CN118027202A - 结合slc13a5膜蛋白的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种结合SLC13A5膜蛋白的抗体，还提供所述抗体的制备方法以及应用。本发明首次将人SLC13A5的C端20aa表位以非包膜VLP多价展示，经哺乳动物细胞表达使得该表位获得具有重要功能的翻译后修饰，并以此为抗原蛋白进行免疫，筛选获得了与SLC13A5具有高水平的结合亲和力的单克隆抗体。本发明的抗体可应用于WB、ELISA和FACS等多种检测，且经人源化改造后具有抗体药物开发的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体地，涉及一种结合SLC13A5膜蛋白的抗体，以及所述抗体的制备方法和应用。
背景技术
溶质载体超家族(solute carrier fami ly,SLC)是仅次于G蛋白偶联受体的第二大膜蛋白家族。SLC膜转运蛋白，包括52个亚家族，400多个成员，它们的主要功能是介导各种营养物质和代谢产物的跨膜转运，包括金属离子、无机离子、有机离子、氨基酸、脂质、糖类、神经递质、核酸，药物及其他外源和内源性物质跨生物膜的流入和流出，在细胞吸收营养物质，药物及其他外源性物质的生理过程中发挥重要作用。SLC13A5(Uniprot:Q86YT5)属于溶质转运第13家族的第5个成员，其编码钠依赖的柠檬酸转运蛋白NaCT(568aa)，负责将阴离子中间体柠檬酸从血液输送到细胞内，柠檬酸是细胞三羧酸循环的中间产物，在能量代谢中发挥重要作用，且脂肪酸的合成速率与柠檬酸的胞质浓度直接相关。SLC13A5已成为肥胖、胰岛素抵抗等代谢性疾病相关的极具潜力的治疗靶点[1,2]。
SLC13A5含有11个跨膜区，其N端位于胞内，C端位于胞外。SLC13A5同源二聚体膜蛋白通过结构构象变化将结合Na+和柠檬酸的位点交替朝向细胞膜的内侧或外侧，以将柠檬酸从细胞外转运到胞内[3]。SLC13A5是一种膜蛋白，由于膜蛋白表达量低，难以获得用于免疫的膜蛋白抗原，因此，目前亟需开发应用于诸如SLC13A5等膜蛋白的检测、表征及疾病治疗的抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗SLC13A5膜蛋白的抗体、制备所述抗体的方法以及所述抗体的应用。
本发明的第一方面，提供了一种抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含选自下组的重链可变区和轻链可变区：
(Z1)所述重链可变区包含以下3个CDR：SEQ ID NO:7所示的H-CDR1；SEQ ID NO:8所示的H-CDR2；SEQ ID NO:9所示的H-CDR3；以及
所述轻链可变区包含以下3个CDR：SEQ ID NO:13所示的L-CDR1；序列如TAS所示的L-CDR2；SEQ ID NO:14所示的L-CDR3；或
(Z2)所述重链可变区包含以下3个CDR：SEQ ID NO:18所示的H-CDR1；SEQ ID NO:19所示的H-CDR2；SEQ ID NO:20所示的H-CDR3；以及
所述轻链可变区包含以下3个CDR：SEQ ID NO:24所示的L-CDR1；序列如DTS所示的L-CDR2；SEQ ID NO:25所示的L-CDR3。
在另一优选例中，所述重链可变区和轻链可变区还包含FR区。
在另一优选例中，所述重链可变区包含鼠源或人源的FR区，和/或所述轻链可变区包含鼠源或人源的FR区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或
所述抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或
所述抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区和/或轻链恒定区为鼠源的或人源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区来源于小鼠重链IgG3或IgG2b。
在另一优选例中，所述轻链恒定区来源于小鼠kappa(κ)链。
在另一优选例中，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:10或21所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体包括：单克隆抗体、多克隆抗体、双链抗体、单链抗体(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2抗体。
在另一优选例中，所述抗体为重组抗体。
在另一优选例中，所述抗体为重组单克隆抗体，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链。
在另一优选例中，所述重组单克隆抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链。
在另一优选例中，所述抗体包括动物源抗体(例如不同亚型的鼠源抗体)、嵌合抗体(例如人-鼠嵌合抗体)、人源化抗体。
在另一优选例中，所述抗体特异性结合人SLC13A5。
本发明的第二方面，提供了一种重组抗体，所述的重组抗体具有：
(i)如本发明第一方面所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段的序列；以及
(ii)任选的促进抗体分泌表达的信号肽和/或用于纯化、检测的标签序列。
在另一优选例中，所述重组抗体具有促进抗体分泌表达的信号肽。
在另一优选例中，所述信号肽具有如SEQ ID NO:5、11、16或22所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：FLAG、Myc、His标签等。
在另一优选例中，所述重组抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链。
在另一优选例中，所述重组抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链。
本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸分子，其编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段；或
(2)如本发明第二方面所述的重组抗体。
在另一优选例中，所述多核苷酸分子包含如SEQ ID NO:27-30中任一项所示的核苷酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种表达载体，其含有如本发明第三方面所述的多核苷酸分子。
在另一优选例中，所述载体包括真核细胞表达载体、原核细胞表达载体。
在另一优选例中，所述载体为哺乳细胞表达载体。
在另一优选例中，所述表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。
本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其含有如本发明第四方面所述的载体，或基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸分子。
在另一优选例中，所述宿主细胞包括真核细胞(如哺乳动物细胞)、原核细胞。
本发明的第六方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包含：
(a)如本发明第一方面所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段或如本发明第二方面所述的重组抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、酶、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、纳米颗粒/纳米棒。
在另一优选例中，所述可检测标记物包括荧光标记物或化学发光标记物。
在另一优选例中，所述放射性核素包括：诊断用同位素；和/或治疗用同位素。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体偶联物为抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate，ADC)。
本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)如本发明第一方面所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物；以及
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物用于制备预防和/或治疗与SLC13A5相关的疾病或病症的药物。
在另一优选例中，所述与SLC13A5相关的疾病或病症包括代谢性疾病、癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述代谢性疾病包括但不限于：肥胖、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤包括但不限于肝癌。
本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物的用途，用于制备：
(1)用于预防和/或治疗与SLC13A5相关的疾病或病症的药物；
(2)用于检测SLC13A5分子的检测试剂、检测板或检测试剂盒。
在另一优选例中，所述与SLC13A5相关的疾病或病症包括代谢性疾病、癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述代谢性疾病包括但不限于：肥胖、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤包括但不限于肝癌。
在另一优选例中，所述检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测、ELISA检测、蛋白质免疫印记(WB)检测。
在另一优选例中，所述用途为诊断性和/或非诊断性的，和/或治疗性和/或非治疗性的。
本发明的第九方面，提供了一种产生如本发明第一方面所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段、或如本发明第二方面所述的重组抗体的方法，包括步骤：
(s1)在适合产生抗体的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗体的培养物；
(s2)从所述培养物中分离或回收所述抗体；以及
(s3)任选地，纯化和/或修饰得步骤(b)中获得的抗体。
本发明的第十方面，提供了一种检测样品中SLC13A5蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与如本发明第一方面所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在SLC13A5蛋白。
在另一优选例中，所述样品包括：离体组织样品、细胞样品。
在另一优选例中，所述方面为体外方法。
在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的方法。
本发明的第十一方面，提供了一种预防和/或治疗与SLC13A5相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：给有需要的受试者施用如本发明第一方面所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或如本发明第七方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述有需要的受试者包括人类或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述与SLC13A5相关的疾病或病症包括代谢性疾病、癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述代谢性疾病包括但不限于：肥胖、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤包括但不限于肝癌。
本发明的第十二方面，提供了一种筛选抗SLC13A5抗体的方法，包括步骤：
(S1)将人SLC13A5的C端20aa(SLC13A5 CTD)以非包膜VLP多价展示，用哺乳动物细胞表达，从而获得用于免疫的抗原蛋白SLC13A5 CTD-VLP；
(S2)使用步骤(S1)中制备的抗原蛋白SLC13A5 CTD-VLP免疫受试动物，收集经免疫后动物的抗血清；
(S3)检测收集的抗血清与抗原蛋白SLC13A5 CTD-VLP的结合，若结合为阳性，则取经免疫后动物的脾脏，制备杂交瘤克隆；
(S4)用抗原蛋白SLC13A5 CTD-VLP对杂交瘤克隆进行初筛，从而获得抗原结合阳性的杂交瘤克隆；
(S5)使用不含SLC13A5 CTD序列的空VLP进一步对抗原结合阳性的克隆进行负筛选，筛选出只结合SLC13A5 CTD的阳性杂交瘤克隆。
在另一优选例中，所述方法还包括以下步骤：
(S6)通过检测阳性杂交瘤克隆产生的单克隆抗体与表达SLC13A5的细胞的结合，从而筛选具有SLC13A5阳性表达细胞结合功能的单克隆抗体；以及
(S7)利用生物膜干涉技术(BLI)表征阳性杂交瘤克隆产生的单克隆抗体与全长人SLC13A5膜蛋白纳米磷脂盘(nanodisc)的结合。
在另一优选例中，所述SLC13A5 CTD的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
在另一优选例中，所述哺乳动物细胞选自：HEK293细胞、CHO细胞。
在另一优选例中，所述受试动物选自：小鼠、大鼠、家兔、山羊、猴等。
在另一优选例中，所述步骤(S3)中的检测为ELISA检测。
在另一优选例中，所述步骤(S4)和(S5)中的筛选均采用间接ELISA法。
在另一优选例中，所述步骤(S6)中的表达SLC13A5的细胞可选自表达SLC13A5的肿瘤细胞，例如HepG2肝肿瘤细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了哺乳表达非包膜SLC13A5 CTD-VLP免疫小鼠后产生的抗血清检测结果；其中A显示了以SLC13A5 CTD-VLP抗原检测抗血清效价的结果，B显示了抗血清与过表达SLC13A5膜蛋白的HepG2肿瘤细胞株的结合检测。
图2显示了多克隆细胞株04D10的FACS检测结果；其中A显示了多克隆细胞株04D10与HEK293细胞的结合结果；B显示了多克隆细胞株04D10与HepG2肝肿瘤细胞的结合结果。
图3显示了重组11H7B8单抗用于WB检测的结果。
图4显示了ELISA检测重组11H7B8单抗结合SLC13A5 nanodisc的EC50。
图5显示了BLI表征重组11H7B8单抗结合SLC13A5 nanodisc的结合亲和力。
图6显示了重组04D10E8单抗用于流式细胞检测的结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，筛选并制备得到抗体。本发明首次将人SLC13A5的C端20aa以非包膜VLP多价展示，经哺乳动物细胞表达使得人SLC13A5的C端20aa表位获得具有重要功能的翻译后修饰。以此为抗原蛋白进行免疫。筛选获得了两株单克隆抗体，分别命名为11H7B8和04D10E8。它们对人SLC13A5具有高水平的结合亲和力，可用于WB、ELISA和FACS检测。此外，本发明的抗SLC13A5抗体11H7B8和04D10E8抗体，以及经人源化改造后的抗体，具有抗体药物开发的潜力。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。
如本文所用，术语“非包膜VLP多价展示”是指将抗原表位通过结构设计融合在VLP(Virus Like Particle)衣壳单体亚基上，经哺乳动物细胞表达，VLP单体进行自组装形成VLP颗粒并将抗原表位展示在VLP表面。
如本文所用，术语“纳米磷脂盘(nanodisc)”是指全长膜蛋白及磷脂分子经由两亲聚合物或骨架蛋白围绕膜蛋白的跨膜区包裹稳定，使得全长膜蛋白形成直径大约20nm的颗粒，并能够在水溶液中稳定存在。如本文中所用的SLC13A5膜蛋白nanodisc，通常采用具有疏水和亲水双重特性的物质作为稳定剂，稳定剂朝向内部磷脂层的疏水面可以稳定膜蛋白的跨膜区，稳定剂的亲水面使得膜蛋白nanodisc能够在水溶液中稳定存在。全长SLC13A5膜蛋白经过纯化富集，组装成nanodisc，最大程度保持全长膜蛋白的天然构象，适合用于验证抗体功能性质。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”由两条轻链(L)和两条重链(H)形成的异元四聚体。每条重链的N端为可变区(VH)，连接重链恒定区。每条轻链的N端为可变区(VL)，连接轻链恒定区。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区在特定序列上有所不同，形成了特定抗体对特定抗原结合的亲和力和特异性。抗体可变区包括互补决定区(CDR)或超变区以及序列较为保守的构架区(FR)。重链，轻链可变区的一级序列由4段FR序列及3段CDR序列间隔排列组成(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。重链及轻链可变区的序列及空间结构构象决定了抗体对抗原表位的特异性结合。抗体恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但对捕获抗体及检测抗体的性能有影响。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为κ和λ中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类,主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，以及抗体亚型(同种型)，如小鼠IgG包括IgG1,IgG2a,IgG2b亚型。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原决定簇(表位)。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述抗SLC13A5的单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述抗SLC13A5的单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明的轻链和重链的可变区相同或具有至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，抗体偶联物及融合表达产物包括：荧光或发光标记物、放射性标记物、能够产生可检测产物的酶、金纳米颗粒/纳米棒和其他可用于检测的分子与所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段结合的而形成的偶联物；或者治疗性的药物、毒素、放射性核素等治疗分子与所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段结合的而形成的偶联物。
术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过较链区上的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的scFv片段。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有结合活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链或scFv。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠源抗体。重组抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的针对SLC13A5膜蛋白的单克隆抗体。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。
在本发明的一个方面，提供了一种抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段。本发明通过小鼠免疫筛选获得了两株抗SLC13A5抗体，克隆号为11H7B8和04D10E8。
重组11H7B8抗体的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
其中，N端的加粗下划线部分为信号肽序列(SEQ ID NO:5)；中间部分为重链可变区(SEQ ID NO:6)，下划线部分依次为重链可变区的CDR：H-CDR1(SEQ ID NO:7)、H-CDR2(SEQ ID NO:8)和H-CDR3(SEQ ID NO:9)，按照IMGT规则划分；斜体加粗部分为重链恒定区(mouse IgG3，SEQ ID NO:10)。
重组11H7B8抗体的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
其中，N端的加粗下划线部分为信号肽序列(SEQ ID NO:11)；中间部分为轻链可变区(SEQ ID NO:12)，下划线部分依次为轻链可变区的CDR：L-CDR1(SEQ ID NO:13)、L-CDR2(TAS)和L-CDR3(SEQ ID NO:14)，按照IMGT规则划分；斜体加粗部分为轻链恒定区(mouseIg kappa，SEQ ID NO:15)。
重组04D10E8抗体的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
其中，N端的加粗下划线部分为信号肽序列(SEQ ID NO:16)；中间部分为重链可变区(SEQ ID NO:17)，下划线部分依次为重链可变区的CDR：H-CDR1(SEQ ID NO:18)、H-CDR2(SEQ ID NO:19)和H-CDR3(SEQ ID NO:20)，按照IMGT规则划分；斜体加粗部分为重链恒定区(mouse IgG2b，SEQ ID NO:21)。
重组04D10E8抗体的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：
其中，N端的加粗下划线部分为信号肽序列(SEQ ID NO:22)；中间部分为轻链可变区(SEQ ID NO:23)，下划线部分依次为轻链可变区的CDR：L-CDR1(SEQ ID NO:24)、L-CDR2(DTS)和L-CDR3(SEQ ID NO:25)，按照IMGT规则划分；斜体加粗部分为轻链恒定区(mouseIg kappa，SEQ ID NO:15)。
本发明抗体的功能是由此抗体轻链和重链可变区序列和抗体结构构象决定，可以特异性地结合SLC13A5膜蛋白。利用此抗体可变区基因或互补决定区(CDR)基因，可在利用原核和真核细胞的任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合SLC13A5膜蛋白的抗体，例如具有重链(如SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列)和轻链(如SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列)的蛋白或多肽；或具有重链(如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列)和轻链(如SEQID NO:30所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列)的蛋白或多肽。
抗体的“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如用于化学发光的化合物，例如吖啶酯)偶联所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化或检测此多肽的标签蛋白序列或其它融合蛋白序列)。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有SLC13A5膜蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还包括本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约60个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
多核苷酸分子、载体和宿主细胞
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:27-30中所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO:27-30所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。此外，还可将重链或轻链与蛋白或标签序列(如荧光蛋白，Flag标签)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了抗体序列，就可以采用生物工程方法进行重组抗体制备。通常是将编码抗体序列的基因克隆入载体，再将表达载体转入细胞表达，收获细胞或表达上清，纯化获得重组抗体。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的质粒(或其他表达载体)。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明抗体序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞，重组表达抗体为本领域技术人员熟知的常规技术。重组表达的抗体可通过本领域技术人员熟知的常规技术分离和纯化，在此不再赘述。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段、或其融合蛋白、或其免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合SLC13A5蛋白分子，因而可用于治疗SLC13A5相关疾病，例如代谢性疾病、癌症或肿瘤等。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的抗体或免疫偶联物还可与其他治疗剂一起使用。
在本发明的一个实施方式中，使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抗体或免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
应用
本发明的抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与SLC13A5相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对SLC13A5的临床诊断和靶向治疗，如针对代谢性疾病(包括但不限于：肥胖、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病(NAFLD))的诊断和治疗；或癌症或肿瘤(例如肝癌)的诊断和治疗。
本发明的优点主要在于：
(1)本发明将人SLC13A5的C端20aa多价展示在非包膜VLP上，用哺乳动物细胞表达，使得该抗原表位具有翻译后修饰；且VLP具有免疫佐剂的作用，其展示的抗原表位能够产生较好的免疫反应。
(2)在杂交瘤多克隆，单克隆株筛选中采用全长膜蛋白SLC13A5 nanodisc能够大大提高筛选效率。SLC13A5 nanodisc是经过纯化富集的全长膜蛋白，具有接近细胞膜上天然膜蛋白的构象，适合用于快速筛选获得应用于WB、ELISA的抗体。
(3)本发明筛选得到的抗SLC13A5抗体11H7B8经BLI表征与全长人SLC13A5nanodisc结合亲和力(KD)水平约为28.4nM，可以应用于WB和ELISA。
(4)本发明筛选得到的抗SLC13A5抗体04D10E8可以与过表达SLC13A5的肿瘤细胞株HepG2和Huh7结合，该抗体可应用于FACS检测。
(5)本发明的抗SLC13A5抗体11H7B8和04D10E8经过人源化改造有作为治疗抗体的潜能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验，通常按常规条件进行，或按照原料/商品制造商建议的条件；未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1SLC13A5 CTD-VLP免疫及抗血清检测
将人SLC13A5的C端胞外区20aa(RAIFDLDHFPDWANVTHIET,SEQ ID NO:26)以非包膜VLP多价展示，构建抗原蛋白，用哺乳动物细胞表达，得到SLC13A5 CTD-VLP。
1.1哺乳动物细胞表达的非包膜SLC13A5 CTD-VLP免疫：初次免疫用100ulSLC13A5 CTD-VLP(估算总蛋白浓度0.2mg/ml)与等体积的氢氧化铝佐剂混合均匀，肌肉多点注射6周雌性Balb/C小鼠。加强免疫与初次免疫的剂量方法相同，每次免疫间隔两周，共计免疫五次。收集小鼠免疫后产生的抗血清anti-serum。
1.2抗血清效价检测：以SLC13A5 CTD-VLP抗原包板，结合抗血清anti-serum。抗血清稀释100倍，再以3倍梯度稀释加入ELISA板结合抗原。图1中A的ELISA结果显示抗血清具有较好的效价。
1.3抗血清与过表达SLC13A5膜蛋白的HepG2肿瘤细胞株的结合检测：考虑到抗血清中应含有结合VLP的抗体，需要进一步测试抗血清与过表达SLC13A5膜蛋白的HepG2肿瘤细胞株的结合。将抗血清稀释1000倍，与HepG2肝肿瘤细胞孵育结合，再用抗小鼠FC FITC标记二抗结合后，洗涤，FACS检测。图1中B显示抗血清中有抗SLC13A5特异性抗体产生。
实施例2杂交瘤融合及杂交瘤细胞株的筛选
采用实施例1中的哺乳动物细胞表达的非包膜SLC13A5 CTD-VLP免疫小鼠，小鼠在进行细胞融合前使用100ul SLC13A5 CTD-VLP用1×PBS稀释至300ul，腹腔注射进行加强免疫。取小鼠脾脏与SP2/0细胞混合，使用PEG1500做融合剂进行细胞融合，融合细胞培养10天后，取20ul，0.2mg/ml SLC13A5 CTD-VLP稀释到10ml PBS,pH7.4缓冲液中，以100ul/孔包被在聚氯乙烯ELISA板上，用间接法ELISA初筛抗原结合阳性的杂交瘤多克隆，使用不含SLC13A5 CTD序列的空VLP以0.4ug/ml，100ul/孔包被在聚氯乙烯板上，通过间接ELISA法进一步对SLC13A5 CTD-VLP阳性克隆进行负筛选，筛选出只结合SLC13A5 CTD的多克隆杂交瘤株。
SLC13A5 nanodisc是经过富集纯化的全长膜蛋白，适合作为Western Blot(WB)样品对应用于WB检测的杂交瘤抗体进行快速筛选。SLC13A5 nanodisc还可以直接包被ELISA板快速筛选出应用于ELISA的杂交瘤抗体。经SLC13A5nanodisc筛选获得适用于做WB和ELISA的多克隆细胞株11H7。
将多克隆细胞株上清分别孵育HepG2肝肿瘤细胞，阴性对照HEK293细胞，经FACS检测，筛选获得可用于FACS检测的多克隆细胞株04D10。图2中A显示多克隆细胞株04D10与HEK293细胞不结合，图2中B显示多克隆细胞株04D10可以结合HpeG2肝肿瘤细胞。
多克隆细胞株经有限稀释至单克隆状态后以上述相同方法进行杂交瘤单克隆细胞株筛选鉴定。从多克隆细胞株11H7中筛选获得了单克隆株11H7B8，适合用于膜蛋白SLC13A5的WB和ELISA检测。从多克隆细胞株04D10中筛选获得了单克隆株04D10E8适合用于膜蛋白SLC13A5的FACS流式检测。
实施例3杂交瘤单克隆抗体测序及重组抗体表达纯化
将单克隆杂交瘤细胞株培养至1E+07cell/ml细胞密度，进行杂交瘤单克隆抗体测序(百英生物)。11H7B8抗体重链为mouse IgG3，轻链为mouse Ig kappa。04D10E8抗体重链为mouse IgG2b，轻链为mouse Ig kappa。基因合成编码信号肽、可变区及恒定区的抗体重链及轻链基因序列(SEQ ID NO:27-30)，分别构建进哺乳细胞表达载体，表达载体可选用pTT5、pCDNA3.1等任意哺乳细胞表达商业化载体。重组质粒转染Expi293哺乳细胞，分泌表达抗体，细胞表达上清经protein A亲和纯化得到重组抗SLC13A5抗体。
11H7B8重组抗体重链核苷酸序列(SEQ ID NO:27)：
ATGCGAGTACTTATTTTGCTGTGGCTCTTTACTGCTTTTCCTGGGATCCTGTCCGATGTTCATCTTCAGGAAAGCGGGCCAGGTCTTGTCCGGCCTAGTCAGTCTCTCAGCCTTACCTGTACGGTTACTGACTACTCCATCACAAGCGATTATGCTTGGAATTGGATTAGGCAGTTTCCAGGCAATAAGTTGGAATGGATGGGTTACATTAGCTTCTCCGGGACCACCAATTTTAACCCGTCTTTGAAGTCCAGAATCTCCATTAGTCGCGATACCTCAAAGAACCAGTTCTTTCTGCAATTGATCAGCGTGACCACCGAAGATACTGCCACTTACTTTTGTGCTAGAGGAGCTAGAAGTGGTCCTTGGCTGGCCTACTGGGGTCAAGGAACGCCAGTTATCGTTTCCGCTGCCACGACAACAGCCCCCAGCGTTTATCCGCTGGTGCCTGGTTGCAGCGACACATCAGGGTCTAGCGTGACACTTGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACTTTCCTGAGCCCGTGACAGTAAAGTGGAACTATGGGGCATTGAGCAGCGGAGTTAGGACAGTGTCAAGCGTGCTTCAAAGCGGCTTCTATAGCCTTTCCTCCCTCGTGACCGTGCCATCTTCCACATGGCCCTCACAGACCGTAATCTGTAATGTGGCGCATCCCGCGTCAAAGACGGAACTGATCAAACGGATTGAACCGAGGATTCCTAAGCCATCCACACCACCGGGTTCCTCATGCCCACCGGGTAACATTTTGGGAGGCCCGAGCGTGTTTATTTTTCCACCAAAGCCTAAGGATGCATTGATGATATCTCTGACCCCGAAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTTAGTGAGGATGATCCGGACGTACACGTCTCTTGGTTCGTGGACAACAAGGAAGTGCACACAGCGTGGACCCAGCCAAGAGAAGCACAGTACAATTCTACGTTCCGGGTGGTGTCCGCTCTTCCCATCCAGCATCAGGATTGGATGAGAGGGAAAGAGTTCAAGTGCAAGGTCAACAACAAAGCACTCCCTGCACCTATTGAAAGGACGATCAGCAAACCAAAGGGAAGGGCGCAGACGCCACAAGTGTATACAATCCCTCCCCCTCGCGAGCAGATGTCAAAAAAGAAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTGACCAATTTCTTCTCAGAGGCCATCAGCGTCGAGTGGGAGCGGAATGGCGAGCTGGAGCAAGACTATAAGAACACGCCACCAATCCTGGACTCAGACGGGACATATTTCCTGTACTCTAAGCTGACAGTCGACACCGACAGTTGGTTGCAAGGCGAGATTTTTACATGCTCTGTTGTGCACGAAGCCCTGCATAATCATCATACTCAGAAGAACCTCTCCAGGAGTCCCGGGAAG
11H7B8重组抗体轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:28)：
ATGGAATCAGATACGTTGCTCCTGTGGGTTCTGCTCCTGTGGGTGCCTGGATCAACTGGCGACATTGTGCTCACCCAATCCCCTGCTTCTCTCGCCGTTAGTCTCGGGCAACGGGCTACTATTAGTTGTCGCGCTTCTGAAAGCGTGGAATATTCCGGCACCAATCTGATGCAGTGGTACCAGCAAAAGCCAGGTCAGCCCCCAAAGCTGCTCATCTACACCGCAAGTAACGTGGAATCTGGCGTCCCCGCCAGATTTAGCGGGTCAGGGTCTGGGACCGACTTCTCACTTAACATCCACCCTCTGGAGGAAGACGACATCGCCATGTATTTTTGTCAGCAGGGTAGAAAGGCACCTCTTACATTCGGCGCTGGTACAACCCTGGAACTGTTCCGCGCCGATGCCGCTCCTACAGTGAGCATCTTTCCTCCTTCCTCCGAGCAGCTGACAAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGTTTCCTGAACAACTTCTATCCTAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGACAGAACGGCGTGCTGAACTCCTGGACCGACCAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCATGTCCTCCACACTGACCCTGACCAAGGATGAGTACGAGAGGCACAACAGCTACACATGCGAGGCCACACACAAGACCTCCACCAGCCCTATCGTGAAGAGCTTCAATAGAAACGAGTGC
04D10E8重组抗体重链核苷酸序列(SEQ ID NO:29)：
ATGGGAAGGCTGACCTCATCTTTCCTCCTGCTCATTGTGCCTGCTTATGTATTGAGTCAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGCCCTGGAATCTTGCAACCTTCACAGACTCTGTCTCTTACATGCTCCTTTTCCGGCTTTAGCCTGTCCACATACGGCATGGGCGTGGCCTGGATTAGACAACCATCCGGCAAAGGCCTCGAGTGGCTTGCTCATATCTGGTGGAATGACGACAAGTACTTTAACACCGCCCTCAAGAGCAGACTGACTATCAGCAAAGATACATCCAACACCCAGGTGTTTCTGCGAATTGCCTCCGTGGACACTGCTGATACTGCCACTTACTACTGTGCACGGCTCACCAACTACCGGGATGGTGATTTCGATTATTGGGGCCAGGGCGCCACCCTGATAGTCTCCTCCGCCAAAACAACCCCTCCCAGTGTCTACCCCCTCGCTCCCGGTTGTGGGGACACTACAGGTTCATCTGTCACCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGGCTACTTCCCAGAGTCTGTGACCGTGACTTGGAACAGCGGCTCTCTGAGCTCTTCCGTGCACACCTTTCCTGCACTTTTGCAGTCCGGATTGTATACTATGTCTTCCAGTGTAACTGTGCCTAGCTCTACATGGCCTAGTCAGACCGTGACTTGCAGTGTAGCTCATCCGGCTTCCAGCACGACTGTGGACAAGAAACTGGAACCTAGTGGCCCTATCTCCACGATTAATCCCTGTCCTCCTTGCAAAGAGTGCCATAAATGCCCAGCTCCTAACTTGGAGGGGGGACCAAGTGTGTTTATCTTCCCCCCAAATATCAAGGACGTGCTCATGATCAGCCTCACCCCAAAAGTTACGTGCGTCGTGGTGGACGTTAGCGAAGACGACCCCGACGTGCAGATCTCCTGGTTCGTGAATAACGTAGAAGTGCATACAGCTCAGACCCAGACACACAGGGAAGATTACAACAGTACGATCAGGGTTGTGAGCACACTTCCCATACAGCACCAGGATTGGATGAGCGGTAAAGAGTTTAAGTGCAAGGTGAACAATAAAGATCTCCCCAGCCCAATTGAAAGAACAATCTCCAAGATCAAGGGGCTGGTGCGAGCGCCTCAGGTGTACATTCTGCCACCGCCTGCTGAGCAGCTGTCACGAAAGGACGTCTCTCTGACCTGCCTTGTCGTAGGTTTCAACCCTGGAGATATATCCGTGGAATGGACCAGTAACGGCCATACCGAGGAGAACTACAAGGATACCGCCCCGGTCCTCGACTCCGACGGGTCTTATTTTATTTACTCTAAGTTGAATATGAAAACATCCAAGTGGGAGAAAACTGACTCCTTTTCCTGCAATGTTAGACATGAGGGGCTGAAAAACTATTACTTGAAAAAAACAATTTCCAGGTCTCCCGGGAAG
04D10E8重组抗体轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:30)：
ATGGACTTCCAAGTGCAGATTTTTTCTTTCCTTCTCATATCAGCTAGCGTAATAATGAGCCGAGGCGAAAACGTGCTCACCCAGAGTCCTGCCATCATGAGTGCAAGCCCAGGTGAGAAAGTTACGATGACTTGTAGCGCCAACTCAGGCGTTAACTTTATCCACTGGTATCAGCAAAAGTCCAGCACCTCACCTAAGCTCTGGATCTACGATACATCAAAGCTCGCTTCCGGTGTTCCAGGCCGGTTTACAGGAAGTGGTTCAGGCAACAGTTACTCCCTGACGATCTCTAACATGGAGGCTGAGGATGTCGCCACTTACTATTGCTTTCAGGGCAGCGGTTATCCTCTCACTTTTGGTTCAGGGACTAAACTGGAGATTAAGCGCGCCGATGCCGCTCCTACAGTGAGCATCTTTCCTCCTTCCTCCGAGCAGCTGACAAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGTTTCCTGAACAACTTCTATCCTAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGACAGAACGGCGTGCTGAACTCCTGGACCGACCAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCATGTCCTCCACACTGACCCTGACCAAGGATGAGTACGAGAGGCACAACAGCTACACATGCGAGGCCACACACAAGACCTCCACCAGCCCTATCGTGAAGAGCTTCAATAGAAACGAGTGC
实施例4重组抗SLC13A5抗体11H7B8应用于WB及ELISA检测
分别使用空载体(pTT5 vector)和编码SLC13A5基因的哺乳表达质粒转染对数生长期的HEK293和HEK293T细胞。转染3天后收集细胞，使用膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白，以重组11H7B8单抗做WB检测。图3的WB结果显示，重组11H7B8单抗对空载体转染的HEK293和HEK293T膜蛋白提取样品均未检测到SLC13A5膜蛋白。在转染了编码SLC13A5基因的表达质粒的HEK293和HEK293T膜蛋白提取样品中，重组11H7B8单抗均检测到SLC13A5膜蛋白。
将全长人SLC13A5膜蛋白nanodisc以5ug/ml包板(nanodisc的浓度为估算的总蛋白浓度)，以20ug/ml，3倍梯度稀释的重组11H7B8单抗结合做ELISA。图4显示重组11H7B8单抗结合SLC13A5 nanodisc的EC50为0.14ug/ml。
进一步采用生物膜干涉技术(BLI,Gator Bio)表征全长人SLC13A5膜蛋白nanodisc与11H7B8重组抗体的结合。以Anti-His(His)探针捕获全长人SLC13A5膜蛋白nanodisc，11H7B8抗体作为分析物，浓度梯度为：1023.33，511.67，255.83，127.92，63.96，31.98，15.99nM，结果如图5所示，11H7B8抗体与全长人SLC13A5膜蛋白nanodisc结合亲和力(KD)水平约为28.4nM。
实施例5重组抗SLC13A5抗体04D10E8应用于流式细胞检测
以重组抗SLC13A5抗体04D10E8分别结合肿瘤细胞株HepG2和Huh7，流式检测步骤如下：
1)将T75方瓶对数生长的HepG2和Huh7细胞使用胰蛋白酶37℃消化3分钟，换培养基终止消化，轻柔吹打后过70um细胞筛。将细胞制备成单细胞悬液密度至2E+06个/ml。
2)将制备好的细胞离心收集，使用含3％FBS的1×PBS为封闭液重悬细胞，4℃静置30分钟封闭。
3)将重组抗SLC13A5抗体04D10E8稀释至10nM，分别孵育步骤2)中已封闭好的细胞。使用PBS孵育步骤2)中细胞做为阴性对照。4℃静置1小时。
4)以1×PBS洗涤细胞三次，使用抗小鼠FC FITC标记二抗分别与步骤3)中细胞组孵育。4℃静置30分钟。
5)将细胞使用1×PBS洗涤三次后轻柔吹打均匀成单细胞，流式上机分析。
图6中FACS曲线1为HepG2阴性对照，曲线2表明04D10E8重组抗体与过表达SLC13A5膜蛋白的肿瘤细胞株HepG2结合；曲线3为Huh7阴性对照，曲线4表明04D10E8重组抗体与过表达SLC13A5膜蛋白的肿瘤细胞株Huh7结合。
参考文献
1.Chen FF et al.,Mapping the Metabol ic Niche of Citrate Metabolismand SLC13A5.Metabolites.13(3)，331(2023)
2.Kumar A et al.,NaCT/SLC13A5 facilitates citrate import andmetabolism under nutrient-limited conditions.Cel l reports,36(11)，109701(2021)
3.Sauer DB et al.,Structure and inhibition mechanism of the humancitrate transporter NaCT.Nature 591,157–161(2021)
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含选自下组的重链可变区和轻链可变区：
(Z1)所述重链可变区包含以下3个CDR：SEQ ID NO:7所示的H-CDR1；SEQ ID NO:8所示的H-CDR2；SEQ ID NO:9所示的H-CDR3；以及
所述轻链可变区包含以下3个CDR：SEQ ID NO:13所示的L-CDR1；序列如TAS所示的L-CDR2；SEQ ID NO:14所示的L-CDR3；或
(Z2)所述重链可变区包含以下3个CDR：SEQ ID NO:18所示的H-CDR1；SEQ ID NO:19所示的H-CDR2；SEQ ID NO:20所示的H-CDR3；以及
所述轻链可变区包含以下3个CDR：SEQ ID NO:24所示的L-CDR1；序列如DTS所示的L-CDR2；SEQ ID NO:25所示的L-CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或
所述抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或
所述抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列。
4.一种重组抗体，其特征在于，所述的重组抗体具有：
(i)如权利要求1-3任一项所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段的序列；以及
(ii)任选的促进抗体分泌表达的信号肽和/或用于纯化、检测的标签序列。
5.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1-3任一项所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段；或
(2)如权利要求4所述的重组抗体。
6.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包含：
(a)如权利要求1-3任一项所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段或如权利要求4所述的重组抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、酶、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、纳米颗粒/纳米棒。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：
(a)如权利要求1-3任一项所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段、如权利要求4所述的重组抗体、或如权利要求6所述的抗体偶联物；以及
(b)药学上可接受的载体。
8.如权利要求1-3任一项所述的抗SLC13A5抗体或其抗原结合片段、如权利要求4所述的重组抗体、或如权利要求6所述的抗体偶联物的用途，用于制备：
(1)用于预防和/或治疗与SLC13A5相关的疾病或病症的药物；
(2)用于检测SLC13A5分子的检测试剂、检测板或检测试剂盒。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述与SLC13A5相关的疾病或病症包括代谢性疾病、癌症或肿瘤。
10.一种筛选抗SLC13A5抗体的方法，包括步骤：
(S1)将人SLC13A5的C端20aa(SLC13A5 CTD)以非包膜VLP多价展示，用哺乳动物细胞表达，从而获得用于免疫的抗原蛋白SLC13A5 CTD-VLP；
(S2)使用步骤(S1)中制备的抗原蛋白SLC13A5 CTD-VLP免疫受试动物，收集经免疫后动物的抗血清；
(S3)检测收集的抗血清与抗原蛋白SLC13A5 CTD-VLP的结合，若结合为阳性，则取经免疫后动物的脾脏，制备杂交瘤克隆；
(S4)用抗原蛋白SLC13A5 CTD-VLP对杂交瘤克隆进行初筛，从而获得抗原结合阳性的杂交瘤克隆；
(S5)使用不含SLC13A5 CTD序列的空VLP进一步对抗原结合阳性的克隆进行负筛选，筛选出只结合SLC13A5 CTD的阳性杂交瘤克隆。
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