤后重悬于电融合缓冲液中。电融合完毕，静置5分钟后轻缓收集细胞于DMEM完全培养基中静置于37℃。10min后离心，500rpm室温离心5分钟，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)轻轻重悬细胞，将细胞铺于96孔板中，每孔200μL。
4.筛选分泌抗HPV18 VLP单克隆抗体的杂交瘤细胞
融合后第7天，用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞。选择OD较高的阳性克隆进行特异性检测及亚克隆化，并用梯度稀释法及有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率，最后获得两株稳定分泌抗HPV18 VLP的单克隆抗体细胞株，命名为2A12及8H4(图2)。将克隆化好的细胞扩增培养后冻存于液氮。
5.单克隆抗体的制备和纯化
将2A12及8H4细胞株以1×106/只的量注入弗氏不完全佐剂预处理的雌性小鼠腹腔，7天左右待小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用Protein G亲和纯化方法纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。以BCA法测定纯化抗体的浓度。
6.本发明特异性抗体的特征分析
1)免疫球蛋白亚型鉴定
采用洛阳佰奥通实验材料中心的小鼠单克隆抗体亚型鉴定检测试剂盒，鉴定细胞株2A12、8H4分泌抗体亚型，结果如图3所示，为2A12为IgG1,8H4为IgG2b。
2)序列测定
对抗体进行测序，结果如下，2A12的重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示；8H4的重链可变区序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:4所示。进一步的研究分析显示，两株抗体的CDR区序列如表1所示。表1单克隆抗体2A12和8H4的CDR序列
Figure BDA0002336536240000041
Figure BDA0002336536240000051
3)间接Elisa鉴定单克隆抗体的特异性
通过包被不同亚型的HPV VLP蛋白，鉴定2A12及8H4与HPV18 VLP反应的特异性。以碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释HPV VLPs，0.25μg/ml，100μl/孔进行包被。37℃包被1小时后以PBST洗涤两遍后进行封闭，封闭液为4％脱脂奶粉，250μl/孔，37℃孵育1小时后以PBST洗涤两遍进行上样，37℃孵育1.5小时。PBST洗涤两遍后加入二抗：山羊抗鼠HRP抗体，37℃孵育50分钟。PBST洗涤4遍后加入TMB显色，每孔100μl，室温显色10分钟后，每孔加入70μl 1MHCL进行终止，于450nm波长处进行读数。
结果如图4所示，2A12及8H4在ELISA水平均特异地仅与HPV18 VLP反应。
4)免疫荧光试验鉴定单克隆抗体的反应特性及反应特异性
将表达各亚型VLP的载体转染293TT细胞48小时后，以4％多聚甲醛固定细胞，室温30分钟后以0.5％曲拉通X-100进行穿透，室温20分钟。10％FBS in PBS进行封闭，37℃1小时。以杂交瘤上清作为一抗，同时作无关抗体对照V3-20A5，37摄氏度孵育2小时。二抗为Alexa Fluor 488goat anti mouse IgG(H+L),4℃孵育45分钟。洗涤干净后于荧光显微镜下进行观察，结果如图5所示。2A12与8H4均可特异地与细胞核内HPV18 VLP反应。
5)细胞流式试验鉴定单克隆抗体的反应特性及反应特异性
流式染色操作同4)所述，染色完毕收集细胞于流式细胞仪进行检测。结果如图6所示。2A12与8H4均可特异地与细胞核内HPV18 VLP反应。
6)单克隆抗体的体外中和反应特性及特异性检测
以HPV假病毒进行体外中和试验。将抗体腹水纯化抗体稀释为不同浓度，与各亚型HPV假病毒共同孵育，37℃一小时后，加入预先铺好的2*104 293TT细胞中，至于5％C0237℃培养箱中培养48小时。去除上清，加入细胞裂解液后转移至化学发光板中，加入化学发光底物液进行读数，读取RLU读值。计算中和抑制率，抑制率＝[1-(样品组的RLU-细胞对照组CC的RLU均值)/(无抗体对照处理组的RLU-细胞对照组CC的RLU均值)]×100％。
结果如图7所示，2A12及8H4对于HPV18假病毒具有很好的中和活性，能够特异地中和HPV18假病毒，与HPV6、HPV16、HPV31、HPV45、HPV52、HPV58假病毒均无中和反应活性。
7)单克隆抗体HPV18假病毒中和反应IC50的测定
将杂交瘤单克隆上清以双抗夹心ELISA测定浓度后，进行HPV18假病毒的中和反应实验。操作同6)所述，计算得出每个浓度下的中和抑制率后，将抑制率数值对抗体浓度进行曲线拟合，计算IC50，IC50表示抑制率为50％时抗体的浓度。
结果如图8所示，2A12的IC50为0.43ng/ml,8H4的IC50为0.86ng/ml。两个单克隆抗体均具有优异的中和反应活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 源道隆（苏州）医学科技有限公司
<120> 可结合HPV18病毒的蛋白质及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Gln Ser Tyr Asp Trp Pro Ile Thr
1 5

Claims (7)

1.一种可结合HVP18的免疫球蛋白，其特征在于，包括VH区和VL区，其中，
所述VH区包括三个CDR区，所述VL区包括三个CDR区；
所述免疫球蛋白的VH的三个CDR序列分别为SEQ ID NO:5、6和7，并且所述免疫球蛋白的VL的三个CDR序列分别为SEQ ID NO:8、9和10；或者
所述免疫球蛋白的VH的三个CDR序列分别为SEQ ID NO:11、12和13，并且所述免疫球蛋白的VL的三个CDR序列分别为SEQ ID NO:14、15和16。
2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白的VH序列如SEQ IDNO:1所示，VL序列如SEQ ID NO:2所示；或者所述免疫球蛋白的VH序列如SEQ ID NO:3所示，VL序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述VH区和VL区分别位于不同多肽链上。
4.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白为单链抗体，所述VH区和VL区位于同一条多肽链上。
5.权利要求1-4中任一项所述的免疫球蛋白在制备HPV18检测剂中的应用。
6.权利要求1-4中任一项所述的免疫球蛋白在制备HPV18感染治疗药物中的应用。
7.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-4中任一项所述的免疫球蛋白。
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