CN112125972B

CN112125972B - 抗hpv16 l1蛋白单克隆抗体及应用该抗体的检测方法

Info

Publication number: CN112125972B
Application number: CN201910556535.XA
Authority: CN
Inventors: 罗春霞; 孙春昀; 庞琳; 孙玲玲; 胡萍
Original assignee: Sinocelltech Ltd
Current assignee: Sinocelltech Ltd
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2019-06-25
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2039-06-25
Also published as: CN112125972A

Abstract

本发明提供了一种抗人乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白的单克隆抗体、抗原结合片段及应用该抗体的检测方法，该抗体与HPV16 L1抗原结合力强，并与HPV6、11、18、31、33、35、39、45、52、56、58和59型无交叉反应，且能够特异性中和HPV16假病毒，具有中和活性。本发明筛选得到的单克隆抗体对不同表达系统来源的病毒样颗粒抗原都表现出良好的反应一致性和中和活性，识别的表位在免疫豚鼠血清和免疫人血清中均是优势表位，适合作为ELISA定量中的检测抗体进行HPV疫苗的免疫原性评价。

Description

抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体及应用该抗体的检测方法

技术领域：

本发明属于分子病毒学和免疫学领域，具体来说，本发明涉及可特异性结合人乳头瘤病毒(HPV16)L1蛋白单克隆抗体及其抗原结合片段、编码它们的序列，以及应用它们对HPV疫苗的免疫原性进行评价。

背景技术：

人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种嗜上皮性病毒,具有高度的特异性。HPV是一种无包膜DNA病毒，病毒颗粒大小为50～60nm。病毒衣壳由72个壳粒构成，壳粒是由主要衣壳L1蛋白与次要衣壳L2蛋白组成的直径为50-55nm的正二十面体颗粒。研究表明，L2蛋白变异度较高，与病毒抗原的多态性有关；而L1蛋白保守性高，是主要的型特异性抗体，可以诱导机体产生中和抗体，常用作HPV疫苗的靶抗原。

目前已鉴定的HPV有超过100多型，不同亚型的HPV有不同的组织偏好并引发不同的疾病，从良性疣到上皮细胞肿瘤(包括宫颈、阴道、阴门、肛门和咽喉等部位)。根据病毒致癌性的严重程度分两大类：①低危型HPV(非癌相关型)：最常见的亚型包括HPV6、11、42、43和44；②高危型HPV(癌相关型)：最常见的亚型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、56、58、59和68等。

宫颈癌在全球女性癌症死亡率中位居第二位，且病发趋势呈年轻化。在众多HPV型别中，HPV16和18感染覆盖约70％的宫颈癌，是导致女性宫颈癌的主要致病因素。因此生成针对HPV16 L1蛋白特异性抗体，即不与其他型别HPV VLP蛋白发生交叉反应的抗体，对于HPV16的特异性检测既是充满挑战也是极为重要的。

目前市场上仅有美国默克公司生产的Gardasil 4和Gardasil 9以及英国葛兰素史克公司生产的Cervarix三种宫颈癌预防性疫苗产品，鉴于宫颈癌的高发病率和高致死率，我们仍然需要研发更多低价、安全和高效的新型HPV疫苗。

受到HPV病毒样颗粒分子量大，结构复杂等因素的限制，其完整性和结构正确与否会直接影响免疫和保护效果，效价测定就成为评价HPV疫苗质量的关键。目前有体内和体外两种方法评价疫苗的免疫原性，其中体内法能够直观地反映接种疫苗的免疫原性，但该方法的缺点是在动物体内实验成本高且周期长，还存在动物个体差异大，不利于动物福利原则等问题；而在疫苗的体外活性检测方法中，单克隆抗体是疫苗抗原质控的重要工具，抗体水平可以用来评价疫苗效果，其中中和抗体及其表位以及相应的中和机制也是疫苗研发过程的重要指标。

因此本领域仍然需要更多更有效的特异性中和抗体，可以灵敏且高度特异性检测HPV病毒样颗粒，尤其是HPV16亚型，以期对生产的疫苗及其保护效果进行更好的评价。

发明内容：

本发明的第一方面涉及一种分离的HPV16 L1蛋白抗体及HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区或其部分和/或重链可变区或其部分，

其中轻链可变区或其部分包含氨基酸序列为SEQ ID NO:13的轻链CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:14的轻链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:15的轻链CDR3的一个或多个；且

重链可变区或其部分包含氨基酸序列为SEQ ID NO:16的重链CDR1、氨基酸序列为SEQID NO:17的重链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:18的重链CDR3的一个或多个。

优选地，其中所述抗体或其抗原结合片段包含、由以下组成或基本上由以下组成：与HPV16 L1蛋白抗体轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或与HPV16 L1蛋白抗体重链可变区氨基酸序列SEQIDNO:7具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列。

优选地，其中所述抗体进一步包含轻链恒定区和重链恒定区。

优选地，其为单克隆抗体。

优选地，血清效价不小于1:125000。

优选地，具与HPV16 L1抗原特异性结合，与其他型别的HPV L1抗原无无交叉反应；优选的,其他型别HPV为HPV6、11、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59。

优选地，与完整HPV16-VLP抗原特异性结合,与变性HPV16-VLP无无交叉反应。

优选地，对不同表达系统来源的病毒样颗粒抗原表现出良好的反应一致性和中和活性。

优选地，识别的表位在免疫人或豚鼠血清中是优势表位。

优选地，其中抗原结合片段的形式为Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd'片段、单链抗体分子或单域抗体；其中单链抗体分子优选为scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。

本发明的第二方面涉及一种分离的核酸，其包含、由以下组成或基本上由以下组成：编码第一方面的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

本发明的第三方面涉及载体，其包含第二方面的分离的核酸。

本发明的第四方面涉及细胞，其包含第二方面的分离的核酸，和/或包含第三方面的载体。

本发明的第五方面涉及第一方面的抗体或其抗原结合片段、第二方面的核酸、第三方面的载体、或第四方面的细胞在检测HPV16 L1蛋白中的应用。

本发明的第六方面涉及一种中和活性检测方法的检测方法，包括

a.将第一方面的抗体或其抗原结合片段与一定量的HPV16假病毒孵育；

b.用a步骤的混合液侵染细胞一段时间后，检测细胞数的变化；

c.通过计算中和抑制率，得出中和抑制率为100％时抗体的最低浓度，即IC100(100％inhibitory concentration)，

优选地，抗体或片段与HPV16假病毒孵育4℃孵育1小时。

优选地，侵染68-72小时后检测细胞数的变化。

优选地，细胞是293FT，HPV16假病毒带有EGFP荧光基因或Luciferase化学发光基因，通过检测荧光或发光来检测细胞数的变化。

发明的有益效果：

与现有技术相比，本发明筛选得到的单克隆抗体及其抗原结合片段具有显著的技术效果。

特别的，本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段具有高特异性，不识别HPV6、11、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59型HPV，从而其在提供特异性检测方面具有特别显著的优势。

此外，本发明筛选得到的单克隆抗体及其抗原结合片段对不同表达系统来源的病毒样颗粒抗原都表现出良好的反应一致性和中和活性。

此外，本发明筛选得到的单克隆抗体及其抗原结合片段识别的表位在免疫豚鼠血清和免疫人血清中均是优势表位，这对于作为ELISA定量中的检测抗体标准品和HPV疫苗的免疫原性评价具有特别显著的优势。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列附图和实施例均用于说明本发明，并不是对本发明范围的限定。

附图说明：

图1为包括HPV 16 R001抗体在内的五种HPV16单抗(V5、8A9、5C10、4G12和R001)的中和活性对比。

图2展示了用HPV16 R001抗体对HPV16 VLP进行定量检测的标准曲线。

图3为包括HPV 16 R001抗体在内的五种HPV16单抗(V5、8A9、5C10、4G12和R001)与不同表达系统VLPs的ELISA反应。其中E1.16和E2.16的HPV16 VLPs来自大肠表达系统，Y1.16和Y2.16来自酵母表达系统，I1.16来自昆虫表达系统。

图4表示HPV 16 R001抗体识别的表位在免疫豚鼠血清中是优势表位。

图5表示HPV 16 R001抗体识别的表位在免疫人血清中是优势表位。

具体实施方式：

定义

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。为了便利地理解本发明，引述以下术语的通常的含义。

术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，是指表现所需生物学活性的抗体的任何形式。包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体),甚至包括抗体片段。典型地，全长抗体结构优选包含4条多肽链，通常通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。在此典型全长抗体结构外,其结构还包括其他衍生形式。

术语“互补决定区”(CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的这样一些氨基酸残基，其存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immulological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.1991))和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia and Lesk；J Mol Biol 196:901-917(1987))。

每个重链可变区和轻链可变区通常包含3个CDR和最多达4个FR，所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端以例如以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

给定抗体的互补性决定区(CDR)可以使用Kabat体系标识(Kabat等:Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和公众服务部，PHS，NIH，NIH出版编号91-3242，1991)。

“抗体的抗原结合片段”包含完整抗体分子的一部分,其保留母体抗体的至少某些结合特异性，通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd'片段、单链抗体分子(例如scFv，di-scFv或tri-scFv、双体抗体或scFab)、单域抗体。

“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，所述包含单一抗体的群体除了可能以极少量存在的可能突变(例如天然突变)之外是相同的。因此，所述术语“单克隆”表明所述抗体的性质，即不是不相关抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他抗体污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。所述术语单克隆抗体具体地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。

抗体“特异性结合”目的抗原例如肿瘤相关的多肽抗原靶(本文中，HPV16 VLP蛋白)，即以足够的亲和力结合所述抗原以使得所述抗体可用作治疗性试剂，靶向表达所述抗原的细胞或组织，并且与其他蛋白质无显著交叉反应或者与除了上文提到的抗原靶的同源体和变体(例如突变形式、剪接变体，或蛋白水解作用截短的形式)以外的蛋白质无显著交叉反应。

术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链，或其组合)组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定的电荷特征。

“分离的”抗体是已经被鉴别并且从表达它的细胞的组分中分离的抗体。所述细胞的污染组分是会干扰所述抗体的诊断或治疗用途的物质，可能包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。分离的天然抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为所述抗体的天然环境中的至少一种组分是不存在的。然而，通常情况下，分离的抗体是通过至少一个纯化步骤进行制备。

术语“HPV L1蛋白”如本文所用，术语“HPV”和“人乳头状瘤病毒”是指乳头状瘤病毒科的无包膜双链DNA病毒。它们的基因组是圆形的，并且大小约为8千碱基对。大多数HPV编码八种主要蛋白，六种位于“早期”区域(E1-E2)，并且两种位于“晚期”区域(L1(主要衣壳蛋白)和L2(次要衣壳蛋白))。已经鉴定了超过120种HPV类型，并且它们由数字标出(例如，HPV-16、HPV-18等)。

术语“HPV”或“HPV病毒”指乳头状瘤病毒科的乳头状瘤病毒，为无包膜DNA病毒，该病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为8kb,通常可以分为三个区域：①早期区(E)，含有编码E1、E2、E4～E7病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白的6个开放阅读框，以及E3和E8开放阅读框；②晚期区(L)含有编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2的阅读框；③长调控区(LCR)不编码任何蛋白，但具有复制的起源以及多个转录因子结合位点。

术语“HPV L1蛋白”及“HPV L2蛋白”指由HPV基因的晚期区(L)编码，在HPV感染周期中晚期合成的蛋白。L1蛋白质是主要的衣壳蛋白并且具有55-60kDa的分子量。L2蛋白质是次要的衣壳蛋白质。72个L1五聚体构成二十面体HPV病毒粒子的外壳,包裹闭环双链DNA微染色体。L2蛋白质位于L1蛋白质内侧(Structure of Small Virus-like ParticlesAssembled from the L1Protein of Human Papillomavirus 16Chen,X.S.,R.L.Garcea,Mol.Cell.5(3):557-567,2000)。

术语“HPV VLP蛋白”指当重组表达L1蛋白时,L1蛋白可自我装配形成病毒样颗粒(VLP蛋白)，为大约含有72个L1五聚体集合体,与病毒体外壳相似。VLP蛋白可以在接种动物中诱导中和抗体，保护实验动物免受感染性病毒的随后攻击。因此，VLP蛋白似乎是乳头瘤病毒疫苗的优秀候选者。(Structure of Small Virus-like Particles Assembled fromthe L1Protein of Human Papillomavirus 16Chen,X.S.,R.L.Garcea,Mol.Cell.5(3):557-567,2000)。

“HPV假病毒”系利用HPV VLP的非特异包裹核酸的特性，通过细胞内表达的HPV L1和L2组成的VLP包裹游离的DNA或导入外源质粒形成。是理想的HPV体外中和实验模型。

“假病毒中和法”是评价抗体的中和活性的一种方法，将免疫后的动物血清与一定量的假病毒孵育后再侵染细胞，细胞会随着血清中中和抗体的增加而减少，在一定的范围内可存在线性负相关，因此可以通过检测细胞数的变化来评价血清中抗体的中和活性。

实施例1:抗体库的构建和筛选分离

1.抗体库的构建

1.1动物免疫：

取昆虫细胞系统表达的HPV16 L1 VLP蛋白(SEQ ID NO:19)，分别与弗氏完全佐剂(Sigma公司，货号F5881)和弗氏不完全佐剂(Sigma公司，货号F5506)乳化制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原，其中HPV16 L1(500ug/只)与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂的体积比例为1:1.

通过背部皮下多点注射的方式，用弗氏完全佐剂免疫原免疫2-2.2kg日本大耳白兔(2-2.2kg，购自北京百尔康纳特实验兔繁育生物技术开发有限公司)。

首次免疫后，每间隔3周不完全弗氏佐剂免疫原以相同的方法和剂量对动物进行加强免疫。

第四次免疫后第4天经耳缘静脉采血，测定血清效价(步骤见实施例1.2)。

以(抗血清吸光值-空白吸光值)/(免疫前阴性对照血清吸光值-空白吸光值)>2.1为血清效价阳性标准，按照该标准，血清效价达到1:25000的动物于末次免疫后一周，取脾及骨髓组织建库筛选兔单抗。

1.2血清学检测效价：

取适量HPV16 VLP蛋白，用包被液(0.05M Na₂CO₃，0.05M NaHCO₃，pH 9.6，经0.2μm无菌过滤)稀释成5μg/mL，然后用单道移液器在96孔板每孔中加入100μL，轻拍板子使样品混匀，用保鲜膜封严，4℃下包被过夜；

用洗涤液(含0.05％Tween20的TBS，pH 7.2-7.4)按200μL/孔洗板1次，扣干酶标板；

用封闭液(含2％BSA的洗涤液)按300μL/孔封闭酶标板，室温下封闭1小时；

用洗涤液按300μL/孔洗板2次，扣干酶标板；

将待检兔血清用样品稀释剂进行梯度稀释，将1:25000、1:125000两个稀释倍数的样品及样品稀释剂以100μL/孔加样，以100μL/孔加入辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)检测抗体(IR公司，货号：111-035-008)至96孔板内，室温下作用2小时；

用洗涤液按200μL/孔洗板3次，扣干酶标板；

以200μL/孔加入显色液(用底物稀释液将底物储液做1000倍稀释，每升稀释后缓冲液加入320μL0.75％H₂O₂，混合均匀后使用)室温放置12分钟；

以50μL/孔加入终止液(2M H₂SO₄)终止反应；

用酶标仪进行检测：测定波长为450nm。

1.3噬菌体抗体库制备与筛选：

兔子的脾和骨髓组织用TriPure Isolation Reagent试剂(来源：Roche)进行RNA提取，用反转录试剂盒(来源：Invitrogen)进行反转录获得cDNA，设计10对引物扩增兔抗体的轻链可变区序列，4对引物扩增重链可变区序列(参考文献Phage Display:ALaboratoryManual，Sachdev S.Sidhu)，采用重叠延伸拼接PCR法将编码兔抗体的轻链和重链可变区序列拼接成编码scFv的核苷酸序列，轻重链可变区通过接头TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC(编码SSGGGGSGGGGGGSSRSS)(SEQ ID NO:1)进行连接，再通过限制性内切酶Sfi I(Fermentas)酶切连接到噬菌体载体pComb3x(北京义翘神州科技有限公司)中，电转化X-Blue感受态(北京义翘神州科技有限公司)构建免疫兔的噬菌体展示scFv抗体库。

将HPV16 VLP蛋白包被在ELISA板上，按照噬菌体抗体淘选的流程，筛选获得抗HPV16 VLP蛋白阳性抗体富集的噬菌体文库(参考文献：antibody phage display:MethodsandProtocols,Philippa M.O’Brien,Humana Press)。

从富集的文库中挑取单克隆噬菌体进行表达，用ELISA方法检测与HPV16 VLP蛋白的结合，用HPV16 VLP蛋白变性蛋白作为阴性对照，筛选获得与HPV16 VLP蛋白特异性结合的高结合力抗体克隆,例如R001scFv、V5 scFv、8A9 scFv、5C10 scFv、4G12 scFv，送测序公司测序获得核苷酸序列，其中R001scFv抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

参考Kabat(Abhinandan and Martin 2008,Dondelinger,Filé e et al.2018)以及IMGT编号(Lefranc 2014)方式确定R001scFv抗体轻链及重链各3个CDR的氨基酸序列,具体氨基酸序列见表1。

表1.R001scFv抗体轻链及重链各3个CDR的氨基酸序列

SEQ ID NO:13	轻链CDR1氨基酸序列	QASQSIGGYLS
			SEQ ID NO:14	轻链CDR2氨基酸序列	RASTLAS
SEQ ID NO:15	轻链CDR3氨基酸序列	QQGYTSSDINNA
			SEQ ID NO:16	重链CDR1氨基酸序列	GFTMSRYHMT
SEQ ID NO:17	重链CDR2氨基酸序列	IIYARNSDTYYANWAKG
			SEQ ID NO:18	重链CDR3氨基酸序列	ARVDSDSSGAFDRLDL

实施例2抗体的构建、生产与纯化

抗体构建及生产：

采用PCR方法将R001scFv抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)与重链信号肽序列(SEQ ID NO:11)进行拼接，再通过Hind III和KpnI(来源：Fermentas)酶切插入带有兔IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:5)序列的pSTEP2载体中获得完整的重链序列(SEQ IDNO:9)表达载体。采用PCR方法将R001scFv抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)与轻链信号肽序列(SEQ ID NO:12)进行拼接，再通过Hind III和BamHI酶切插入带有兔kappa轻链恒定区(SEQ ID NO:6)序列的pSTEP2载体中获得完整的轻链序列(SEQ ID NO:10)表达载体。

提质粒后转染HEK-293细胞进行培养表达7天，培养上清采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度抗体HPV 16 R001。

类似地,可以获得高纯度抗体HPV16.8A9、HPV16.V5、HPV16.5C10和HPV16.4G12。

拼接重链信号肽和重链可变区引物如下：

F1	AAGCTTGCCGCCACCATGGGCTGGTCCCTGATTCTGC
		F2	GCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCT
F3	TTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGAGCCA
		F4	ACCAGGGTGCTGAGCCAGTCGGTGAAGGAGTCC
R1	TGTGACCAGGGTACCCTGGCCCCA

拼接轻链信号肽和轻链可变区引物：

F5	CTGAAGCTTGCCGCCACCATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTG
		F6	GCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCTACAGCC
F7	TTCCTGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATAGCGAC
		F8	ACAGGAGTGCATAGCGACCCTATGCTGACCCAGAC
R2	GGTGCAACTGGATCCCCTTTGACGACCACCTCGGT

HPV16 R001抗体的氨基酸序列和核苷酸序列见说明书结尾处。

实施例3抗体的生物学鉴定

3.1抗体特异性鉴定：

3.1.1单克隆抗体HPV 16 R001与其他型别的HPV VLP无交叉反应

采用间接ELISA方法，将HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58，HPV59完整VLP蛋白用pH为7.2的磷酸盐缓冲液稀释成2μg/mL，100μL/孔包被酶标板，将待检抗体稀释至10ng/mL加样，通过辣根过氧化物酶标记的二抗显色。

表2.HPV 16 R001抗体特异性鉴定结果

包被蛋白	OD450-blank
		HPV6 VLP	0.004
HPV11 VLP	0.001
		HPV16 VLP	2.531
HPV18 VLP	0.000
		HPV31 VLP	0.002
HPV33 VLP	0.001
		HPV35 VLP	0.001
HPV39 VLP	0.004
		HPV45 VLP	0.002
HPV51 VLP	0.001
		HPV52 VLP	0.003
HPV56 VLP	0.003
		HPV58 VLP	0.003
HPV59 VLP	0.000

抗体特异性鉴定结果显示，单克隆抗体HPV 16 R001具有良好的特异性，与HPV16VLP特异性结合，与HPV6、11、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59型无交叉反应。

3.1.2HPV16 R001抗体识别完整HPV16-VLP不识别变性HPV16-VLP

采用间接ELISA方法鉴定：将完整HPV16-VLP及变性后的HPV16-VLP蛋白用pH为7.2的磷酸盐缓冲液稀释成2μg/mL，100μL/孔包被酶标板，将抗体HPV16-R001稀释至100ng/mL

加样，体积为100μL；通过0.08μg/ml辣根过氧

化物酶(100μL)标记的羊抗兔IgG(Fc)/HRP二抗显色，测OD450。

结果如表3所示，HPV 16 R001抗体只识别完整VLP，不识别变性VLP。

表3HPV 16 R001抗体只识别完整VLP，不识别变性VLP

	完整HPV16-VLP	变性后的HPV16-VLP
			OD450	3.122	-0.005

3.2抗体中和活性鉴定：

中和活性检测是基于HPV16假病毒的血清中和活性检测。HPV假病毒的包装：HPV16假病毒制备质粒(pCMV3-3-HPV16L1+L2)与绿色荧光质粒(PSEU-GFP Spark)共转染至293FT贴壁细胞制备而成，具体方法参考文献(Pastrana D V,Buck C B,Pang Y S,Thompson CD,Castle P E,FitzGerald P C,Kjaer S K,Lowy D R,Schiller J T.Reactivity ofhuman sera in a sensitive,high-throughputpseudovirus-based papillomavirusneutralization assay for HPV16and HPV18。[J]Virology 2004,321:205-216.)进行。

中和活性的检测：293FT细胞(来自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)提前4-8小时用中和培养基(DMEM+10％FBS+1％NEAA+1％HEPES+50μg/mL庆大霉素)铺板于96孔板中，37℃5％CO₂培养箱中进行培养。实施例2中纯化的抗体用中和培养基进行2倍系列稀释，稀释后的HPV16抗体与HPV16假病毒按照体积比1:4混合，4℃孵育1小时后将抗体和假病毒的混合物100μL/孔加入到提前铺板的293FT细胞上,每个稀释度至少2个复孔。同时，设立阳性对照和阴性对照样品。阳性对照：中和培养基和假病毒按照1:4混合；阴性对照：中和培养基。4℃孵育1小时后，100μL/孔加入到提前铺板的293FT细胞上，每个样品3个复孔。细胞在37℃5％CO₂培养箱中继续培养68-72小时后，EGFP荧光检测。

通过计算中和抑制率，得出中和抑制率为100％时抗体的最低浓度，即IC100(100％inhibitory concentration)。如下表4中和活性鉴定结果所示，HPV16 R001抗体IC100为12.5ng/mL。

表4 HPV 16 R001抗体中和活性鉴定结果

抗体名称	抗体批次	抗体初始浓度(mg/mL)	抗体IC100(ng/mL)
				HPV16 R001	HB08JU2701	1.550	12.500

按上述方法完成包括HPV 16 R001抗体在内的五种HPV16单抗(V5、8A9、5C10、4G12和R001)的对比实验，HPV16 R001单克隆抗体中和活性最好(见图1)。

3.3抗体配对检测：

结合抗体特异性和中和活性的检测结果，选择特异性好且中和活性较强的HPV 16R001，采用双抗夹心法，建立定量检测HPV16VLP蛋白的方法。

将HPV 16 R001用pH为7.2的磷酸盐缓冲液稀释至包被浓度，100μL/孔包被酶标板，将已知浓度的HPV16VLP蛋白作为标准品，进行2倍梯度稀释后，加入反应孔中，100μL/孔加入辣根过氧化物酶标记的HHPV 16 R001对HPV16 VLP蛋白进行检测，加入TMB底物显色，在酸的作用下终止反应，读取450nm的吸光度(OD值)，450nm处OD值与样品中的HPV16 VLP蛋白呈正相关。通过已知含量的标准品建立标准曲线计算待检样本中HPV16 VLP蛋白的含量。

HPV16 VLP标准品450nm处OD值见表5:

表5 HPV16 VLP定量检测标准曲线

*有效OD值＝OD_样品-OD_blank

以此绘制标准曲线图2。

利用上述检测方法对包括自身在内的14种HPV型混合物进行交叉反应检测，评价检测方法的特异性。将除自身以外的其它13种HPV型混合物以50ng/mL，25ng/mL，12.5ng/mL加样检测，同时将样品稀释液作为空白对照样品加样检测，各做3个复孔，分别读取450nm的吸光度(OD值)，以样品孔OD450平均值小于空白对照孔OD450平均值加3倍标准差作为无交叉反应的判定标准。

表6 14种HPV型混合物进行交叉反应检测结果

如表6所示的14种HPV型混合物进行交叉反应检测结果表明；单克隆抗体HPV 16R001与混合物中的HPV6、11、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59型无交叉反应。

3.4结合稳定性分析

利用三种表达系统(酵母表达系统、大肠杆菌表达系统和昆虫细胞表达系统)的5种HPV16L1抗原，对HPV16 R001、HPV16.8A9、HPV16.V5和HPV16.4G12的结合稳定性进行了分析。用双抗体夹心ELISA方法进行检测，将HPV16 L1抗原参考品和HPV16 L1抗原样品，根据BCA蛋白定量值进行系列稀释，分别用上述四个型特异性单抗作为检测抗体进行分析。

HPV16 R001单克隆抗体对不同表达系统VLPs的反应曲线最相近(见图3)；同时将其与不同表达系统的参考品组合检测5种抗原，其抗原/蛋白比值均接近于1。因此，HPV16R001单克隆抗体作为检测抗体时，对不同表达系统来源的抗原的反应一致性好，适合作为ELISA定量中的检测抗体标准品。

3.5单抗的优势表位分析

将源自三个表达系统的5种HPV16 VLP蛋白疫苗免疫豚鼠，获得14份免疫豚鼠血清。将免疫后豚鼠血清从1:1000起，6倍系列稀释，按照假病毒为基础的中和实验的步骤进行操作，计算免疫后豚鼠血清中总中和抗体滴度ID50。

将50份免疫HPV16、HPV18二价疫苗的人血清进行单抗阻断人血清试验：

(1)用磷酸盐缓冲液稀释HPV16 L1 VLP蛋白至2μg/mL，以100μL/孔加入酶标板，4℃放置过夜；

(2)封闭：次日，300μL洗涤液洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2h，用湿盒减少酶标板的边缘效应；

(3)加样：300μL洗涤液洗板3次，将饱和浓度(5μg/mL)的单克隆抗体HPV16.001，以100μL/孔加入酶标板，设阳性对照组(用样品稀释液代替单抗)，37℃孵育1h，用湿盒减少酶标板的边缘效应；

(4)加免疫后人血清：300μL洗涤液洗板5次，将待测免疫后人血清以100μL/孔加入酶标板，37℃孵育1h，用湿盒减少酶标板的边缘效应；

(5)加酶标二抗：300μL洗涤液洗板5次，将HRP标记的羊抗人抗体以100μL/孔加入酶标板，37℃孵育1h，用湿盒减少酶标板的边缘效应；

(6)显色：300μL洗涤液洗板5次，100μL/孔加入TMB显色液，37℃孵育10～20min，用湿盒减少酶标板的边缘效应；

(7)终止：将终止液以50μL/孔加至酶标板，稍震荡混匀后，立即用酶标仪读数，设置测定波长为450nm，参比波长为620nm。

(8)结果计算：本实验以“只加免疫后人血清不加单抗”为阳性对照组，参照以下公式进行抑制率的计算：抑制率(I％)＝(OD450/630阳性-OD450/630单抗阻断后)/OD450/630阳性×100％。若抑制率小于30％，则判定为无阻断作用。若抑制率大于或等于30％，则判定为存在阻断作用。

图4表明:HPV16 R001单克隆抗体识别的表位在免疫豚鼠血清中均是优势表位。

图5表明:HPV16 R001单克隆抗体识别的表位在免疫人血清中是优势表位。50份免疫后人血清中，饱和浓度的HPV16 R001单抗可以阻断其中的27份血清与抗原的结合。其中，对12份免疫人血清的阻断率在50％以上，对其余15份免疫人血清的阻断率在30％-50％之间。因此，HPV16 R001单克隆抗体识别的表位在免疫后人血清中是优势表位。

下表7为HPV16 R001抗体的氨基酸序列和核苷酸序列。

表7：R001抗体的氨基酸序列和核苷酸序列

序列表

<110> 神州细胞工程有限公司

<120> 抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体及应用该抗体的检测方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Linker)

<400> 1

tctagtggtg gcggtggttc gggcggtggt ggaggtggta gttctagatc ttcc 54

<210> 2

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(R001 scFv)

<400> 2

gaccctatgc tgacccagac tgcagcctct gtggaggtag ctgtgggagg cacagtcacc 60

atcaagtgcc aggccagtca gagtattggt ggttacttat cctggtatca gcagaaacca 120

gggcagcgtc ccaaactcct gatctacagg gcttccactc tggcatctgg ggtcccatcg 180

cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccttcagcgg cgtggagtgt 240

gccgatgctg ccgcttatta ctgtcaacag ggttatacta gtagtgatat taataatgct 300

ttcggcggag ggaccgaggt ggtcgtcaaa tctagtggtg gcggtggttc gggcggtggt 360

ggaggtggta gttctagatc ttcccagtcg gtgaaggagt ccgaggggcg cctggtcacg 420

cctgggacac ccctgacact cacctgcaca gcctctggat tcaccatgag tagatatcac 480

atgacctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggaat ggatcggaat catttatgct 540

cgtaatagtg acacatacta cgcgaactgg gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc 600

tcgaccacgg tggatctgaa aatcaccagt ccgacaatcg aggacacggc cacgtatttc 660

tgtgccagag tcgatagtga tagtagtggt gctttcgatc gcttggatct ctggggccag 720

ggcaccctgg tcactgtctc ttca 744

<210> 3

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(R001重链可变区)

<400> 3

cagtcggtga aggagtccga ggggcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60

tgcacagcct ctggattcac catgagtaga tatcacatga cctgggtccg ccaggctcca 120

gggaaggggc tggaatggat cggaatcatt tatgctcgta atagtgacac atactacgcg 180

aactgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcga ccacggtgga tctgaaaatc 240

accagtccga caatcgagga cacggccacg tatttctgtg ccagagtcga tagtgatagt 300

agtggtgctt tcgatcgctt ggatctctgg ggccagggca ccctggtcac tgtctcttca 360

<210> 4

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(R001轻链可变区)

<400> 4

gaccctatgc tgacccagac tgcagcctct gtggaggtag ctgtgggagg cacagtcacc 60

atcaagtgcc aggccagtca gagtattggt ggttacttat cctggtatca gcagaaacca 120

gggcagcgtc ccaaactcct gatctacagg gcttccactc tggcatctgg ggtcccatcg 180

cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccttcagcgg cgtggagtgt 240

gccgatgctg ccgcttatta ctgtcaacag ggttatacta gtagtgatat taataatgct 300

ttcggcggag ggaccgaggt ggtcgtcaaa 330

<210> 5

<211> 973

<212> DNA

<213> 人工序列(IgG1重链恒定区)

<400> 5

ggtcaaccta aggctccgtc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 60

tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa ggctacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 180

ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240

aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300

agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360

ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420

gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480

cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540

accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600

aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660

gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720

ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780

gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840

ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900

tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960

ccgggtaaat aaa 973

<210> 6

<211> 316

<212> DNA

<213> 人工序列(kappa轻链恒定区)

<400> 6

ggggatccag ttgcacctac tgtcctcatc ttcccaccag ctgctgatca ggtggcaact 60

ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg 120

gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct 180

gcagattgta cctacaacct cagcagcact ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc 240

cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcaat 300

aggggtgact gttaaa 316

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(R001重链可变区)

<400> 7

Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Met Ser Arg Tyr His

20 25 30

Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Tyr Ala Arg Asn Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val

85 90 95

Asp Ser Asp Ser Ser Gly Ala Phe Asp Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(R001轻链可变区)

<400> 8

Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Ala Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Phe Ser Gly Val Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Ser Ser Asp

85 90 95

Ile Asn Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 1390

<212> DNA

<213> 人工序列(R001完整重链)

<400> 9

atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagccag 60

tcggtgaagg agtccgaggg gcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

acagcctctg gattcaccat gagtagatat cacatgacct gggtccgcca ggctccaggg 180

aaggggctgg aatggatcgg aatcatttat gctcgtaata gtgacacata ctacgcgaac 240

tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatcacc 300

agtccgacaa tcgaggacac ggccacgtat ttctgtgcca gagtcgatag tgatagtagt 360

ggtgctttcg atcgcttgga tctctggggc cagggtaccc tggtcacagt gagctctggt 420

caacctaagg ctccgtcagt cttcccactg gccccctgct gcggggacac acccagctcc 480

acggtgaccc tgggctgcct ggtcaaaggc tacctcccgg agccagtgac cgtgacctgg 540

aactcgggca ccctcaccaa tggggtacgc accttcccgt ccgtccggca gtcctcaggc 600

ctctactcgc tgagcagcgt ggtgagcgtg acctcaagca gccagcccgt cacctgcaac 660

gtggcccacc cagccaccaa caccaaagtg gacaagaccg ttgcgccctc gacatgcagc 720

aagcccacgt gcccaccccc tgaactcctg gggggaccgt ctgtcttcat cttcccccca 780

aaacccaagg acaccctcat gatctcacgc acccccgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840

gtgagccagg atgaccccga ggtgcagttc acatggtaca taaacaacga gcaggtgcgc 900

accgcccggc cgccgctacg ggagcagcag ttcaacagca cgatccgcgt ggtcagcacc 960

ctccccatcg cgcaccagga ctggctgagg ggcaaggagt tcaagtgcaa agtccacaac 1020

aaggcactcc cggcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccagagggca gcccctggag 1080

ccgaaggtct acaccatggg ccctccccgg gaggagctga gcagcaggtc ggtcagcctg 1140

acctgcatga tcaacggctt ctacccttcc gacatctcgg tggagtggga gaagaacggg 1200

aaggcagagg acaactacaa gaccacgccg gccgtgctgg acagcgacgg ctcctacttc 1260

ctctacagca agctctcagt gcccacgagt gagtggcagc ggggcgacgt cttcacctgc 1320

tccgtgatgc acgaggcctt gcacaaccac tacacgcaga agtccatctc ccgctctccg 1380

ggtaaataaa 1390

<210> 10

<211> 703

<212> DNA

<213> 人工序列(R001完整轻链)

<400> 10

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagcgac 60

cctatgctga cccagactgc agcctctgtg gaggtagctg tgggaggcac agtcaccatc 120

aagtgccagg ccagtcagag tattggtggt tacttatcct ggtatcagca gaaaccaggg 180

cagcgtccca aactcctgat ctacagggct tccactctgg catctggggt cccatcgcgg 240

ttcaaaggca gtggatctgg gacagagtac actctcacct tcagcggcgt ggagtgtgcc 300

gatgctgccg cttattactg tcaacagggt tatactagta gtgatattaa taatgctttc 360

ggcggaggga ccgaggtggt cgtcaaaggg gatccagttg cacctactgt cctcatcttc 420

ccaccagctg ctgatcaggt ggcaactgga acagtcacca tcgtgtgtgt ggcgaataaa 480

tactttcccg atgtcaccgt cacctgggag gtggatggca ccacccaaac aactggcatc 540

gagaacagta aaacaccgca gaattctgca gattgtacct acaacctcag cagcactctg 600

acactgacca gcacacagta caacagccac aaagagtaca cctgcaaggt gacccagggc 660

acgacctcag tcgtccagag cttcaatagg ggtgactgtt aaa 703

<210> 11

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(重链信号肽)

<400> 11

atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagc 57

<210> 12

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(轻链信号肽)

<400> 12

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagc 57

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(轻链CDR1)

<400> 13

Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(轻链CDR2)

<400> 14

Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(轻链CDR3)

<400> 15

Gln Gln Gly Tyr Thr Ser Ser Asp Ile Asn Asn Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(重链CDR1)

<400> 16

Gly Phe Thr Met Ser Arg Tyr His Met Thr

1 5 10

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(重链CDR2)

<400> 17

Ile Ile Tyr Ala Arg Asn Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(重链CDR3)

<400> 18

Ala Arg Val Asp Ser Asp Ser Ser Gly Ala Phe Asp Arg Leu Asp Leu

1 5 10 15

<210> 19

<211> 505

<212> PRT

<213> 人工序列(HPV16 L1 VLP蛋白)

<400> 19

Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val

1 5 10 15

Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn

20 25 30

Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro

35 40 45

Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys

50 55 60

Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro

65 70 75 80

Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln

85 90 95

Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro

100 105 110

Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp

115 120 125

Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg

130 135 140

Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly

145 150 155 160

Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr

165 170 175

Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn

180 185 190

Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met

195 200 205

Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile

210 215 220

Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu

225 230 235 240

Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe

245 250 255

Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro

260 265 270

Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser

275 280 285

Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala

290 295 300

Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn

305 310 315 320

Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr

325 330 335

Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu

340 345 350

Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu

355 360 365

Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr

370 375 380

Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu

385 390 395 400

Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp

405 410 415

Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr

420 425 430

Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu

435 440 445

Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu

450 455 460

Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe

465 470 475 480

Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr

485 490 495

Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu

500 505

Claims

1.一种分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区或其部分和重链可变区或其部分，

其中轻链可变区或其部分包含氨基酸序列为SEQ ID NO:13的轻链CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:14的轻链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:15的轻链CDR3；且

重链可变区或其部分包含氨基酸序列为SEQ ID NO:16的重链CDR1、氨基酸序列为SEQID NO:17的重链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:18的重链CDR3。

2.权利要求1的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HPV16 L1蛋白抗体轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:8的氨基酸序列，和HPV16L1蛋白抗体重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

3.权利要求1或2的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体进一步包含轻链恒定区和重链恒定区。

4.权利要求3的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链恒定区核苷酸序列为SEQ ID NO:6，重链恒定区核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

5.权利要求1或2的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体。

6.权利要求1或2的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，血清效价不小于1:125000。

7.权利要求1或2的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，与HPV16 L1抗原特异性结合，与其他型别的HPV L1抗原无交叉反应。

8.权利要求7的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，其与HPV6、11、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59型别的HPV L1抗原无交叉反应。

9.权利要求1或2的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，与完整HPV16-VLP抗原特异性结合,与变性HPV16-VLP无交叉反应。

10.权利要求1或2的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，对不同表达系统来源的病毒样颗粒抗原表现出良好的反应一致性和中和活性。

11.权利要求1或2的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，识别的表位在免疫人或豚鼠血清中是优势表位。

12.权利要求1或2的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，其中抗原结合片段的形式为Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd'片段、单链抗体分子或单域抗体。

13.权利要求12的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段，其中单链抗体分子为scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。

14.一种分离的核酸，其编码权利要求1-13中任一项的分离的HPV16 L1蛋白抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

15.一种载体，其包含权利要求14的分离的核酸。

16.一种分离的细胞，其包含权利要求14的分离的核酸。

17.一种分离的细胞，其包含权利要求15的载体。

18.权利要求1-13之任一的抗体或其抗原结合片段、权利要求14的核酸、权利要求15的载体、或权利要求16或17的细胞在制备检测HPV16 L1蛋白的试剂中的应用。

19.一种中和活性的检测方法，包括

a.将权利要求1-13之任一的抗体或其抗原结合片段与一定量的HPV16假病毒孵育；

20.权利要求19的方法，其中，抗体或片段与HPV16假病毒孵育4℃孵育1小时。

21.权利要求19或20的方法，其中，侵染68-72小时后检测细胞数的变化。

22.权利要求21的方法，其中，细胞是293FT，HPV16假病毒带有EGFP荧光基因或Luciferase化学发光基因，通过检测荧光或发光来检测侵染细胞数的变化。