CN113444168A - 一种抗hpv 35抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，特别是涉及一种抗HPV 35抗体及其制备方法和用途，所述抗HPV 35抗体具有如下技术特征：<1>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的CDR‑H1；<2>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR‑H2；<3>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR‑H3；<4>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR‑L1；<5>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR‑L2；<6>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR‑L3。所述抗HPV 35抗体与其它16种亚型HPV无交叉反应，检测灵敏度高。

Description

一种抗HPV 35抗体及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，特别是涉及一种抗HPV 35抗体及其制备方法和用途。
背景技术
宫颈癌和宫颈癌前病变是全世界妇女健康的一个主要问题。临床学、分子生物学和流行病学调查已经证明人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宫颈癌和宫颈非典型增生的主要病因。目前HPV已经发现200多种亚型，根据致病性不同分为高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45等；低危型包括HPV6、11等。HPV为无包膜的环状双链DNA病毒，其衣壳是由72个主要衣壳蛋白Ll蛋白五聚体构成的二十面体结构，1个病毒粒子上含有360个Ll蛋白单体。目前中国批准上市的宫颈癌疫苗有3种，包括：葛兰素史克(GSK)公司的HPV 2价疫苗Cervarix(亚型为HPV 16、18)，默沙东公司HPV4价疫苗
Figure BDA0003128547000000011
Figure BDA0003128547000000012
和9价疫苗
Figure BDA0003128547000000013
9(亚型为HPV 6、11、16、18、31、33、45、52、58)。世界卫生组织国际癌症研究署已明确的13种能够导致宫颈癌和高度痛前宫颈上皮内病变的HR-HPV包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68。其中仅HPV68在IARC致痛物分级中属于2A级，其余12种均属于I类致癌物。由于目前市售疫苗最多为9个亚型，因此越来越多的公司也在不断研发更多价型(如包括HPV 35)的HPV疫苗。根据世界卫生组织(WHO)对HPV疫苗质量、安全性及有效性指导原则，以及国家食品药品监督管理局(CFDA)的相关规定，在多价HPV疫苗的研制和生产过程中，需要建立鉴别试验、抗原含量、吸附完全性和体外相对效力测定的方法，这些方法均可采用酶联免疫法(ELISA)，因此ELISA法中单克隆抗体具有型别特别性以及较高中和活性对于HPV疫苗的质量控制来说至关重要。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗HPV 35抗体及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抗HPV 35抗体，所述抗HPV 35抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗HPV 35抗体具有如下技术特征中的一个或多个；
<1>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；
<2>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；
<3>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；
<4>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1；
<5>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2；
<6>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述抗HPV 35抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。
本发明还提供一种核酸构建体，含有所述的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有所述的核酸构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
本发明还提供所述的抗HPV 35抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗HPV35抗体的条件下，培养所述的抗体的表达系统，从而表达出所述抗HPV 35抗体，分离出所述抗HPV 35抗体。
本发明另一方面提供一种用于检测HPV 35抗原的试剂盒，包含所述抗HPV 35抗体或其免疫偶联物。
本发明另一方面提供所述抗HPV 35抗体、所述试剂盒在药物筛选、药物质控或制备诊断或治疗药物中的用途。
如上所述，本发明的抗HPV 35抗体及其制备方法和用途，具有以下有益效果：本发明的人乳头瘤病毒35型(HPV 35)特异性的单克隆抗体与其它16种亚型HPV无交叉反应，用于HPV疫苗的鉴别试验具有高特异性的优点，具有中和抗体活性，可以准确检测HPV多价疫苗中HPV 35型有中和活性的抗原含量和吸附完全性，具有检测灵敏度高的优点，HPV疫苗质量控制方面将会得到广泛应用。
附图说明
图1显示为本发明的HPV35L1中和活性检验中假病毒对照图。
图2-1显示为本发明的免疫印迹法测定HPV 35单抗图。
图2-2显示为本发明的免疫印迹法测定HPV 35单抗图。
图3-1显示为测定HPV 35体外相对效力筛选单克隆抗体。
图3-2显示为测定HPV 35体外相对效力筛选单克隆抗体。
图3-3显示为测定HPV 35体外相对效力筛选单克隆抗体。
图4显示为HPV 35抗原体外相对效力测定图。
具体实施方式
本发明提供一种抗HPV 35抗体，所述抗HPV 35抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗HPV 35抗体具有如下技术特征中的一个或多个；
<1>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；
<2>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；
<3>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；
<4>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1；
<5>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2；
<6>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
所述抗HPV 35抗体识别人乳头瘤病毒35型L1蛋白。所述抗HPV 35抗体能够中和HPV35型病毒。
CDR(互补决定区，complementarity determining region)通常指抗体中在空间结构上可以与抗原决定簇形成互补的区域。抗体中的可变性通常并不均匀地分布在整个抗体的可变区中，单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区通常均具有3个超变区(hypervariable region，HVR)，这些区域在空间结构上通常可以与抗原决定簇形成互补，所以超变区也被称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，即重链可变区通常包括三个互补决定区，即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区通常包括三个互补决定区，即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在本发明某些实施方式中，所述抗HPV 35抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3。
在本发明某些实施方式中，所述抗HPV 35抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
在本发明某些实施方式中，重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3，轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
所述抗HPV 35抗体为抗体片段，和/或单克隆抗体。进一步的，所述单克隆抗体为IgG2抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。例如，抗体片段包括单链抗体(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')或F(ab')2。
在本发明某些实施方式中，所述抗HPV 35抗体为单链抗体(single chain Fv,scFv)。单链抗体通常可以为包括抗体的VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)的多肽链。通常来说，单链抗体还可以包括连接肽(linker)，连接肽通常位于VH和VL之间，以使scFv形成能与抗原结合的期望结构。例如，所述抗HPV 35抗体可以包括VH和VL，VH和VL之间可以设有连接肽，所述单链抗HPV 35抗体自N端至C端可以依次包括VL、连接肽和VH，所述抗HPV 35单链抗体自N端至C端也可以依次包括VH、连接肽和VL。所述连接肽可以是本领域中各种适用于形成scFv的连接肽，例如，所述连接肽可以是G4S3 linker，所述G4S3 linker的选择或设计可以参考文献Michel Sadelain etc，Science Translational Medicine，2013；Carl H.Juneetc,Science Translational Medicine,2015。
“Fab”片段包括轻链的可变区和恒定区，重链的可变区和第一恒定区(CH1)。一个F(ab’)抗体片段包括一对Fab片段，它们通常通过它们之间的铰链半胱氨酸在羧基末端附近共价连接。
在本发明某些实施方式中，所述抗HPV 35抗体为单克隆抗体，所述单克隆抗体包括恒定区，恒定区可以为天然序列恒定区(例如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即构成该群体的各种抗体是相同的，除了通常以极少量存在的可能的天然存在的突变体。单克隆抗体具有高度特异性，即针对抗原上的单个表位。此外，不同于包含针对不同决定区(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定区。除了它们的特异性外，单克隆抗体的一个优点是，它们现在可以在合成时不受其他抗体的污染。修饰词“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的性质，不应解释为需要任何特定的方法来产生抗体。
本文中的单克隆抗体明确地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的相应序列相同或同源，剩余部分与衍生自另一特定物种或属于另一特定抗体类型或亚型的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。
在本发明某些实施方式中，所述抗HPV 35抗体从杂交瘤细胞株筛选得到，其重链可变区和轻链可变区核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，重链可变区和轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。
在本发明某些实施方式中，重链可变区和轻链可变区中还可以包括框架区，所述框架区可以位于互补决定区之间，也可以位于互补决定区的两端。在本发明某些具体实施方式中，所述框架区的序列为人源单抗可变区，或为鼠源单抗可变区的框架区序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的框架区序列，该框架区序列与人源单抗可变区序列的框架区序列可以具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。
本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述抗HPV 35抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。
本发明还提供一种核酸构建体，含有所述的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有所述的核酸构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
本发明还提供所述的抗HPV 35抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗HPV35抗体的条件下，培养所述的抗体的表达系统，从而表达出所述抗HPV 35抗体，纯化分离出所述抗HPV 35抗体。
本发明另一方面提供一种用于检测HPV 35抗原的试剂盒，包含所述抗HPV 35抗体或其免疫偶联物。
所述试剂盒通常以HPV 35抗原作为靶标进行检测。所述试剂盒还可以包括抗HPV35抗体的标记物，所述抗HPV 35抗体的标记物通常可以用于标记抗HPV 35抗体，可选用的标记物的种类包括但不限于荧光标记物、放射性标记物、酶标标记物、化学发光性标记物等中的一种或多种的组合。根据试剂盒的检测原理，所述试剂盒通常还可包含检测所需的一种或多种试剂。此外，所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
在一种实施方式中，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。
在一种实施方式中，所述试剂盒为双抗夹心酶联免疫试剂盒。在一种实施方式中，所述双抗夹心酶联免疫试剂盒中包被抗体为兔单克隆抗体，一抗为鼠单克隆抗体。
本发明另一方面提供所述抗HPV 35抗体、所述试剂盒在药物筛选、药物质控或制备诊断或治疗药物中的用途。
所述药物可以是以HPV 35抗原为作用靶标，结合或作用于所述HPV 35抗原，从而治疗和/或预防适应症的药物。
在本发明某些实施方式中，所述药物筛选、药物质控中的药物可以是肿瘤治疗药物、肿瘤诊断药物或肿瘤预防药物。所述肿瘤诊断、治疗或预防药物可以是以肿瘤细胞表面功能性表面的HPV 35抗原为靶标，结合或作用于HPV 35抗原，从而诊断、治疗和/或预防肿瘤的药物。所述肿瘤可以是宫颈癌或宫颈癌前病变等HPV 35表达阳性的肿瘤。
在本发明某些实施方式中，所述肿瘤预防药物为疫苗
所述药物筛选为体外筛选。
所述药物质控例如为药物的体外药效测定。
本发明还提供所述抗HPV 35抗体或所述试剂盒在检测HPV 35抗原含量中的用途。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明实施例使用的抗HPV 35抗体是委托第三方公司从杂交瘤细胞株产生的。
实施例1、免疫印迹法检测抗HPV 35抗体
实验步骤如下：配制10％凝胶，分别取300μl HPV 35L1原液加60μl 6×上样缓冲液混匀，100℃水浴煮沸5分钟，10000转/分离心5分钟，上样，浓缩胶电压100V，分离胶电压120V。SDS-PAGE湿法转膜条件：100V，90min；5％奶粉封闭过夜；细胞上清作为一抗(编号分别为1－18)，按1：20稀释，孵育温度为室温，时间为20h。羊抗小鼠HRP(BIO-RAD批号L1706516)按1:1000稀释作为二抗，室温孵育3小时；显色：DAB显色，并用水终止。
如图2-1和2-2所示，结果表明：识别HPV35L1的18株单克隆抗体中，编号为1、10、14共3株单克隆抗体为线性表位，其它15株单克隆抗体为空间表位。
实施例2、抗体的亚型之间的交叉特异性鉴定
HPV亚型种类多达200种以上，因为生产HPV多价疫苗时需要对各亚型进行鉴别试验，这样各亚型抗原含量检验时不存在相互交叉的反应以保证每个亚型抗原含量检验结果的准确性。本实验对于HPV17种亚型进行鉴定，确定此单克隆抗体对HPV 35为阳性，而对于其它16种亚型均为阴性。
实验步骤：
包被：用碳酸盐包被液按稀释倍数稀释纯化兔抗HPV6L1、11L1、16L1、18L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1、35L1、39L1、51L1、53L1、56L1、66L1、68L1，100μl/孔加入酶标板，2～8℃放置过夜。
封闭：300μl/孔洗涤液洗板5次，每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶粉-PBS)，置37℃封闭2小时。
加样：300μl/孔洗涤液洗板5次；各亚型原液稀释至40μg/ml；100μl/孔加样；37℃温育1小时。
加一抗：300μl/孔洗涤液洗板5次。细胞上清分别用稀释液按1:100稀释后，100μl/孔分别加入酶标板37℃孵育1小时。
加酶标抗：300μl/孔洗涤液洗板5次。用稀释液5000倍稀释HRP-山羊抗小鼠lgG，100μl/孔加入酶标抗，37℃孵育1小时。
显色：300μl/孔洗涤液洗板5次，100μl/孔加入新鲜配制的显色液，37℃避光保温10min。
终止读数：将终止液以50μl/孔加至板内，稍振荡混匀后，用酶标仪读数，测定波长450nm，参比波长620nm。结果如表1和表2所示。
表1
Figure BDA0003128547000000071
Figure BDA0003128547000000081
表2
HPV亚型 51L1 56L1 66L1 59L1 空白 35L1 53L1 68L1
编号 1 2 3 4 5 6 7 8
11 0.047 0.034 0.040 0.037 0.052 2.923 0.011 0.012
15 0.044 0.032 0.037 0.031 0.056 2.873 0.011 0.012
7 0.041 0.030 0.038 0.037 0.049 2.955 0.010 0.011
6 0.040 0.030 0.035 0.035 0.051 2.778 0.011 0.011
12 0.040 0.029 0.037 0.038 0.052 1.961 0.013 0.011
13 0.041 0.034 0.046 0.041 0.051 2.940 0.010 0.011
3 0.046 0.029 0.043 0.037 0.056 2.876 0.011 0.011
16 0.045 0.034 0.042 0.039 0.059 2.757 0.013 0.015
18 0.039 0.030 0.042 0.036 0.058 2.892 0.011 0.011
1 0.038 0.027 0.036 0.033 0.053 2.378 0.010 0.011
5 0.041 0.027 0.036 0.032 0.051 1.352 0.012 0.012
4 0.039 0.028 0.042 0.035 0.051 2.912 0.011 0.013
9 0.040 0.030 0.042 0.035 0.054 2.949 0.011 0.012
17 0.041 0.031 0.037 0.036 0.053 2.068 0.013 0.012
14 0.041 0.030 0.036 0.035 0.053 1.724 0.012 0.010
2 0.044 0.032 0.040 0.036 0.058 1.438 0.010 0.011
结果表明：16株单克隆抗体，除去抗体编号为1、5、15的细胞上清与其它16种亚型存在交叉，其他13株单克隆抗体均与其它16种亚型无交叉。
实施例3、抗体的亚型鉴定
包被：用磷酸盐包被液按5μg/孔稀释HPV35L1原液，100μl/孔加入酶标板，2～8℃放置过夜。
封闭：300μl/孔洗涤液洗板5次，每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶粉-PBS)，置37℃封闭2小时。
加样：300μl/孔洗涤液洗板5次，HPV35L1细胞上清编号:11、15、7、6、12、13、3、16、18、4、9、17、14、2；分别按1:10和1:100稀释。100μl/孔加样；37℃温育1小时。
加酶标抗：300μl/孔洗涤液洗板5次。用稀释液5000倍稀释HRP-山羊抗小鼠lgG，100μl/孔加入酶标抗；用稀释液2000倍稀释Goat anti-mouse-lgG1-HRP、Goat anti-mouse-lgG2a-HRP、Goat anti-mouse-lgG2b-HRP，100μl/孔加入酶标抗，37℃孵育1小时。
显色：300μl/孔洗涤液洗板5次，100μl/孔加入新鲜配制的显色液，37℃避光保温10min。
终止读数：将终止液以50μl/孔加至板内，稍振荡混匀后，用酶标仪读数，测定波长450nm，参比波长620nm。
结果表明：HPV35L1的14株单克隆抗体中编号11、7、13、3、18、4、9、17、2共9株较偏重于lgG2a；其余5株单克隆抗体较偏重于lgG1。
实施例4、抗体的中和活性检测
通过假病毒中和法检测各株单克隆抗体的中和抗体效价。
细胞铺板：将293FT细胞按1.5×104/well的密度预铺于96孔细胞培养板中，每孔体积为100μl，37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁。将各株抗体分别用完全培养基进行连续倍比稀释适当稀释倍数。
中和：在60μl血清稀释液中加入60μl假病毒稀释液，混匀后置于25±2℃恒温培养箱中孵育60±2分钟。
加样：准确吸取血清-假病毒混合液100μl，缓慢小心加入96孔预铺的细胞板中。
培养：于37℃，5％CO2培养箱中培养68～76小时后用倒置荧光显微镜观察结果。中和假病毒对照荧光数50％的最大稀释倍数即为中和抗体效价。
表3细胞上清液中和抗体效价
编号 中和抗体效价
11 2560
7 40
6 1280
12 320
13 40
3 640
16 160
18 320
4 1280
14 <40
如图1和表3所示，结果表明：HPV35L1的10株单克隆抗体中，中和滴度结果大小顺序为：编号11>6＝4>3>18＝12>16>7＝13。
实施例5、HPV 35体外相对效力测定单克隆抗体的筛选
包被：用包被液按一定稀释倍数适当稀释HPV35L1兔抗，100μl/孔加入酶标板，4℃放置过夜或37±2℃2小时。
封闭：300μl/孔洗涤液洗板6次，每孔加入200μl封闭液，置37±2℃封闭2小时。
样品、参考品处理及加样：300μl/孔洗涤液洗板6次。重组人乳头瘤病毒35L1原液、参考品用稀释液预稀释适当倍数后，按2倍或适当倍数递增稀释9～11个稀释度，100μl/孔加入酶标板，每个稀释度供试品溶液测定双复孔，37±2℃孵育1小时。
加一抗：300μl/孔洗涤液洗板6次。重组人乳头瘤病毒6L1原液测定：用稀释液按适当稀释倍数稀释HPV35单抗，100μl/孔加入酶标板，37±2℃孵育1小时。
加酶标二抗：300μl/孔洗涤液洗板6次。用稀释液适当倍数稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，100μl/孔加入酶标板，37±2℃孵育1小时。
显色：300μl/孔洗涤液洗板6次，100μl/孔加入新鲜配制的显色液，37±2℃显色5～20分钟。
终止读数：将终止液以50μl/孔加至板内，稍振荡混匀后，用酶标仪读数，测定波长为450nm，参比波长620nm。
数据分析：使用软件SoftMax Pro软件分析，选择四参数拟合(4-parameter)浓度为X轴，吸光度值做Y轴拟合曲线，拟合方程为Y＝(A-D)/(1+(X/C)∧B)+D，C值即为供试品EC50。
表4单克隆抗体的EC50值汇总表(单位：μg/ml)
编号 HPV 35-1 编号 HPV 35-2 编号 HPV 35-3
1 1.88 7 0.69 13 1.07
2 5.21 8 2.72 14 9.51
3 1.56 9 2.38 15 0.573
4 2.19 10 6.5 16 1.48
5 0.878 11 0.251 17 3.65
6 0.922 12 0.414 18 1.71
如表4(表4中35-1、35-2、35-3代表3块不同的酶标板号，每块酶标板上做6个单克隆抗体)、图4和图3-1至3-3所示，结果表明：HPV35L1的18株单克隆抗体中，编号为11、12、15、7单克隆抗体的EC50值较低，适合用于抗原的体外相对效力测定。
综合以上所有实验，选择编号为11的单克隆抗体应用于体外相对效力测定试剂盒。
实施例6、HPV 35编号为11单克隆抗体的序列测定
HPV 35编号为11单克隆抗体记为代号：35H11，细胞培养后分别提取mRNA进行可变区序列测定(送检至第三方公司检测)，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。序列见序列表。
抗HPV 35抗体的体外重组表达、纯化、亲和力测定等均可以采用现有技术中的实验步骤进行。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海博唯生物科技有限公司
<120> 一种抗HPV 35抗体及其制备方法和用途
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Arg Cys Arg Tyr Tyr Gly Asn Asn Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Asn Ile His Asn Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asn Ala Lys
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 737
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caggtccaac tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactatt gtactgggtg aagcagaggc 120
ctggacaagg ccttgagtgg attggagaga ttaatcctag caatggtggt actaacttca 180
atgagaagtt caagagcaag gccacactga ctgtagacaa atcctccagc acagcataca 240
tgcaactcag cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtaca agatgccgtt 300
actacggtaa taattacaac tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg 360
tctcctcaca ggtccaactg cagcagtctg gggctgaact ggtgaagcct ggggcttcag 420
tgaagttgtc ctgcaaggct tctggctaca ccttcaccag ctactatatg tactgggtga 480
agcagaggcc tggacaaggc cttgagtgga ttggagagat taatcctagc aatggtggta 540
ctaacttcaa tgagaagttc aagagcaagg ccacactgac tgtagacaaa tcctccagca 600
cagcatacat gcaactcagc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat tactgtacaa 660
gatgccgtta ctacggtaat aattacaact atgctatgga ctactggggt caaggaacct 720
cagtcaccgt ctcctca 737
<210> 8
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa agacatccag atgactcagt ctccagcctc cctatctgca 360
tctgtgggag aaactgtcac catcacatgt cgagcaagtg ggaatattca caattattta 420
gcatggtatc agcagaaaca gggaaaatct cctcagctcc tggtctataa tgcaaaaacc 480
ttagcagatg gtgtgccatc aaggttcagt ggcagtggat caggaacaca atattctctc 540
aagatcaaca gcctgcagcc tgaagatttt gggagttatt actgtcaaca tttttggagt 600
actccgctca cgttcggtgc tgggaccaag ctggagctga aa 642
<210> 9
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Cys Arg Tyr Tyr Gly Asn Asn Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln
115 120 125
Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser
130 135 140
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met Tyr Trp Val
145 150 155 160
Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro
165 170 175
Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser
195 200 205
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Tyr
210 215 220
Tyr Gly Asn Asn Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Asp Ile Gln Met Thr
100 105 110
Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile
115 120 125
Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
130 135 140
Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr
145 150 155 160
Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
165 170 175
Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser
180 185 190
Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly
195 200 205
Thr Lys Leu Glu Leu Lys
210

Claims (12)

1.一种抗HPV 35抗体，所述抗HPV 35抗体包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述抗HPV 35抗体具有如下技术特征中的一个或多个；
<1>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1；
<2>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2；
<3>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；
<4>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1；
<5>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2；
<6>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的一种抗HPV 35抗体，其特征在于，所述抗HPV 35抗体的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；
和/或，所述抗HPV 35抗体的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-L3。
3.根据权利要求1所述的一种抗HPV 35抗体，其特征在于，所述抗HPV 35抗体的重链可变区的氨基酸序列包括：
a)如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；或
b)与SEQ ID No.9所示的氨基酸序列具有80％以上同源性、且具有a)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列；
和/或所述抗HPV 35抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括
c)如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；或
d)与SEQ ID No.10所示的氨基酸序列具有80％以上同源性、且具有a)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种抗HPV 35抗体，其特征在于，所述抗HPV 35抗体为单链抗体，和/或单克隆抗体。
5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，编码如权利要求1-4任一所述的抗HPV 35抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。
6.一种核酸构建体，其特征在于，含有如权利要求5所述的分离的多核苷酸。
7.一种抗体的表达系统，其特征在于，所述表达系统含有如权利要求6所述的核酸构建体或基因组中整合有外源的如权利要求5所述的多核苷酸。
8.如权利要求1-4任一所述的抗HPV 35抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在适合表达所述抗HPV 35抗体的条件下，培养如权利要求7所述的抗体的表达系统，从而表达出所述抗HPV 35抗体，分离出所述抗HPV 35抗体。
9.一种用于检测HPV 35抗原的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-4任一所述的抗HPV 35抗体和/或其免疫偶联物。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。
11.如权利要求1-4任一所述的抗HPV 35抗体、如权利要求9所述的试剂盒在肿瘤诊断、治疗、预防药物筛选或质控中的用途，或在制备诊断或治疗药物中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌或宫颈癌前病变。
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