WO2022068894A1 - 同时靶向pd-l1和vegf的双功能分子及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

提供一种同时靶向PD-L1和VEGF的双功能分子以及包含所述双功能分子的药物组合物，还提供所述同时靶向PD-L1和VEGF的双功能分子治疗和预防肿瘤的用途。

Description

同时靶向PD-L1和VEGF的双功能分子及其医药用途 技术领域
本发明属于生物医药领域，具体的涉及一种同时靶向PD-L1和VEGF的双功能分子及其医药用途。
背景技术
程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)，又被称为CD279，为CD28超家族成员。PD-1主要表达于活化的T细胞，B细胞及髓系细胞。PD-1有两个天然配体，PD-L1和PD-L2。PD-L1和PD-L2均属于B7超家族，组成性地或诱导性地表达于多种细胞膜表面，包括非造血系统细胞以及多种肿瘤细胞。PD-L1在肿瘤的表达与癌症患者的不良预后显著相关。PD-L1与T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。阻断PD-1与其配体的相互作用可促进肿瘤特异性的T细胞免疫，提高肿瘤细胞的免疫清除效率。大量临床试验表明，靶向PD-1或PD-L1的抗体可促进CD8+T细胞浸润到肿瘤组织，上调抗肿瘤的免疫效应因子，如IL-2、IFN-γ，颗粒酶B以及穿孔素，从而有效抑制肿瘤的生长。因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对肿瘤抑制有重要的意义。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性的生长因子。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。VEGF除了促进血管生成作用外，还有免疫抑制作用，主要通过抑制树突状细胞成熟，从而抑制T细胞的活化；肿瘤血管异常减少了肿瘤中T细胞的进入；上调免疫抑制性MDSC和Treg细胞3个机制发挥免疫抑制作用。
VEGF家族包括：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和PIGF。血管内皮生长因子受体(VEGFR)包括VEGFR1(又称Flt1)、VEGFR2(又称KDR或Flk1)、VEGFR3(又称Flt4)和Neuropilin-1(NRP-1)。其中，前三种受体在结构上类似，都属于酪氨酸激酶超家族，均由膜外区、跨膜片段及膜内区三部分构成，其中膜外区由免疫球蛋白样结构域组成，膜内区属酪氨酸激酶区。VEGFR1和VEGFR2主要位于血管内皮细胞表面，VEGFR3主要位于淋巴管内皮细胞表面。VEGF家族分子对于几种受体有不同的亲和力。VEGFA主要与VEGFR1、VEGFR2和NRP-1结合发挥作用。VEGFR2是血管发生和构建的主要调节者，与VEGFR1相比VEGFR- 2具有很高的酪氨酸激酶活性。VEGFR2与配体VEGFA结合后介导血管内皮细胞的增殖、分化等行为，以及血管的形成过程和血管的通透性。VEGFR1可以隔离VEGF和VEGFR2的结合，从而调节VEGFR2的功能。
目前已经上市的VEGF抑制剂有十余种，包括最常用的贝伐珠单抗，最近比较热门的卡博替尼、仑伐替尼，除此之外，还有包括索拉非尼、瑞戈非尼、阿昔替尼、阿帕替尼、培唑帕尼等。VEGF抑制剂针对部分肿瘤患者，单药用药有效，但更多的会联合其他治疗方法使用，如肺癌、结肠癌患者，可以选择VEGF抑制剂联合化疗，或者联合PD-1/PD-L1抑制剂类免疫抑制剂。
然而无论是PD-L1或VEGF的单抗，还是二者的联用，尚不能获得十分满意的结果，在肿瘤治疗领域，仍然存在进一步提高抑瘤效果的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双功能分子，所述双功能分子既能阻断或抑制PD-1/PD-L1信号通路，又能阻断或降低VEGF与其受体的相互作用，因而能够特异地解除VEGF和PD-1对机体的免疫抑制，同时抑制肿瘤引起的血管发生。
本发明的第一个方面提供一种同时靶向PD-L1和VEGF的双功能分子，所述双功能分子包含一个靶向PD-L1的部分和两个VEGF受体部分，所述靶向PD-L1的部分为PD-L1抗体，所述VEGF受体部分包含一个或一个以上的VEGF受体的全长或片段，所述PD-L1抗体的每个重链的C端均连接一个所述VEGF受体部分，所述PD-L1抗体的轻链和重链可变区CDR序列如下：
HCDR1的序列如SEQ ID NO：16所示；
HCDR2的序列如SEQ ID NO：17所示；
HCDR3的序列如SEQ ID NO：18所示；
LCDR1的序列如SEQ ID NO：19所示；
LCDR2的序列如SEQ ID NO：20所示；
LCDR3的序列如SEQ ID NO：21所示。
在一个实施方案中，所述VEGF受体为VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3或者Neuropilin-1(NRP-1)。
在一个实施方案中，所述VEGF受体的片段为结构域或功能域；优选地，所述VEGF受体部分包含VEGFR1结构域2(VEGFR1 domain 2)和/或VEGFR2结构域3(VEGFR2 domain 3)；
优选地，所述VEGF受体部分的氨基酸序列如SEQ ID NO：13、14、15或23所示。
在一个实施方案中，所述PD-L1抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：3所示；重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示。
在一个实施方案中，所述PD-L1抗体的轻链恒定区序列如SEQ ID NO：7所示；重链恒定区序列如SEQ ID NO：6所示。
在一个实施方案中，所述PD-L1抗体的重链的C端直接或者通过连接肽连接VEGF受体部分。
作为优选，所述连接肽为(G 4S) XG，所述x为3-6，优选为4-5；优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在一个实施方案中，所述PD-L1抗体的轻链序列如SEQ ID NO：28所示；所述PD-L1抗体的重链与连接肽和VEGF受体部分的整体序列如SEQ ID NO：24、25、26或27所示。
本发明的第二个方面提供一种药物组合物，其包含本发明的双功能分子以及药学上可接受的载体。
本发明的第三个方面提供核酸分子，其编码本发明的双功能分子。
本发明的第四个方面提供表达载体，其含有本发明的核酸分子。
本发明的第五个方面提供一种宿主细胞，其包含本发明的表达载体，所述宿主细胞选自细菌、酵母菌和哺乳动物细胞；优选为哺乳动物细胞；更优选为293细胞；更优选为HEK293E细胞、expi293或CHO细胞。
本发明的第六个方面提供本发明的双功能分子在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述癌症为PD-L1阳性的肿瘤。
在一个实施方案中，所述癌症选自肺癌、胃癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、肠癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、胰腺癌和头颈肿瘤。
本发明的第七个方面提供一种治疗和/或预防肿瘤的方法，包括给予所需患者治疗和/或预 防有效量的本发明的双功能分子或者本发明的药物组合物。
附图说明
图1：双功能分子结构示意图。
图2A、图2B：双功能分子的SDS-PAGE和SEC-HPLC检测结果。2A为双功能分子的SDS-PAGE检测结果；2B为双功能分子的SEC-HPLC检测结果。
图3：双功能分子和对照抗体与PD-L1结合的动力学特征参数检测结果。3A为双功能分子Ab-068；3B为双功能分子Ab-069；3C为对照单抗Ab-002。
图4：双功能分子和对照融合蛋白与VEGF结合的动力学特征参数检测结果。4A为双功能分子Ab-068；4B为双功能分子Ab-069；4C为对照融合蛋白Ab-030。
图5A、图5B：采用间接ELISA方法检测双功能分子与VEGFA和PD-L1的结合活性。5A为VEGFA；5B为PD-L1。
图6A、图6B、图6C：双功能分子的结合活性检测结果。6A为采用竞争ELISA方法检测双功能分子与VEGFR2竞争结合VEGFA的活性；6B为采用竞争ELISA方法检测双功能分子与PD-1竞争结合PD-L1的活性；6C为采用ELISA的方法检测双功能分子与PD-L1和VEGF同时结合的活性。
图7：双功能分子对PD-1/PD-L1信号通路的影响。
图8：双功能分子对结核菌素诱导的T细胞分泌胞因子IFN-γ的影响。
图9：双功能分子对HUVEC细胞增殖的影响。
图10：双功能分子对肿瘤生长的抑制作用。
具体实施方式
术语
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入本文。
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本发明的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本发明的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。
当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语“约”是指包括指定值的±20％、或在某些情况下±10％、或在某些情况下±5％、或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变化。
本文所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
本文中的术语“抗体”可以包含完整抗体(例如全长单克隆抗体)及其任何抗原结合片段(即抗原结合部分)或其单链，还可以包含在完整抗体或其抗原结合片段或其单链的基础上进行改造(例如连接其他肽段、功能单位重排等)而形成的具有抗原特异性结合能力的产物。
在一个实施方案中，抗体典型是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重(H)多肽链和两条轻(L)多肽链的Y型四聚蛋白。天然IgG抗体即具有这样的结构。每条轻链由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)组成。每条重链包含一个可变结构域(VH)和恒定区。
本领域已知五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，对应的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ，IgG和IgA可以进一步分为不同的亚类，例如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配到两种明显相异的类型之一，称为κ和λ。
在IgG、IgA和IgD抗体的情形中，该恒定区包含称为CH1、CH2和CH3的三个结构域(IgM和IgE具有第四结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区分离，该铰链区是可变长度的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。每类抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。
术语“可变区”或“可变结构域”显示出从一种抗体到另一种抗体的氨基酸组成的显著变化，并且主要负责抗原识别和结合。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的IgG抗体具有两个结合位点(即它是二价的)。重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)结构域各包含具有极端变异性的三个区域，被称为高变区(HVR)，或更通常地，被称为互补决定区(CDR)，VH和VL各有4个骨架区FR，分别用FR1，FR2，FR3，FR4表示。因此， CDR和FR序列通常出现在重链可变结构域(或轻链可变结构域)的以下序列中：FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。
术语“Fc”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。
本文中“抗体”可在最广的意义上使用，可包括如多克隆抗体(polyclonal antibodies)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体及灵长类化抗体、CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)、人类抗体(包括重组产生的人类抗体)、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括突变蛋白及其变体)等等。
术语“单克隆抗体”(或称“单抗”)指由单一细胞克隆产生的基本均质、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物、合成技术或上述技术的组合等。
需说明的是，本发明的单克隆抗体可变区的CDR和FR的划分是根据Kabat定义确定的。而其他命名和编号系统，例如Chothia、IMGT或AHo等，也是本领域技术人员已知的。因此，以本发明的单抗序列为基础，包含任何命名系统衍生的一种或多种CDR的人源化抗体均明确地保持在本发明的范围内。
术语“人源化抗体”是指其中非人抗体(如小鼠抗体)CDR以外的所有或部分氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应氨基酸置换的抗体。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰是容许的，只要它们不消除抗体结合特定抗原的能力。“人源化”抗体保持与原抗体类似的抗原特异性。
术语“嵌合抗体”是指其中可变区源自一个物种而恒定区源自另一物种的抗体，例如其中可变区源自小鼠抗体而恒定区源自人抗体的抗体。
术语“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如在此所使用，抗体分子的“片段”包括抗体的“抗原结合片段”，并且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体中与所选抗原或其免疫原性决定部分特异性结合或反应的多肽片段，或由此片段进一步衍生的融合蛋白产物，例如单链抗体，嵌合抗原受体中的胞外结合区等。示例性的抗体片段或其抗原结合片段包括但不限于：可变轻链片段、可变重链片段、Fab片段、F(ab') 2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、线性抗体、单链抗体(scFv)及由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体等。
术语“抗原”是指被抗体或抗体结合片段识别并特异性结合的物质，广义上，抗原可以包 括所选靶标的任何免疫原性片段或决定簇，包括单表位、多表位、单结构域、多结构域、完整的胞外结构域(ECD)或蛋白质。肽、蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质，其部分及其组合均可构成抗原。非限制性示例性抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原等。“抗原”也可以指引发免疫反应的分子。任何形式的抗原或含有该抗原的细胞或制剂都可以用于生成对抗原决定簇具有特异性的抗体。抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白(例如，用在其表面上表达至少一部分抗原的细胞进行免疫的)、或可溶性蛋白质(例如，仅用该蛋白质的ECD部分进行免疫的)或蛋白质构建体(例如，Fc抗原)。该抗原可以在基因修饰的细胞中产生。前述任何抗原可以单独或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强佐剂组合使用。编码该抗原的DNA可以是基因组的或非基因组的(例如，cDNA)，并且可以编码足以引起免疫原性应答的至少一部分ECD。可以使用任何载体来转化其中表达抗原的细胞，所述载体包括但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、质粒以及非病毒载体如阳离子脂质。
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象存在并且包括至少3-15个氨基酸。由给定的抗体确定其结合的表位的方法是本领域熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
术语“双功能分子”是指对两种不同抗原具有特异性的结合分子(例如抗体或包含抗体片段的分子)，优选双特异性抗体。
使用本发明中的可变区制作抗体或双功能分子时，恒定区没有特别限定，可以使用本领域技术人员公知的恒定区或者自行获得的恒定区，还可以在恒定区部分导入氨基酸突变(例如提高或降低与Fcγ受体或FcRn的结合的突变)。
获得本发明的双功能分子和抗体或抗原结合片段的方法没有特别限制，可通过任意方法获得，例如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。发明的双功能分子和抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进 行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。
术语“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。术语“K D”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离常数。可以使用本领域已知的各种技术来确定结合亲和力，例如表面等离子体共振、生物层干涉法、双极化干涉法、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、ELISA、分析超速离心和流式细胞术等。
术语“生物学活性”指抗体结合抗原并导致可测量的生物学反应的能力，所述生物学反应可以在体外或体内进行测量。
本发明的药物组合物，可以根据需要与对其为惰性的适当的药学上可接受的载体、介质等进行混和而制剂化。例如：生理盐水、灭菌水、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂(如抗坏血酸等)、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、螯合剂(如EDTA等)或粘合剂等。另外，还可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白等蛋白质、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸、多糖和单糖等糖类或碳水化物、甘露糖醇和山梨糖醇等糖醇。在制为注射用水溶液时，可举出例如生理盐水、含葡萄糖和其它辅药的等渗液，例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，还可以与适当的助溶剂，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子型表面活性剂(聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆188、HCO-50)等并用。另外，通过在制剂中混合透明质酸酶(hyaluronidase)，还可以进行更大液量的皮下给药。
本发明的双功能分子还可以封入微囊(例如羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸甲酯]等的微囊)中，或者制为胶体药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊等)。还可以制备为缓释制剂。
术语“药物制剂”或“制剂”或“制剂处方”，表示这样的制品：其存在形式允许活性成分的生物学活性有效，并且不含有对所述制剂要施用的受试者有毒的其他组分。
术语“溶液制剂”表示，在大气压下至少约2℃至约8℃的温度为液体的制剂。
术语“缓冲剂”或“缓冲液”表示稳定药物制剂pH的药学上可接受的赋形剂。合适的缓冲剂是本领域公知的，且可以在文献中找到的。优选的药学上可接受的缓冲液包括但不限于：组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、精氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或其混合物等等。缓冲液用本领域已知的酸或碱进行pH调节，可以将pH调至在4.5-6.0范围内的值，特别是调至在4.5-5.5范围内的值，最特别地是调至pH5.2。
术语“稳定剂”表示药学可接受的赋形剂，其在制造，储存和应用过程中保护活性药物成分和/或制剂免受化学和/或物理降解。稳定剂包括但不限于糖，氨基酸，多元醇，环糊精等。
术语“表面活性剂”表示，用于保护蛋白制剂抵抗物理应力(如搅拌和剪切)的药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的表面活性剂包括：聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚(例如在商标Brij TM下销售的那些)和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)。聚氧乙烯脱水山梨糖醇-脂肪酸酯包括聚山梨酯20(在商标吐温20 TM下销售)和聚山梨酯80(在商标吐温80 TM下销售)。
本发明的双功能分子或药物组合物可与其他药物联合使用，活性成分可以混合在一起形成单一的给药单元，也可分别独立成为给药单元，分别使用。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段的药物制剂的剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如人种差异；体重、年龄和健康状况；涉及的具体疾病；疾病的严重程度；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
术语“药盒”包括有效量的一种或多种单位剂型的本发明的药物制剂或联合用药物。在一些实施方案中，药盒可含有治疗或预防性组合物的无菌容器；这样的容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合于保持药物的材料制成。此外，药盒还包括将本发明的药物制剂或联合用药物给予个体的说明书。说明书中通常包含使用本发明的药物制剂或联合用药物来治疗或预防疾病的方法。
本文所用的术语“个体”或“受试者”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本发明的个体包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
本文所用的术语“疾病”或“病症”或“紊乱”等是指任何损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的改变或失调。例如，所述的“疾病”包括但不限于：肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病、T细胞功能障碍性疾病、或免疫耐受能力缺陷(如移植排斥)。
本文所用的术语“肿瘤”指的是一种以细胞或组织的病理性增生为特征的疾病，及其随后的迁移或侵袭其他组织或器官。肿瘤生长通常是不受控制的和进行性的，不诱导或抑制正常细胞增殖。肿瘤可影响多种细胞、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、骨、脑、乳腺、软 骨、神经胶质细胞、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、尿道、输尿管、尿道、子宫、阴道器官，或组织或相应的细胞。肿瘤包括癌症，如肉瘤，癌，或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。本发明所述的肿瘤，可包括，但不限于白血病(如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病，急性粒细胞白血病，急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症)，淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、原发性巨球蛋白血症，重链病，实体瘤如肉瘤和癌症(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤，间皮瘤，尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌，尼罗河管癌，绒癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤，颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤。较佳地，所述的“肿瘤”包括但不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌和胶质瘤。
本文所用的术语“治疗”是指在试图改变个人或处理细胞引起的的疾病过程中的临床干预，既可以进行预防也可以在临床病理过程干预。治疗效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少任何疾病直接或间接的病理后果、防止转移、减慢疾病的进展速度、改善或缓解病情、缓解或改善预后等。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：双功能分子的重链和轻链的序列设计、制备和检测
1.序列设计
本实施例中的双功能分子采用图1所示的结构模式，即在一个抗PD-L1的IgG抗体的两条重链的C端均通过连接片段各连接一个VEGFR部分，双功能分子的重链和轻链的组成如表1所示。
表1 双功能分子的重链和轻链的组成设计
Figure PCTCN2021121802-appb-000001
上表中，IgG部分包含重链可变区和重链恒定区，重链可变区的序列如SEQ ID NO:1所示，其包含SEQ ID NO:16所示的HCDR1、SEQ ID NO:17所示的HCDR2和SEQ ID NO:18所示的HCDR3，重链可变区由SEQID NO:2所示的核酸序列编码；重链恒定区序列采用人Igγ4链C区(Ig gamma-4 chain C region，hIgG4 AA)，其最后一位氨基酸由K替换为A，其序列如SEQ ID NO:6所示。
针对VEGFR部分设计了两种形式，一种采用VEGFR1 domain 2序列，另一种采用VEGFR1 domain2-VEGFR2 domain3融合序列。VEGFR1 domain 2的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，其通过序列如SEQ ID NO:10所示的连接片段Linker1连接到IgG部分的C端(对应双功能分子Ab-051)；VEGFR1 domain 2除了采用SEQ ID NO:13外，还采用了SEQ ID NO:13的截短形式，即C端截短2个氨基酸(SEQ ID NO:14)(对应双功能分子Ab-068)、C端截短3个氨基酸(SEQ ID NO:15)(对应双功能分子Ab-069)。Ab-051、Ab-068和Ab-069中，PD-L1抗体的重链与Linker1和VEGF受体部分的整体氨基酸序列分别如SEQ ID NO：24、25和26所示。
在本实施例中设计的VEGFR1 domain2-VEGFR2 domain3融合序列中，VEGFR1 domain2的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，VEGFR2 domain3的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，二者形成的融合序列如SEQ ID NO:23所示(对应双功能分子Ab-037)。Ab-037中，PD-L1抗体的重链与Linker1和VEGF受体部分的整体氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。
双功能分子的轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，轻链可变区的序列如SEQ ID NO:3所示，其包含SEQ ID NO:19所示的LCDR1、SEQ ID NO:20所示的LCDR2和SEQ ID NO:21所示的LCDR3，轻链可变区由SEQID NO:4所示的核酸序列编码；轻链恒定区序列采用Ig k链C区(Ig kappa chain C region，k型)，其序列如SEQ ID NO:7所示。Ab-051、Ab-068、Ab-069和Ab-037的轻链序列均如SEQ ID NO：28所示。
2.双功能分子的表达和纯化
双功能分子的重链氨基酸序列组成：重链可变区序列+人IgG重链恒定区序列+(GGGGS) 4G Linker序列+VEGF-R序列；
双功能分子的轻链氨基酸序列组成：轻链可变区序列+人kappa轻链亚型恒定区序列。
利用金斯瑞在线密码子优化工具，选用人偏爱密码子，确定编码DNA序列，再在两端各加上25bp左右的同源臂序列，利用NCBI的DNAWorks工具，设计重叠延伸引物，对于轻链可直接通过PCR反应获得轻链全长序列，对于重链先分成4个片段PCR后进行TA克隆并测序，每段均获得正确模板后，再以此为模板搭建全长序列，分别将重链与轻链全长序列同源重组至线性化pTT5载体中，转化大肠杆菌E.coli DH5α，铺板，37℃倒置培养过夜，挑单克隆测序，利用SnapGene软件或NCBI在线Blast工具比对序列，挑选完全正确的克隆。利用商品化试剂盒提取重组质粒共转染293细胞。细胞培养6天后，将培养液通过离心、上清过滤后上样至HiTrap MabSelectSuRe柱，用Elution Buffer一步洗脱蛋白并回收目标样品分子，并换液至PBS。
3.双功能分子的纯度检测
将待测双功能分子样品用磷酸盐缓冲液稀释成1mg/mL，待测样品依次流经色谱柱,设置参数见下表：
表2 色谱柱设置参数
参数 条件
仪器 Waters 2695
运行缓冲液 1×PBS(pH 6.8)
流速 0.5mL/min
运行时间 30mins
柱温 30℃
样品仓温度 10℃
检测波长 280nm
数据采集完后，用Empower软件进行积分处理，分析双功能分子的纯度以及聚体和片段的含量。
双功能分子的产量及纯度结果见表3，SEC-HPLC结果见图2B。
表3 双功能分子的产量和纯度
样品ID VEGFR部分 量(mg/100ml) SEC-HPLC测得纯度(％)
Ab-051 SEQ ID NO:13 3.128 99.09
Ab-068 SEQ ID NO:14 5.082 98.68
Ab-069 SEQ ID NO:15 6.417 98.14
Ab-037* SEQ ID NO:23 6.7 100
*注：表中Ab-037是委托商业公司进行生产并测试。
结果表明，双功能分子的纯度大于95％。
4.双功能分子的SDS-PAGE电泳检测
将纯化后的样品分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测。样品的电泳图如图2A所示，还原型蛋白样品目标蛋白在62kD和25kD处，非还原型蛋白样品(单个抗体)目标蛋白在170kD处。
5.抗PD-L1的抗体的制备
构建抗PD-L1的单抗Ab-002和Ab-012作为对照样品。Ab-002和Ab-012的重链可变区的序列如SEQ ID NO:1所示，其由SEQID NO:2所示的核酸序列编码；Ab-002和Ab-012的轻链可变区的序列如SEQ ID NO:3所示，其由SEQID NO:4所示的核酸序列编码。编码重链可变区和轻链可变区的核酸序列委托泓迅生物科技有限公司合成。Ab-002和Ab-012的轻链恒定区序列均采用Igκ链C区(Ig kappa chain C region，κ型)，其序列如SEQ ID NO:7所示。二者的重链恒定区序列有所不同，Ab-002的重链恒定区序列采用人Igγ4链C区(Ig gamma-4chain C region，hIgG4 AA)，其序列如SEQ ID NO:6所示(但最后一位氨基酸为K而不是A)；Ab-012的重链恒定区序列采用人Igγ1链C区(Ig gamma-1chain C region，hIgG1)，其序列如SEQ ID NO:5所示。
将抗PD-L1抗体的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA分别克隆到带有相应恒定区的PTT5载体中，获得抗体Ab-002和Ab-012的重组表达质粒。将重组质粒转染293细胞，将293细胞培养液纯化后进行检测，制得了抗PD-L1单抗Ab-002和Ab-012。
6.VEGFR融合蛋白的制备
构建融合蛋白Ab-030和Ab-059作为对照样品。所述融合蛋白包含VEGFR部分和Fc部分，其中VEGFR部分的C端与Fc部分的N端相连。Ab-030和Ab-059的VEGFR部分均采用VEGFR1 domain2+VEGFR2 domain3序列，具体氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，其由SEQ ID NO:9所示的核酸序列编码。Ab-030的Fc部分采用hIgG4 AA-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；Ab-059的Fc部分采用hIgG1-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
将VEGFR部分与人Fc的融合cDNA克隆到PTT5载体中，获得Ab-030和Ab-059的重组表达质粒。将重组质粒转染293细胞，将293细胞培养液纯化后进行检测，制得了VEGFR融合蛋白Ab-030和Ab-059。
上述双功能分子、单抗和融合蛋白均可简称为抗体，以下的实验中用到的抗体，如果没有特别说明，均为参照本实施例的方法制得。
实施例2：双功能分子的动力学参数测定
1.双功能分子与PD-L1结合的动力学参数测定
1.1实验原理
采用捕获法将抗人Fc抗体通过氨基偶联的方式固定在CM5芯片的实验通道和参比通道上，然后将待测样品捕获在实验通道上，重组人PD-L1蛋白经倍比稀释成系列浓度后依次流过两通道表面发生结合，随后进行解离，从而得到各样品的结合解离曲线，最后用Biacore Insight Evaluation软件对其结果进行分析与评估。
1.2芯片及样品准备
将浓度为0.5mg/mL的抗人Fc抗体溶液用pH 5.0的乙酸盐缓冲液稀释至20μg/mL，采用氨基偶联法将其固定于CM5芯片的参比和实验通道上，固定水平约为5000RU。待测样品Ab068、Ab-069、Ab-002用运行缓冲液稀释至2μg/mL，重组人源PD-L1蛋白用运行缓冲液稀释至100nM，之后用该缓冲液倍比稀释至0.39nM，得到100nM-0.39nM系列浓度的重组人PD-L1。
1.3实验条件及数据处理
进样分析时，待测样品依次流过参比道和实验通道，然后进行再生，为下一循环做准备。待测样品与固定配体的结合参数见下表：
表4 待测样品与固定配体的结合参数
参数 条件
仪器 BIAcore 8K
样品稀释液 1×HBS-EP+(pH 7.4)
运行缓冲液 l×HBS-EP+(pH 7.4)
抗体捕获流速 10μL/min
抗体捕获时间 60s
重组人PD-L1注入速度 50μL/min
重组人PD-L1注入时间 90s
解离时间 300s
再生溶液 3M MgCl 2
再生溶液注入速度 30μL/min
再生时间 30s×1
分析温度 25℃
样品室和托盘温度 25℃
与重组人PD-L1蛋白的亲和力采用1:1Langmuir binding模型进行拟合计算，KD为解离 速率常数(kd)与结合速率常数(ka)的比值，即KD＝kd/ka。
双功能分子和对照PD-L1单抗与PD-L1结合的动力学参数见表5，动力学特征参数检测结果分别如图3所示。
表5 双功能分子Ab-068及Ab-069和对照抗体Ab-002与PD-L1结合的动力学参数
Figure PCTCN2021121802-appb-000002
KD为亲和力常数；Ka为抗原抗体结合速率；Kd为抗原抗体解离速率；KD＝Kd/Ka。
结果表明，双功能分子与PD-L1抗原有较好的亲和力，并且亲和力与相应的PD-L1单抗Ab-002接近。
2.双功能抗体与VEGF165结合的动力学参数测定
2.1实验原理
采用捕获法将抗人Fc抗体通过氨基偶联的方式固定在CM5芯片的实验通道和参比通道上，然后将待测样品捕获在实验通道上，重组人源VEGF蛋白经倍比稀释成系列浓度后依次流过两通道表面发生结合，随后进行解离，从而得到各样品的结合解离曲线，最后用Biacore Insight Evaluation软件对其结果进行分析与评估。
2.2.芯片及样品准备
将浓度为0.5mg/mL的抗人Fc抗体溶液用pH5.0的乙酸盐缓冲液稀释至20μg/mL，采用氨基偶联法将其固定于CM5芯片的参比和实验通道上，固定水平约为5000RU。待测样品Ab068、Ab-069、Ab-030用运行缓冲液稀释至1μg/mL，重组人源VEGF蛋白用运行缓冲液稀释至50nM，之后用该缓冲液倍比稀释至0.0975nM，得到50nM-0.0975nM系列浓度的重组人源VEGF。
2.3.实验条件及数据处理
进样分析时，待测样品依次流过参比道和实验通道，然后进行再生，为下一循环做准备。待测样品与固定配体的结合参数见下表：
表6 待测样品与固定配体的结合参数
参数 条件
仪器 BIAcore 8K
样品稀释液 1×HBS-EP+(pH 7.4)
运行缓冲液 l×HBS-EP+(pH 7.4)
抗体捕获流速 10μL/min
抗体捕获时间 60s
重组人源VEGF注入速度 50μL/min
重组人源VEGF注入时间 90s
解离时间 500s
再生溶液 3M MgCl2
再生溶液注入速度 30μL/min
再生时间 30s×1
分析温度 25℃
样品室和托盘温度 25℃
与重组人源VEGF蛋白的亲和力采用1:1 Langmuir binding模型进行拟合计算，KD为解离速率常数(kd)与结合速率常数(ka)的比值，即KD＝kd/ka。
双功能分子和对照融合蛋白Ab-030与VEGF结合的动力学参数见表7，动力学特征参数检测结果分别如图4所示。
表7 双功能抗体Ab-068及Ab-069和对照融合蛋白Ab-030与VEGF结合的动力学参数
Figure PCTCN2021121802-appb-000003
KD为亲和力常数；Ka为抗原抗体结合速率；Kd为抗原抗体解离速率；KD＝Kd/Ka。
结果表明，双功能分子与VEGF抗原有较好的亲和力。
实施例3：ELISA方法检测抗体与抗原的结合活性
1.间接ELISA方法测定抗体与抗原VEGFA-his的结合活性
方法具体如下：
用1μg/ml Recombinant Human VEGF 165 Protein(R&D)包被酶标板，4℃孵育过夜。洗板后，1％BSA封闭1.5小时。洗板后加入梯度稀释的抗体，37℃孵育2小时。洗板后加入酶标记的羊抗人IgG二抗工作液，37℃孵育1小时。洗板后加入TMB显色液避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用GraphPad软件对数据进行分析处理。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行曲线拟合，计算抗体的结合EC50(表8)，检测抗体与抗原VEGF 165结合的结果如图5A所示(图中NC1-hG4AA是hG4AA抗体的阴性同型对照，下同)。
结果显示，双功能分子能有效地结合VEGF165蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系。
2.间接ELISA方法分别测定抗体与抗原PD-L1的结合活性
方法具体如下：
以人PD-L1-his包被酶标板，4℃过夜，用1％的BSA于37℃封闭1.5h后，分别加入抗体，37℃孵育2小时，洗板后加入anti-human IgG Fc-HRP检测二抗，孵育1小时，洗涤，加入显色液显色，终止液终止，然后在酶标仪上读OD450。将原始读值导入GraphPad Prism拟合EC50值(表8)，求出待测抗体与PD-L1蛋白的结合能力。检测抗体与抗原PD-L1结合结果如图5B所示。
结果显示，双功能分子能有效地结合PD-L1蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系。
表8 双功能分子Ab-051、Ab-068及Ab-069和对照融合蛋白Ab-030/PD-L1单抗Ab-002与VEGF、PD-L1的结合活性
Figure PCTCN2021121802-appb-000004
3.竞争ELISA方法分别测定抗体与VEGFR2竞争结合抗原VEGFA的活性
具体方法如下：
用VEGF(R&D)包被酶标板，4℃过夜，用1％的BSA于37℃封闭1.5h后，洗板后加入梯度稀释的抗体和人biotinylated VEGFR2蛋白(终浓度为0.1μg/ml)，室温孵育2小时。洗板后加入HRP标记链霉亲和素SA-HRP工作液，37℃孵育1小时。洗板后加入TMB显色液避光显色5min，加入终止液终止显色反应。然后在酶标仪上读OD450。将原始读值导入GraphPad Prism拟合IC50值(表9)。检测结果如图6A所示。结果显示，双功能分子能有效地结合抗原VEGFA，抑制VEGFR2结合VEGFA，并且抑制VEGFR2结合VEGFA的效率呈剂量依赖关系。
4.竞争ELISA方法分别测定抗体与PD-1竞争结合抗原PD-L1
具体方法如下：
用PD-L1-his包被酶标板，4℃过夜，1％BSA封闭1.5h后，洗板后加入不同浓度的抗体与biotinylated PD1蛋白室温孵育2小时后，洗板拍干。加入酶标二抗，37℃孵育1小时。洗板拍干，加入TMB进行显色反应5min，加入终止液终止显色。然后在酶标仪上读OD450。将原始读值导入GraphPad Prism拟合IC50值(表9)。检测结果如图6B所示。结果显示，双功能分子能有效地结合抗原PD-L1，抑制PD-1结合其配体PD-L1，并且抑制PD-1结合其 配体PD-L1的效率呈剂量依赖关系。
表9 双功能分子Ab-051、Ab-068及Ab-069和对照融合蛋白Ab-030/PD-L1单抗Ab-002与VEGF、PD-L1的结合活性
Figure PCTCN2021121802-appb-000005
5.ELISA方法测定双功能分子同时结合PD-L1和VEGF抗原
具体方法如下：
用PD-L1-his包被酶标板，4℃过夜，1％BSA封闭1h后，洗板后加入不同浓度的抗体室温孵育2小时后，洗板拍干。加入VEGF-Biotin，室温孵育2小时，加入酶标二抗，37℃孵育1小时。洗板拍干，加入TMB进行显色反应5min，加入终止液终止显色。然后在酶标仪上读OD450。将原始读值导入GraphPad Prism拟合IC50值(表10)。检测结果如图6C所示。结果显示，双功能分子能同时有效地结合抗原PD-L1和VEGF，并且其结合呈剂量依赖关系。相应的单抗不能同时结合两个抗原。
表10 双功能分子Ab-051、Ab-068及Ab-069和对照融合蛋白Ab-030/PD-L1单抗Ab-002与VEGF、PD-L1的双结合活性
双结合 Ab-051 Ab-068 Ab-069 Ab-002 Ab-030 NC1-hG4AA
EC50(nM) 0.0524 0.0625 0.0412 NA NA NA
实施例4：双功能分子阻断PD-1/PD-L1信号通路的实验
具体方法如下：
取CHO-PD-L1-CD3L细胞(中检院)，消化重悬细胞，以40,000个/孔的密度接种在96孔板中，100μL/孔，然后放到37℃，5％CO 2的培养箱中培养24小时。第二天，配制RPMI1640+2％FBS溶液备用。用该溶液梯度稀释抗体，3倍稀释，使其最高浓度点为200nM。从培养箱中拿出CHO-PD-L1-CD3L细胞培养板，去除95μL上清，加入50μL抗体。将Jurkat-PD-1-NFAT细胞重悬在RPMI1640+2％FBS溶液中，调整密度至1x10^6个/mL,加50μL至培养板中。在37℃，5％CO 2的培养箱中培养6小时。加入50μL Bright-Glo化学发光检测试剂，室温孵育5分钟，然后在Envision多功能酶标仪上读取化学发光信号。将读取的化学发光信号原始信号输入GraphPad Prism 5计算抑制率IC50(表11)。检测结果如图7所示。
结果显示，双功能分子能有效地阻断表达有PD-1分子的Jurkat细胞同CHO/PD-L1细胞结合，从而抑制报告基因的活性，并且有药物浓度剂量依赖效应。
表11 双功能分子Ab-051、Ab-068、Ab-069及Ab-037和对照PD-L1单抗Ab-002对PD-1/PD-L1信号通路的影响
  Ab-051 Ab-068 Ab-069 Ab-037 Ab-002 NC1-hG4AA
EC50(nM) 2.38 4.02 3.35 3.65 2.30 NA
实施例5：双功能分子增强结核杆菌素(TB)刺激PBMC释放IFNγ的实验
新鲜分离纯化的PBMC，调整细胞浓度为2×10 6/ml，加入结核菌素，37℃、5％CO 2培养箱培养5天。收集PBMC，用PBS洗一次，重悬至新鲜的培养基中，调整密度为2×10 6个每毫升，接种至96孔细胞培养板，每孔180μL。将不同浓度的抗体分别加入96孔细胞培养板的对应孔中,每孔20μL。细胞培养板置于37℃，5％CO 2培养箱孵育3天。取上清，采用ELISA的方法(人IFN-γ检测试剂盒，Biolegand，430104)检测IFN-γ的水平。结果如图8所示，双功能分子能够增强激活的T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ，并且有药物浓度剂量效应。
实施例6：双功能分子抑制VEGFA诱导的HUVEC细胞增殖的实验
取生长状态良好的HUVEC细胞(购自ScienceCells)，调整细胞浓度为4×10 4/ml，接种于96孔板，100μL/孔，于37℃、5％CO 2孵箱中培养24h后，观察细胞贴壁良好，弃培养基，用基础培养基配制100ng/ml VEGFA加入96孔板中，100μl/孔；加入不同浓度的抗体，继续培养72h，加CTG，室温放置15分钟，放入酶标仪检测荧光值。将读取的化学发光信号原始信号输入GraphPad Prism 5计算抑制率IC50(表12)。检测结果如图9所示。
表12 双功能分子Ab-051、Ab-068、Ab-069及Ab-037和对照融合蛋白Ab-030对HUVEC细胞增殖的影响
  Ab-051 Ab-068 Ab-069 Ab-037 Ab-030 NC1-hG4AA
IC50(nM) 1.344 1.229 1.554 1.537 1.256 NA
结果显示，双功能分子均可有效抑制VEGFA引起的HUVEC细胞增殖，且呈剂量依赖关系。
实施例7：双功能分子体内抑制肿瘤生长实验
为检测双功能分子的体内抑瘤活性，使用了小鼠CT26细胞(小鼠结肠癌细胞：小鼠PD-L1敲除，表达人PD-L1，集萃药康生物科技公司)，接种于5－7周龄的BALB/c小鼠(小鼠PD-L1敲除，表达人PD-L1，购买自集萃药康生物科技公司)皮下，造模与具体给药方式见表13。给药后测量各组肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。
表13 双功能分子治疗小鼠CT26结肠癌模型的给药方案
组别 受试品 动物数(只) 剂量(mg/kg) 给药途径 给药频率 给药次数
G1 PBS 6 9.0 i.p Q3D 5
G2 Ab-012 6 6.8 i.p Q3D 5
G3 Ab-059 6 4.5 i.p Q3D 5
G4 Ab-012+Ab-059 6 6.8+4.5 i.p Q3D 5
G5 Ab-069 6 8.0 i.p Q3D 5
实验结束时，PBS溶剂对照组平均肿瘤体积±标准误为1833±261mm 3，而双功能分子Ab-069、PD-L1单抗Ab-012、VEGF融合蛋白Ab-059以及Ab-012与Ab-059联用组平均肿瘤体积±标准误分别为297±69mm 3、425±55mm 3、1220±287mm 3、476±108mm 3，TGI％分别为83.9％、76.8％、33.6％、73.7％(参见表14、图10)。融合蛋白Ab-059有一定的肿瘤抑制作用，但是与PBS溶剂对照组相比，未见显著性差异(P>0.05)。其它各组均与PBS溶剂对照组的肿瘤体积相比有明显差异(P<0.01)，表明双功能分子及PD-L1单抗有显著的肿瘤抑制作用。双功能抗体相比于PD-L1单抗以及PD-L1单抗与VEGF融合蛋白联用的技术方案，实验结束后的肿瘤体积均值更低。本实验的抗肿瘤药效结果在对小鼠肿瘤称重的比较上也得到进一步证实。
表14 小鼠CT26结肠癌模型体内抑瘤实验结果
分组 肿瘤体积(mm 3) TGI 肿瘤重量(g)
PBS 1833±261 / 1.81±0.32
Ab-012 425±55 76.78％ 0.54±0.07
Ab-059 1220±287 33.58％ 1.33±0.27
Ab-012+Ab-059 476±108 73.65％ 0.61±0.15
Ab-069 297±69 83.87％ 0.38±0.06
以上实施例中所涉及的生物序列总结于表15。
表15 实施例中的生物序列
Figure PCTCN2021121802-appb-000006
Figure PCTCN2021121802-appb-000007
Figure PCTCN2021121802-appb-000008
Figure PCTCN2021121802-appb-000009
Figure PCTCN2021121802-appb-000010
以上是对本发明的优选实施方式的描述，而不是对本发明内容的限制。除了以上内容外，本领域技术人员在不脱离本发明原理的情况下，可以做出若干修改和替代，这些修改和替代也应视为本发明的保护范围内。

Claims (16)

  1. 一种同时靶向PD-L1和VEGF的双功能分子，其特征在于：所述双功能分子包含一个靶向PD-L1的部分和两个VEGF受体部分，所述靶向PD-L1的部分为PD-L1抗体，所述VEGF受体部分包含一个或一个以上的VEGF受体的全长或片段，所述PD-L1抗体的每个重链的C端均连接一个所述VEGF受体部分，所述PD-L1抗体的轻链和重链可变区CDR序列如下：
    HCDR1的序列如SEQ ID NO：16所示；
    HCDR2的序列如SEQ ID NO：17所示；
    HCDR3的序列如SEQ ID NO：18所示；
    LCDR1的序列如SEQ ID NO：19所示；
    LCDR2的序列如SEQ ID NO：20所示；
    LCDR3的序列如SEQ ID NO：21所示。
  2. 如权利要求1所述的双功能分子，其特征在于：所述VEGF受体为VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3或者Neuropilin-1(NRP-1)。
  3. 如权利要求1-2任一项所述的双功能分子，其特征在于：所述VEGF受体的片段为结构域或功能域；
    优选地，所述VEGF受体部分包含VEGFR1结构域2(VEGFR1 domain 2)和/或VEGFR2结构域3(VEGFR2 domain 3)；
    优选地，所述VEGF受体部分的氨基酸序列如SEQ ID NO：13、14、15或23所示。
  4. 如权利要求1-3任一项所述的双功能分子，其特征在于：所述PD-L1抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：3所示；重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示。
  5. 如权利要求1-4任一项所述的双功能分子，其特征在于：所述PD-L1抗体的轻链恒定区序列如SEQ ID NO：7所示；重链恒定区序列如SEQ ID NO：6所示。
  6. 如权利要求1-5任一项所述的双功能分子，其特征在于：所述PD-L1抗体的重链的C端直接或者通过连接肽连接VEGF受体部分。
  7. 如权利要求6所述的双功能分子，其特征在于：所述连接肽为(G 4S) XG，所述x为3-6，优选为4-5；优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
  8. 如权利要求1-7任一项所述的双功能分子，其特征在于：所述PD-L1抗体的轻链序列如SEQ ID NO：28所示；所述PD-L1抗体的重链与连接肽和VEGF受体部分的整体序列如 SEQ ID NO：24、25、26或27所示。
  9. 一种药物组合物，其特征在于：包含权利要求1-8任一项所述的双功能分子以及药学上可接受的载体。
  10. 核酸分子，其特征在于：编码权利要求1-8任一项所述的双功能分子。
  11. 表达载体，其特征在于：其含有权利要求10所述的核酸分子。
  12. 一种宿主细胞，其特征在于：其包含权利要求11所述的表达载体，所述宿主细胞选自细菌、酵母菌和哺乳动物细胞；优选为哺乳动物细胞；更优选为293细胞；更优选为HEK293E细胞、expi293或CHO细胞。
  13. 权利要求1-8任一项所述的双功能分子在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
  14. 如权利要求13所述的用途，其特征在于：所述癌症为PD-L1阳性的肿瘤。
  15. 如权利要求13所述的用途，其特征在于：所述癌症选自肺癌、胃癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、肠癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、胰腺癌和头颈肿瘤。
  16. 一种治疗和/或预防肿瘤的方法，包括给予所需患者治疗和/或预防有效量的根据权利要求1-8中任一项所述的双功能分子或者根据权利要求9所述的药物组合物。
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