CN105153302A - 一种抗hpv6l1蛋白的抗体、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种特异性结合人乳头瘤病毒低危亚型——6型L1蛋白和/或VLP的抗体或抗原结合部分，包含有SEQ？ID？NO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和SEQ？ID？NO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。本发明提供的特异性结合HPV6L1蛋白和/或VLP的抗体或抗原结合部分与其他大部分HPV亚型，如HPV11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别无交叉反应，特异性高，具有中和HPV6假病毒并阻断其感染的特性，且亲和性高。利用两株抗体建立的双抗夹心ELISA检测试剂盒，可用于检测HPV6L1蛋白的存在或水平，且该抗体也可用于针对患者的治疗和对易感人群进行被动免疫，具有良好的应用前景。

Description

一种抗HPV6L1蛋白的抗体、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，更具体地，本发明涉及一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV6L1蛋白的抗体、制备方法及其在制备体外检测试剂盒中的应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)是一组无包膜的小DNA病毒，感染人皮肤及粘膜上皮组织，可诱发产生疣状增生乃至引发良性或恶性肿瘤。根据感染后诱发病变的良恶性不同分为高危型HPV和低危型HPV。高危型HPV感染与宫颈癌及癌前病变的发生密切相关，此外还与粘膜相关的癌及癌前病变的发生相关。高危型HPV感染相关的恶性病变中以妇女宫颈癌的发病率最高，全球范围内的发病率仅次于乳腺癌，高居妇科恶性肿瘤的第二位。低危型HPV主要引起皮肤黏膜的疣状增生，表现为尖锐湿疣、扁平疣等良性病变。流行病学调查及临床研究表明，生殖器尖锐湿疣组织中以HPV6和HPV11型检出率最高，约占低危型别的70％以上。预防HPV感染最有效的方法是接种HPV疫苗，目前已上市的HPV疫苗，包括Merck公司的四价疫苗“Gardasil”和九价疫苗“Gardasil9”，以及GSK公司的双价疫苗“Cervarix”，这三种疫苗都包含HPV6型的疫苗成分，HPV疫苗能够刺激机体产生保护性中和抗体，在有效的预防HPV感染及宫颈癌中具有重要意义。

研究发现，具有中和能力的单抗基本都识别构象表位，并且大多数识别型特异性构象表位的单克隆抗体都具有中和能力。不同中和单抗通过封闭病毒与细胞第二受体的结合位点，可阻止病毒感染入胞的发生，对这些单抗结合表位的研究有利于解释病毒感染入胞的关键位点。目前多数认为，在动物的HPV感染中，血清IgG(主要是中和IgG)能以足够高的浓度穿过宫颈上皮，特别是在鳞状、柱状上皮结合处，从而与病毒颗粒结合并阻止感染发生。对疫苗诱发产生的中和抗体活性的测定是检测预防性疫苗免疫保护性的重要标准。中和活性抗体在HPV疫苗的免疫原性检测和含量测定中具有重要的应用前景。

由于目前还未出现针对HPV6的更有效的特异性抗体，因此寻找这样一种抗体，并将其应用于HPV6感染的诊断、检测中十分必要。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明的一个方面是提供一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗体，其特征在于，包含有SEQIDNO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和SEQIDNO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。

本发明的另一个方面是提供一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗体，包含有如SEQIDNO.13所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQIDNO.14所示的轻链可变区氨基酸序列。

本发明所述抗体均为单克隆抗体。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体是由保藏编号为CGMCCNO.10957的细胞产生的单克隆抗体。所述细胞是由免疫后的宿主脾细胞和骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，其被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.10957，保藏日期为2015年7月6日。

本发明中所述抗体为型别特异性抗体，仅能特异性的结合HPV6L1蛋白和/或VLP，而对其他大部分的HPV型别均无反应，如HPV11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别。

在本发明中，所述抗体具有中和活性，可阻断HPV6型假病毒感染293FT细胞，具有中和假病毒的作用。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体是单价或二价抗体。

在本发明中，可以采用Kohler等在Nature256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备所述单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。在本发明中，所述免疫原是汉逊酵母细胞表达产生的经过层析纯化后得到的HPV6L1蛋白和/或该HPV6L1蛋白在体外自动组装形成的病毒样颗粒(VLP)。其抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.21所示。

免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。佐剂可以利用弗氏佐剂(弗氏完全性佐剂或者弗氏不完全性佐剂)或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内会产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂(如PEG4000)将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice，pp.59-103，AcademicPress，1996)。

将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养基敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21和MC-11小鼠肿瘤衍生株(THESalkInstituteCellDistributionCenter，SanDiego，Calif.USA)，以及SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(AmericanTypeCμltureCollection，Rockville，Md.USA)。另外，还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor，J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeuretal.，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)。

杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可以使用下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性：免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。

在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice，pp.59-103，AcademicPress，1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。

利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来，进而得到所述单克隆抗体。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述得到的单克隆抗体为5H3。

本发明的另一个方面是提供了一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗原结合部分，包含有SEQIDNO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和SEQIDNO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。

其中，所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、dAb、互补决定区片段、单链抗体，人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

所述特异性结合HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗原结合部分可使用本领域技术人员公知的方法获得，如利用化学试剂处理的方法，或利用蛋白酶消化的方法，如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等。

本发明的另一个方面是提供了一种保藏编号为CGMCCNO.10956的杂交瘤细胞，其被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2015年7月6日。

本发明的另一个方面是提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的特异性结合人乳头瘤病毒HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗体或其抗原结合部分。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒中还包含与HPV6的L1蛋白和/或VLP特异性结合的第二抗体。

在上述试剂盒中，所述第二抗体可以为有技术中已知的任意抗HPV6L1蛋白和/或VLP的抗体，从而利用双夹心法对样品进行检测。

作为优选，所述第二抗体包含有SEQIDNO.7-9所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和SEQIDNO.10-12所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。

作为优选，所述第二抗体包含有如SEQIDNO.17所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQIDNO.18所示的轻链可变区氨基酸序列。

作为优选，所述第二抗体包含有如SEQIDNO.19所示的重链可变区核苷酸序列和如SEQIDNO.20所示的轻链可变区核苷酸序列。

更优选地，所述第二抗体是由保藏编号为CGMCCNO.10956的细胞产生的单克隆抗体。

更优选地，所述第二抗体为4F8。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述第二抗体采用与本发明所述特异性结合人乳头瘤病毒HPV6的抗体相同的方法制备。

本发明的另一个方面还提供了上述试剂盒在检测样品中HPV6的和/或VLP存在或者水平中的用途。

本发明的有益效果：

本发明提供的特异性结合人乳头瘤病毒HPV6L1蛋白和/或VLP的抗体或抗原结合部分与大部分的HPV其他亚型，如HPV11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别无交叉反应，特异性高，具有中和HPV6假病毒并阻断其感染的特性，且亲和性高。可用于检测样品中HPV6L1蛋白和/或VLP的存在或水平试剂盒的研发，以及针对患者的治疗和对易感人群进行被动免疫，具有良好的应用前景。

生物保藏信息：

保藏编号：CGMCCNO.10957

保藏日期：2015年7月6日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

分类命名：杂交瘤细胞株

保藏编号：CGMCCNO.10956

保藏日期：2015年7月6日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

分类命名：杂交瘤细胞株

附图说明

图1为本发明实施例1(1)中制备的抗原HPV6L1-VLP的电镜观察结果。序列说明

SEQIDNO.1-3为本发明抗体或抗原结合部分的重链可变区CDR1-3的氨基酸序列；

SEQIDNO.4-6为本发明抗体或抗原结合部分的轻链可变区CDR1-3的氨基酸序列；

SEQIDNO.7-9为本发明第二抗体的轻链可变区CDR1-3的氨基酸序列；

SEQIDNO.10-12为本发明第二抗体的轻链可变区CDR1-3的氨基酸序列；

SEQIDNO.13为本发明抗体的重链可变区氨基酸序列；

SEQIDNO.14为本发明抗体的轻链可变区氨基酸序列；

SEQIDNO.15为本发明抗体的重链可变区核苷酸序列；

SEQIDNO.16为本发明抗体的轻链可变区核苷酸序列；

SEQIDNO.17为本发明第二抗体的重链可变区氨基酸序列；

SEQIDNO.18为本发明第二抗体的轻链可变区氨基酸序列；

SEQIDNO.19为本发明第二抗体的重链可变区核苷酸序列；

SEQIDNO.20为本发明第二抗体的轻链可变区核苷酸序列；

SEQIDNO.21为抗原HPV6L1蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明公开了一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV6L1蛋白的抗体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本发明中使用的术语“抗体”，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)组成。重链恒定区由3个结构域(C_H1、C_H2和C_H3)组成。各轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。V_H和V_L区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(V_H和V_L)分别形成抗体结合部位。。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

本发明中使用的术语“抗原结合部分”，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合片段”。通常参见，FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，RavenPress,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fd、Fv等。

其中，术语“Fab片段”意指由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab′)₂片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fd片段”意指由V_H和C_H1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的抗体片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

本发明中使用的术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P4,816,567)。

本发明中使用的术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。

本发明中使用的术语“中和抗体”是指，能清楚或显著降低目标病毒或假病毒的毒力的抗体或抗体片段。

本发明中使用的术语“表位”是指，抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位，可以是线性的表位，也可以是构象的表位。

本发明中使用的“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用。

本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示，例如：丙氨酸可用A或Ala表示。

本发明中，术语“佐剂”是指，非特异性免疫增强剂，与抗原混合后可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型，包括但不限于铝佐剂如氢氧化铝，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂等。

本发明中：术语“HPVVLP”是指，有体外表达的HPVL1蛋白组装而成的病毒样颗粒，如HPV6L1-VLP就是指，体外表达的HPV6L1蛋白组装而成的病毒样颗粒。

本发明中，术语“HPV假病毒”是指，利用HPVVLP非特异性的包裹核酸的特性，通过在细胞内表达HPVL1和L2蛋白，且包裹细胞内游离的病毒DNA或外源导入的报告质粒，从而形成的HPV假病毒，常规用于HPV疫苗体外中和效果的评价。本发明中所用的假病毒为HPV6型假病毒。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实验材料与仪器：

1.主要试剂、试剂盒及耗材

弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)及PEG4000购于Sigma公司。

DMEM培养基(含2％HAT)及胎牛血清(FBS)购自美国HyClone公司。

HRP偶联的羊抗鼠IgGFc购自美国JacksonImmun公司。

HRP底物A和B液购自北京勤邦生物技术有限公司。

ProteinG亲和柱柱料购自通用电气(中国)医疗集团。

SepharoseCL-4B凝胶过滤自通用电气(中国)医疗集团。

10％二甲基亚砜保护液：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。

20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

抗体亚型分类检测试剂盒(PierceRapidELISAMousemAbIsotypingKit)购自Thermoscientific公司。

其余试剂均为国产分析纯产品。

2.主要仪器

CO₂培养箱购自SANYO公司。

生物安全柜购自Baker公司。

倒置荧光显微镜购自Olympus公司。

流式细胞仪购自BD公司。

酶标仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

IMMAGE800购自美国贝克曼库尔特有限公司。

紫外分光光度计购自莱伯泰科有限公司。

3.实验动物及细胞株

实验动物为SPF级Balb/c雌性小鼠，8-12周龄，体重28g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，屏障条件下饲养。

SP2/0细胞购自京天成生物技术(北京)有限公司。

293FT细胞购自Invitrogen公司。

HPV6型假病毒，由美国JohnTSchiller惠赠。

实施例1杂交瘤细胞的制备及筛选

1.免疫原制备

制备HPV6L1蛋白的单克隆抗体所使用的免疫原为HPV6L1-VLP蛋白，是按照本领域常规方法经体外重组表达如SEQIDNO.21所示的氨基酸，其可自动组装成VLP，经透射电镜观察可见图1所示的病毒样颗粒，直径在40-60nm之间，呈球形。将HPV6L1-VLP蛋白与等体积的福氏完全佐剂(CFA)或福氏不完全佐剂(IFA)混合，利用超声充分乳化，制备相应的免疫原。

2.动物免疫

0天用与CFA混合的免疫原，经背部皮下多点注射小鼠，免疫3只小鼠，0.12ml/只，所含免疫原为100μg，每只Balb/c小鼠每次注射量为100μg蛋白。第7天进行第2次免疫。第11天用于IFA混合的免疫原进行第3次免疫，0.08ml/只。第14天经小鼠尾静脉采血，分离血清，利用以下所示的间接ELISA方法检测抗体效价，如表1中的结果显示，小鼠血清抗体效价均在1:50000以上，均可用于融合。

表1三只小鼠血清抗体ELISA检测结果

3.间接ELISA法

HPV6L1-VLP蛋白包被96孔板，100ng/孔。阴性对照(NC)孔加入含5％脱脂奶粉的PBS溶液100μl，4℃过夜；弃去孔中液体，PBS洗板3次，加入含5％脱脂奶粉的PBS溶液，200μl/孔，室温封闭1小时；弃去孔中液体，PBS洗板1次，加入一抗(尾血从1：500至1：50000梯度稀释；杂交瘤细胞培养上清1：1稀释；小鼠腹水从1：1000至1：200万梯度稀释；纯化抗体1μg/ml至0.0005μg/ml梯度稀释)，室温孵育1小时；弃去孔中液体，PBS洗板3次，加入HRP偶联的羊抗鼠IgGFc(1：2000稀释)，室温孵育1小时；PBS洗板5次，加入底物A和B液，50μl/孔，室温避光反应20min；加入1mol/L硫酸终止反应，上酶标仪测定A450值，以A₄₅₀(阳性)>2A₄₅₀(NC)作为判断标准。

4.杂交瘤细胞的制备及筛选

取抗体效价最高的小鼠(2号小鼠)用于融合。融合前3天用与IFA混合的免疫原进行加强免疫，0.08ml/只，免疫后第17天取脾脏分离脾细胞进行细胞融合。首先分离单个脾细胞，经PEG4000(500g/L)与鼠骨髓瘤SP2/0细胞按4:1比例融合，用含20％FBS和2％HAT的DMEM培养基，在96孔板中37℃恒温培养14天；收集上清，筛选阳性克隆细胞，进一步用含20％FBS的DMEM培养基扩大培养，收集上清，进行复筛，复筛出的阳性克隆细胞扩大培养，收集上清，经冻存和复苏获得阳性克隆，收集上清。按间接ELISA法检测培养上清，筛选上清阳性的细胞株。结果如表2所示。从700株细胞株中筛选到578株阳性细胞株，最终从中挑选能够稳定分泌抗HPV6L1-VLP蛋白抗体的细胞株共计30株。

表2稳定分泌抗HPV6L1蛋白抗体的细胞株上清液ELISA检测结果

5.杂交瘤细胞分泌上清液中抗体特异性检测

利用间接ELISA法，包被原分别为HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、6、59、68的L1-VLP蛋白，100ng/孔。对该40株杂交瘤细胞分泌在细胞上清液的抗体进行检测，结果显示clone2B12，clone4F8，clone4H5，clone5H3和clone2A9这五株杂交瘤细胞仅对HPV6L1-VLP蛋白反应为阳性，对其他型别的HPV检测结果均为阴性，确定该5株杂交瘤细胞为型别特异性抗体。

6.腹水制备

将clone2B12，clone4F8，clone4H5，clone5H3和clone2A9五株杂交瘤细胞制备腹水，每株阳性克隆细胞接种2只小鼠，10-14天后收集腹水，用ProteinG亲和柱纯化腹水，获得纯化抗体，紫外分光光度计测定A280值，计算抗体浓度，调整抗体浓度至2.0mg/ml，按间接ELISA法检测腹水和纯化抗体效价，结果如表3、4所示。其中clone4F8和clone5H3这两株杂交瘤细胞分泌的抗体效价最高，亲和力最好。

表3小鼠腹水抗体ELISA检测结果

稀释度单位(μg/ml)

表4纯化后抗体ELISA检测结果

稀释度单位(μg/ml)

7.抗体中和活性检测

使用HPV假病毒中和试验方法检测抗体的中和活性及其抗体滴度，检测抗体清除假病毒或显著降低假病毒毒力的能力，具体如下：

1)将293FT细胞铺于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为1.5×10⁴个/100μl，37℃、5％浓度CO₂培养箱中培养6小时。

2)将假病毒与纯化抗体在稀释板中等体积混合，同时设立培养基替代抗体的对照孔(阴性对照)及培养基对照孔(空白对照)，将稀释板4℃放置1小时。

3)从稀释板各孔中吸取100μl的假病毒血清混合物(或培养基)贴壁缓缓加入预先已铺好细胞的培养板对应孔中，将细胞培养板置于37℃、5％浓度CO₂培养箱中培养72小时。

4)将细胞培养板置于荧光显微镜下观察，感染抑制率大于50％的孔为阳性孔，小于50％的孔为阴性孔，记录强阳性孔与强阴性孔，其余孔内细胞用胰酶消化并转移至流式管中，利用流式细胞仪检测荧光细胞占总细胞的比例，计算感染抑制率(感染抑制率＝(l－血清组的荧光细胞比值/阴性对照组的荧光细胞比值)×100％)，感染抑制率大于50％(阳性)的最高抗体稀释度的倒数作为血清的中和滴度。

结果显示，5株杂交瘤细胞株中有4株具有中和活性，clone4F8，clone4H5，clone5H3和clone2A9这四株抗体具有中和活性，滴度分别为3.699、3.699、4.301和3.699。clone2B12株细胞株不具有中和活性。

表55株单抗对11个型别的HPV假病毒的中和活性

8.杂交瘤细胞的传代培养及保存

将上述杂交瘤细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞仍然能够生长良好、稳定传代，培养上清中抗体效价在1:10000以上。结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续稳定分泌抗HPV6的单克隆抗体。

获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性；另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭，因此有必要对细胞株进行保存。保存方法如下：去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。1000rpm/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×10⁷细胞/ml。取样，用台盼兰染色，计数活细胞数量应在95％以上。最终用无菌注射器将细胞分装至安瓶中，每瓶0.5ml-1.0ml，熔封安瓶。4℃静置2小时后转移入-70℃冰箱中15小时，最后转入液氮中冻存。

实施例25H3抗体的鉴定

1.抗体获得

选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接种第16代clone5H3杂交瘤细胞，每只小鼠1×10⁶-2×10⁶个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，用9号针头采集腹水。

2.抗体的纯化

将腹水13000rpm/min离心30分钟，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用ProteinG亲和层析和SepharoseCL-4B凝胶过滤进行纯化，最终得到HPV6L1蛋白的单克隆抗体clone5H3，浓度在1mg/ml以上。

3.抗体纯度检测

将纯化后的抗体进行12％SDS-PAGE电泳，结果表明纯度在95％以上。

4.抗体类及亚类鉴定

利用PierceRapidELISAMousemAbIsotypingKit对1B7抗体进行亚型分类的检测，使用各种免疫球蛋白亚型(IgG1、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgA、IgM、Kappa和Lambda)的抗体检测上述杂交瘤细胞产生的抗体的Ig亚型，结果显示clone5H3细胞株产生的单克隆抗体均属于IgG₁型。

5.抗体轻链及重链可变区基因序列测定

提取clone5H3杂交瘤细胞的mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，5H3的可变区基因序列：重链如SEQIDNO.15所示，轻链如SEQIDNO.16所示。将获得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列。1B7的可变区氨基酸序列：重链如SEQIDNO.13所示，轻链如SEQIDNO.14所示。

6.抗体型别特异性检测

如实施例1中5.杂交瘤细胞分泌上清液中抗体特异性检测结果显示，

5H3抗体仅对HPV6L1-VLP蛋白反应为阳性，对其他HPV型别(11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)检测结果均为阴性，证明5H3抗体为型别特异性单克隆抗体。

7.抗体中和活性鉴定

如实施例1中7.的抗体中和活性检测结果显示，5H3抗体为具有中和活性的单克隆抗体。

实施例34F8抗体的鉴定

1.抗体获得

除了接种clone4F8杂交瘤细胞以外，利用与实施例2-1中相同的方法进行。

2.抗体的纯化

利用与实施例2-1中相同的方法进行，最终得到HPV6L1蛋白的单克隆抗体4F8，浓度在1mg/ml以上。

3.抗体纯度检测

利用与实施例2-1中相同的方法进行，结果表明纯度在95％以上。

4.抗体类及亚类鉴定

利用与实施例2-1中相同的方法进行，结果显示clone4F8细胞株产生的单克隆抗体属于IgG_2b型。

5.抗体轻链及重链可变区基因序列测定

提取clone4F8杂交瘤细胞的mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，4F8的可变区基因序列：重链如SEQIDNO.19所示，轻链如SEQIDNO.20所示。将获得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列。1B7的可变区氨基酸序列：重链如SEQIDNO.17所示，轻链如SEQIDNO.18所示。

6.抗体型别特异性检测

如实施例1中5.杂交瘤细胞分泌上清液中抗体特异性检测结果显示，

4F8抗体仅对HPV6L1-VLP蛋白反应为阳性，对其他HPV型别(11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)检测结果均为阴性，证明4F8抗体为型别特异性单克隆抗体。

7.抗体中和活性鉴定

如实施例1中7.的抗体中和活性检测结果显示，4F8抗体为具有中和活性的单克隆抗体。

实施例4HPV6L1抗原检测试剂盒

利用实施例1得到的单克隆抗体5H3和4F8进行HPV6双抗夹心ELISA试剂盒的研制，用以检测HPV6L1抗原水平。

1.双抗体夹心ELISA法的建立

1)试剂盒原理：

5H3和4F8两株抗体均为HPV6型别特异性且具有中和活性的单克隆抗体。以5H3作为包被抗体，以4F8作为酶标抗体，建立双抗夹心ELISA检测试剂盒，当将待检样品溶液或标准品溶液加入已经预包被有5H3抗体的酶标板，再加入4F8-HRP酶标二抗，用显色液显色，样品吸收值与样品中HPV6L1蛋白的含量在线性范围内成正相关，与标准曲线比较即可得出样品中HPV6L1蛋白的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，通过与系列浓度的HPV6L1蛋白标准品溶液颜色的比较，粗略判断样品中HPV6L1蛋白的浓度范围。

2)试剂盒的组成为：

(1)包被有包被抗体的酶标板：包被抗体为5H3型特异性单抗，由保藏号为CGMCCNO.10957的杂交瘤细胞株clone5H3株分泌产生。用包被缓冲液将包被抗体稀释成5μg/ml，包被于96孔酶标板上，每孔加入100μl，置于4℃环境孵育8小时。弃去包被液，洗涤液洗涤3次，拍干。然后在酶标板中加入封闭液，每孔100μl，37℃环境孵育2小时。倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。其中，所用的包被缓冲液是pH值为9.5、0.1mol/L碳酸盐缓冲液；所用封闭液是含有在封闭液中终浓度为8％(质量百分含量)的牛血清白蛋白、pH值为8.6、0.1mol/L的巴比妥钠-盐酸缓冲液。

(2)酶标抗体：标记酶为辣根过氧化物酶，标记方法为过碘酸钠法，酶标抗体为4F8型特异性中和单抗，由保藏号为CGMCCNO.10956的杂交瘤细胞株clone4F8株分泌产生，酶标抗体的工作浓度为1μg/ml。

(3)标准品溶液：HPV6L1蛋白标准品溶液，7瓶，浓度分别为125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、7.813ng/ml、3.906ng/ml、0ng/ml。配制标准品溶液为含有在配制标准品的溶液中终浓度为5-10％(质量百分含量)的DMSO、pH为6.5-6.7、0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

(4)底物显色液：由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢，显色液B液为邻苯二胺。

(5)终止液为1-2mol/L硫酸溶液。

(6)浓缩洗涤液：pH值为8.5、含有在浓缩洗涤液中的终浓度为0.05％(质量百分含量)叠氮化钠、在浓缩洗涤液中的终浓度为2.0％(质量百分含量)吐温-20、0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；40ml/瓶，1瓶。

(7)浓缩复溶液：含有在复溶液中的终浓度为5-10％(质量百分含量)的DMSO、pH为6.5-6.7、0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；200ml/瓶，1瓶。

(8)试剂盒说明书。

2.线性范围及试剂盒灵敏度验证

将HPV6L1-VLP蛋白配置成125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、7.813ng/ml、3.906ng/ml、0ng/ml的稀释液，以确定试剂盒对抗原浓度的检测下限，用以检测试剂盒的灵敏度，并且重复试验3次，以测得结果为阳性的最低浓度的平均值作为试剂盒的灵敏度。重复检测3次的标准曲线方程为y＝0.3176x-0.0103、y＝0.3093x-0.0163和y＝0.3166x-0.0124，R2分别为0.9997、0.9961和0.9903，R2均大于0.99。HPV6L1-VLP抗原的检测范围为7.8-125ng/ml。HPV6试剂盒的检测灵敏度为7.8ng/ml。

3.试剂盒精密度验证

1)精密度验证—板内差异

将HPV6L1-VLP蛋白倍比稀释至5个不同抗原浓度，每个抗原浓度做5个复孔(n＝6)，共30个样品，通过计算30个样品的板内变异系数(Coefficientofvariation,CV)确定板内差异，从而对该试剂盒进行精密度分析。结果如表5显示，30次检测中，板内CV(％)值均小于15％，表明该试剂盒板内精密度良好。

表6HPV6试剂盒板内变异系数

2)精密度验证—板间差异

将HPV6L1-VLP蛋白倍比稀释至5个不同抗原浓度，每个抗原浓度做3个复孔(n＝4)，共30个样品，通过计算30个样品的板间变异系数确定板间差异，从而对该试剂盒进行精密度分析。结果如表6显示，30次检测中，板间CV(％)值均小于15％，表明该检测试剂盒板间精密度良好。

表7HPV6试剂盒板间变异系数

4.试剂盒准确度验证

将HPV6L1-VLP蛋白稀释至高、中、低3个浓度(40ng/ml、20ng/ml和10ng/ml)，每个样品作2个复孔，计算样品回收率，分析该试剂盒的准确度。结果显示加标回收率(95％CI)在91.04％--118.26％之间，试剂盒回收率良好。

5.试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、HPV6L1蛋白实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存6个月以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (15)

1.一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗体，其特征在于，包含有SEQIDNO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和SEQIDNO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。

2.一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗体，其特征在于，包含有如SEQIDNO.13所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQIDNO.14所示的轻链可变区氨基酸序列。

3.一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗原结合部分，其特征在于，包含有SEQIDNO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和SEQIDNO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；

其中，所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、dAb、互补决定区片段、单链抗体，人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

4.如权利要求1-2所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含有如SEQIDNO.15所示的重链可变区核苷酸序列和如SEQIDNO.16所示的轻链可变区核苷酸序列。

5.如权利要求1-2所述的抗体，其特征在于，所述抗体是由免疫后的宿主脾细胞和骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。

6.根据权利要求1-2所述的抗体，其特征在于，所述抗体是由保藏编号为CGMCCNO.10957的细胞产生的单克隆抗体。

7.根据权利要求1-2所述的抗体，其特征在于，所述抗体是具有中和活性的单克隆抗体。

8.根据权利要求1-2所述的抗体，其特征在于，所述抗体是单价或二价抗体。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-2中任意一项所述的抗体或如权利要求3所述的抗原结合部分。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含与HPV6的L1蛋白和/或VLP特异性结合的第二抗体。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗体包含有SEQIDNO.7-9所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和SEQIDNO.10-12所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。

12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗体包含有如SEQIDNO.17所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQIDNO.18所示的轻链可变区氨基酸序列。

13.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗体包含有如SEQIDNO.19所示的重链可变区核苷酸序列和如SEQIDNO.20所示的轻链可变区核苷酸序列。

14.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗体是由保藏编号为CGMCCNO.10956的细胞产生的单克隆抗体。

15.如权利要求9所述试剂盒在检测样品中HPV6的L1蛋白和/或VLP的存在或者水平中的用途。