CN115724950A - Hpv6型衣壳蛋白l1单克隆抗体、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其是涉及HPV6型衣壳蛋白L1单克隆抗体、制备方法及应用。本发明提供了特异性结合HPV6型衣壳蛋白L1的结合分子，其中包括通过杂交瘤技术筛选获得针对6型HPV的鼠源单克隆抗体，该抗体对HPV6L1VLPs和假病毒具有高度的特异性和中和活性。本发明基于该单抗、兔多抗及抗鼠IgG酶标抗体建立了双抗夹心间接ELISA法用于HPV6L1抗原的检测。该方法具有良好的特异性、灵敏度、线性和准确度，对疫苗有效抗原成分的含量及活性进行评价，对HPV疫苗的生产和对尖锐湿疣、扁平疣及复发性呼吸道乳头瘤等疾病的防控具有重要价值。

Description

HPV6型衣壳蛋白L1单克隆抗体、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其是涉及HPV6型衣壳蛋白L1单克隆抗体、制备方法及应用。

背景技术

人乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一种无包膜的小DNA病毒，目前约有200多种，HPV主要感染皮肤和粘膜组织，其中有40多种HPV感染可以导致人类疾病，根据HPV感染与癌症发生的关系，HPV可以分为高危型和低危型，其中HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58及59等为高危型，高危型HPV持续性感染可引发宫颈癌、肛门癌和阴道癌等恶性肿瘤。其他的HPV亚型为低危型，主要引起皮肤黏膜的疣状增生，表现为尖锐湿疣、扁平疣等病变，目前在临床上还没有很好的治疗方法。流行病学调查及临床研究表明，生殖器尖锐湿疣组织中以HPV 6和HPV 11型检出率最高，统计显示HPV 6和HPV 11感染引起生殖器疣与复发性呼吸道乳头瘤病的比率超过90％。

预防HPV感染最有效的方法是接种HPV疫苗，目前国内外已上市的5个宫颈癌疫苗均以HPV主要衣壳蛋白L1为有效抗原，通过基因重组技术在一定条件下组装为病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，再辅以不同的佐剂配制成疫苗。基于重组HPV L1 VLPs疫苗的成功上市及广泛应用，充分表明了L1 VLPs高度还原了天然HPV的结构，保留了天然病毒的关键中和表位，具有与野生同型病毒相同或相似的抗原性和免疫原性，可诱导高滴度的中和抗体，进而很好地预防HPV持续感染、宫颈癌、及其他相关疾病。目前已上市的HPV疫苗，Merck公司的四价疫苗“Gardasil”和九价疫苗“Gardasil 9”以及国内外研制的超过两价次的HPV疫苗多数包含HPV 6型的疫苗成分。

在HPV疫苗生产的全程，保持正确的中和表位和稳定的VLPs结构，是保证疫苗质量和有效性的前提。在疫苗生产工艺的各个环节建立准确、灵敏、特异的检测方法对抗原结构和定量进行全程监控既是技术的需要，也是法规的指导原则。利用经典的抗原抗体反应原理，采用中和抗体对抗原中和表位进行鉴定是疫苗质控的有效手段，通过Western-blot、ELISA、和IVRP等技术手段对HPV疫苗原液、半成品及成品中的抗原成分进行鉴别实验、抗原含量检测、抗原体外效力测定，可为疫苗的检测放行提供依据。因此单克隆中和抗体作为疫苗抗原质控的重要反应试剂，并且同时具有特异性和中和活性的单克隆抗体在疫苗质控过程中具有不可替代的作用。另外，疫苗效力检测是疫苗成品放行的重要指标，目前HPV疫苗效力是通过疫苗免疫动物后采集血清，采用假病毒中和实验来检测血清的中和效价来进行评价，虽然该方法能够较好地反映疫苗成品的中和抗体水平，但也同时存在着动物用量较多，检测值波动较大，检测周期长，成本较高的缺点，同时也违背动物实验的3R原则，国内外一些企业已在响应国际组织的倡导，在逐渐淘汰动物实验检测疫苗成品效力的方法。目前已被认同和用于部分实践的，基于中和抗体针对疫苗抗原的中和表位和体外活性的质控和表征，已经是一种高效、经济、和可行的替代方法，例如美国默克公司的HPV疫苗，中国的甲肝和乙肝疫苗，都已经部分或全部使用中和抗体而非动物实验放行疫苗产品。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种HPV6型衣壳蛋白L1结合分子，该结合分子能够特异性结合HPV6型衣壳蛋白L1，将其用于HPV6型衣壳蛋白L1抗原检测实现的对疫苗抗原中和表位和体外活性的质控和表征，从而替代动物实验。

本发明的另一个目的在于，提供一种特异性结合HPV6型衣壳蛋白L1的单克隆抗体、生产该单克隆抗体的杂交瘤细胞以及杂交瘤细胞的制备方法。

为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供HPV6型衣壳蛋白L1结合分子，包括与HPV6型衣壳蛋白L1结合分子特异性结合的模块a或模块b；

所述模块a包括第一VH结构域，所述第一VH结构域包括具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第一CDR-H1，具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第一CDR-H2和具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第一CDR-H3；

所述模块b包括第二VH结构域，所述第二VH结构域包括具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的第二CDR-H1，具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的第二CDR-H2和具有SEQ ID No.6所示氨基酸序列的第二CDR-H3。

在可选的实施方式中，所述第一VH结构域具有SEQ ID No.13所示氨基酸序列；所述第二VH结构域具有SEQ ID No.14所示氨基酸序列。

在可选的实施方式中，所述模块a还包括第一VL结构域，所述第一VL结构域包括具有SEQ ID No.7所示氨基酸序列的第一CDR-L1，具有SEQ ID No.8所示氨基酸序列的第一CDR-L2和具有SEQ ID No.9所示氨基酸序列的第一CDR-L3；

所述模块b还包括第二VL结构域，所述第二VL结构域包括具有SEQ ID No.10所示氨基酸序列的第二CDR-L1，具有SEQ ID No.11所示氨基酸序列的第二CDR-L2和具有SEQ IDNo.12所示氨基酸序列的第二CDR-L3。

在可选的实施方式中，所述第一VL结构域具有SEQ ID No.15所示氨基酸序列；所述第二VL结构域具有SEQ ID No.16所示氨基酸序列。

在可选的实施方式中，所述HPV6型衣壳蛋白L1结合分子选自与HPV6型衣壳蛋白L1特异性结合的scFv分子、Fv分子、Fab分子或完整抗体分子；

所述完整抗体分子包括单克隆抗体、克隆抗体或纳米抗体。

第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的HPV6型衣壳蛋白L1结合分子在制备HPV6型衣壳蛋白L1抗原检测产品中的应用，或者在非以疾病诊断或治疗为目的的HPV6型衣壳蛋白L1抗原体外检测中的应用；

所述检测的方法包括双抗夹心间接ELISA法。

第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的HPV6型衣壳蛋白L1结合分子在HPV6型疫苗生产或质控中的应用。

第四方面，本发明提供第一杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.45133，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年3月17日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，所述第一杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的重链氨基酸具有前述实施方式所述的第一VH结构域和前述实施方式所述的第一VL结构域，或者，

第二杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.45134，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年3月17日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，所述第二杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的重链氨基酸具有前述实施方式所述的第二VH结构域和前述实施方式所述的第二VL结构域。

第五方面，本发明提供前述实施方式所述杂交瘤细胞的制备方法，所述杂交瘤细胞生产的单克隆抗体特异性结合HPV6型衣壳蛋白L1，所述制备方法包括：

将HPV 6型病毒原液与佐剂混合后免疫小鼠，处死尾血抗体滴度超过1/50000的小鼠，获取脾细胞与SP2/0细胞融合后，依次筛选阳性杂交瘤细胞和特异性识别HPV 6型病毒的杂交瘤细胞。

第六方面，本发明提供单克隆抗体，包括(A)具有前述实施方式所述的第一VH结构域和前述实施方式所述的第一VL结构域，或者，

(B)具有前述实施方式所述的第二VH结构域和前述实施方式所述的第二VL结构域，或者，

(C)所述单克隆抗体由前述实施方式所述杂交瘤细胞生产获得。

本发明提供了特异性结合HPV6型衣壳蛋白L1的结合分子，其中包括通过杂交瘤技术筛选获得针对6型HPV的鼠源单克隆抗体，该抗体对HPV6 L1 VLPs和假病毒具有高度的特异性和中和活性，表明该抗体是一个针对HPV6 L1蛋白中和表位的抗体。本发明基于该单抗、兔多抗及抗鼠IgG酶标抗体建立了双抗夹心间接ELISA法用于HPV6 L1抗原的检测。该方法具有良好的特异性、灵敏度、线性和准确度，可以特异性快速鉴别并定量HPV6 L1蛋白，对疫苗有效抗原成分的含量及活性进行评价，广泛应用于HPV疫苗的生产质控、临床病原学检测及流行病调查，对HPV疫苗的生产和对尖锐湿疣、扁平疣及复发性呼吸道乳头瘤等疾病防控具有重要价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的HPV6型多抗和鼠单抗分别稀释500和5000倍后检测抗原的标准曲线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

在某次具体实施方式中，第一方面，本发明提供了特异性结合HPV6型衣壳蛋白L1的模块(a1)，所述模块(a1)包括第一VH结构域，所述第一VH结构域包括具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第一CDR-H1，具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第一CDR-H2和具有SEQID No.3所示氨基酸序列的第一CDR-H3。

在另一次具体实施方式中，本发明提供了特异性结合HPV6型衣壳蛋白L1的模块(a2)，所述模块(a2)包括第一VH结构域和的第一VL结构域。所述第一VH结构域包括具有SEQID No.1所示氨基酸序列的第一CDR-H1，具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第一CDR-H2和具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第一CDR-H3。所述第一VL结构域包括包括具有SEQ IDNo.7所示氨基酸序列的第一CDR-L1，具有SEQ ID No.8所示氨基酸序列的第一CDR-L2和具有SEQ ID No.9所示氨基酸序列的第一CDR-L3。

在另一次具体实施方式中，本发明提供了特异性结合HPV6型衣壳蛋白L1的模块(b1)，所述模块(b1)包括第二VH结构域，所述第二VH结构域包括具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的第二CDR-H1，具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的第二CDR-H2和具有SEQ ID No.6所示氨基酸序列的第二CDR-H3。

在另一次具体实施方式中，本发明提供了特异性结合HPV6型衣壳蛋白L1的模块(b2)，所述模块(b2)包括第二VH结构域和的第二VL结构域。所述第二VH结构域包括具有SEQID No.4所示氨基酸序列的第二CDR-H1，具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的第二CDR-H2和具有SEQ ID No.6所示氨基酸序列的第二CDR-H3。所述第二VL结构域包括包括具有SEQ IDNo.10所示氨基酸序列的第二CDR-L1，具有SEQ ID No.11所示氨基酸序列的第二CDR-L2和具有SEQ ID No.12所示氨基酸序列的第二CDR-L3。

结合第一方面所述的各个模块中含有CDR的氨基酸序列，第二方面，在一次具体的实施方式中，本发明提供了如下各模块：

模块(a11)包括第一VH结构域，所述第一VH结构域具有SEQ ID No.13所示氨基酸序列。

模块(a12)包括第一VH结构域和第一VL结构域，所述第一VH结构域具有SEQ IDNo.13所示氨基酸序列，所述第一VL结构域具有SEQ ID No.15所示氨基酸序列。

模块(b11)包括第二VH结构域，所述第二VH结构域具有SEQ ID No.14所示氨基酸序列。

模块(b21)包括第二VH结构域和第二VL结构域，所述第二VH结构域具有SEQ IDNo.14所示氨基酸序列，所述第二VL结构域具有SEQ ID No.16所示氨基酸序列。

结合第二方面提供的各模块，第三方面，本发明提供了第一scFV分子和第二scFV分子，所述第一scFV分子包括由弹性连接肽(Linker)连接的第一VH结构域和第一VL结构域；所述第二scFV分子包括由弹性连接肽(Linker)连接的第二VH结构域和第二VL结构域。对于所述Linker的氨基酸残基组成和长度本领域技术人员能够根据实际需求，通过常规手段调整获得，包括但不限于由长度为15～25个氨基酸残基的甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)构成。

第四方面，本发明提供了第一Fv分子和第二Fv分子，所述第一Fv分子包括由短肽连接的第一VH结构域和第一VL结构域；所述第二Fv分子包括由短肽连接的第二VH结构域和第二VL结构域。所述短肽本领域技术人员能够根据实际需求，通过常规手段调整获得，包括但不限于由3～9个氨基酸残基组成的短肽链。

第五方面，本发明提供了第一Fab分子和第二Fab分子，所述第一Fab分子包括第一VH结构域、第一VL结构域、轻链恒定区(CL)和一个重链恒定区(CH1)；所述第二Fab分子包括第二VH结构域、第二VL结构域、轻链恒定区(CL)和一个重链恒定区(CH1)。对于CH1和CL，本领域技术人员能够根据实际需求进行选择，例如所述CH1选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE或IgM中的任一种或几种，所述CL选自κ链或λ链，此外，本领域技术人员还可以实际需求，通过常规手段对上述选用的CH1和CL的序列及修饰进行调整。

第六方面，本发明还提供了基于前述实施方式的完整抗体分子，所述完整抗体分子包括2条相同的重链和2条相同的轻链，所述重链包括第一VH结构域或第二VH结构域，和重链恒定区，所述轻链包括与重链对应的第一VL结构域或第二VL结构域，和轻链恒定区；对于重链恒定区和轻链恒定区的具体序列组成，本领域技术人员能够根据实际需求进行选择，例如所述重链恒定区可以选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE或IgM中的任一种或几种，所述轻链恒定区可以选自κ链或λ链，此外，本领域技术人员还可以实际需求，通过常规手段对上述选用的重链恒定区和轻链恒定区的序列或者修饰进行调整。

需要说明的是，上述提供的各模块、scFV分子、Fv分子、Fab分子和完整抗体分子可以通过人工合成获得，完整抗体分子还可以通过构建杂交瘤细胞，表达分泌获得。

第七方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的HPV6型衣壳蛋白L1结合分子在制备HPV6型衣壳蛋白L1抗原检测产品中的应用，或者在非以疾病诊断或治疗为目的的HPV6型衣壳蛋白L1抗原体外检测中的应用；所述检测的方法包括双抗夹心间接ELISA法。

第八方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的HPV6型衣壳蛋白L1结合分子在HPV6型疫苗生产或质控中的应用。

第九方面，本发明提供第一杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.45133，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，所述杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的重链氨基酸具有前述实施方式所述的第一VH结构域和前述实施方式所述的第一VL结构域。

第十方面，本发明提供第二杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.45134，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，所述杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的重链氨基酸具有前述实施方式所述的第二VH结构域和前述实施方式所述的第二VL结构域。

第十一方面，本发明提供前述实施方式所述杂交瘤细胞的制备方法，所述杂交瘤细胞生产的单克隆抗体特异性结合HPV 6型衣壳蛋白L1，所述制备方法包括：

将HPV 6型病毒原液与佐剂混合后免疫小鼠，处死尾血抗体滴度超过1/50000的小鼠，获取脾细胞与SP2/0细胞融合后，依次筛选阳性杂交瘤细胞和特异性识别HPV 6型病毒的杂交瘤细胞。

第十二方面，本发明提供第一单克隆抗体，所述第一单克隆抗体具有前述实施方式所述的第一VH结构域和前述实施方式所述的第一VL结构域，由前述实施方式所述第一杂交瘤细胞生产获得。

第十三方面，本发明提供第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体具有前述实施方式所述的第二VH结构域和前述实施方式所述的第二VL结构域，由前述实施方式所述第二杂交瘤细胞生产获得。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

1.单克隆抗体的制备

1.1小鼠免疫

HPV 6型原液分别与佐剂CFA和AD11.15混合，免疫Balb/c小鼠，第14天取小鼠尾血，使用间接ELISA方法进行尾血中抗体效价的评价。采用HPV 6型原液包被酶标板(1：100稀释)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBS溶液洗板3次，使用5％milk-PBS在室温封闭1hr；然后使用PBS溶液洗板1次后，加入梯度稀释的小鼠尾血，室温反应1hr；然后使用PBS溶液洗板3次，拍干后，加入1:2000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠Fc二抗，室温反应1hr，PBS溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的底物A液和B液，避光、室温条件下反应，20min；然后加入50μL终止液，混匀后在酶标仪上读取OD₄₅₀和OD₆₃₀值，输出OD＝OD₄₅₀-OD₆₃₀。取尾血滴度均超过1/50000的小鼠进行后续实验。

1.2细胞融合及单克隆筛选

处死小鼠取脾细胞分别与SP2/0细胞融合，在选择培养基中培养为单克隆细胞株后挑克隆，共挑取9个96孔板的克隆。使用HPV6型原液包被酶标板(1：100稀释)，进行单克隆筛选，方法同上。从9个96孔板共846个克隆中初筛共保留77个OD≥1.0的阳性克隆。将初筛阳性克隆从96孔板中扩大培养至48孔板，培养2～3天后，进行复筛，保留复筛OD≥1.0强阳性克隆34株。

1.3克隆特异性筛选

对34株阳性克隆进行特异性检测，其中1A2、1G11、6H1、1E6、4G1共5株为特异识别HPV 6的阳性克隆，检测结果见表1。方法如下：分别将HPV 6、HPV11、HPV 16、HPV 18、HPV31、HPV 33、HPV 45、HPV 52、HPV 58共9中亚型抗原稀释至1μg/ml，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBS溶液洗板3次，使用5％milk-PBS在室温封闭1hr；然后使用PBS溶液洗板1次后，加入20倍稀释后的不同克隆的杂交瘤细胞上清，室温反应1hr；然后使用PBS溶液洗板3次，拍干后，加入1:10000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠Fc二抗，室温反应1hr，PBS溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的底物A液和B液，避光、室温条件下反应，20min；然后加入50μL终止液，混匀后在酶标仪上读取OD₄₅₀和OD₆₃₀值，输出OD＝OD₄₅₀-OD₆₃₀。

表1.抗体的特异性ELISA检测(OD值*)

*所有数值均为复孔的平均值；Virus Like Particle(VLP)：类似病毒样颗粒

1.4中和活性检测

将5株特异识别HPV6的阳性克隆的细胞上清进行中和活性检测，检测结果见表2，经假病毒中和实验验证，1A2、1G11、6H1、1E6和4G1共5株克隆的细胞上清具有较高的中和活性。方法如下：1)用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清、1％双抗、1％L-Glu和1％G418)稀释293FT细胞并加入96孔细胞培养板中，37℃培养过夜；2)用DMEM完全培养基倍比稀释HPV6-GFP假病毒至所需浓度(每孔荧光斑点数约400)；3)用DMEM完全培养基倍比稀释待检HPV6型杂交瘤细胞上清液；4)用DMEM完全培养基倍比稀释商品化的HPV6型型单克隆抗体(义翘神州)；5)各取60μL稀释后的细胞上清液和假病毒进行混匀，然后放入4℃反应1小时；6)取100μL的混合液缓慢加入铺有293FT细胞的96孔细胞培养板中，37℃培养60-96小时；6)弃去细胞培养液，用ELSPOT(AID)进行读值。检测结果显示，接收到的HPV假病毒(三药生物)符合预期的要求，每个孔的荧光斑点数符合要求(约400个)，随着假病毒稀释倍数的提高荧光斑点数也降低。HPV6型细胞上清1A2、1G11、6H1、1E6和4G1都具有较高的中和活性，稀释5120倍后仍具有中和活性。

表2.中和活性检测

注：中和活性阳性判定：荧光斑点数值≤阳性荧光斑点数平均值/2。

1.5腹水制备及抗体纯化

根据上清的亲和力、特异性及中和活性结果选择克隆1G11和6H1进行腹水制备，取杂交瘤细胞分别接种4只Balb/c小鼠，在第10～14天收集腹水，用蛋白G纯化腹水，获得纯化抗体。

1.6抗体灵敏度检测

根据上清的亲和力、特异性及中和活性结果选择克隆1G11和6H1进行腹水制备及抗体纯化，抗体检测结果见表3。抗体1G11和6H1灵敏度均可达到0.0005μg/mL。

表3.抗体灵敏度检测

Concentration(μg/mL)	1	0.5	0.05	0.005	0.0005	NC
							1G11 Lot#:2021081603	NaN	NaN	NaN	1.462	0.239	0.012
6H1 Lot#:2021081604	NaN	NaN	NaN	3.795	0.778	0.010

注：NC为阴性对照5％milk-PBS，阳性判断标准为OD值>NC值的2.1倍。

1.7抗体型别鉴定

用抗体亚型鉴定试剂盒对抗体1G11和6H1进行亚型鉴定，检测结果见表4。抗体1G11是IgG1亚型，轻链是κ型，6H1是IgG2b亚型，轻链是κ型。

表4.抗体亚型鉴定

注：NaN为超出最大检测限值

2.抗体基因测序及分析

提取1G11和6H1杂交瘤细胞株总RNA，经PrimeScriptTM 1st Strand cDNASynthesis Kit(Takara,Cat#6110A)反转录，经RT-PCR法扩增抗体VH及VL基因，克隆至pUC-19T载体，通过载体上M13通用引物进行测序，结果如下：

2.1VH区-1G11(Leader sequence-Variable Region)

1)DNA Sequence:420bp

ATGAACTTCGGGTTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAGTCACTTTCAGTAGTTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTACTAGAGGTGGTAGTACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAGAGGGGGAGGATTACTACGGTAGTAGCTACGTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID No.17)。

2)Amino Acid Sequence:140aa

MNFGFSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGVTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASITRGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCAREGEDYYGSSYVDYWGQGTTLTVSS(SEQID No.13)。

CDR1:SYAMS(SEQ ID No.1)。

CDR2:SITRGGSTYYPDSVKG(SEQ ID No.2)。

CDR3:EGEDYYGSSYVDY(SEQ ID No.3)。

2.2VL区-1G11(Leader sequence-Variable Region)

1)DNA Sequence:381bp

ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTGTATTTTTGCTTTTCTGGATTCCAGCCTCCAGAGGTGACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGCATTGGCACAAGCATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTAATAGCTGGCCAACCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID No.18)。

2)Amino Acid Sequence:127aa

MVSTPQFLVFLLFWIPASRGDILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPTTFGAGTKLELK(SEQ ID No.15)。

CDR1:RASQSIGTSIH(SEQ ID No.7)。

CDR2:YASESIS(SEQ ID No.8)。

CDR3:QQSNSWPTT(SEQ ID No.9)。

2.3VH区-6H1(Leader sequence-Variable Region)

1)DNA Sequence:420bp

ATGGGATGGATCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGGTAGTGAAGACTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGTTACTACATGCACTGGGTCAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAGTTGTTACAATGGTGCTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTTACTCTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGTTCAACAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGATGAATACGACGGGGCGTACTACCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID No.19)。

2)Amino Acid Sequence:140aa

MGWIWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPEVVKTGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHGKSLEWIGYISCYNGATSYNQKFKGKATFTLDTSSSTAYMQFNSLTSEDSAVYYCAREDEYDGAYYLDYWGQGTTLTVSS(SEQID No.14)。

CDR1:GYYMH(SEQ ID No.4)。

CDR2:YISCYNGATSYNQKFKG(SEQ ID No.5)。

CDR3:EDEYDGAYYLDY(SEQ ID No.6)。

2.4VL区-6H1(Leader sequence-Variable Region)

1)DNA Sequence:381bp

ATGGAGTCACAGACTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGATGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAACACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAACAATATTTCCGCTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID No.20)。

2)Amino Acid Sequence:127aa

MESQTQVFVYMLLWLSGVDGDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKTLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYFRYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID No.16)。

CDR1:KASQNVGTNVA(SEQ ID No.10)。

CDR2:SASYRYS(SEQ ID No.11)。

CDR3:QQYFRYPLT(SEQ ID No.12)。

3.单克隆抗体的应用

3.1双抗夹心间接ELISA方法的建立

具体步骤如下：1)用包被液(碳酸盐缓冲液)500倍稀释HPV6(R147)兔多抗200倍、500倍、1000倍和2000倍，100μL/孔，4℃，包被(碳酸盐缓冲液)，过夜；2)添加5％脱脂乳(PBS配)，200μl/孔，37℃封闭2h；3)2％脱脂乳稀释HPV6型原液至120μg/ml，然后3倍倍比稀释至11个梯度，100μL/孔，37℃，孵育1h；4)用2％脱脂乳5000倍、8000倍、10000倍和15000倍稀释对应HPV6型(1G11或6H1)鼠单抗，100μL/孔，37℃，孵育1h；5)2％脱脂乳5000倍/10000倍稀释羊抗鼠lgG-HRP二抗(BIO-RAD)，100μL/孔，37℃，1h；6)添加TMB显色液，100μL/ml，37℃显色10min；7)添加50μL/孔浓硫酸终止反应，酶标仪测定450nm、参比波长620nm读值，结果见下表5，其中A和B行为鼠单抗5000倍稀释；C和D行为鼠单抗8000倍稀释；E和F行为鼠单抗10000倍稀释；G和H行为鼠单抗抗15000倍稀释；每个样品做1个复孔。通过双抗夹心间接ELSIA方法，结果显示通过4参数曲线显示，如下抗体反应浓度条件下具有良好的线性关系，检测结果见图1，即HPV6型兔多抗和鼠单抗稀释倍数分别为500和5000，抗原起始稀释浓度120μg/ml。

表5.HPV6型兔多抗和不同稀释倍数鼠单抗检测抗原的OD值

本发明通过杂交瘤技术筛选获得针对6型HPV的鼠源单克隆抗体，该抗体对HPV6L1 VLPs和假病毒具有高度的特异性和中和活性，表明该抗体是针对HPV6 L1蛋白中和表位的抗体，基于该单抗、兔多抗及抗鼠IgG酶标单抗建立了双抗夹心间接ELISA法用于HPV6 L1抗原的检测，该方法具有良好的特异性、灵敏度、线性和准确度，可以特异性快速鉴别并定量HPV6 L1蛋白，对疫苗有效抗原成分的含量及活性进行评价，广泛应用于HPV疫苗的生产质控、临床病原学检测及流行病调查，对HPV疫苗的生产和宫颈癌的防控具有重要价值。

抗体与抗原的表位是一一对应的关系，一个抗原表位对应一个相应的抗体，抗原表位分线性表位和空间表位，中和表位多数为空间表位，抗原的中和表位是产生中和抗体的结构基础，也是作为疫苗候选抗原激发有效免疫应答的前提。由于抗体产生的异质性和多样性，即使针对同一抗原也会产生具有不同CDR区的抗体，而筛选获得具有中和活性的优质抗体概率很低，该抗体具有唯一性。其中1G11抗体：VH区-1G11，CDR1:SYAMS,CDR2:SITRGGSTYYPDSVKG,CDR3:EGEDYYGSSYVDY；VL区-1G11，CDR1:RASQSIGTSIH,CDR2:YASESIS,CDR3:QQSNSWPTT，对应杂交瘤细胞CGMCC保藏号为：45133。6H1抗体：VH区-6H1，CDR1:GYYMH,CDR2:YISCYNGATSYNQKFKG,CDR3:EDEYDGAYYLDY；VL区-6H1，CDR1:KASQNVGTNVA,CDR2:SASYRYS,CDR3:QQYFRYPLT，对应杂交瘤细胞CGMCC保藏号为：45134。

采用适合的中和抗体对疫苗抗原的中和表位进行鉴别和表征是疫苗行业质控和放行的重要内容，这就要求该抗体具有良好的特异性和中和活性。为了充分证明所获抗体的特异性，首先采用ELISA法进行HPV 6、HPV 31、HPV11、HPV 16、HPV 18、HPV 33、HPV 45、HPV 52、HPV 58抗原的交叉反应验证，表明该抗体只与HPV6型抗原特异反应，表明其优异的特异性。为了证实该抗体的中和活性，采用假病毒中和实验进行了验证，证实该抗体的中和活性高达20480。

建立了双抗夹心间接ELISA检测HPV6 L1抗原含量的方法，HPV6 L1兔多抗包被，加入待检抗原孵育，加入本单抗孵育，加入抗鼠IgG酶标复合物，进行显示检测。该方法具有良好的特异性、灵敏度、线性和准确度，可以快捷鉴别并定量HPV6 L1抗原，对疫苗有效抗原成分的含量及活性进行评价。由于所使用是检测抗体为中和性单抗，因此，该方法可以对疫苗抗原的中和表位进行很好的质控和表征，在一定程度上指征了疫苗成品的免疫原性，因此该方法具有取代动物实验评价疫苗中和活性的潜在优势，规避了动物实验导致的检测波动大、检测周期长、成本高昂的问题，也符合国际社会倡导的动物实验3R原则。该方法采用HPV6 L1兔多抗进行包板，可以最大限度地捕获待检抗原，提高灵敏度，加入待检抗原，再加入HPV6型单克隆抗体(1G11或6H1)，最后加入抗鼠IgG酶标抗体进行显色、读值。传统的双抗体夹心法需要对其中的一个单抗进行标记，尤其是应用于多价HPV疫苗时，需要对多个型别的HPV单抗分别进行标记，增大了工作量和成本，而本发明针对多价HPV疫苗不同价型的HPV抗原定量检测时，则采用抗鼠IgG酶标抗体为通用的显色抗体，大大提高了检测的便利性，降低了成本。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.HPV6型衣壳蛋白L1结合分子，其特征在于，包括与HPV6型衣壳蛋白L1结合分子特异性结合的模块a或模块b；

所述模块a包括第一VH结构域，所述第一VH结构域包括具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第一CDR-H1，具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第一CDR-H2和具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第一CDR-H3；

所述模块b包括第二VH结构域，所述第二VH结构域包括具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的第二CDR-H1，具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的第二CDR-H2和具有SEQ ID No.6所示氨基酸序列的第二CDR-H3。

2.根据权利要求1所述的HPV6型衣壳蛋白L1结合分子，其特征在于，所述第一VH结构域具有SEQ ID No.13所示氨基酸序列；

所述第二VH结构域具有SEQ ID No.14所示氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的HPV6型衣壳蛋白L1结合分子，其特征在于，所述模块a还包括第一VL结构域，所述第一VL结构域包括具有SEQ ID No.7所示氨基酸序列的第一CDR-L1，具有SEQ ID No.8所示氨基酸序列的第一CDR-L2和具有SEQ ID No.9所示氨基酸序列的第一CDR-L3；

所述模块b还包括第二VL结构域，所述第二VL结构域包括具有SEQ ID No.10所示氨基酸序列的第二CDR-L1，具有SEQ ID No.11所示氨基酸序列的第二CDR-L2和具有SEQ IDNo.12所示氨基酸序列的第二CDR-L3。

4.根据权利要求3所述的HPV6型衣壳蛋白L1结合分子，其特征在于，所述第一VL结构域具有SEQ ID No.15所示氨基酸序列；

所述第二VL结构域具有SEQ ID No.16所示氨基酸序列。

5.根据权利要求1～4任一项所述的HPV6型衣壳蛋白L1结合分子，其特征在于，所述HPV6型衣壳蛋白L1结合分子选自与HPV6型衣壳蛋白L1特异性结合的scFv分子、Fv分子、Fab分子或完整抗体分子；

所述完整抗体分子包括单克隆抗体、克隆抗体或纳米抗体。

6.权利要求1～5任一项所述的HPV6型衣壳蛋白L1结合分子在制备HPV6型衣壳蛋白L1抗原检测产品中的应用，或者在非以疾病诊断或治疗为目的的HPV6型衣壳蛋白L1抗原体外检测中的应用；

所述检测的方法包括双抗夹心间接ELISA法。

7.权利要求1～5任一项所述的HPV6型衣壳蛋白L1结合分子在HPV6型疫苗生产或质控中的应用。

8.第一杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.45133，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，所述第一杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的重链氨基酸具有权利要求2所述的第一VH结构域和权利要求4所述的第一VL结构域，或者，

第二杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.45134，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，所述杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的重链氨基酸具有权利要求2所述的第二VH结构域和权利要求4所述的第二VL结构域。

9.权利要求8所述杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，所述杂交瘤细胞生产的单克隆抗体特异性结合HPV6型衣壳蛋白L1，所述制备方法包括：

将HPV 6型病毒原液与佐剂混合后免疫小鼠，处死尾血抗体滴度超过1/50000的小鼠，获取脾细胞与SP2/0细胞融合后，依次筛选阳性杂交瘤细胞和特异性识别HPV 6型病毒的杂交瘤细胞。

10.单克隆抗体，其特征在于，包括(A)具有权利要求2所述的第一VH结构域和权利要求4所述的第一VL结构域，或者，

(B)具有权利要求2所述的第二VH结构域和权利要求4所述的第二VL结构域，或者，

(C)所述单克隆抗体由权利要求8所述杂交瘤细胞生产获得。

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