CN113717283B

CN113717283B - 一种抗乙型肝炎病毒e抗原的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN113717283B
Application number: CN202010449334.2A
Authority: CN
Inventors: 陈自敏; 王邵娟; 刘嘉祺; 熊君辉; 袁权; 葛胜祥; 宋浏伟; 孙旭东
Original assignee: Xiamen Innodx Biotech Co ltd; Xiamen University
Current assignee: Xiamen Innodx Biotech Co ltd; Xiamen University
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN113717283A

Abstract

本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是乙型肝炎病毒的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及乙型肝炎病毒e抗原的单克隆抗体，还涉及乙型肝炎病毒e抗原的检测试剂(特别是化学发光法)。

Description

一种抗乙型肝炎病毒e抗原的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是乙型肝炎病毒的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及乙型肝炎病毒的单克隆抗体，还涉及乙型肝炎病毒e抗原的检测试剂，特别是化学发光法检测。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，简称HBV)是一种呈世界性分布、危害严重的传染病。目前，乙型肝炎病毒感染已成为世界范围内共同而且重要的公共卫生问题。临床以肝功能异常为主要特征并且伴多样性的临床表现。目前全世界共有3.5亿～4亿慢性HBV感染者，20亿人曾感染HBV，约占全球人口的6％，慢性HBV携带者中有相当一部分发展成为慢性乙型肝炎(CHB)，部分患者发展成为肝硬化患者(HC)、肝细胞癌(HCC)或非致癌性HC并发症，每年因HBV感染而死亡的人数超过110万。

目前临床上用于检测乙型肝炎的主要血清学指标是乙肝六项即：乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)，乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)，乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)，乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)及乙型肝炎病毒核心IgM抗体(HBcAb-IgM)。其中HBsAg是乙型肝炎的早期诊断指标之一，出现于患者血清转氨酶(ALT)升高前2周～8周，至恢复期HBsAg滴度逐渐降低乃至消失，最终产生保护性的HBsAb。HBeAg与HBcAg由同一启动子控制，其表达可能与HBcAg相关进而与HBV的载量相关，故常被作为HBV活跃复制的血清学指标；同时，HBeAg向HBeAb的转化目前是判断抗病毒药物治疗效果的主要指标。

乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B virus e antigen，HBeAg)是乙型肝炎病毒在人体内复制过程中的一个主要产物，由前c和c基因编码，具有重要的生物学功能。HBeAg是临床判定HBV复制程度及判断慢性乙型肝炎患者预后的重要指标之一，是抗病毒治疗疗效判定的重要依据。HBeAg是乙型肝炎核心抗原的可溶性成分，常常与血清HBV-DNA、DNA.P及Dane颗粒同时存在，为HBV复制和具有传染性的标志，也是急性乙型肝炎发展为慢性的重要指标。

目前国内外的用于检测HBeAg的试剂都是针对1-149aa表位的抗体，对HBcAg存在一定的交叉反应，对于HBeAg的终点判断有一定的限制作用。

开发一种简单、准确的HBeAg发光检测试剂在HB患者抗病毒疗效及病程预后方面都有迫切的现实意义以及对于抗病毒药物的筛选也提供了一种评估手段。

发明内容

本发明的第一个方面提供了针对乙型肝炎病毒e抗原的单克隆抗体抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合乙型肝炎病毒e抗原的-10至-1位氨基酸表位。

优选地，所述抗体包含分别如SEQ ID NO:1-3所示的重链CDR序列CDR1-3；和SEQID NO:4-6所示的轻链CDR序列CDR1-3。

更优选地，所述抗体包含如SEQ ID NO:7所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区序列。

在优选的实施方式中，本发明的单克隆抗体是于2019年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)的杂交瘤细胞株16D9分泌的单克隆抗体，该杂交瘤细胞株的保藏编号为C2019301。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。

在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞。

本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合乙型肝炎病毒e抗原，从而可用于检测乙型肝炎病毒e抗原在样品中的存在或其水平。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。在本发明中，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，

)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通过引用并入本文)。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。

在另一个方面，本发明提供了检测乙型肝炎病毒e抗原在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用带有可检测的标记的试剂来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。

在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测乙型肝炎病毒e抗原在样品中的存在或其水平。

在具体的实施方案中，本发明提供了用于检测生物样品中乙型肝炎病毒e抗原的方法，该方法包括：

将样品与针对乙型肝炎病毒e抗原不同表位的两种抗体或其抗原结合片段相接触，以及定性或定量检测所述两种抗体与乙型肝炎病毒e抗原的结合，其中结合指示所述样品中乙型肝炎病毒e抗原存在或浓度；其中一种抗体或其抗原结合片段针对包含在乙型肝炎病毒e抗原的第-10至-1位氨基酸残基的序列中的表位，另外一种抗体或其抗原结合片段针对乙型肝炎病毒e抗原的非N端表位。

在优选的实施方式中，针对包含在乙型肝炎病毒e抗原的第-10至-1位氨基酸残基的序列中的表位的抗体是本发明所述的抗体，其通过磁珠包被，所述另外一种抗体通过吖啶酯标记。

在另一个方面，本发明提供了用于检测乙型肝炎病毒e抗原在样品中的存在或其水平的试剂盒，其包含磁珠包被的本发明所述的抗体或其抗原结合片段和吖啶酯标记的针对乙型肝炎病毒e抗原的非N端表位的另外一种抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方案中，本发明所述的试剂盒还包括处理液体系，所述处理液包含0.5mM硫代甘油+8M尿素+50mMTB 8.0。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423 426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879 5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，CancerImmunol.描述。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444 6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121 1123(1994))。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P4,816,567)。

例如，可以如下来制备单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。可将免疫原预先偶联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上，以增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以是弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内将产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂，如PEG，使其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1996)。上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中优选含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等特征。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21或MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA)，和SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(American Type CultureCollection,Rockville,Md.USA)。另外也有研究报道，利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。生长杂交瘤细胞的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性的方法包括例如，免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，可利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)描述的Scatchard分析法来测定单抗的亲和力。当确定了杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。

还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。

如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567to Cabilly etal.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。

如本文中所使用的，术语“人抗体”是指人源化抗体，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature,321:522 525(1986)；Reichmannet al.,Nature,332:323 329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；和Clark,Immunol.Today 21:397 402(2000)。

如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。

如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与载体蛋白融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中所使用的，术语“载体蛋白”是指这样的蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处(例如蛋白内部，N端或C端)插入表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。此类载体蛋白是本领域技术人员熟知的，包括例如，HPV L1蛋白(可以将表位肽插入在所述蛋白的第130-131位氨基酸之间或在第426-427位氨基酸之间，参见Slupetzky,K.等Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreignepitope on capsid surface loops[J].J Gen Virol,2001,82:2799-2804；Varsani,A.等Chimeric human papillomavirus type 16(HPV-16)L1particles presenting thecommon neutralizing epitope for the L2minor capsid protein of HPV-6and HPV-16[J].J Virol,2003,77:8386-8393)，HBV核心抗原(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸，参见Koletzki,D.,et al.HBV core particles allow the insertion andsurface exposure of the entire potentially protective region of Puumalahantavirus nucleocapsid protein[J].Biol Chem,1999,380:325-333)，土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸，参见Sabine

GertrudBeterams and Michael Nassal，J.Virol.1998,72(6):4997)，CRM197蛋白(可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的N末端或C末端)。任选地，可以在表位肽与载体蛋白之间使用连接体(例如柔性或刚性连接体)，以促进二者各自的折叠。

如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。

可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原(例如，流感病毒血凝素蛋白)的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO 03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的单克隆抗体竞争结合流感病毒血凝素蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段(即，抗原结合部分)。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。

如本文中所使用的，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。可以使用多种方法测定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。

如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株16D9时，其还指杂交瘤细胞株16D9的亚克隆和后代细胞。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段具有显著的有利方面，本发明的单克隆抗体能够用于乙型肝炎病毒的诊断、预防和治疗。并且，其识别的表位能够用于检测乙型肝炎病毒，并且高灵敏、高精度。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不是对本申请的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本申请的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1为SDS-PAGE电泳胶图，其中，泳道1为-10-183aa抗原，泳道2为Marker，泳道3为-10-152aa抗原，泳道4为-10-149aa抗原。

图2为不同合成肽与16D9单抗竞争结果。

图3为构建于真核载体中的HBeAg序列。

图4为western blot结果图。

图5为单抗配对的酶联免疫值结果图。

图6为HBeAg对不同HBV基因型的检测效果。

图7为本发明试剂盒与已上市试剂盒对HBeAg检测效果的对比。

图8为本发明试剂盒灵敏度的检测结果。

图9为本发明试剂对抗HBV效果的评价结果。

序列信息

本申请涉及的部分序列信息描述于下表中，其余描述于实施例中。

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关于生物材料保藏的说明

杂交瘤细胞16D9已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC,Wuhan University,Wuhan,China)进行保藏，其具有保藏号CCTCC NO.C2019301，且保藏时间为2019年11月28日。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明来源的试剂均是本领域的常规试剂或市售可得的试剂。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围

实施例1：抗原制备

1.1克隆HBeAg第－10-149位、－10-152位和－10-183位氨基酸

HBeAg第-10-149位氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，第-10-152位氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，第-10-183位氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。利用大肠杆菌表达体系，制备－10-149；－10-152；－10-183抗原。

1.2制备和纯化－10-149；－10-152；－10-183抗原

1.2.1收集菌液打超声破碎，将破碎液12000rpm，10℃离心10min，留取上清。

1.2.2对得到的上清进行饱和硫胺沉淀，4度沉淀1-2h，13000rpm，离心10min收集沉淀，并用与原上清等体积的50mM TB8.8缓冲液重悬，1×PB7.4透析样品。样品经中压DEAE-FF层析(GE介质)纯化，收集穿透峰溶液(目的蛋白)。穿透峰溶液再经Capto Core700分子筛纯化，收集第一个样品峰。SDS-PAGE胶图如图1所示。

实施例2：Anti-HBeAg小鼠单克隆抗体的制备(杂交瘤细胞系16D9，9F10，4C8， 14C12，12D7，8D1)

2.1小鼠免疫

2.1.1免疫原的准备：免疫原大肠杆菌重组表达的－10-149，－10-152，－10-183蛋白。取完成抗原稀释至0.4mg/mL，与弗氏佐剂等体积混合，使其成油包水状乳剂(判断混合液是否乳化完全的方法：可将一小滴混合液滴在清水的液面上，若混合液凝聚不散，则可认为已基本上混匀)。初次免疫使用弗氏完全佐剂，后续加强免疫使用弗氏不完全佐剂，并且融合前72h的最后一次加强免疫不加佐剂。

2.1.2小鼠的基础免疫：使用上述免疫原对6-8周龄BALB/c雌鼠进行皮下多点注射免疫，注射剂量为500μL/只/次，每次免疫前采集200μL眼球静脉血以备滴度测定。每隔2周加强免疫一次。用间接ELISA测定血清滴度，当小鼠血清滴度达到平台期后，小鼠停止免疫并休息两个月后进行融合。

2.1.3融合前72小时的免疫加强(Final boost)：小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合前72h进行脾脏免疫加强，此次加强的免疫原不含佐剂，取100μl 0.5mg/mL的重组蛋白进行注射。其中脾脏免疫前，需先用乙醚麻醉小鼠，剖开腹腔外皮取出脾脏，沿脾脏纵向注射100μL抗原，迅速手术缝合腹皮切口。

2.2融合杂交瘤的制备与筛选

融合前72h加强免疫后，取小鼠脾脏制成细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行细胞融合，以获得杂交瘤细胞。在此之前先制备饲养细胞。在杂交瘤细胞的培养过程中，融合后的大量骨髓瘤细胞和脾细胞在1640-HAT培养液中相继死亡，单个细胞或少数分散的细胞不易存活，必须加入其他细胞方能使之生存，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。本实验室使用小鼠腹腔巨噬细胞或13天龄的小鼠胸腺细胞作为饲养细胞。

2.2.1小鼠巨噬细胞的制备：分如下步骤进行：(i)将一只6周龄左右的BALB/c小鼠引颈处死，自来水冲洗，浸泡于75％乙醇溶液中5min；放入超净工作台，使小鼠腹部朝上；用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，用大镊子向上下方向撕拉开皮肤，充分暴露腹部。(ii)用无菌眼科镊子提起腹膜，然后用5mL注射器向腹腔内注入适量培养液，用另一无菌眼科镊子轻微提动小鼠四肢，最后利用注射器吸出培养液于离心管中。(iii)将腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT培养液中，使成浓度为2×10⁵/mL的巨噬饲养细胞。(iv)加入96孔细胞培养板，每孔0.1mL，置培养箱培养；也可直接与融合细胞混合后添加到96孔细胞培养板中。

2.2.2小鼠胸腺细胞的制备：分如下步骤进行(i)将一只13天龄左右的BALB/c小鼠引颈处死，自来水冲洗，浸泡于75％乙醇溶液中5min；放入超净工作台，使小鼠腹部朝上；(ii)用镊子提起小鼠腹部皮肤，将腹部和胸部的外皮剪开。(iii)用另一把干净的剪刀剪开胸腔，用镊子取出乳白色的胸腺，经研磨后通过200目细胞筛，得到胸腺饲养细胞液。

2.2.3小鼠骨髓瘤细胞的制备：分如下步骤进行。(i)小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)易培养，融合率高，是目前最理想的融合细胞，但Sp2/0杂交瘤细胞系对培养条件的变化比NS-1敏感，过度稀释(密度低于3×10⁵/mL)和pH碱性(pH高于7.3)时生长不良。(ii)选择对数生长期的细胞进行融合。(iii)融合前从培养瓶移出骨髓瘤细胞于离心管，用RPMI-1640培养液洗3次(1000rpm×5min)。用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数。(iv)一般融合前5天开始复苏小鼠骨髓瘤细胞，每次融合约需6瓶35cm²Sp2/0细胞。

2.2.4免疫脾细胞的制备：分如下步骤进行。(i)取待融合的BALB/C小鼠，摘除眼球放血致小鼠死亡，收集的血液制成抗血清，可作抗体检测的阳性对照。自来水冲洗，浸泡于75％乙醇溶液中5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上，右侧卧位。(ii)无菌手术打开腹腔取出脾脏，用剪刀剪成小块放于200目细胞筛网上，再用研磨棒(注射器内芯)挤压研磨，同时用吹管滴加RPMI-1640培养液。(iii)补加适量RPMI-1640培养液，静置3-5min，取上2/3部分悬液移入50mL塑料离心管中。上述过程反复2-3次。(iv)用RPMI-1640培养液洗细胞3次(1000rpm×10min)。(v)用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数。

2.2.5使用PEG促融剂融合制备杂交瘤：分如下步骤进行。(1)融合前先将1mL的PEG-1500和10mL的RPMI-1640无血清培养基和200mL完全培养基预温至37℃。(ii)将制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50mL离心管内(1×10⁸脾细胞+1×10⁷骨髓瘤细胞，约10:1)，离心1500rpm×8min，离心后，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状。(iii)1mL吸管吸取0.8mL(按1×10⁸脾细胞+0.8mL PEG)加入离心管内，边加边轻轻搅拌，PEG平均在60s内加完，随即加入10mL预温至37℃的RPMI-1640完全培养液，搅拌要温和。最后补加RPMI-1640培养液至40mL，离心1000rpm×5min。(iv)弃上清液，取少量HT培养液将细胞小心吹散，将细胞移入准备好的HT培养液中，加入96孔细胞培养板，每孔0.1mL，放入CO2孵育箱中培养。(v)12h后，配置适量的HAT完全培养基，每个孔中滴加0.1mL；5天后，用HT完全培养基给孔中的细胞上清进行50-100％的换液；大约9-14天后，吸取上清检测。

2.2.6杂交瘤的筛选：间接ELISA筛选，包被抗原300ng/mL，每孔包被0.1mL，加入细胞上清50uL检测，并挑选出阳性克隆孔。

2.2.7杂交瘤细胞的克隆化：采用有限稀释法，先把细胞按一定浓度进行梯度稀释，然后接种到96孔细胞培养板的每个孔中，尽可能使孔内只有一个细胞生长。杂交瘤单克隆阳性细胞株一般需要重复克隆2-3次，直到100％阳性后确认为稳定克隆株，最后获得了杂交瘤细胞为16D9，9F10，4C8，14C12，12D7，8D1。

2.3单抗腹水的生产

取BALB/c小鼠2-3只，经腹腔注入0.5mL液体石蜡油。1周后，将对数生长期的杂交瘤细胞以1000rpm离心5min，弃上清液。杂交瘤细胞用无血清培养液悬浮，并将细胞数调至(1-2)×10⁶/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。7-10d后，小鼠腹部明显膨大后，引颈处死小鼠，自来水冲洗，浸洗，浸泡于75％乙醇中5min，使小鼠腹部朝上用注射针头固定四肢于小鼠解剖台板。用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后从两边向小鼠背部方向剪开，用大镊子向上下方向撕开皮肤，充分暴露腹部。用无菌眼科镊子提取腹膜，将腹膜中央处剪一小口，然后用1mL吸管通过小口吸出腹腔内全部腹水。收集的腹水可以混合，置离心管离心，3000rpm，20min。离心后收集上清。

2.4单抗腹水的纯化

经硫酸铵沉淀和Protein A亲和层析纯化(购自美国GE公司)，获得纯化的单克隆抗体16D9，9F10，4C8，14C12，12D7，8D1。

实施例3：Anti-HBeAg小鼠单克隆抗体对HBeAg N端不同合成肽的结合活性评估

3.1多肽合成

以HBV序列(GenBank ID：AAL15969.1)作为参考序列，合成3条多肽(委托上海生工生物科技有限公司合成)。这3条多肽(S1-S3)一起覆盖了HBeAg的负10到负1的10个氨基酸。S1-S3的多肽信息如下表所示。

表1：S1-S3的多肽信息

3.2 Anti-HBeAg小鼠单克隆抗体与多肽的S1-S3的反应性分析

3.2.1反应板的制备

将多肽用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为5μg/mL；在96孔酶标板每孔中加入100μL的包被液，2～8℃包被16～24小时后再37℃包被2小时；用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mMNa₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。

3.2.2Anti-HBeAg小鼠单克隆抗体的ELISA检测

取2.1中获得的6株Anti-HBeAg小鼠单克隆抗体以含20％新生牛血清的PBS溶液稀释至1μg/mL，进行定性ELISA检测。

样品反应：取3种已包被多肽的酶标板，每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应30分钟。

酶标记物反应：完成样品反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mMNaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG(GAM)反应液，置于37℃温箱反应30分钟。

显色反应：完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mMNaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15分钟。

终止反应及读值测量：完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。

Anti-HBeAg小鼠单克隆抗体与3种多肽的反应性判定：根据反应后的读值进行判定。若检测值/本底值大于5，则判定为阳性。

3.2.3 Anti-HBeAg小鼠单克隆抗体的识别性质分析

结果如表2所示。所获得的6株Anti-HBeAg小鼠单克隆抗体的识别类型可分为3组(根据其识别性质)，分别为：sA、sB、sC、sD，其中sA组抗体识别的多肽为S1、S3；sB组抗体识别的多肽为S1、S2；sC组抗体对多肽是S1，sD组抗体对多肽都不识别。

表2:单抗识别情况

分组	单抗名称	单抗亚型	识别的多肽
				sA	4C8	IgG1	S1，S3
sB	9F10-2	IgG2B	S1，S2
				sC	14C12-1	IgG2B	S1
sB	16D9	IgG1	S1，S2
				sC	12D7-2	IgG1	S1
sD	8D1	IgM	－

实施例4：16D9抗体精确识别表位的鉴定

4.1.利用BSA偶联的负10到负1的完全抗原用碳酸缓冲液(20mmol/L CB，pH 9.6)稀释后包被于聚氯乙烯板上，而后利用16D9标记的16D9-HRP进行活性测定，选择OD在0.8-1.5的使用比例。而后将合成的20个不同裸肽(见下图表3、4)利用PBS稀释至50ug/mL，取稀释好的裸肽与稀释好的16D9-HRP 1:1混匀，即为检测样品，对照样品是PBS与稀释好的16D9－HRP 1:1混匀，即为对照样品，而后将检测样品和对照样品加入到BSA偶联的负10到负1的完全抗原包被的聚氯乙烯板上，温育30min，清洗板5次，清洗板5次，加入底物温育15min。酶标仪波长450/620下读值，最后将检测出来的OD值进行计算分析，计算公式为(对照样品OD值－检测样品OD值)/对照样品OD值，判定标准为：大于50％以上显示有竞争效果，大于90％以上显示有良好的竞争效果。结果如图2所示。

表3:不同截短肽合成情况

合成肽编号(peptide ID)	序列信息	序列位置
			HBV156	PTVQASKLCL	负15到负6
HBV145	TVQASKLCLG	负14到负5
			HBV134	VQASKLCLGW	负13到负4
HBV123	QASKLCLGWL	负12到负3
			HBV112	ASKLCLGWLW	负11到负2
HBV1001	SKLCLGWLWG	负10到负1
			HBV91	KLCLGWLWGM	负9到1
HBV82	LCLGWLWGMD	负8到2
			HBV73	CLGWLWGMDI	负7到3
HBV64	LGWLWGMDID	负6到负4

表4:负10到负1的裸肽不同氨基酸丙氨酸突变情况

4.2结果分析：

从图2结果可知，16D9单抗对不同截短的肽负10到负1，负11到负2，负12到负3的竞争效果达到50％以上，且负12到负3裸肽竞争效果达到90％以上，由于该抗体的免疫原为负10到152的完全抗原，说明该单抗的表位识别的位置在负10到负3位之间；其次通过丙氨酸突变的合成肽竞争结果显示，16D9单抗关键的影响位点是负10位与负9位，其次负6位也是有一定的影响。

实施例5：Anti-HBeAg抗体对细胞内Core相关蛋白的反应性评估

5.1真核质粒构建方法：

将HBV基因的HBeAg序列及其N端前负29至负1共222个氨基酸段的序列分别构建到真核表达载体CMV启动子下游，如图3所示，其中C149至C183是HBeAg序列(从+1位置开始)分别从C端进行截短至数字对应的氨基酸位置，pca-C183为-29至183段，pcb-C183为负20至183段，pcc-C183为负10至183段。

5.2真核表达以及western blot评估

将6*10^5数量的293β5细胞铺于6孔板，待12h贴壁后细胞密度达到80-90％左右进行转染，使用lipo3000转染试剂将构建好的真核表达质粒分别转染293β5细胞，并于转染后12h更换培养基(DMEM+10％Gibco FBS)，继续培养48h后弃细胞上清，并用PBS洗涤一次细胞，每孔添加300μL DDM(n-Dodecyl-β-D-maltoside(DDM,麦芽糖苷)细胞裂解液，4℃静置1h裂解，收集裂解液于1.5mlEP管中，12000rpm 4℃离心10min，收集上清至干净的1.5ml EP管中，并对裂解样品进行western blot分析。结果如图4所示。

5.3结果分析

利用体内真核构建的不同长度的抗原评估单抗，显示16D9识别位点为pc183a/b/c。结合表2的结果，显示16D9识别是负10到负1的表位。

实施例6：利用负10到负1的表位单抗与HBeAgN端单抗建立真实的检测HBeAg检测试剂

6.1磁珠包被单抗制备：

磁性微粒子溶液制备，磁性微粒子为表面覆有亲水性聚合物和羧基的磁珠，粒径为1.5～3um；其制备方法为：将磁性微粒子、EDC与NHS的质量比为1:1:1，并加入pH为5.0的50mM MES溶液，使磁性微粒子浓度为4mg/mL，放置在垂直旋转仪上活化，活化环境温度25℃，时间20min；将活化后的磁性微粒子与单克隆抗体比例为每毫克磁性微粒子标记15ug的负10到负1的HBeAg单克隆抗体，放置在垂直旋转仪上标记，反应环境温度25℃，时间3h；将反应后的磁性微粒子用洗液洗涤3次，加入含有甘氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.05％TritonX-100、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，使磁性微粒子浓度为4mg/mL，放置在垂直旋转仪上终止，反应环境温度25℃，时间2h；将终止后的磁性微粒子用洗液洗涤3次，加入含有0.5％(W/V)牛血清白蛋白、0.5％(W/V)酪蛋白、0.05％T(W/V)ritonX-100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，使磁性微粒子浓度为4mg/mL，2-8℃保存备用；

以上方法对负10到负1的6株单抗进行包被。

6.2吖啶酯标记单抗制备：

吖啶酯标记抗体溶液制备，其制备方法为：取14A7单克隆抗体(购自厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，货号：M10532)50ug，加入含NaCl的磷酸盐缓冲液至体积为300μL，再加入5μL吖啶酯母液，振荡混匀，室温避光反应30min；反应后加入200μL含NaCl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液，手工颠倒20次混匀，室温避光反应30min；反应后将产物转移至透析袋中，透析液为pH为7.4的20mM PBS缓冲液，2-8℃避光透析，每隔2h换一次PBS缓冲液，共更换3次，以除去未标记的吖啶酯；将标记物取出，按实际体积加入10％(W/V)牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为0.1％(V/V 1:100)，加入等体积甘油，手工颠倒混匀后，-15℃以下避光保存备用。

6.3实验方法：

6.3.1检测样品与标本：

利用HBV1.3倍体C型的克隆PTSMP-CMV-S11(以下简称S11)样品，和HBV1.3的G1896A突变的PTSMP-CMV-S11-Em(以下简称S11Em)样品(Y.Wu et al./Journal ofVirological Methods 234(2016)96–100)。HBeAg阳性临床血清标本，HBeAg阴性临床血清标本。

6.3.2加样：

取50ul样品或者样本，加入10ul巯基乙醇，混匀后加入50ul磁珠包被单抗，37℃孵育15min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，再加入50ul吖啶酯标记单抗，震荡混匀后37℃孵育10min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，加入预激发液100～200ul，进行预激发。去除预激发液，加入激发液100～200ul，进行激发和检测。

以上述方法正交检测各磁珠包被单抗与吖啶酯标记单抗配对，求P/N(S111.3样品检测值与S11Em样品检测值比值)以及(阳性样本检测值与阴性样本检测值比值)值。最后筛选到16D9单抗包被磁珠与14A7标记吖啶酯配对检测真实HBeAg为最佳配对。

实施例7：高特异性的HBeAg检测试剂系统的建立

由于该试剂的捕获与标记抗体都是线性表位，而HBeAg在负7位与61位都含有半胱氨酸，会形成分子间二硫键，使eag形成双体结构。我们需要添加还原剂打开二硫键，达到较好的检测效果。于是我们对于样本的处理条件进行了各种方案的尝试。抗体配对选择16D9单抗包被磁珠与14A7标记吖啶酯配对进行裂解体系的摸索。

7.1实验方法

7.1.1磁性微粒子溶液制备：磁性微粒子为表面覆有亲水性聚合物和羧基的磁珠，粒径为1.5～3um；其制备方法为：将磁性微粒子、EDC与NHS的质量比为1:1:1，并加入pH为5.0的50mM MES溶液，使磁性微粒子浓度为4mg/mL，放置在垂直旋转仪上活化，活化环境温度25℃，时间20min；将活化后的磁性微粒子与16D9单克隆抗体比例为每毫克磁性微粒子标记15ug的HBeAg单克隆抗体，放置在垂直旋转仪上标记，反应环境温度25℃，时间3h；将反应后的磁性微粒子用洗液洗涤3次，加入含有甘氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.05％TritonX-100、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，使磁性微粒子浓度为4mg/mL，放置在垂直旋转仪上终止，反应环境温度25℃，时间2h；将终止后的磁性微粒子用洗液洗涤3次，加入含有0.5％(W/V)牛血清白蛋白、0.5％(W/V)酪蛋白、0.05％T(W/V)ritonX-100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，使磁性微粒子浓度为4mg/mL，2-8℃保存备用。

7.1.2吖啶酯标记抗体溶液制备，其制备方法为：取待标记14A7单克隆抗体各50ug，加入含NaCl的磷酸盐缓冲液至体积为300μL，再加入5μL吖啶酯母液，振荡混匀，室温避光反应30min；反应后加入200μL含NaCl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液，手工颠倒20次混匀，室温避光反应30min；反应后将产物转移至透析袋中，透析液为pH为7.4的20mM PBS缓冲液，2-8℃避光透析，每隔2h换一次PBS缓冲液，共更换3次，以除去未标记的吖啶酯；将标记物取出，按实际体积加入10％(W/V)牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为0.1％(V/V 1:100)，加入等体积甘油，手工颠倒混匀后，-15℃以下避光保存备用。

7.1.3含不同组分的处理液配制：

表5.A-O含不同组分处理液配制

7.1.4实验样品：利用HBV 1.3倍体C型的克隆S11 1.3样品，和HBV 1.3的G1896A突变的S11Em样品。

7.1.5实验步骤：

7.1.5.1A-N处理：在反应孔中加入50ul对应待测标本和10ul A-N处理液，混匀后加入50ul配制好的磁珠混悬液，孵育15～20min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，加入50ul吖啶酯标记单抗，孵育10～15min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，加入预激发液100～200ul，进行预激发。去除预激发液，加入激发液100～200ul，进行激发和检测。

7.1.5.2 O裂解：在反应孔中每孔加入50ul对应待测标本，加入1ulO的处理液，混匀后加入50ul磁珠包被单抗，37℃孵育15min，混匀后加入50ul磁珠包被单抗，37℃孵育15min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，再加入50ul吖啶酯标记单抗，震荡混匀后37℃孵育10min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，加入预激发液100～200ul，进行预激发。去除预激发液，加入激发液100～200ul，进行激发和检测。

7.1.5.3实验结果

通过以上的不同处理液的比较，最后求P/N(S11 1.3样品检测发光值与S11Em样品检测发光值比值)值。具体见表6。

表6.不同处理液效果评价

7.1.5.4结果分析

结果显示，利用处理液K(0.5mM硫代甘油+8M尿素+50mMTB 8.0)体系，P/N比值最高，效果最好。

实施例8:特异检测HBeAg的酶联免疫检测方法

8.1单抗配对酶免评价

单克隆化抗体16D9用磷酸盐缓冲液(20mmol/LPB，pH7.4)，稀释后包被于聚氯乙烯板上，一株单克隆抗体标记上辣根过氧化物酶(标记单抗为14A7)。准备样品分别是：C149抗原、－10-152抗原(来源引用：CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY,Mar.2010,p.464–469；Nature.1997Mar 6；386(6620):88-91)，分别用稀释液稀释值到1ug/ml和100ng/ml，阳性样本1，阳性样本2，阴性样本1，阴性样本2和20％nbs。准备样本处理液：0.5mM硫代甘油+8M尿素+50mM TB 8.0。

取出50ul样本与10ul的样本处理液混合，而后混匀，最后全部加入到包被好的聚氯乙烯板上，置37°温育40min，清洗板5次加入14A7-HRP(1/500稀释)温育40min，清洗板5次，加入底物温育15min。酶标仪波长450-620下读值。结果如图5所示。

结果分析说明，该试剂可以特异性检测HBeAg，对c149检测不出，对－10-152检测很好。

实施例9：特异检测HBeAg的化学发光检测方法

9.1试剂盒制备

本发明包含的HBV单克隆抗体16D9、14A7(也可以是其他HBeAg非N端的抗体4F2等)的乙型肝炎核心抗原的发光诊断试剂盒的组成和制备如下:

9.1.1磁珠包被单抗制备：

磁性微粒子为表面覆有亲水性聚合物和羧基的磁珠，粒径为1.5～3um；其制备方法为：将磁性微粒子、EDC与NHS的质量比为1:1:1，并加入pH为5.0的50mM MES溶液，使磁性微粒子浓度为4mg/mL，放置在垂直旋转仪上活化，活化环境温度25℃，时间20min；将活化后的磁性微粒子与16D9单克隆抗体比例为每毫克磁性微粒子标记15ug的HBeAg单克隆抗体，放置在垂直旋转仪上标记，反应环境温度25℃，时间3h；将反应后的磁性微粒子用洗液洗涤3次，加入含有甘氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，使磁性微粒子浓度为4mg/mL，放置在垂直旋转仪上终止，反应环境温度25℃，时间2h；将终止后的磁性微粒子用洗液洗涤3次，加入含有0.5％(W/V)牛血清白蛋白、0.5％(W/V)酪蛋白、0.05％T(W/V)ritonX-100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，使磁性微粒子浓度为4mg/mL，2-8℃保存备用。

9.1.2吖啶酯标记单抗制备：

其制备方法为：取待标记14A7单克隆抗体50ug，加入含NaCl的磷酸盐缓冲液至体积为300μL，再加入5μL吖啶酯母液，振荡混匀，室温避光反应30min；反应后加入200μL含NaCl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液，手工颠倒20次混匀，室温避光反应30min；反应后将产物转移至透析袋中，透析液为pH为7.4的20mM PBS缓冲液，2-8℃避光透析，每隔2h换一次PBS缓冲液，共更换3次，以除去未标记的吖啶酯；将标记物取出，按实际体积加入10％(W/V)牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为0.1％(V/V 1:100)，加入等体积甘油，手工颠倒混匀后，-15℃以下避光保存备用。

9.1.3样品处理液制备：

样本处理液：0.5mM硫代甘油+8M尿素+50mM TB 8.0。

9.1.4准备阴/阳性对照样本

9.2试剂盒检测方法：

用于检测乙型肝炎核心抗原的发光诊断试剂盒的检测方法如下：

1、准备：将试剂盒放置室温(18-30℃)下平衡15-30min。

2、配液：将50ml浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。

3、加样：分别在对应孔中加入50ul待测标本。

4、裂解：往标本孔中加入10ul处理液，充分混匀。

5、反应：往处理后的标本孔中加入50ul磁珠包被单抗16D9,混匀后用封板膜封板后置于37±1℃孵育15min；孵育15～20min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，再加入50ul吖啶酯标记抗体14A7，孵育10～15min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，加入预激发液100～200ul，进行预激发。去除预激发液，加入激发液100～200ul，进行激发和检测。

结果判定

临界值：Cut Off(C.O.)＝4872

结果判定：(S＝每孔的发光值)

阴性结果：(S/C.O.<1):标本的发光值小于Cut Off值为阴性，代表该标本中未检测出HBeAg。

阳性结果：(S/C.O.≥1):标本的发光值大于等于Cut Off值为阳性，代表该样本中检出HBeAg。

实施例10：利用建立的HBeAg检测试剂评估不同HBV基因型的HBeAg，以及利用商品化试剂同时检测不同HBV基因型的HBeAg

10.1试剂盒制备

本发明包含的HBV单克隆抗体16D9、14A7(也可以是其他非HBeAg－N端区抗体4F2(购自：武汉奥科博泰生物技术有限公司，货号：A0021)等的乙型肝炎e抗原的发光诊断试剂盒的组成和制备如下:

10.1.1磁珠包被单抗制备：

10.1.2吖啶酯标记单抗制备：

10.1.3样品处理液制备：

配置样本处理液：0.5mM硫代甘油+8M尿素+50mM TB 8.0。

10.1.4准备不同的HBV感染性克隆构建的不同基因型样品。

将HBV A-H型基因序列分别构建在真核表达载体中，将构建好的克隆瞬时转染HepG2细胞或Huh7细胞中，分别收集转染前上清D0，及转染后不同天数的细胞上清D2，D4，D6，D8，D10用于后续HBeAg的检测。

10.2试剂盒检测方法：

用于检测乙型肝炎e抗原的发光诊断试剂盒的检测方法如下：

准备：将试剂盒放置室温(18-30℃)下平衡15-30min。

配液：将50ml浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。

加样：分别在对应孔中加入50ul待测样品。

裂解：往标本孔中加入10ul处理液，充分混匀。

反应：往处理后的标本孔中加入50ul磁珠包被单抗16D9，混匀后用封板膜封板后置于37±1℃孵育15min；孵育15～20min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，再加入50ul吖啶酯标记抗记14A7(或者是其它HBeAg非N端的抗体如4F2等)，孵育10～15min，孵育结束后，用含0.05～0.08％的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，加入预激发液100～200ul，进行预激发。去除预激发液，加入激发液100～200ul，进行激发和检测。结果如图6所示。

结果分析：本发明所涉及的HBeAg检测试剂对HBV不同的基因型的HBeAg都能够有效检出。

实施例11：对比本研究建立的HBeAg检测试剂和已上市的HBeAg发光试剂评估HBV

Dtw1.3基因型以及Dtw1.3-G1896A突变分别瞬时转染肝癌细胞HepG2和Huh7细胞的上清样品，评估本研究所建立的HBeAg检测试剂对e抗原检测的特异性

11.1检测的实验方法如实施例9.2。

11.2检测结果如图7所示。

结果分析：

通过以上的数据评估，由于经过G1896A突变后的D型HBV克隆Dtw的HBeAg表达缺失，已上市的HBeAg发光试剂对于G1986A突变后的样本都还有不同程度的检出，而本发明所研究的特异性的HBeAg检测试剂检测结果均为阴性，进一步说明，本发明所研究的试剂能够特异性检测HBeAg,不受HBcAg的干扰。

实施例12：本研究的HBeAg检测试剂盒的特异性和检测范围灵敏度分析

12.1乙型肝炎e抗原检测试剂盒的特异性分析

12.1.1试剂盒准备

用于检测真实的HBeAg的发光诊断试剂盒制备(发光检测试剂法)如实施例7所述。

12.1.2样本准备

利用乙肝两对半5项全阴的样本。

12.1.3检测标本

收集的427份乙肝两对半5项全阴样本，-20℃冷冻保存。

12.1.4检测项目

对每份血清标本进行本研究的HBeAg化学发光试剂检测。

12.1.5检测结果

完成所有样本检测后统计结果，结果都显示S/C.O.<1，为阴性样本。

12.1.6结果与分析

从结果看，说明本专利公布的HBeAg试剂特异性良好。

12.2乙型肝炎e抗原抗原检测试剂盒的检测范围灵敏度分析

12.2.1试剂盒准备

用于检测HBeAg的发光诊断试剂盒制备(发光检测试剂法)如实施例7方法。

12.2.2检测标本

12.2.2.1.选取1份利用罗氏eAg试剂盒测值到393C0I的血清样本利用20％NBS以2倍为梯度进行线性稀释11个点，利用20％NBS作为阴性对照，按照实施例9所述方法进行检测。

12.2.2.2.将-10-152抗原利用D08稀释至1ug/ml,并以3倍为梯度进行稀释11个点，并利用不含-10-152抗原的20％NBS作为阴性对照，按照实施例9所述方法进行检测。结果如图9所示。

12.2.2.3.结果与分析

16D9/14A7配对对-10-152的抗原检测灵敏度在0.5ng/ml，样本检测灵敏度在0.5COI左右。

实施例13：利用慢性乙肝病人样本进行该研究的HBeAg抗原检测试剂盒与罗氏 HBeAg定值的比较

13.1试剂盒准备

13.1.1用于检测HBeAg的发光诊断试剂盒制备(发光检测试剂法)如实施例7的方法。

13.1.2乙型肝炎病毒HBeAg检测试剂，购自罗氏公司。

13.2检测标本

选取了32份慢性乙型肝炎病毒感染血清标本，-20℃冷冻保存。

13.3检测项目

对每份血清标本进行罗氏乙型肝炎病毒e抗原试剂盒检测。

对每份血清标本进行自制乙型肝炎病毒e抗原化学发光试剂检测。

13.4检测结果

完成所有项目检测后统计结果，比较罗氏e抗原定值与自制乙型肝炎病毒e抗原化学发光试剂检测的相关性。

表7.32份慢性型肝炎病毒感染血清标本检测结果

/>

13.5结果分析：

32份慢性乙肝病人中，对于1896位为G的样本，本发明的HBeAg试剂与Roche检测试剂符合率较好，但是对于1896位为A的样本，本发明的HBeAg试剂检测全部为阴性，而Roche的HBeAg试剂测定都为阳性。

实施例14：本研究发展的新型HBeAg检测试剂在抗乙肝药物筛选评估中的应用

乙肝病毒的共价闭合环状DNA(cccDNA)在HBV病毒生活史中至关重要，清除cccDNA是实现乙肝治愈的最高目标。但现有的抗乙肝药物均不具备直接清除感染者肝细胞内cccDNA的作用。肝内持续长期存在的cccDNA可作为HBV转录、复制、表达的模板，是慢性乙肝患者长期抗病毒治疗停药后仍然可能出现病毒反弹的重要原因。HBV cccDNA检测的“金标准”方法是southern blot杂交，该方法操作繁琐且灵敏度低，难以用于靶向cccDNA的抗乙肝新药的筛选评估。缺乏能实现高通量筛选的cccDNA检测方法是影响慢性乙肝治疗新药发展的重要瓶颈。在整合了CMV启动子或四环素控制型TRE启动子等外源启动子驱动的HBV1.1倍基因组的肝细胞中(如HepAD38细胞，Antimicrob.Agents Chemother.1997,41(8):1715.)，培养上清中的HBeAg水平被证实与细胞内cccDNA的含量高度相关(AntiviralResearch 72(2006)116–124)，因此可作为指示药物处理后胞内cccDNA水平的替代指标。尽管如此，由于现有HBeAg检测方法和试剂存在对HBcAg的交叉反应性，而在HepAD38等模型中HBcAg的表达水平要远高于HBeAg，且已有多项研究表明裸露的HBcAg衣壳能大量分泌到细胞培养上清和感染者血清中(Cellular Microbiology(2011)13(4),602–619；JVirol.2018Nov 27；92(24).)，对现有HBeAg试剂的检测造成较大干扰。

为克服HBcAg对HBeAg精确检测造成的影响，有研究者在HBeAg区别于HBcAg的N端PreC序列中插入HA蛋白标签，通过HA标签抗体来捕获检测HBeAg，进而实现对细胞内cccDNA的准确指示，该方法可以实现高通量筛选针对cccDNA的药物，但是需要对病毒株进行遗传改造，并适用于未经过改造的野生型乙肝病毒序列(D.Cai et al./Antiviral Research132(2016)26－37)。

由于本研究发展的HBeAg检测方法是基于识别HBeAg特有氨基酸序列的单克隆抗体16D9，因此可以用于精确测定HepAD38细胞(及采用类似策略构建的其他HBV细胞模型)培养上清中的HBeAg水平,且不受HBcAg的干扰。本实验通过采用本研究发展的HBeAg化学发光检测方法，对比Roche公司生产的Elecsys HBeAg试剂和Abbott公司生产的ArchitectHBeAg试剂，对抗HBV药物处理后的HepAD38细胞培养上清进行HBeAg定量测定，同时对比细胞内cccDNA水平，评估不同HBeAg检测方法用于抗HBV药物评估的性能。

14.1样本准备

HepAD38细胞(获自重庆医科大学)(四环素Tet调控HBVpgRNA的转录和病毒复制)24孔板每孔2*10⁵个细胞铺板。细胞12h贴壁后更换不同处理条件，条件包括1、+Tet(培养基中持续添加Tet)，2、-Tet(普通培养基，不含Tet)，3、+ETV(培养基中添加1μMEntecavir+,一种核苷类抗HBV抑制剂)。指定时间收集上清并更换新鲜培养基，收集第0天D0，第四天D4，第10天D10及第十四天D14的上清作为检测样本，第14天的细胞裂解用于检测cccDNA。

14.2试剂盒准备

用于检测真实的HBeAg的发光诊断试剂盒制备(发光检测试剂法)如实施例9方法

14.3检测项目

对每份收集的样本进行本研究的HBeAg化学发光试剂检测以及商品化的HBeAg的检测，以及对第14天的细胞样品进行cccDNA荧光定量PCR检测。

14.4检测结果如图9所示。

14.5结果分析

HepAD38细胞是四环素Tet控制的稳定表达HBV 1.1倍基因组的细胞系，在培养基中含有四环素Tet时(+Tet)，整合的HBV 1.1倍基因组5’端的Tet-off启动子无法起始HBVpgRNA的转录，使得HBVDNA的合成受到显著抑制，细胞中HBV cccDNA水平很低或检测不出，培养上清中HBeAg含量很低；撤除四环素后(-Tet)，HBV pgRNA的转录得以快速恢复，cccDNA逐步形成并累积并开始以其为模板表达HBeAg并分泌至细胞培养上清中。

Entecavir(ETV)是目前临床乙肝治疗常用的核苷类似物，能高效抑制乙肝病毒以pgRNA为模板合成HBV DNA的过程，在HepAD38细胞撤除四环素Tet起始pgRNA合成的同时加入ETV，可阻断不同形式的HBV DNA(包括ssDNA、dsDNA、rcDNA和cccDNA)的从头合成，在撤除四环素Tet同时加ETV处理处理14天后，细胞中几乎不能检测到cccDNA(实测细胞内cccDNA水平低于未撤除四环素Tet的对照组)。对比分析三种试剂的从撤除四环素Tet开始的HBeAg动态变化表明，本研究发展的HBeAg试剂的HBeAg检测结果一直处于低水平，而对照ElecsysHBeAg试剂和Architect HBeAg试剂在第14天以前与-Tet对照相比无显著区别，仅在D14略有降低。上述实验结果说明，本研发展的HBeAg试剂在细胞模型中的与胞内cccDNA的符合性更佳，可以用于抗HBV药物效果的体外评价。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司；厦门大学

<120> 一种抗乙型肝炎病毒e抗原的单克隆抗体及其应用

<130> IDC190448

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 16D9重链可变区CDR1

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Glu

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 16D9重链可变区 CDR2

<400> 2

Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 16D9重链可变区 CDR3

<400> 3

Thr Arg Glu Gly Tyr Asp Tyr Leu Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 16D9轻链可变区 CDR1

<400> 4

Gln Ser Val Ser Ile Asp

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 16D9轻链可变区 CDR2

<400> 5

Ser Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 16D9轻链可变区 CDR3

<400> 6

Gln Gln Asp His Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 16D9重链可变区

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val Asn Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Gly Tyr Asp Tyr Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 16D9轻链可变区

<400> 8

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn His Tyr Thr Gly Val Ser Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp His Ser Ser Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 多肽S1

<400> 9

Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 多肽S2

<400> 10

Ser Cys Pro Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 多肽S3

<400> 11

Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp Pro Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 159

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBeAg第负10-149位氨基酸序列

<400> 12

Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp Pro Tyr

1 5 10 15

Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Thr Asp

20 25 30

Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Phe

35 40 45

Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Thr Pro His His Thr Ala

50 55 60

Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr

65 70 75 80

Trp Val Gly Val Asn Leu Gln Asp Gln Ala Ser Arg Asp Gln Val Val

85 90 95

Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp

100 105 110

Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Ile Val Ile Glu Tyr

115 120 125

Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro

130 135 140

Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val

145 150 155

<210> 13

<211> 162

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBeAg第负10-152位氨基酸序列

<400> 13

Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp Pro Tyr

1 5 10 15

Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Thr Asp

20 25 30

Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Phe

35 40 45

Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Thr Pro His His Thr Ala

50 55 60

Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr

65 70 75 80

Trp Val Gly Val Asn Leu Gln Asp Gln Ala Ser Arg Asp Gln Val Val

85 90 95

Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp

100 105 110

Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Ile Val Ile Glu Tyr

115 120 125

Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro

130 135 140

Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg

145 150 155 160

Arg Arg

<210> 14

<211> 193

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBeAg第负10-183位氨基酸序列

<400> 14

Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp Pro Tyr

1 5 10 15

Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Thr Asp

20 25 30

Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Phe

35 40 45

Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Thr Pro His His Thr Ala

50 55 60

Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr

65 70 75 80

Trp Val Gly Val Asn Leu Gln Asp Gln Ala Ser Arg Asp Gln Val Val

85 90 95

Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp

100 105 110

Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Ile Val Ile Glu Tyr

115 120 125

Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro

130 135 140

Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg

145 150 155 160

Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg

165 170 175

Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln

180 185 190

Cys

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBV156

<400> 15

Pro Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBV145

<400> 16

Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBV134

<400> 17

Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBV123

<400> 18

Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBV112

<400> 19

Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp

1 5 10

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBV1001

<400> 20

Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly

1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBV91

<400> 21

Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met

1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBV82

<400> 22

Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp

1 5 10

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBV73

<400> 23

Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile

1 5 10

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBV64

<400> 24

Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBVA1

<400> 25

Ala Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBVA2

<400> 26

Ser Ala Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBVA3

<400> 27

Ser Lys Ala Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBVA4

<400> 28

Ser Lys Leu Ala Leu Gly Trp Leu Trp Gly

1 5 10

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBVA5

<400> 29

Ser Lys Leu Cys Ala Gly Trp Leu Trp Gly

1 5 10

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBVA6

<400> 30

Ser Lys Leu Cys Leu Ala Trp Leu Trp Gly

1 5 10

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBVA7

<400> 31

Ser Lys Leu Cys Leu Gly Ala Leu Trp Gly

1 5 10

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBVA8

<400> 32

Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Ala Trp Gly

1 5 10

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBVA9

<400> 33

Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Ala Gly

1 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> HBVA10

<400> 34

Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Ala

1 5 10

Claims

1.一种与乙型肝炎病毒e抗原特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含：如SEQ ID NO：4的氨基酸序列所示的CDR1、如SEQ ID NO：5的氨基酸序列所示的CDR2和如SEQ ID NO：6的氨基酸序列所示的CDR3，所述重链可变区包含：如SEQ ID NO：1的氨基酸序列所示的CDR1、如SEQ ID NO：2的氨基酸序列所示的CDR2和如SEQ ID NO：3的氨基酸序列所示的CDR3。

2.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：如SEQ ID NO：8的氨基酸序列所示的轻链可变区和如SEQ ID NO：7的氨基酸序列所示的重链可变区。

3.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段是单链抗体，单价抗体，多特异性抗体或嵌合抗体。

4.一种与乙型肝炎病毒e抗原特异性结合的单克隆抗体，其中所述抗体获自CGMCC保藏编号为C2019301的杂交瘤。

5.CGMCC保藏编号为C2019301的杂交瘤细胞株。

6.编码权利要求1-3中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

7.一种包括权利要求6的多核苷酸的载体。

8.一种包括权利要求6的多核苷酸或权利要求7的载体的宿主细胞。

9.非诊断目的的检测乙型肝炎病毒e抗原在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段的步骤。

10.权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测乙型肝炎病毒e抗原在样品中的存在或其水平。

11.非诊断目的的一种用于检测生物样品中乙型肝炎病毒e抗原的方法，该方法包括：

将样品与针对乙型肝炎病毒e抗原不同表位的两种抗体或其抗原结合片段相接触，以及定性或定量检测所述两种抗体与乙型肝炎病毒e抗原的结合，其中结合指示所述样品中乙型肝炎病毒e抗原存在或浓度；

其中一种抗体或其抗原结合片段是权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，另外一种抗体或其抗原结合片段针对乙型肝炎病毒e抗原的非N端表位。

12.权利要求11所述的方法，其中，权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段通过磁珠包被；所述另外一种抗体通过吖啶酯或辣根过氧化物酶标记。

13.权利要求11或12所述的方法，其中，所述另外一种抗体是14A7抗HBeAg单克隆抗体或4F2抗HBeAg单克隆抗体。

14.用于检测乙型肝炎病毒e抗原在样品中的存在或其水平的试剂盒，其包含磁珠包被的权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和吖啶酯或辣根过氧化物酶标记的针对乙型肝炎病毒e抗原的非N端表位的另外一种抗体或其抗原结合片段。

15.权利要求14所述的试剂盒，其中，所述另外一种抗体是14A7抗HBeAg单克隆抗体或4F2抗HBeAg单克隆抗体。

16.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其还包括处理液体系，所述处理液包含0.5mM硫代甘油，8M尿素和50mM Tris-HCl缓冲液。

17.权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于筛选针对cccDNA的抗乙肝病毒药物。