KR20220058592A - 항 vegf 단일 도메인 항체 및 이의 응용 - Google Patents

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상하이 노바맙 바이오파아슈티컬 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 항 VEGF 단일 도메인 항체 및 이의 응용을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 항 VEGF 단일 도메인 항체 및 이의 VHH 사슬을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 단일 도메인 항체 또는 이의 VHH 사슬을 코딩하는 코딩 서열, 상응한 발현 벡터, 상기 단일 도메인 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포, 및 본 발명의 단일 도메인 항체의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 단일 도메인 항체는 인간 VEGFA를 특이적으로 인식할 수 있으며, VEGFB, VEGFC, VEGFD와 교차 반응을 일으키지 않고, 우수한 특이성을 갖고 있으며; 본 발명의 단일 도메인 항체는 인간, 마우스, 토끼 및 원숭이의 VEGFA를 동시에 인식할 수 있고, VEGFA와 VEGFR2 및 VEGFA와 VEGFR1의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있으며; 신생혈관 생성에 대해 우수한 억제 작용을 갖고; 본 발명의 단일 도메인 항체는 비제제의 조건하에서 바람직한 안정성을 나타낸다.

Description

항 VEGF 단일 도메인 항체 및 이의 응용
본 발명은 생물의학 또는 생물제약 기술분야에 관한 것으로, 더 구체적으로는 항 VEGF 단일 도메인 항체 및 이의 응용에 관한 것이다.
기존의 혈관내피성장인자 약물은 베바시주맙(Bevacizumab, 상품명 아바스틴(Avastin)), 캉바이시푸(Conbercept), 애플리버셉트(Aflibercept) 등을 포함한다. 2018년 2월 13일, 중국 식품약품감독관리총국(CFDA)은 성인 당뇨병성 황반부종의 치료에 사용되는 아일리아(Eylea)(애플리버셉트 안내 주사액)를 승인하였다. 항종양 치료에 사용되는 베바시주맙(Bevacizumab, 상품명 아바스틴(Avastin))의 가격은 1병당 4 ml(100 mg의 베바시주맙 함유)에 1998위안이며, 권장 용량은 5 mg/kg이고, 14일에 1회 투여하며, 환자의 체중이 60 kg인 경우 매회 300 mg의 베바시주맙, 즉 3병을 월 2회 투여하면 월 11988위안이다. 안과 질환 치료에 사용되는 캉바이시푸의 가격은 1개당 0.2 ml(10 mg의 캉바이시푸 함유)에 5550위안이며, 투여 방안은 첫 3개월 동안 월 1회 주사하고, 이후 3개월에 1회씩 주사하며, 1년에 총 6회 주사하는 즉, 연간 33300위안이다. 이 밖에, 애플리버셉트의 가격은 1병당 0.1 ml(4 mg의 애플리버셉트 함유)에 5850위안이며, 투여 방안은 2개월에 1회씩 투여하고, 1년에 총 6회 투여하는 즉, 연간 35100위안이다.
단일 도메인 항체(nanobody, Nb), 즉 중쇄 단일 도메인 항체 VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)―낙타 체내에는 천연적으로 경쇄가 결실된 중쇄 항체(heavy-chain antibody, HCAb)가 존재하고, 이의 가변 영역을 클로닝하여 얻은 하나의 중쇄 가변 영역으로만 구성된 단일 도메인 항체는, 현재 얻을 수 있는 완전한 기능을 갖는 안정적인 항원 결합 가능 최소 단위이다. 단일 도메인 항체는 높은 안정성, 우수한 수용성, 간단한 인간화, 높은 표적화, 강한 침투성과 같은 특성을 갖고, 면역 실험, 진단 및 치료에서 상상을 초월하는 큰 역할을 한다. 단일 도메인 항체는 차세대 항체 진단 및 치료에서 떠오르는 별이 되고 있다.
더 나은 특이성 및 차단 활성, 더 바람직한 임상 약효를 갖고, 생산이 간편하며 생산 비용을 절감할 수 있고 환자의 약물 부담을 줄일 수 있는 신규 항 VEGF 단일 도메인 항체를 개발하는 것은 이미 시급히 해결해야 될 문제가 되었다.
본 발명의 목적은 신규 항 VEGF 단일 도메인 항체 및 이의 응용을 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 목적은 VEGFA와 VEGFR2 및 VEGFA와 VEGFR1의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있으며, 신생혈관 생성에 대해 우수한 억제 작용을 갖고, 고형 종양에 대해 우수한 억제 작용을 갖고 있으며, 우수한 특이성을 갖는 단일 도메인 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에서, 항 VEGF 단일 도메인 항체 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)을 제공하고, 상기 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은 서열번호 1로 표시되는 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4에 의해 이격된다.
본 발명의 제2 양태에서, 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬을 제공하고, 상기 VHH 사슬은 프레임워크 영역(FR) 및 본 발명의 제1 양태에 따른 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 프레임워크 영역(FR)은,
(a) 서열번호 4로 표시되는 FR1, 서열번호 5로 표시되는 FR2, 서열번호 6으로 표시되는 FR3 및 서열번호 7로 표시되는 FR4; 또는
(b) 서열번호 10으로 표시되는 FR1, 서열번호 11로 표시되는 FR2, 서열번호 12로 표시되는 FR3 및 서열번호 13으로 표시되는 FR4를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬은 서열번호 8 또는 서열번호 14로 표시되는 바와 같다.
이 밖에, 또한 신규 항 VEGF 단일 도메인 항체의 중쇄 가변 영역을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1로 표시되는 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3을 포함한다.
본 발명의 제3 양태에서, 항 VEGF 항체를 제공하고, 상기 항 VEGF 항체는 본 발명의 제2 양태에 따른 VHH 사슬을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 항체는 디아바디(diabody), 단쇄 항체, 단일 도메인 항체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 항체는 동물 유래 항체, 키메라 항체, 인간화 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 인간화 항체, 인간-동물 키메라 항체이며, 더 바람직하게는 완전 인간화 항체이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 항체는 항체 단편일 수 있으며, 예를 들어 Fab, Fab', (Fab')2 또는 당해 기술분야에 공지된 다른 항체 유도체 등, 및 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체 또는 다른 아형의 항체 중 하나 이상일 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 항체는 항 VEGF 단일 도메인 항체이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 항체는 단량체, 2가(2가 항체) 및/또는 다가(다가 항체)이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 항체는 서열번호 8 또는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 항체의 VHH 사슬 서열은 서열번호 8 및/또는 서열번호 14로 표시된 바와 같다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 항체는 서열번호 8 또는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 2개의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 항체는 서열번호 8및/또는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열의 VHH 사슬을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 2개의 VHH 사슬 사이는 링커를 통해 연결된다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 링커는 (GaSb)x―(GmSn)y 서열로부터 선택되고, 여기서 a, b, m, n, x, y = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10(바람직하게는, a=4, b=1, m=3, n=1)이다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 링커는 GGGGSGGGS(서열번호 18), GS(서열번호 19), GGGGS(서열번호 20)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 항체의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시된 바와 같다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 2가 항 VEGF 항체는 hu bi-Nb24(Y)이다.
본 발명의 제4 양태에서, 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 제1 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체 VHH 사슬의 CDR 영역, 본 발명의 제2 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9 또는 서열번호 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함한다.
본 발명의 제5 양태에서, 발현 벡터를 제공하고, 상기 발현 벡터는 본 발명의 제4 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 발현 벡터는 DNA, RNA, 바이러스 벡터, 플라스미드(plasmid), 트랜스포존(transposon), 다른 유전자 전이 시스템 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 발현 벡터는 렌티바이러스(Lentivirus), 아데노바이러스(Adenovirus), AAV 바이러스, 레트로바이러스(Retrovirus) 또는 이들의 조합과 같은 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 제6 양태에서, 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제5 양태에 따른 발현 벡터를 포함하거나 또는 이의 게놈에 본 발명의 제4 양태에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 대장균, 효모 세포, 포유동물 세포, 파지(bacteriophage) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 원핵 세포는 대장균, 고초균, 락토바실러스(lactobacillus), 스트렙토마이세스(streptomyces), 프로테우스 미라빌리스(proteus mirabilis) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 진핵 세포는 피치아 파스토리스(pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(schizosaccharomyces pombe), 트리코데르마(trichoderma) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 진핵 세포는 폴아미웜(fall armyworm)과 같은 곤충 세포, 담배와 같은 식물 세포, BHK 세포, CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 바람직하게 포유동물 세포이고, 더 바람직하게 HEK293 세포, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포 또는 COS 세포이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 피치아 파스토리스이다.
본 발명의 제7 양태에서, 항 VEGF 단일 도메인 항체의 생성 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(a) 단일 도메인 항체의 생성에 적합한 조건하에서, 본 발명의 제6 양태에 따른 숙주 세포를 배양하여 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체를 포함하는 배양물을 획득하는 단계;
(b) 상기 배양물에서 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체를 분리하거나 회수하는 단계; 및
(c) 선택적으로, 정제 및/또는 변형하여 단계 (b)의 VEGF 단일 도메인 항체를 획득하는 단계를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체는 서열번호 8 또는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제8 양태에서, 면역 접합체를 제공하고, 상기 면역 접합체에는,
(a) 본 발명의 제2 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체; 및
(b) 검출 가능한 표지, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소, 금 나노입자/나노로드, 자성 나노입자, 바이러스 외피 단백질, VLP 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합 부분이 포함된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 방사성 핵종은,
(i) Tc-99m, Ga-68, F-18, I-123, I-125, I-131, In-111, Ga-67, Cu-64, Zr-89, C-11, Lu-177, Re-188 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단용 동위원소; 및/또는
(ii) Lu-177, Y-90, Ac-225, As-211, Bi-212, Bi-213, Cs-137, Cr-51, Co-60, Dy-165, Er-169, Fm-255, Au-198, Ho-166, I-125, I-131, Ir-192, Fe-59, Pb-212, Mo-99, Pd-103, P-32, K-42, Re-186, Re-188, Sm-153, Ra223, Ru-106, Na24, Sr89, Tb-149, Th-227, Xe-133 Yb-169, Yb-177 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료용 동위원소를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은 약물 또는 독소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약물은 세포 독성 약물이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 세포 독성 약물은 항튜불린 약물, DNA 작은 홈 결합 시약, DNA 복제 억제제, 알킬화 시약, 항생제, 엽산 길항제, 항대사 약물, 화학 증감제, 토포이소머라제 억제제(topoisomerase Inhibitor), 빈카 알카로이드(vinca alkaloid) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 특히 유용한 세포 독성 약물의 예는 예를 들어 DNA 작은 홈 결합 시약, DNA 알킬화 시약 및 튜불린 억제제를 포함하고, 전형적인 세포 독성 약물은 예를 들어 아우리스타틴(auristatins), 캠프토테신(camptothecins), 두오카르마이신(duocarmycins), 에토포시드(etoposides), 마이탄신(maytansines)과 마이탄시노이드(maytansinoids)(예를 들어 DM1과 DM4), 탁산(taxanes), 벤조디아제핀(benzodiazepines) 또는 벤조디아제핀 함유 약물(benzodiazepine containing drugs)(예를 들어, 피롤로[1,4]벤조디아제핀(PBDs), 인돌리노벤조디아제핀(indolinobenzodiazepines) 및 옥사졸리디노벤조디아제핀(oxazolidinobenzodiazepines)), 빈카 알카로이드(vinca alkaloids) 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 독소는 아우리스타틴(예를 들어, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 F, MMAE 및 MMAF), 클로르테트라사이클린(chlortetracycline), 유사 마이탄시놀(maytansinol), 리신 독소(ricin toxin), 리신 독소 A-사슬, 콤브레타스타틴(combretastatin), 듀오카르마이신(duocarmycins), 돌라스타틴(dolastatin), 아드리아마이신(adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), cc1065, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드, 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜키신(colchicine), 디히드록시안트락스디온(dihydroxyanthraxdione), 악티노마이신(actinomycin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 슈도모나스 독소(PE) A, PE40, 아브린(abrin), 아브린 A 사슬, 볼켄신(volkensin) A 사슬, α-사르시나, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 이노마이신(enomycin), 커신(curcin), 크로틴(crotin), 칼리키아마이신, 비누풀(Saponaria officinalis) 억제제, 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은 검출 가능한 표지이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은 형광 또는 발광 표지, 방사성 표지, MRI(자기공명영상) 또는 CT(전자컴퓨터 X선 단층 촬영 기술) 조영제, 또는 검출 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소, 방사성 핵종, 생물 독소, 사이토카인(예를 들어, IL-2 등), 항체, 항체 Fc 단편, 항체 scFv 단편, 금 나노입자/나노로드, 바이러스 입자, 리포좀(liposome), 자성 나노입자, 프로드러그 활성화 효소(예를 들어, DT-디아퍼라아제(DTD) 또는 비페닐 가수분해효소-유사 단백질(BPHL)), 화학 요법제(예를 들어, 시스플라틴) 또는 임의의 형태의 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역 접합체에는 다가(예를 들어, 2가)의 본 발명의 제2 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 본 발명의 제3 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체가 포함된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 다가는 상기 면역 접합체의 아미노산 서열에 다수의 중복된 본 발명의 제2 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 본 발명의 제3 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체가 포함되는 것을 의미한다.
본 발명의 제9 양태에서, 본 발명의 제2 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 본 발명의 제3 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 용도를 제공하고, 상기 용도는,
(a) 혈관의 생성을 억제하는 약물; 및
(b) VEGF 관련 질환 또는 병증을 치료하는 약물을 제조하는 데 사용된다.
본 발명의 제10 양태에서, 약학적 조성물을 제공하고, 상기 약학적 조성물에는,
(i) 본 발명의 제1 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR), 본 발명의 제2 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 본 발명의 제3 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체 또는 본 발명의 제9 양태에 따른 면역 접합체; 및
(ii) 약학적으로 허용 가능한 벡터가 포함된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역 접합체의 접합 부분은 약물, 독소 및/또는 치료용 동위원소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물에는 종양을 치료하는 다른 약물, 예를 들어 세포 독성 약물이 더 포함된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 VEGFA와 VEGFR2 및 VEGFA와 VEGFR1의 상호작용을 차단한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 주사 제형이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 VEGF 관련 질환 또는 병증을 치료하는 약물의 제조에 사용되고, 상기 질환 또는 병증은 종양 또는 암 또는 안구 질환을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양 또는 암은 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 대장암, 폐암, 갑상선암, 비인두암 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 안구 질환은 연령 관련 황반변성, 당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄, 병적근시, 신생혈관성 녹내장 및 신생혈관에 관한 다른 안과 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 제11 양태에서, 본 발명의 제3 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 하나 이상의 용도를 제공하고, 상기 용도는,
(a) 혈관의 생성을 억제하는 약물의 제조;
(b) VEGF 관련 질환 또는 병증을 치료하는 약물의 제조;
(c) 인간 VEGF 분자의 검출;
(d) 유세포 분석;
(e) 세포 면역 형광 검출;
(f) 종양의 치료; 및
(g) 종양의 진단에 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 용도는 진단적 및/또는 비진단적, 및/또는 치료적 및/또는 비치료적인 것이다.
본 발명의 제12 양태에서, 항체를 제공하고, 상기 항체는 하나 이상의 본 발명의 제2 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 2개의 본 발명의 제2 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 본 발명의 제2 양태에 따른 중쇄 가변 영역 VHH를 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 정확한 공간 구조를 갖는 VEGFA 단백질을 특이적으로 표적화할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 인간, 마우스, 토끼, 원숭이의 VEGFA를 인식할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 인간의 VEGFB, VEGFC, VEGFD와 교차 반응을 일으키지 않는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 VEGFA와 VEGFR2 및 VEGFA와 VEGFR1의 상호작용을 차단할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 신생혈관의 생성을 억제할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 단일 도메인 항체이다.
본 발명의 제13 양태에서, 재조합 단백질을 제공하고, 상기 재조합 단백질은,
(i) 본 발명의 제2 양태에 따른 VHH 사슬 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체; 및
(ii) 발현 및/또는 정제에 협조하는 선택적인 태그 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 태그 서열은 Fc 태그, HA 태그 및 6His태그를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 재조합 단백질은 VEGFA 단백질에 특이적으로 결합된다.
본 발명의 제14 양태에서, 본 발명의 제2 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 본 발명의 제3 양태에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역 접합체의 용도를 제공하고, 상기 용도는 약제, 시약, 검출 플레이트 또는 키트의 제조에 사용되며;
여기서, 상기 시약, 검출 플레이트 또는 키트는 샘플의 VEGF 단백질을 검출하는 데 사용되고;
여기서, 상기 약제는 VEGF 관련 질환 또는 병증의 치료 또는 예방에 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출은 유세포 분석, 세포 면역 형광 검출을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 질환 또는 병증은 종양 또는 암 또는 안구 질환을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양 또는 암은 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 대장암, 폐암, 갑상선암, 비인두암 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 안구 질환은 연령 관련 황반변성, 당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄, 병적근시, 신생혈관성 녹내장 및 신생혈관에 관한 다른 안과 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 제15 양태에서, 질환의 치료 방법을 제공하고, 필요한 대상에게 본 발명의 제3 양태에 따른 단일 도메인 항체 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역 접합체를 투여하는 단계를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 대상은 포유동물, 예를 들어 인간, 마우스, 토끼, 원숭이이다.
본 발명의 제16 양태에서, 샘플 중 VEGFA 단백질의 검출 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(1) 샘플을 본 발명의 제2 양태에 따른 VHH 사슬, 본 발명의 제3 양태에 따른 단일 도메인 항체, 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역 접합체에 접촉시키는 단계; 및
(2) 항원-항체 복합체를 형성하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하되, 복합체를 형성하면 샘플에 VEGFA 단백질이 존재함을 나타낸다.
다른 바람직한 예에서, 상기 방법은 비진단적 및 비치료적 방법이다.
본 발명의 제17 양태에서, VEGFA 단백질 검출 시약을 제공하고, 상기 검출 시약은,
(i) 본 발명의 제2 양태에 따른 VHH 사슬, 본 발명의 제3 양태에 따른 단일 도메인 항체, 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역 접합체; 및
(ii) 검출학적으로 허용 가능한 벡터를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역 접합체의 접합 부분은 진단용 동위원소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출학적으로 허용 가능한 벡터는 무독성, 불활성의 수성 캐리어 매질이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약은 동위원소 추적자(tracer), 조영제, 유세포 분석 시약, 세포 면역 형광 검출 시약, 자성 나노입자 및 현상제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약은 체내 검출에 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약의 제형은 액체 형태 또는 분말 형태(예를 들어,액제, 주사제, 동결 건조 분말, 정제, 구강붕해제, 분무흡수제)이다.
본 발명의 제18 양태에서, VEGFA 단백질을 검출하는 키트를 제공하고, 상기 키트는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역 접합체 또는 본 발명의 제17 양태에 따른 검출 시약 및 설명서를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 설명서에는 상기 키트가 시험할 대상의 VEGFA 발현을 비침투적으로 검출하는 데 사용된다는 것이 기재된다.
본 발명의 제19 양태에서, 본 발명의 제8 양태에 따른 면역 접합체의 용도를 제공하고, 상기 용도는 체내에서 VEGFA 단백질을 검출하는 조영제를 제조하는 데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출은 암의 진단 또는 예후에 사용된다.
본 발명의 제20 양태에서, 항 VEGF 단일 도메인 항체 VHH 사슬의 프레임워크 영역(FR)을 제공하고, 상기 VHH 사슬의 프레임워크 영역(FR)은 서열번호 4로 표시되는 FR1, 서열번호 5로 표시되는 FR2, 서열번호 6으로 표시되는 FR3, 서열번호 7로 표시되는 FR4로 구성되거나; 또는 서열번호 10으로 표시되는 FR1, 서열번호 11로 표시되는 FR2, 서열번호 12로 표시되는 FR3 및 서열번호 13으로 표시되는 FR4로 구성된다.
본 발명의 제21 양태에서, VEGF 관련 질환 또는 병증의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 필요한 대상에게 본 발명의 제10 양태에 따른 약학적 조성물을 제공하는 단계를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 대상은 인간과 같은 포유동물을 포함한다.
이해해야 할 것은, 본 발명의 범위 내에서 본 발명의 상기 각 기술특징과 하기(예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술특징 사이는 서로 조합되어, 새로운 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있다. 편폭에 한하여, 여기에서 더 이상 일일이 설명하지 않는다.
도 1은 ELISA에 의해 인간 VEGFA와 VEGFR2의 상호 작용을 차단할 수 있는 단일 도메인 항체를 동정한 결과이다. 동정한 결과, 후보 항체 Nb24의 차단 활성은 대조군 항체 Avastin보다 현저히 우수하다. 여기서, 아바스틴(Avastin)은 베바시주맙(Bevacizumab)이다.
도 2는 HUVEC 세포에 대한 후보 항체의 증식 억제 작용의 검출 결과이다. 동정한 결과, HUVEC 세포에 대한 후보 항체 Nb24의 증식 억제 작용은 대조군 항체 Avastin보다 강하다.
도 3은 효모 발현 huNb24 2가의 SEC-HPLC 검출 결과이다. 황산 암모늄으로 침전하여 정제된 샘플을 SEC-HPLC로 동정하며, 샘플 순도는 94.11%에 도달할 수 있다.
도 4는 ELISA로 후보 항체의 인간화 후의 차단 활성을 검출한 것이다. 결과는 인간화 전과 인간화 후의 항체의 차단 활성이 유사(IC50 Nb24=0.045 μg/ml, IC50 huNb24=0.038 μg/ml)하기에 인간화가 성공적임을 나타낸다. 여기서, Nb24는 인간화 전 항체이고, huNb24는 인간화 후 항체이다.
도 5는 ELISA로 효모 발현 인간화 2가 항체의 차단 활성을 검출한 것이다. 결과는 효모 발현 단일 도메인 항체 2가의 차단 활성이 현저히 향상(IC50 huNb24=0.044 μg/ml, IC50 hu bi-Nb24(Y)=0.013 μg/ml)되고, 대조군 항체 Avastin의 차단 활성(IC50 Avastin=0.331 μg/ml)보다 현저히 높음을 나타낸다. 여기서, hu bi-Nb24(Y)는 효모 발현 인간화 2가 항체이다.
도 6은 ELISA로 인간화 2가 항체와 동종 출시 제품의 차단 활성을 검출하여 비교한 것이다. 결과는 효모 발현 인간화 이량체 항체의 차단 활성이 현저한 우세를 갖고, 몇 가지 출시 제품의 차단 활성보다 우수함을 나타낸다(IC50 hu bi-Nb24(Y)=0.022 μg/ml, IC50 Eylea=0.085 μg/ml, IC50 Conbercept=0.088 μg/ml, IC50 Avastin=0.439 μg/ml). 여기서, Eylea는 애플리버셉트이고, Conbercept는 캉바이시푸이다.
도 7은 HUVEC 세포에 대한 효모 발현 인간화 2가 항체의 증식 억제 작용의 검출 결과이다. 결과는 효모 발현 인간화 2가 항체의 효과가 동종 출시 대조 제품보다 우수함을 나타낸다(IC50 hu bi-Nb24(Y)=53.59 ng/ml, IC50 Eylea=65.96 ng/ml, IC50 Conbercept=129.7 ng/ml, IC50 Avastin=254.7 ng/ml).
도 8은 ELISA에 의해 후보 항체가 VEGF 상동 단백질과 교차 반응을 일으키는지 여부를 검출한 결과이다. 결과는 인간화 2가 항체가 인간 VEGF와 반응을 일으킬 수 있고, VEGFB, VEGFC, VEGFD와 같은 다른 상동 단백질과 교차 반응을 일으키지 않으며, 특이성이 우수함을 나타낸다.
도 9는 ELISA에 의해 후보 항체가 다른 종의 VEGF와 교차 반응을 일으키는지 여부를 검출한 결과이다. 결과는 인간화 2가 항체가 인간, 마우스, 토끼의 VEGFA를 동시에 인식할 수 있음을 나타낸다.
도 10은 ELISA에 의해 인간 VEGFA와 VEGFR1의 상호작용에 대한 효모 발현 인간화 2가 항체의 차단을 검출한 결과이다. 결과는 후보 항체가 인간 VEGFA와 VEGFR1의 상호작용(IC50 hu bi-Nb24(Y)=0.168 μg/ml)을 차단할 수 있고, 차단 활성이 대조군 항체 Avastin보다 우수함을 나타낸다(IC50 Avastin=0.967 μg/ml).
도 11은 OIR 모델 마우스의 망막 비관류 영역 면적을 통계한 결과이다. 마우스에 대해 상이한 농도의 효모 발현 인간화 2가 항체를 투여하며, 실험군 마우스의 망막 비관류 영역 면적은 양성대조군보다 작다.
도 12는 OIR 모델 마우스의 망막 신생혈관 클러스터를 통계한 결과이다. 애플리버셉트 Eylea(양성대조군)에 비해, 상이한 농도의 효모 발현 인간화 2가 항체는 마우스의 망막 신생혈관 클러스트에 대한 억제 효과가 더 현저하고, 통계학적으로 차이가 있다.
도 13은 SEC-HPLC로 상이한 온도에서의 후보 항체의 안정성을 검출한 결과이다. 도 13a는 4℃에서 1개월 동안 배치한 후의 후보 항체의 안정성 결과를 도시하며, 결과는 상기 항체가 비제제 조건하에 4℃에서 1개월 동안 배치한 후 현저한 순도 변화가 없고, 바람직한 안정성을 보여줌을 나타낸다. 도 13b는 25℃에서 1개월 동안 배치한 후의 후보 항체의 안정성 결과를 도시하며, 결과는 상기 항체가 비제제 조건하에 25℃에서 1개월 동안 배치한 후 현저한 순도 변화가 없고, 바람직한 안정성을 보여줌을 나타낸다. 도 13c는 40℃에서 15일 동안 배치한 후의 후보 항체의 안정성 결과를 도시하며, 결과는 상기 항체가 비제제 조건하에 40℃에서 15일 동안 배치한 후 현저한 순도 변화가 없고, 바람직한 안정성을 보여줌을 나타낸다. 도 13d는 -20℃에서 동결 및 융해를 5번 반복한 후의 후보 항체의 안정성 결과를 도시하며, 결과는 상기 항체가 비제제 조건하에 -20℃에서 동결 및 융해를 5번 반복한 후 현저한 순도 변화가 없고, 바람직한 안정성을 보여줌을 나타낸다.
본 발명자의 광범위하고 심층적인 연구 끝에, 대량의 스크리닝을 통해 항 VEGF 단일 도메인 항체를 처음으로 예기치 않게 발견하였으며, 실험 결과에 따르면, 본 발명의 단일 도메인 항체는 VEGFA를 특이적으로 인식할 수 있고, VEGFB, VEGFC, VEGFD와 교차 반응을 일으키지 않으며, 우수한 특이성을 갖고; VEGFA와 VEGFR2 및 VEGFA와 VEGFR1의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있으며; 신생혈관의 생성에 대해 우수한 억제 작용을 갖는다. 본 발명의 단일 도메인 항체의 생성은 간편하다. 따라서, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명은 인간 유래 VEGFA 단백질로 낙타를 면역화하여 고품질의 면역 단일 도메인 항체 유전자 라이브러리를 획득한다. 그런 다음 VEGFR 단백질 분자를 ELISA 플레이트에 접합시켜 VEGFR 단백질의 정확한 공간 구조를 디스플레이하고, 이 형태의 항원을 파지 디스플레이 기술로 면역 단일 도메인 항체 유전자 라이브러리(낙타 중쇄 항체 파지 디스플레이 유전자 라이브러리)를 스크리닝하여, VEGFA 특이적 단일 도메인 항체 유전자를 획득한다. 그런 다음 이 유전자를 포유동물 세포에 전이함으로써, 포유동물 세포에서 고효율적으로 발현되고 특이성이 높은 단일 도메인 항체 균주를 획득한다. 그런 다음 ELISA, 유세포 분석, 루시퍼라제 리포터 유전자 검출 시스템 등 방법을 통해 차단 활성을 갖는 항 VEGF 단일 도메인 항체를 동정한다.
용어
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “본 발명의 단일 도메인 항체”, “본 발명에 따른 단일 도메인 항체”, “본 발명의 항 VEGF 항체”, “본 발명의 VEGF 단일 도메인 항체”, “항 VEGF 단일 도메인 항체”는 동일한 의미를 갖고 호환하여 사용할 수 있으며, VEGFA(인간 VEGFA 포함)를 특이적으로 인식하고 결합하는 단일 도메인 항체를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 단일 도메인 항체의 가변 영역은 서열번호 1로 표시되는 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3을 갖는다. 더 바람직하게는, 본 발명의 단일 도메인 항체의 프레임워크 영역은 (a) 서열번호 4로 표시되는 FR1, 서열번호 5로 표시되는 FR2, 서열번호 6으로 표시되는 FR3 및 서열번호 7로 표시되는 FR4를 갖거나, 또는 (b) 서열번호 10으로 표시되는 FR1, 서열번호 11로 표시되는 FR2, 서열번호 12로 표시되는 FR3 및 서열번호 13으로 표시되는 FR4를 갖는다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “항체” 또는 “면역글로불린”은 동일한 구조 특징을 갖는 약 150000달톤의 헤테로테트라글리칸 단백질이고, 이는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합을 통해 중쇄에 연결되며, 상이한 면역글로불린의 동형의 중쇄 사이의 이황화 결합은 개수가 상이하다. 각 중쇄와 경쇄에도 규칙적인 간격의 사슬 내 이황화 결합이 있다. 각 중쇄의 일단에는 가변 영역(VH)이 있고, 그 뒤에는 다수의 불변 영역이 있다. 각 경쇄의 일단에는 가변 영역(VL)이 있고, 타단에는 불변 영역이 있으며; 경쇄의 불변 영역과 중쇄의 첫 번째 불변 영역은 대향하고, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역은 대향한다. 특수한 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄의 가변 영역 사이에서 계면을 형성한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “단일 도메인 항체”, “VHH”, “나노바디(nanobody)”, “단일 도메인 항체”(single domain antibody, sdAb, 또는 나노바디nanobody)는 동일한 의미를 갖고 호환하여 사용할 수 있으며, 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하여 하나의 중쇄 가변 영역으로만 구성된 단일 도메인 항체(VHH)를 구축하는 것을 의미하고, 이는 완전한 기능을 갖는 최소 항원 결합 단편이다. 통상적으로, 먼저 천연적으로 경쇄 및 중쇄 불변 영역 1(CH1)이 결실된 항체를 획득한 후, 항체 중쇄의 가변 영역을 클리닝하여, 하나의 중쇄 가변 영역으로만 구성된 단일 도메인 항체(VHH)를 구축한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “가변”은 항체 중 가변 영역의 일부 부분이 서열 상에서 상이함을 나타내고, 이는 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합과 특이성을 형성한다. 그러나, 가변성은 항체 가변 영역 전체에 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄와 중쇄 가변 영역에서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라고 하는 3개의 단편에 집중되어 있다. 가변 영역에서 더 보존된 부분을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 이들은 대략 β-시트 구성이고, 연결 고리를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결되며, 일부 경우에서는 부분적으로 β-시트 구조를 형성할 수 있다. 각 사슬 중의 CDR은 FR 영역을 통해 밀착되고 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성한다(Kabat 등, NIH Publ. No. 91-3242, 볼륨 I, 647-669페이지(1991) 참조). 불변 영역은 항원과 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 상이한 이펙터 기능을 나타내고, 예를 들어 항체의 항체 의존적 세포 독성에 관여하는 것이다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 면역 접합체 및 융합 발현 생성물은 약물, 독소, 사이토카인(cytokine), 방사성 핵종, 효소 및 다른 진단 또는 치료 분자와 본 발명의 항체 또는 이의 단편이 결합되어 형성된 접합체를 포함한다. 본 발명은 상기 항 VEGF 항체 또는 이의 단편에 결합되는 세포 표면 표지 또는 항원을 더 포함한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “중쇄 가변 영역”과 “VH”는 호환하여 사용될 수 있다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “가변 영역”과 “상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)”은 호환하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 바람직한 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
본 발명의 일 바람직한 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄는 상기 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명에서, 용어 “본 발명의 항체”, “본 발명의 단백질” 또는 “본 발명의 폴리펩티드”는 호환하여 사용될 수 있고, VEGF 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 의미하며, 예를 들어 중쇄 가변 영역을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 이들은 시작 메티오닌(methionine)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
일반적으로, 항체의 항원 결합 특성은 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 분리된 가변 영역이라고 하는 중쇄 가변 영역에 위치한 3개의 특정 영역으로 설명할 수 있으며, 4개의 FR의 아미노산 서열은 상대적으로 보존적이고, 결합 반응에 직접적으로 관여하지 않는다. 이러한 CDR은 고리형 구조를 형성하고, 그 사이의 FR을 통해 형성된 β-시트는 공간 구조 상에서 서로 가까우며, 중쇄 상의 CDR과 상응한 경쇄 상의 CDR은 항체의 항원 결합 사이트를 구성한다. 동일한 유형의 항체의 아미노산 서열을 비교하여 FR 또는 CDR 영역을 구성하는 아미노산을 결정할 수 있다.
본 발명의 항체의 중쇄의 가변 영역은 이들 중 적어도 일부가 항원 결합에 관여하기 때문에 특히 흥미로운 것이다. 따라서, 본 발명은 CDR이 여기에서 동정된 CDR과 90% 이상(바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상)의 상동성을 갖고 있으면 CDR이 있는 항체 중쇄 가변 영역을 갖는 분자를 포함한다.
본 발명은 완전한 항체를 포함할 뿐만 아니라 상기 항체의 단편, 유도체 및 유사체를 포함한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “단편”, “유도체” 및 “유사체”는 본 발명의 항체와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 기본적으로 유지하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드일 수 있고, 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 코딩되거나 코딩되지 않을 수 있으며, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에 치환기를 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 또는 (iii) 성숙한 폴리펩티드와 다른 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같이 폴리펩티드 반감기를 연장하는 화합물)의 융합에 의해 형성된 폴리펩티드일 수 있으며, 또는 (iv) 추가 아미노산 서열을 해당 폴리펩티드 서열에 융합하여 형성된 폴리펩티드(예를 들어, 리더 서열 또는 분비 서열 또는 해당 폴리펩티드를 정제하는 서열 또는 프로단백질 서열, 또는 6His 태그와 형성된 융합 단백질)일 수 있다. 본문의 교시에 따라 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에게 공지된 범위에 속한다.
본 발명의 항체는 VEGFA 결합 활성을 갖고 상기 CDR 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어는 본 발명의 항체와 동일한 기능을 갖고 상기 CDR 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변이체 형태를 더 포함한다. 이러한 변이체 형태는 하나 이상(통상적으로 1 ~ 50개, 바람직하게는 1 ~ 30개, 더 바람직하게는 1 ~ 20개, 가장 바람직하게는 1 ~ 10개)의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 및 C 말단 및/또는 N 말단에 하나 이상(통상적으로 20개 이내, 바람직하게는 10개 이내, 더 바람직하게는 5개 이내)의 아미노산의 추가를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 기술분야에서 성능이 비슷하거나 유사한 아미노산으로 치환하는 경우, 통상적으로 단백질의 기능을 변화시키지 않는다. 다른 예를 들면, C 말단 및/또는 N 말단에 하나 이상의 아미노산의 추가도 통상적으로 단백질의 기능을 변화시키지 않는다. 상기 용어는 본 발명의 항체의 활성 단편 및 활성 유도체를 더 포함한다.
상기 폴리펩티드의 변이체 형태는 상동 서열, 보존적 변이체, 대립유전자변이체, 천연 돌연변이체, 유도 돌연변이체, 높거나 낮은 엄중도의 조건하에 본 발명의 항체의 코딩 DNA와 혼성화할 수 있는 DNA에 의해 코딩된 단백질, 및 본 발명의 항체에 대한 항혈청을 사용하여 획득한 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.
본 발명은 또한 대략 전장 폴리펩티드 이외의 다른 폴리펩티드를 제공하고, 본 발명은 본 발명의 단일 도메인 항체의 단편을 더 포함한다. 통상적으로, 상기 단편은 본 발명의 항체의 적어도 약 50개의 연속적인 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 50개의 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 약 80개의 연속적인 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 약 100개의 연속적인 아미노산을 갖는다.
본 발명에서, “본 발명의 항체의 보존적 변이체”는 본 발명의 항체의 아미노산 서열에 비해 10개 이하, 바람직하게는 8개 이하, 더 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 3개 이하의 아미노산이 특성이 유사하거나 비슷한 아미노산에 의해 치환되어 형성된 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 보존적으로 변이된 폴리펩티드는 표 1에 따른 아미노산 치환에 의해 생성되는 것이 가장 바람직하다.
초기 잔기 대표적인 치환 바람직한 치환
Ala(A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn(N) Gln; His; Lys; Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro; Ala Ala
His(H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile(I) Leu; Val; Met; Ala; Phe Leu
Leu(L) Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys(K) Arg; Gln; Asn Arg
Met(M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val(V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala Leu
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 형태 또는 RNA 형태일 수 있다. DNA 형태는 cDNA, 게놈DNA 또는 인공 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있다. DNA는 코딩 사슬 또는 비코딩 사슬일 수 있다.
본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 성숙한 폴리펩티드만을 코딩하는 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열 및 각 추가 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열(및 선택적인 추가 코딩 서열) 및 비코딩 서열을 포함한다.
용어 “폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드”는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 추가 코딩 및/또는 비코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 서열과 혼성화하고 2개의 서열 사이에 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 엄격한 조건하에 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, “엄격한 조건”은 (1) 낮은 이온 강도 및 높은 이온 강도에서의 혼성화 및 용출, 예를 들어 0.2×SSC, 0.1% SDS, 60℃; 또는 (2) 혼성화할 때 변성제의 추가, 예를 들어 50%(v/v) 포름아미드(formamide), 0.1% 송아지 혈청/0.1% 피콜(Ficoll), 42℃ 등; 또는 (3) 두 서열 사이의 동일성이 적어도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상인 경우에만 혼성화가 일어나는 것을 의미한다. 또한, 혼성화 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드는 성숙한 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 및 활성을 갖는다.
본 발명의 항체의 뉴클레오티드 전장 서열 또는 이의 단편은 통상적으로 PCR 증폭 방법, 재조합 방법 또는 인공 합성 방법을 사용하여 획득할 수 있다. 하나의 가능한 방법은 인공 합성 방법을 사용하여 관련 서열을 합성하는 것이며, 특히 단편 길이가 짧은 경우에 해당된다. 통상적으로, 먼저 다수의 작은 단편을 합성한 후 연결하여 매우 긴 서열의 단편을 획득할 수 있다. 이 밖에, 중쇄의 코딩 서열 및 발현 태그(예를 들어, 6His)를 융합하여 융합 단백질을 형성할 수 있다
관련 서열을 획득하면, 재조합 방법을 사용하여 관련 서열을 대량으로 획득할 수 있다. 이는 통상적으로 이를 벡터로 클로닝한 후 세포로 전이하고, 일반적인 방법을 통해 증식된 숙주 세포에서 관련 서열을 분리함으로써 획득한다. 본 발명에 관한 생체 분자(핵산, 단백질 등)은 분리된 형태로 존재하는 생체 분자를 포함한다.
현재, 화학적 합성을 통해 전적으로 본 발명의 단백질(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열을 획득할 수 있다. 그런 다음 상기 DNA 서열을 본 기술분야에 공지된 각 기존의 DNA 분자(또는 벡터 등) 및 세포에 도입시킬 수 있다. 이 밖에, 화학적 합성을 통해 돌연변이를 본 발명의 단백질 서열에 도입시킬 수 있다.
본 발명은 또한 상기 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 조절 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 적절한 숙주 세포를 형질전환시켜 단백질을 발현할 수 있도록 한다.
숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예로는 대장균, 스트렙토마이세스; 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; 초파리 S2 또는 Sf9의 곤충 세포; CHO, COS7, 293 세포의 동물 세포 등이 있다.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 숙주가 대장균과 같은 원핵 생물인 경우, DNA를 흡수할 수 있는 컴피턴트 세포는 지수발육기 후에 획득될 수 있고, CaCl2 방법으로 처리되며, 사용된 단계는 본 기술분야에 잘 알려진 것이다. 다른 하나의 방법은 MgCl2를 사용하는 것이다. 필요하면 형질전환은 전기천공법을 사용할 수도 있다. 숙주가 진핵 생물인 경우, 인산칼슘 공침법, 통상적인 기계적 방법, 예를 들어 미세주입, 전기천공, 리포좀 패키징과 같은 DNA 형질감염 방법을 사용할 수 있다.
획득된 형질전환체는 통상적인 방법으로 배양하여 본 발명의 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 배양 과정에서 사용된 배지는 사용된 숙주 세포에 따라 통상적인 배지에서 선택될 수 있다. 배양은 숙주 세포의 성장에 적합한 조건에서 수행된다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도로 성장한 후, 적합한 방법(예를 들어, 온도 전환 또는 화학적 유도)을 사용하여 선택된 프로모터를 유도한 다음, 세포를 일정한 시간 동안 배양한다.
상기 방법 중의 재조합 폴리펩티드는 세포내 또는 세포막에서 발현될 수 있거나, 또는 세포외로 분비될 수 있다. 필요하면 이의 물리적, 화학적 또는 다른 특성을 사용하여 다양한 분리 방법으로 재조합된 단백질을 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려진 것이다. 이러한 방법의 예로는 통상적인 재생 처리, 단백질 침전제 처리(염석법), 원심분리, 삼투압 파괴, 과처리, 초원심분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 다른 다양한 액상 크로마토그래피 기술 및 이러한 방법의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 단독으로 사용할 수 있거나, 검출 가능한 표지(진단을 목적으로), 치료제, PK(단백질 키나아제) 변형 부분 또는 상기 물질의 임의의 조합과 결합 또는 접합하여 사용할 수 있다.
진단을 목적으로 하는 검출 가능한 표지는 형광 또는 발광 표지, 방사성 표지, MRI(자기공명영상) 또는 CT(전자컴퓨터 X선 단층 촬영 기술) 조영제, 또는 검출 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체에 결합 또는 접합될 수 있는 치료제는 1. 방사성 핵종; 2. 생물 독소; 3. IL-2와 같은 사이토카인; 4. 금 나노입자/나노로드; 5. 바이러스 입자; 6. 리포좀; 7. 자성 나노입자; 8. 프로드러그 활성화 효소(예를 들어, DT-디아퍼라아제(DTD) 또는 비페닐 가수분해효소-유사 단백질(BPHL)); 9. 화학 요법제(예를 들어, 시스플라틴) 또는 임의의 형태의 나노입자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
혈관내피성장인자(Vasc uLar Endothelial Growth Factor, VEGF)
혈관내피성장인자(Vasc uLar Endothelial Growth Factor, VEGF)는 고도로 특이적인 혈관내피성장인자로, VEGF는 내피 세포막의 수용체, 혈관내피성장인자 수용체(Vasc uLar Endothelial Growth Factor Receptor, VEGFR)에 결합되어 수용체의 자가인산화를 일으킴으로써, 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)를 활성화하여 미토겐 특성을 구현하고 내피 세포 증식을 유도한다. VEGF는 혈관 신생 특성으로 인해 혈액 순환이 불충분한 경우 조직의 산소 공급을 회복시킬 수 있다. 조직 중의 VEGF가 과발현되는 경우 질환 증상이 나타날 수 있다. 예를 들어, VEGF의 과발현은 당뇨망막병증과 같은 망막의 혈관 질환을 일으킬 수 있다. 이 밖에, 혈관 공급이 충분하지 않아 성장에 필요한 영양을 얻지 못하는 경우, 고형 종양은 일정하게 제한된 크기 이상으로 성장할 수 없기 때문에, 이런 제한을 극복하기 위해 고형 종양은 VEGF를 발현하여 성장 및 전이가 가능하도록 한다.
VEGF 패밀리 구성원에는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F 및 태반성장인자(Placenta Growth Factor, PGF)가 포함된다. 그 중 VEGF-A는 가장 중요한 인자로, 정상적 및 병적 신생혈관(즉, 혈관 생성)을 조절할 수 있다. VEGF-A의 생물학적 효과는 이의 특이적 수용체에 결합되어 매개된 것이며, 주요 특이적 수용체는 혈관내피성장인자 수용체 1(VEGFR-1) 및 수용체 혈관내피성장인자 수용체 2(VEGFR-2)이다. 여기서, VEGFR-2는 주요 VEGFR로 혈관내피세포의 증식에 대해 중요한 영향을 미친다. VEGFR-2는 세포내 키나아제를 통해 VEGFR를 유도하여 이량체 및 자가인산화를 필요로 하는 수용체를 바인딩하도록 함으로써, 세포의 유사분열을 강화한다. VEGF-C 및 VEGF-D는 림프관의 형성을 조절할 수 있다.
약학적 조성물
본 발명은 또한 조성물을 제공한다. 바람직하게, 상기 조성물은 약학적 조성물이고, 이는 상기 항체 또는 이의 활성 단편 및 약학적으로 허용 가능한 벡터를 포함한다. 통상적으로, 이러한 물질을 무독성, 불활성 및 약학적으로 허용 가능한 벡터에 조제할 수 있으며, 여기서 pH 값은 조제되는 물질의 특성 및 치료할 병증에 따라 달라질 수 있지만, pH는 통상적으로 약 5 ~ 8이고, 바람직하게 pH는 약 6 ~ 8이다. 조제된 약학적 조성물은 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있는 바, 종양내, 복강내, 정맥내 또는 국부 투여를 포함지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 VEGFA 단백질 분자의 결합에 직접 사용될 수 있기 때문에, 종양의 치료에 사용될 수 있다. 이 밖에, 다른 치료제와 동시에 사용될 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 안전 유효량(예를 들어, 0.001 ~ 99 wt%, 바람직하게는 0.01 ~ 90 wt%, 더 바람직하게는 0.1 ~ 80 wt%)의 본 발명에 따른 단일 도메인 항체(또는 이의 접합체) 및 약학적으로 허용 가능한 벡터 또는 부형제를 포함한다. 이러한 벡터는 식염수, 버퍼, 포도당, 물, 글리세린(glycerine), 에탄올(ethanol) 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약물 제제는 투여 방식과 일치해야 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 주사제 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어 생리식염수 또는 포도당 및 다른 보조제를 포함하는 수용액을 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 주사제, 용액과 같은 약학적 조성물은 바람직하게 멸균 조건에서 제조된다. 활성 성분의 투여량은 치료 유효량이며, 예를 들어 하루에 약 10 μg/kg(체중) 내지 약 50 mg/kg(체중)이다. 이 밖에, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 치료제와도 함께 사용될 수 있다.
약학적 조성물을 사용하는 경우, 안전 유효량의 면역 접합체를 포유동물에게 투여하며, 여기서 상기 안전 유효량은 통상적으로 적어도 약 10 μg/kg(체중)이고, 대부분의 경우 약 50 mg/kg(체중)을 초과하지 않으며, 바람직하게 상기 사용량은 약 10 μg/kg(체중) 내지 10 mg/kg(체중)이다. 물론, 구체적인 사용량은 투여 경로, 환자의 건강 상황 등 요소를 고려해야 하며, 이는 모두 숙련된 의사의 기술 범위 내에 있다.
항 VEGF 단일 도메인 항체
본 발명에서, 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체는 단량체, 2가(2가항체) 및/또는 다가(다가항체)를 포함한다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체는 서열번호 8 및/또는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개 또는 복수개의 VHH 사슬을 포함한다.
전형적으로, 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체는 서열번호 8 및/또는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 2개의 VHH 사슬을 포함한다.
전형적으로, 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체는 서열번호 8 및/또는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열의 VHH 사슬을 갖는다.
전형적으로, 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 2개의 VHH 사슬을 포함한다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 2개의 VHH 사슬 사이는 링커를 통해 연결된다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 2개의 VHH 사슬 사이는 링커를 통해 연결된다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 링커는 (GaSb)x―(GmSn)y 서열로부터 선택되고, 여기서 a, b, m, n, x, y = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10(바람직하게는, a=4, b=1, m=3, n=1)이다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 링커는 GGGGSGGGS(서열번호 18), GS(서열번호 19), GGGGS(서열번호 20)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시된 바와 같다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 2가 항 VEGF 단일 도메인 항체는 hu bi-Nb24(Y)이다.
표지된 단일 도메인 항체
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 단일 도메인 항체는 검출 가능한 표지가 있다. 보다 바람직하게는, 상기 표지는 동위원소, 금 콜로이드 표지, 착색 표지 또는 형광 표지로 이루어진 군으로부터 선택된다.
금 콜로이드 표지는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 일 바람직한 해결수단에서, 항 VEGF의 단일 도메인 항체는 금 콜로이드 표지를 사용하여 금 콜로이드 표지의 단일 도메인 항체를 획득할 수 있다.
본 발명의 신규 항 VEGF 단일 도메인 항체는 우수한 특이성과 높은 역가를 갖는다.
검출 방법
본 발명은 또한 VEGF 단백질의 검출 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 단계는 대략 다음과 같다. 세포 및/또는 조직 샘플을 획득하고; 샘플을 매질에 용해하며; 상기 용해된 샘플 중 VEGF 단백질의 수준을 검출한다.
본 발명의 검출 방법에서 사용된 샘플은 특별히 한정되지 않고, 대표적인 예로는 세포 보존액에 존재하는 세포 함유 샘플이다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 항체(또는 이의 단편) 또는 검출 플레이트를 포함하는 키트를 제공하고, 본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 키트는 용기, 사용설명서, 버퍼 등을 더 포함한다.
본 발명은 또한 VEGF 수준을 검출하기 위한 검출 키트를 제공하고, 상기 키트는 VEGF 단백질을 인식하는 항체, 샘플을 용해하기 위한 개열 매질, 검출에 필요한 범용 시약 및 버퍼, 예를 들어 다양한 버퍼, 검출 표지, 검출 기질 등을 포함한다. 상기 검출 키트는 체외 진단 장치일 수 있다.
응용
상술한 바와 같이, 본 발명의 단일 도메인 항체는 생물학적 응용 가치 및 임상적 응용 가치가 광범위하며, 그 응용은 VEGF 관련 질환의 진단 및 치료, 기초 의학 연구, 생물학적 연구 등 많은 분야에 관련된다. 하나의 바람직한 응용은 VEGF에 대한 임상 진단 및 표적화 치료이다.
본 발명의 주요 장점은 하기와 같다.
(a) 본 발명의 단일 도메인 항체는 정확한 공간 구조를 갖는 VEGF 단백질을 특이적으로 표적화한다.
(b) 본 발명의 단일 도메인 항체는 인간, 마우스, 토끼, 원숭이의 VEGF를 인식할 수 있다.
(c) 본 발명의 단일 도메인 항체는 인간 VEGFA만 인식하고, VEGFB, VEGFC, VEGFD와 교차 반응을 일으키지 않으며, 우수한 특이성을 갖는다.
(d) 본 발명의 단일 도메인 항체는 VEGFA와 VEGFR2 및 VEGFA와 VEGFR1의 상호작용을 차단할 수 있고, 애플리버셉트의 차단 활성보다 높다.
(e) 본 발명의 단일 도메인 항체는 신생혈관의 생성에 대해 우수한 억제 작용을 갖고, 효과는 출시 제품 애플리버셉트보다 우수하다.
(f) 본 발명의 단일 도메인 항체는 우수한 항종양 활성을 갖고, 효과는 출시 제품 Avastin보다 우수하다.
(g) 본 발명의 단일 도메인 항체는 생산이 간편하다.
(h) 본 발명의 단일 도메인 항체는 비제제 조건에서 바람직한 안정성을 나타낸다.
하기 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 추가로 설명한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 나타내지 않은 실험 방법은 통상적으로 (Sambrook 및 Russell 등, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼(Molec uLar Cloning-A Laboratory Manual)(제3판)(2001) CSHL 출판사)에서 기재된 조건과 같은 일반적인 조건을 따르거나, 또는 제조업체에서 권장하는 조건을 따른다. 다른 설명이 없는 한, 백분율 및 분량은 중량에 따라 계산한다.
실시예 1: 항 VEGF 단일 도메인 항체의 스크리닝 및 발현
인간 VEGF를 특이적으로 표적화하는 단일 도메인 항체를 획득하기 위해, 먼저 포유동물 세포 HEK293F를 사용하여 인간 VEGFA 단백질을 일시적으로 발현시키고, 친화성 정제 후 낙타 면역에 사용하였다. 구체적인 방법은 특허 CN2018101517526의 실시예 1 및 실시예 2의 방법 설명을 참조할 수 있다. 요약하면, 정제된 VEGFA 단백질로 두 신쟝 쌍복 낙타를 면역화하고, 7회 면역 후 낙타의 말초혈액에서 total RNA를 분리한 다음, 역전사하고 PCR로 VHH 유전자를 증폭시키며, VHH 유전자를 파지 벡터 pMECS에 클로닝하며, TG1에 형질전환시켜 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였다. 구축된 라이브러리 용량은 각각 6.4×108 CFU 및 5.5×108 CFU이고, 삽입률은 각각 91.7% 및 95.8%이다. 그런 다음 라이브러리를 스크리닝하며, 2개의 라이브러리를 각각 6회 및 5회 스크리닝하여 항체 유전자를 포함하는 파지 인리치먼트를 획득하였다. 각 라이브러리에서 300개의 클론을 선택하여 PE-ELISA 동정을 수행하고, 획득된 양성 클론을 시퀀싱한 다음, 서열이 상이한 단일 도메인 항체를 Fc와 융합하여 발현시키며, HEK293F 시스템을 사용하여 항체를 일시적으로 발현시키고, 발현 방법은 특허 CN2018101517526의 실시예 3의 방법 설명을 참조바란다.
실시예 2: 차단형 항 VEGF 단일 도메인 항체의 스크리닝
ELISA 방법을 사용하여 인간 VEGFA와 VEGFR2의 상호작용을 차단할 수 있는 단일 도메인 항체를 스크리닝하였다. (1) ELISA 플레이트에 VEGFR2 단백질을 피복하고(1 μg/ml, 100 μL/웰), 4℃에서 밤새 배양하며; (2) PBST로 5회 세척한 후, 300 μL의 1% BSA 차단 용액을 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하며; (3) PBST로 5회 세척한 후, 50 μL의 구배 희석된 항체 샘플(40 μg/ml에서 시작하여 2배 구배 희석)을 첨가하고, 각 웰에 50 μL의 0.08 μg/ml 비오틴화 VEGFA 단백질을 첨가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 배양하며; (4) PBST로 5회 세척한 후, 100 μL의 SA-HRP(1:100000 희석)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하며; (5) PBST로 5회 세척한 후, 100 μL의 TMB 발색 용액을 첨가하고, 37℃에서 10 min 동안 발색하며, 50 μL/웰의 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 마이크로플레이트 리더로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 1에 도시된 바와 같이, Nb24의 차단 활성은 대조군 항체 Avastin보다 현저히 우수하다(IC50 Nb24=0.0149 μg/ml, IC50 Avastin=0.2172 μg/ml).
실시예 3: HUVEC 세포에 대한 후보 항체의 증식 억제 작용
요약하면, 방법은 다음과 같다. (1) 잘 성장한 HUVEC 세포를 트립신 처리하고, 완전 배지에서 중화하며, PBS로 1회 세척한 다음, 3E4/ml의 농도에 따라 재현탁하고, 100 μL/웰을 96웰 플레이트에 분배하며, 37℃, 5% CO2에서 20 h 동안 배양하였다. (2) 다음날 2% FBS의 DMEM로 VEGFA를 100 ng/ml로 희석하고, 항체를 10000 ng/ml, 5000 ng/ml, 2500 ng/ml, 1250 ng/ml, 312.50 ng/ml, 78.13 ng/ml, 39.06 ng/ml, 9.77 ng/ml, 2 ng/ml로 구배 희석하였다. (3) 다른 96웰 플레이트에 60 μL의 VEGFA와 동일한 부피의 희석된 항체를 첨가하여 골고루 혼합하고, 37℃에 배치하여 2 h 동안 공동 배양하며; 각 혼합액은 3개의 중복 웰에 있다. (4) 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트를 꺼내고 상층액을 흡인한 다음, 대응되는 웰에 각각 (3)의 혼합액 100 μL를 첨가하며, 37℃에서 72 h 동안 배양하였다. (5) 72 h 후, 10 μL/웰의 CCK8 용액을 첨가하고, 2 h 동안 발색하며, 발색 완료 후, 마이크로플레이트 리더로 OD450 파장에서의 흡광도를 판독하였다. 결과는 도 2에 도시된 바와 같이, HUVEC 세포에 대한 후보 항체 Nb24의 증식 억제 작용은 대조군 항체 Avastin보다 강하다(IC50 Nb24=29.58 ng/ml, IC50 Avastin=72.28 ng/ml).
실시예 4: 항체 Nb24의 인간화 및 발현
후보 항체를 인간화 형질전환시키며, 가변 영역을 변경하지 않고 4개의 프레임워크 영역 서열에 대해 인간화 설계를 수행하며, 형질전환 방법은 특허 CN2018101517526의 실시예 4의 방법을 참조바란다. 그런 다음 pFUSE 벡터에 인간화된 항체 huNb24 서열을 구축하여 인간화된 단일 도메인 항체와 Fc 서열을 융합시키고, HEK293F 시스템을 사용하여 발현시키며, 발현된 단백질은 후속 검증에 사용될 수 있다. 형질전환된 서열은 하기 표 2에 따른 바와 같다.
항체 영역 서열번호(SEQ ID NO.: )
인간화 전 인간화 후
FR1 4 10
CDR1 1 1
FR2 5 11
CDR2 2 2
FR3 6 12
CDR3 3 3
FR4 7 13
완전한 아미노산 서열 8 14
완전한 뉴클레오티드 서열 9 15
실시예 5: 인간화 2가 항체의 구축 및 발현
상기 인간화된 항체를 2가 형태로 구축하고, 링커 GGGGSGGGS(서열번호 18)를 사용하여 연결하며, 연결 후 아미노산 서열은 서열번호 16(대응되는 코딩 뉴클레오티드 서열은 서열번호 17로 표시된 바와 같은)으로 표시된 바와 같고, 그런 다음 효모(pichia pastoris)를 사용하여 발현하였다. 요약하면, 발현 방법은 다음과 같다. (1) pPICZaA 벡터에 서열번호 16으로 표시되는 단일 도메인 항체 2가 서열을 구축하고; (2) Sac I 제한효소로 pPICZaA-Nb24-Nb24를 선형화한 후 X-33 컴피턴트 세포로 전기형질전환하며; (3) 전기형질전환된 샘플을 각각 상이한 농도의 블레오마이신 내성 함유 YPD 평판 배지에 코팅하고, 30℃의 인큐베이터에서 3 ~ 4일 동안 배양하며, 구체적인 실시형태는 Invitrogen사에서 제공된 pPICZaA 벡터 설명서를 참조할 수 있고; (4) 평판 배지에 단클론이 성장한 후, 상이한 농도의 평판의 단클론을 선택하여 BMGY 배지에 넣으며, BMGY 배지의 OD 값이 약 20에 도달하면 균사체를 수집하여 BMMY 배지로 교체하고, 28℃, 250 rpm에서 배양하며; (5) 그 후 24 h마다 샘플링하고, 최종 부피가 1%인 메탄올을 첨가하여 샘플링하며, 샘플을 12000 rpm에서 5 min 동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 -20℃에서 보관하며; 5일 동안 연속 유도한 다음 배양을 종료하고; (6) 채취한 샘플을 SDS-PAGE로 검출하며, 동시에 샘플을 수집하여 황산 암모늄 침전법으로 타깃 항체를 정제하였다. 결과는 도 3에 도시된 바와 같이, 발현 상층액에서 황산 암모늄 침전법으로 정제하여 획득한 단일 도메인 항체 2가 항체 hu bi-Nb24(Y)를 SEC-HPLC로 검출한 이의 순도는 94.11%이고, 후속 연구에 사용될 수 있다.
실시예 6: ELISA 검출에 의한 인간화 항체 및 2가 항체의 차단 활성
검출 방법은 실시예 2와 같고, 결과는 도 4에 도시된 바와 같이, 인간화 항체의 차단 활성과 인간화 전 항체의 차단 활성은 유사하며(IC50 Nb24=0.045 μg/ml, IC50 huNb24=0.038 μg/ml), 따라서 이는 인간화 형질전환이 성공적임을 나타낸다. 인간화 후의 단일 도메인 항체와 효모 발현 2가 항체의 차단 활성을 비교하고, 상기 실험을 중복하며, 결과는 도 5에 도시된 바와 같이, 효모 발현 단일 도메인 항체 2가 hu bi-Nb24(Y)의 차단 활성은 3배 이상 향상되고(IC50 huNb24=0.044 μg/ml, IC50 hu bi-Nb24(Y)=0.013 μg/ml), 대조군 항체 Avastin의 차단 활성보다 현저히 높다(IC50 Avastin=0.331 μg/ml). 다시 상기 실험 방법을 사용하여 후보 항체와 동종 출시 제품의 차단 활성을 검출하여 비교하고, 결과는 도 6에 도시된 바와 같이, 효모 발현 인간화 이량체 항체 hu bi-Nb24(Y)의 차단 활성은 현저한 우세를 갖는다(IC50 hu bi-Nb24(Y)=0.022 μg/ml, IC50 Eylea=0.085 μg/ml, IC50 Conbercept=0.088 μg/ml, IC50 Avastin=0.439 μg/ml). 따라서, 효모 발현 인간화 이량체는 기존의 출시 제품보다 현저히 우수한 차단 활성을 가짐을 나타낸다.
실시예 7: 인간화 2가 항체HUVEC 세포에 대한 인간화 2가 항체의 증식 억제 작용
검출 방법은 실시예 3과 같고, 결과는 도 7에 도시된 바와 같이, HUVEC 세포에 대한 효모 발현 인간화 2가 항체 hu bi-Nb24(Y)의 증식 억제 작용은 동종 출시 대조 제품보다 우수하다(IC50 hu bi-Nb24(Y)=53.59 ng/ml, IC50 Eylea=65.96 ng/ml, IC50 Conbercept=129.7 ng/ml, IC50 Avastin=254.7 ng/ml).
실시예 8: ELISA 검출에 의한 후보 항체의 특이성
ELISA를 사용하여 후보 항체가 VEGF 상동 단백질과 교차 반응을 일으키는지 여부를 검증하였다. (1) 1 μg/ml의 테스트할 항체를 4℃에서 100 μL/웰로 ELISA 플레이트에 피복하여 밤새고; (2) PBST로 5회 세척한 후, 각 웰에 300 μL의 1% BSA를 첨가하여 실온에서 2시간 동안 차단하며; (3) PBST로 5회 세척한 후, 100 μL의 1 μg/ml Biotin-hVEGFA, Biotin-hVEGFB, Biotin-hVEGFC, Biotin-hVEGFD를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하고; (4) PBST로 5회 세척한 후, 100 μL의 희석된 SA-HRP(1:5000 희석)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하며; (5) PBST로 5회 세척한 후, 100 μL의 TMB 발색 용액을 첨가하고, 37℃에서 10 min 동안 발색하며, 50 μL/웰의 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 마이크로플레이트 리더로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 8에 도시된 바와 같이, 인간화 2가 항체 hu bi-Nb24(Y)는 인간 VEGFA와 반응을 일으킬 수 있고, VEGFB, VEGFC, VEGFD와 같은 다른 상동 단백질과 교차 반응을 일으키지 않는다.
아울러, ELISA를 사용하여 후보 항체가 다른 종의 VEGF와 교차 반응을 일으키는지 여부를 검출하였다. (1) 1 μg/ml의 테스트할 항체를 4℃에서 100 μL/웰로 ELISA 플레이트에 피복하여 밤새고; (2) PBST로 5회 세척한 후, 각 웰에 300 μL의 1% BSA를 첨가하여 실온에서 2시간 동안 차단하며; (3) PBST로 5회 세척한 후, 100 μL의 1 μg/ml Biotin-hVEGFA(인간), Biotin-mVEGFA(마우스), Biotin-rVEGFA(토끼)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하고; (4) PBST로 5회 세척한 후, 100 μL의 희석된 SA-HRP(1:5000 희석)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하며; (5) PBST로 5회 세척한 후, 100 μL의 TMB 발색 용액을 첨가하고, 37℃에서 10 min 동안 발색하며, 50 μL/웰의 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 마이크로플레이트 리더로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 9에 도시된 바와 같이, 인간화 2가 항체 hu bi-Nb24(Y)는 인간, 마우스, 토끼의 VEGFA를 동시에 인식할 수 있다. 이 밖에, 인간 VEGF121과 게잡이 원숭이의 대응되는 위치의 서열이 완전히 동일하므로, 상기 후보 항체는 게잡이 원숭이의 VEGFA도 인식할 수 있는 것으로 볼 수 있다.
실시예 9: ELISA 검출에 의한 VEGFR1/VEGFA에 대한 인간화 2가 항체의 차단 작용
(1) ELISA 플레이트에 VEGFR1 단백질을 피복하고(1 μg/ml, 100 μL/웰), 4℃에서 밤새 배양하며; (2) PBST로 5회 세척한 후, 300 μL의 1% BSA 차단 용액을 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하며; (3) PBST로 5회 세척한 후, 50 μL의 구배 희석된 항체 샘플(20 μg/ml에서 시작하여 2배 구배 희석)을 첨가하고, 각 웰에 50 μL의 0.08 μg/ml 비오틴화 VEGFA 단백질을 첨가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 배양하며; (4) PBST로 5회 세척한 후, 100 μL의 SA-HRP(1:100000 희석)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하며; (5) PBST로 5회 세척한 후, 100 μL의 TMB 발색 용액을 첨가하고, 37℃에서 10 min 동안 발색하며, 50 μL/웰의 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 마이크로플레이트 리더로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 10에 도시된 바와 같이, 후보 항체 hu bi-Nb24(Y)는 인간 VEGFA와 VEGFR1의 상호작용을 차단할 수 있고(IC50 hu bi-Nb24(Y)=0.168 μg/ml), 차단 활성은 대조군 항체 Avastin보다 우수하다(IC50 Avastin=0.967 μg/ml).
실시예 10: 신생 마우스 OIR 모델의 안내 혈관 성장에 대한 후보 항체의 억제 작용
(1) 신생혈관 연구를 위한 고전적인 마우스 모델-OIR 모델을 사용하였다. 7일령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 75% 산소 농도 밀폐 용기에서 12일 동안 사양하며, 이 기간 동안 정기적으로 산소통의 산소 농도를 모니터링하여 75%로 유지하도록 하고, 그 후 정상적인 공기 환경에서 5일 동안 사양하였다. P7(7일령)-P12(12일령)는 망막 혈관 폐쇄기에 해당하고, P12-P17(17일령)은 저산소-비정상 혈관 증식기에 해당하며, P17-P21(21일령)은 비정상 증식 혈관 회복기에 해당한다. P17을 비정상 신생혈관의 관찰 지점으로 선택하며, P12일 때 OIR 모델군의 마우스 유리체에 1 μL의 상이한 농도의 항체 약물 hu bi-Nb24(Y)(1.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml)를 주입하고, 대조군 항체 Eylea의 농도는 40 mg/ml이며, 그 후 마우스를 정상적인 공기 환경에서 P17될 때까지 사양하였다.
(2) FITC-IB4 망막 혈관 내피 세포를 염색하여 retinal stretched preparation을 수행하고, OIR 모델에서 P17일 때 비정상 신생혈관 클러스터 및 망막 비관류 영역을 관찰하는 바, C57BL/6J 마우스를 희생시킨 후, 마우스의 안구를 즉시 적출하여 4% 파라포름알데히드에 1 ~ 2 h 동안 고정하고, 수술현미경으로 각막윤부를 따라 구형벽을 절단하여 수정체와 유리체를 제거하며, 망막신경섬유층과 색소상피층을 분리하여 공막, 맥락막 및 망막색소상피층을 제거하고, 망막신경섬유층을 PBS로 세척하여 잔존 유리체를 제거하며; 1 mg/ml의 BSA 및 0.3% TX-100 함유 PBS로 1 ~ 2 h 동안 차단하고; FITC-IB4 용액에 첨가하여(1:50 희석) 4℃에서 48 h 동안 배치하며; 꺼내어 PBS로 15분×3회 세척한 후, 유리 슬라이드에 망막신경섬유층을 평평하게 배치하고, 시신경유두를 중심으로 방사상 절개하며, 봉입제로 봉입한 다음 형광현미경과 공초점현미경으로 관찰하고 촬영하며 집계하였다.
결과는 도 11 및 도 12에 도시된 바와 같이, 도 11에서, OIR 음성대조군에 비해 세 가지 농도의 약물 hu bi-Nb24(Y)(1.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml)은 모두 망막 비관류 영역의 면적을 감소시킬 수 있고, 통계학적으로 의미가 있으며(p<0.05); 양성대조군 약물 애플리버셉트 Eylea(40 mg/ml)도 망막 비관류 영역의 면적을 감소시킬 수 있다. 세 가지 농도의 약물 hu bi-Nb24(Y)(1.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml)의 망막 비관류 영역 면적은 모두 Eylea보다 작지만, 통계학적으로 차이가 없으며; 도 12에서, OIR 대조군에 비해 세 가지 농도의 약물 hu bi-Nb24(Y)(1.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml)과 Eylea는 모두 신생혈관 클러스터를 감소시킬 수 있고, 통계학적으로 의미가 있으며; Eylea에 비해, 세 가지 농도의 약물 hu bi-Nb24(Y)(1.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml)의 망막 신생혈관 클러스터의 백분율은 모두 작고, 통계학적으로 차이가 있으며; 약물 hu bi-Nb24(Y)의 농도의 증가에 따라 P17일때 망막 신생혈관 클러스터의 백분율은 감소된다(0.5 VS 1, p=0.0027; 0.5 vs 1.5, p=0.0177; 1 vs 1.5, p=0.2417)
실시예 11: 후보 항체의 안정성에 관한 연구
농도가 1 mg/ml인 후보 항체 hu bi-Nb24(Y)를 10mM의 PB 용액에 넣고, 각각 -20℃(반복 동결-융해), 4℃, 25℃, 40℃의 조건에 배치하며, 다른 시점에서 샘플링하여 SEC-HPLC로 검출하였다. Advance Bio SEC 130A 2.7μm 7.8×300mm column을 사용하고, 검출 파장은 280 nm이며, 실온에서 tassel은 0.5 ml/min이며, 200 mM, pH 7.0의 PB 용액을 이동상으로 30 min 동안 등용매 용리하였다.
검출 결과는 도 13에 도시된 바와 같이, 4℃에서 1개월 동안 배치(도 13a), 25℃에서 1개월 동안 배치(도 13b), 40℃에서 15일 동안 배치(도 13c), -20℃에서 동결 및 융해를 5번 반복(도 13d)하는 조건하에서 후보 항체의 순도는 현저한 변화가 없고, 이는 상기 항체가 비제제 조건에서 바람직한 안정성을 나타냄을 보여준다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 단독으로 참조로서 인용된 것처럼 본 발명에 참조로서 인용된다. 이 밖에, 본 발명의 상기 교시 내용을 읽은 후, 당업자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 가할 수 있으며, 이러한 등가 형태도 본 발명의 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위 내에 속함을 이해해야 한다.
본 발명의 서열 정보
서열번호 1
GFTFDDPDVG
서열번호 2
ISKDGST
서열번호 3
AADSNPIAPIRTCLGWYNY
서열번호 4
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTAS
서열번호 5
WFRQAPGNECELVST
서열번호 6
YYTDSVKGRFTISQDYAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
서열번호 7
WGQGTQVTVSS
서열번호 8
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASGFTFDDPDVGWFRQAPGNECELVSTISKDGSTYYTDSVKGRFTISQDYAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADSNPIAPIRTCLGWYNYWGQGTQVTVSS
서열번호 9
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACTTTTGATGATCCTGACGTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAATGAGTGCGAGTTGGTCTCAACTATTAGTAAGGATGGTAGTACATACTATACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACTACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGCAGACTCCAATCCTATAGCGCCTATTAGAACTTGTTTGGGGTGGTATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGC
서열번호 10
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTAS
서열번호 11
WFRQAPGNECELVST
서열번호 12
YYTDSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYC
서열번호 13
WGQGTLVTVSS
서열번호 14
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFDDPDVGWFRQAPGNECELVSTISKDGSTYYTDSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAADSNPIAPIRTCLGWYNYWGQGTLVTVSS
서열번호 15
GAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACCCCGACGTGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAACGAGTGCGAGCTGGTGAGCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGACAGCAACCCCATCGCCCCCATCAGGACCTGCCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
서열번호 16
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFDDPDVGWFRQAPGNECELVSTISKDGSTYYTDSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAADSNPIAPIRTCLGWYNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFDDPDVGWFRQAPGNECELVSTISKDGSTYYTDSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAADSNPIAPIRTCLGWYNYWGQGTLVTVSS
서열번호 17
GAAGTTCAACTTCAAGAGTCTGGTGGTGGTTTAGTTCAACCAGGTGGGTCTTTGAGATTGTCTTGTACTGCTTCTGGTTTTACTTTTGATGATCCAGATGTTGGTTGGTTTAGACAAGCTCCAGGTAATGAATGTGAATTAGTTTCTACTATTTCTAAGGATGGTTCTACTTACTACACTGACTCTGTTAAGGGTAGATTCACTATTTCCAGAGATTACGCTAAGAACACTGTTTACTTGCAAATGAACTCTTTGAGAGCTGAAGATACTGCTGTTTACTACTGTGCTGCTGATTCCAATCCAATTGCTCCAATTAGAACTTGTTTGGGATGGTACAACTACTGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACTGTTTCTTCTGGTGGTGGAGGTTCTGGAGGTGGTTCTGAAGTTCAATTGCAAGAATCTGGTGGTGGTTTGGTTCAACCAGGTGGTTCTTTGAGATTGTCTTGTACTGCTTCTGGATTCACTTTTGATGATCCAGATGTTGGTTGGTTTAGACAAGCTCCAGGTAATGAATGTGAATTGGTTTCTACTATTTCTAAGGATGGTAGTACTTACTACACTGATTCTGTTAAGGGTAGGTTTACTATTTCCAGAGATTACGCAAAGAACACCGTCTACTTGCAAATGAACTCTTTGAGAGCTGAGGATACTGCTGTCTACTACTGTGCTGCTGATTCCAACCCAATCGCTCCAATCAGAACCTGTTTGGGTTGGTACAACTACTGGGGTCAAGGTACTTTGGTCACTGTTTCCTCT
서열번호 18
GGGGSGGGS
서열번호 19
GS
서열번호 20
GGGGS
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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH chain FR3 <400> 6 Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Tyr 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH chain FR4 <400> 7 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH chain <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Pro 20 25 30 Asp Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Lys Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Asp Ser Asn Pro Ile Ala Pro Ile Arg Thr Cys Leu Gly Trp Tyr 100 105 110 Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 9 <211> 377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH chain <400> 9 caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtacag cctctggatt cacttttgat gatcctgacg tgggctggtt ccgccaggct 120 ccagggaatg agtgcgagtt ggtctcaact attagtaagg atggtagtac atactataca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagactacg ccaagaacac ggtgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcggc agactccaat 300 cctatagcgc ctattagaac ttgtttgggg tggtataact actggggcca ggggacccag 360 gtcaccgtct cctcagc 377 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH chain FR1 <400> 10 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH chain FR2 <400> 11 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val Ser Thr 1 5 10 15 <210> 12 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH chain FR3 <400> 12 Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH chain FR4 <400> 13 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH chain <400> 14 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Pro 20 25 30 Asp Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Lys Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Asp Ser Asn Pro Ile Ala Pro Ile Arg Thr Cys Leu Gly Trp Tyr 100 105 110 Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 15 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH chain <400> 15 gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60 agctgcaccg ccagcggctt caccttcgac gaccccgacg tgggctggtt caggcaggcc 120 cccggcaacg agtgcgagct ggtgagcacc atcagcaagg acggcagcac ctactacacc 180 gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc agggactacg ccaagaacac cgtgtacctg 240 cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgacagcaac 300 cccatcgccc ccatcaggac ctgcctgggc tggtacaact actggggcca gggcaccctg 360 gtgaccgtga gcagc 375 <210> 16 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-VEGF antibody <400> 16 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Pro 20 25 30 Asp Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Lys Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Asp Ser Asn Pro Ile Ala Pro Ile Arg Thr Cys Leu Gly Trp Tyr 100 105 110 Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Thr Phe Asp Asp Pro Asp Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Asn Glu Cys Glu Leu Val Ser Thr Ile Ser Lys Asp Gly Ser Thr Tyr 180 185 190 Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ser Asn Pro Ile Ala Pro Ile Arg 225 230 235 240 Thr Cys Leu Gly Trp Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 245 250 255 Val Ser Ser <210> 17 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-VEGF antibody <400> 17 gaagttcaac ttcaagagtc tggtggtggt ttagttcaac 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 19 Gly Ser 1 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (16)

  1. 항 VEGF 단일 도메인 항체 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)으로서,
    상기 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은 서열번호 1로 표시되는 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항 VEGF 단일 도메인 항체 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR).
  2. 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬로서,
    상기 VHH 사슬은 프레임워크 영역(FR) 및 제1항에 따른 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, 바람직하게 상기 프레임워크 영역(FR)은,
    (a) 서열번호 4로 표시되는 FR1, 서열번호 5로 표시되는 FR2, 서열번호 6으로 표시되는 FR3 및 서열번호 7로 표시되는 FR4; 또는
    (b) 서열번호 10으로 표시되는 FR1, 서열번호 11로 표시되는 FR2, 서열번호 12로 표시되는 FR3 및 서열번호 13으로 표시되는 FR4를 포함하는 것을 특징으로 하는 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬.
  3. 항 VEGF 항체로서,
    상기 항 VEGF 항체는 제2항에 따른 VHH 사슬을 갖는 것을 특징으로 하는 항 VEGF 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항 VEGF 항체는 서열번호 8 또는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VHH 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항 VEGF 항체.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 항 VEGF 항체의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시된 바와 같은 것을 특징으로 하는 항 VEGF 항체.
  6. 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 제1항에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체 VHH 사슬의 CDR 영역, 제2항에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 제3항에 따른 항 VEGF 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 발현 벡터로서,
    상기 발현 벡터는 제6항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  8. 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포는 제7항에 따른 발현 벡터를 포함하거나 또는 이의 게놈에 제6항에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  9. 항 VEGF 단일 도메인 항체의 생성 방법으로서,
    (a) 단일 도메인 항체의 생성에 적합한 조건하에서, 제8항에 따른 숙주 세포를 배양하여 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체를 포함하는 배양물을 획득하는 단계;
    (b) 상기 배양물에서 상기 항 VEGF 단일 도메인 항체를 분리하거나 회수하는 단계; 및
    (c) 선택적으로, 정제 및/또는 변형하여 단계 (b)의 VEGF 단일 도메인 항체를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항 VEGF 단일 도메인 항체의 생성 방법.
  10. 면역 접합체로서,
    상기 면역 접합체에는,
    (a) 제2항에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬 또는 제3항에 따른 항 VEGF 항체; 및
    (b) 검출 가능한 표지, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소, 금 나노입자/나노로드, 자성 나노입자, 바이러스 외피 단백질, VLP 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합 부분이 포함되는 것을 특징으로 하는 면역 접합체.
  11. 제2항에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 제3항에 따른 항 VEGF 항체의 용도로서,
    (a) 혈관의 생성을 억제하는 약물; 및
    (b) VEGF 관련 질환 또는 병증을 치료하는 약물을 제조하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  12. 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물에는,
    (a) 제1항에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR), 제2항에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 제3항에 따른 항 VEGF 항체 또는 제10항에 따른 면역 접합체; 및
    (b) 약학적으로 허용 가능한 벡터가 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 항체로서,
    상기 항체는 하나 이상의 제2항에 따른 항 VEGF 단일 도메인 항체의 VHH 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  14. 재조합 단백질로서,
    상기 재조합 단백질은,
    (i) 제2항에 따른 VHH 사슬 또는 제3항에 따른 항 VEGF 항체; 및
    (ii) 발현 및/또는 정제에 협조하는 선택적인 태그 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
  15. 샘플 중 VEGFA 단백질의 검출 방법으로서,
    상기 방법은,
    (1) 샘플을 제2항에 따른 VHH 사슬, 제3항에 따른 항체 또는 제10항에 따른 면역 접합체에 접촉시키는 단계; 및
    (2) 항원-항체 복합체를 형성하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하되, 복합체를 형성하면 샘플에 VEGFA 단백질이 존재함을 나타내는 것을 특징으로 하는 샘플 중 VEGFA 단백질의 검출 방법.
  16. VEGFA 단백질 검출 시약으로서,
    상기 검출 시약은,
    (i) 제2항에 따른 VHH 사슬, 제3항에 따른 항체 또는 제10항에 따른 면역 접합체; 및
    (ii) 검출학적으로 허용 가능한 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 VEGFA 단백질 검출 시약.
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