CN110551211B - 含抗肠病毒71型vp1蛋白单克隆抗体的检测试剂盒 - Google Patents

含抗肠病毒71型vp1蛋白单克隆抗体的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与肠病毒71型VP1蛋白结合的单克隆抗体，或其结合片段。本发明亦揭露可生产所述单克隆抗体的融合瘤及编码所述单克隆抗体片段的单离的核酸。此外，本发明又涉及利用所述单克隆抗体检测肠病毒71型病毒的检测试剂盒及诊断方法。

Description

含抗肠病毒71型VP1蛋白单克隆抗体的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种抗肠病毒71型VP1蛋白的单克隆抗体及其应用，特别是一种可以用在定量腸病毒71型病毒抗原含量的单克隆抗体及含有所述单克隆抗体的检测试剂盒。
背景技术
手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)是一种好发在儿童的疾病，其相关的病原体包含肠病毒属的科萨奇A型(Coxsackievirus,CAV2-CVA16)、科萨奇B型(CBV1-CBV5)、依科病毒(Echovirus,ECHO4-ECHO11)，以及肠病毒71型(Enterovirus 71)，其中又以柯萨奇A16型及肠病毒71型最常见。肠病毒71型容易引起严重的中枢神经相关并发症，如：致命性脑炎(Fatal encephalitis)、无菌性脑膜炎(Aseptic meningitis)及急性无力肢体麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)，严重时会导致病患死亡。1998年肠病毒71型在中国台湾造成78人死亡，后续在2001年至2005年期间每年平均造成40人死亡。肠病毒71型主要感染对象为5岁以下的婴幼儿，其临床症状为发烧、食欲不振、肌肉酸痛等，且会在手部、足部及口中发现有溃疡的情形。为了预防肠病毒71型对在儿童造成的危害，许多国家都致力在开发针对肠病毒71型的疫苗。
由在于生产肠病毒71型疫苗的制程中，仅能以观察细胞病变现象(cytopathiceffect,CPE)来判读病毒效价，但是此方法非常耗时费工，不利在疫苗生产的优化。就疫苗生产过程中，除了需要知道疫苗中的病毒含量高低之外，仍需一个可以快速且准确定量病毒抗原的方法，以检测疫苗抗原的含量以及半成品及成品的抗原稳定性。目前市售的肠病毒71型检验试剂都是针对肠病毒71型抗体的检测，而非针对肠病毒71型抗原的检测及定量。因此，开发一种针对肠病毒71型抗原的检测及定量的试剂盒，将有助在肠病毒71型疫苗的生产。
发明内容
在一方面，本发明涉及一种单克隆抗体或其结合片段，包含：(a)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链互补决定区(complementarity determining regions,CDRs)CDR1多肽，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链互补决定区CDR2多肽，以及具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链互补决定区CDR3多肽；以及(b)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链互补决定区CDR1多肽，具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区CDR2多肽，以及具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链互补决定区CDR3多肽。
在另一方面，本发明涉及一种生产所述单克隆抗体的融合瘤，其寄存在德国微生物与细胞培养研究所莱布尼茨研究所Leibniz Institute DSMZ-German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures，寄存编号为DSM ACC3336。
在又一方面，本发明涉及一种单离的核酸，包含编码一包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区多肽的核苷酸序列。
在再一方面，本发明涉及一种单离的核酸，包含编码一包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区多肽的核苷酸序列。
在另一方面，本发明涉及一种肠病毒71型的检测试剂盒，包含前述的单克隆抗体。
在另一方面，本发明涉及一种活体外检测肠病毒71型是否存在一生物样本中的方法，包含：(a)将所述样本与前述的单克隆抗体接触；(b)分析所述抗体的结合，以决定肠病毒71型的存在。
在再一方面，本发明涉及一种检测一样本中肠病毒71型病毒含量的方法，包含：(a)将所述样本与前述的单克隆抗体接触；(b)分析所述抗体的结合，以决定肠病毒71型的含量。
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
附图说明
图1所示为在一实施例中，以免疫萤光染色法(Immunofluorescence assay,IFA)筛选融合瘤细胞株的结果。图1A及图1C为感染肠病毒71型病毒24小时后的非洲绿猴肾细胞(Vero cells)。图1B为以肠病毒71型市售抗体MAB979作为一级抗体的IFA染色结果。图1D为以融合瘤4C7-4C3的细胞上清液作为一级抗体的IFA染色结果。
图2所示为在一实施例中，以蛋白质印迹法(Western blot)分析融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体所结合的病毒蛋白片段。图2A为将肠病毒71型重组的三段衣壳蛋白(capsid proteins)(VP1、VP2、VP3)以大肠杆菌表现后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析的结果。图2B为以融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体作为一级抗体，以标记碱性磷酸酶(AP)的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Goat anti mouse IgG-AP，KPL公司)作为二级抗体，进行西方墨点分析的结果。M为蛋白质尺寸标准液；1为衣壳蛋白VP1；2为衣壳蛋白VP2；3为衣壳蛋白VP3。
图3所示为在一实施例中，以蛋白质印迹法分析融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体辨识的肠病毒71型基因型。图3A为将不同基因型的肠病毒71型病毒感染非洲绿猴肾细胞(Vero cells)后得到的细胞裂解液，进行SDS-PAGE分析的结果。图3B为以融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体作为一级抗体，以标记碱性磷酸酶(AP)的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Goatanti mouse IgG-AP，KPL公司)作为二级抗体，进行西方墨点分析的结果。M为蛋白质尺寸标准液；1为基因型B4的肠病毒71型；2为基因型B5的肠病毒71型；3为基因型C2的肠病毒71型；4为基因型C4的肠病毒71型；5为基因型C4a的肠病毒71型；6为基因型C4b的肠病毒71型；7为柯萨奇病毒A16；8为非洲绿猴肾细胞(Vero cells)裂解液。
图4所示为在一实施例中，以融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体为一级抗体，以山羊抗鼠抗体为二级抗体，以直接型酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)检测不同浓度的肠病毒71型抗原的统计分析结果。
图5所示为在一实施例中，以融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体直接接合辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)，以直接型ELISA检测不同浓度的肠病毒71型抗原的统计分析结果。
图6所示为在一实施例中，以兔源多克隆抗体为捕捉抗体，融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体为侦测抗体，以山羊抗鼠抗体为二级抗体，以三明治型ELISA检测肠病毒71型抗原的统计分析结果。
图7所示为在一实施例中，以兔源多克隆抗体为捕捉抗体，以融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体直接接合辣根过氧化物酶(HRP)为侦测抗体，以三明治型ELISA检测肠病毒71型抗原的统计分析结果。
图8所示为在一实施例中，以融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体为捕捉抗体，以融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体直接接合辣根过氧化物酶(HRP)为侦测抗体，以三明治型ELISA检测肠病毒71型抗原的统计分析结果。
具体实施方式
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本文及所附的申请专利范围所使用的「约」、「大约」或「近乎」一词实质上代表所述的数值或范围位在20％以内，较佳为在10％以内，以及更佳者为在5％以内。在本文所提供的数字化的量为近似值，意旨若术语「约」、「大约」或「近乎」没有被使用时亦可被推得。
除非上下文另有明确说明，本文及所附的申请专利范围所使用的「一」、「一个」，以及「所述」的含义包括复数参照。此外，为了便在读者阅读，在本说明书中可能使用标题或副标题，其对本发明的范围没有影响。
如本文所用，术语「肠病毒71型」在分类上属在小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)的肠病毒属(Enterovirus)(Li等人，Vaccine,31(32):3281-3287(2013年))，为正股单股RNA病毒(Han等人，Virol.J.7:116(2010年))，病毒基因体大小为7.4kb，依照功能的不同可分为四段结构蛋白(VP1,VP2,VP3 and VP4)及七段非结构蛋白2A,2B,2C,3A,3B,3C and 3D)(Xu等人，Monoclon Antib Immunodiagn Immunother,32(6):386-394(2013年))，而病毒的外鞘蛋白可分为内、外两层，外层由VP1、VP2、VP3蛋白所构成，内层则是由VP4蛋白组成，且病毒颗粒为无封套的正二十面体(Han等人，Virol.J.7:116(2010年))，肠病毒71型可大致分为三种基因型(A,B and C)，在这三种基因型中又可细分为11种亚型，分别为A、B1～B5、C1～C5(Deng等人，Appl Microbiol Biotechnol,99(18):7663-7671(2015年))，中国台湾及中国大陆在1998年至2011年间爆发的肠病毒71型疫情中，主要的亚型为B4、B5、C2、C4、C4a、C4b及C5(Chen等人，Vaccine,31(2):425-430(2013年))。
如本文所用，术语「抗体」是指一种免疫球蛋白分子，或具有可与特定抗原专一性结合能力的免疫球蛋白分子的片段。如本文所用，术语「抗体」除了包含全长抗体分子之外，亦包括保有抗原结合活性的抗体分子片段，例如，活性片段F(ab')2、Fab、Fv，以及Fd。术语「抗体」与「免疫球蛋白」在最广泛的意义上可互换使用，并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、单价、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性)，而且还可以包括某些抗体片段。抗体可以是嵌合的、人类的、人源化的，及/或亲和力成熟的。
术语「可变」是指可变结构域的某些部分在抗体之间的序列广泛不同，并且用在每种特定抗体对在其特定抗原的结合及特异性。然而，变异性不均匀分布在抗体的整个可变结构域中。它集中在轻链及重链可变结构域中称为互补决定区(ComplementarityDetermining Regions,CDR)或高变区的三个区段。可变结构域的保守部分被称为框架(framework,FR)。天然重链与轻链的可变结构域各自包含四个FR区，主要采用由三个CDR连接的β-折迭构型，其形成环连接，并且在某些情况下形成β-片状结构的一部分。每个链中的CDRs被FR区域紧密地保持在一起，且来自另一个链的CDRs有助在抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1991年))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个具有单个抗原结合位点及残留的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且还能够交联抗原的F(ab')2片段。
“Fv”为含有完整的抗原识别及结合位点的最小抗体片段。Fab片段还包含轻链的恒定结构域及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段不同在Fab片段，通过在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱胺酸。
基在其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以分配为两种明显不同的类型之一，称为kappa(κ)及lambda(λ)。
根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)分配给不同的类别。免疫球蛋白有五种主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG，以及IgM，其中几种可进一步分为亚型(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应在不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ，以及μ。不同类别的免疫球蛋白的亚型结构及三维构型是公知的，一般描述在例如Abbas等人所著Cellular and Mol.Immunology，第四版(2000年)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其它蛋白质或胜肽的共价或非共价缔合形成的较大融合分子的一部分。
如本文所用，术语「单克隆抗体」是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，例如，包含群体的单个抗体是相同的，除了可存在少量的可能的天然存在的突变。因此，修饰语「单克隆」表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。这种单克隆抗体通常包括包含结合一标靶的多胜肽序列的抗体，其中透过包括从多个多胜肽序列中选择单个标靶结合多胜肽序列的方法，来获得标靶结合多胜肽序列。例如，选择过程可以是从多个克隆株中选择独特的克隆株，例如杂交瘤克隆株、噬菌体克隆株，或重组DNA克隆株的集合库。应当理解的是，可以进一步改变所选择的标靶结合序列，例如提高对标靶的亲和力，使标靶结合序列人源化，改善其在细胞培养物中的产生，降低其在体内的免疫原性，从而产生多特异性抗体等，且包含改变的标靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(抗原表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不被其他免疫球蛋白污染。根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括，例如，杂交瘤方法(例如，Kohler等人，Nature,256:495(1975)；Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual，(冷泉港实验室出版社，第二版1988年)；Hammerling等人，in:Monoclonal Antibodies andT-Cell hybridomas 563-681(Elsevier出版社，纽约，1981年))、重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人，Nature,352:624-628(1991年)；Marks等人，J.Mol.Biol,222:581-597(1992年)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004年)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004年)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004年)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004年)，以及用在于具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人类基因的动物中产生人类或类人类抗体的技术(参见，例如，WO98/24893；WO96/34096；W O96/33735；WO91/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993年)；Jakobovits等人，Nature 362:255-258(1993年)；Bruggemann等人，Yearin Immunol.7:33(1993年)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等人，Bio.Technology 10:779-783(1992年)；Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994年)；Morrison，Nature 368:812-813(1994年)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14:845-851(1996年)；Neuberger，Nature Biotechnol.14:826(1996年)以及Lonberg与Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995年)。
抗体可进行标定及固定在固态撑体上。如本文所用，术语「标记」是指直接或间接与抗体接合，以致产生「被标定」抗体的可侦测化合物或组成物。标记本身为可侦测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或是在酵素标记的情况下，可催化进行受质化合物或组成物的化学变化使其为可侦测的。
在一方面，本发明涉及一种与肠病毒71型病毒结合的单克隆抗体或其结合片段，包含：(a)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链互补决定区(complementaritydetermining regions,CDRs)CDR1多肽，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链互补决定区CDR2多肽，以及具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链互补决定区CDR3多肽；以及(b)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链互补决定区CDR1多肽，具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链互补决定区CDR2多肽，以及具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链互补决定区CDR3多肽。
在某些较佳实施例中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区。在某些较佳实施例中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一方面，本发明涉及一种生产所述单克隆抗体的融合瘤，其寄存在德国微生物与细胞培养研究所莱布尼茨研究所Leibniz Institute DSMZ-German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures，寄存编号为DSM ACC3336。
在另一方面，本发明涉及一种单离的核酸，包含编码一包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区多肽的核苷酸序列。
在另一方面，本发明涉及一种单离的核酸，包含编码一包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区多肽的核苷酸序列。
在另一方面，本发明涉及一种肠病毒71型的检测试剂盒，包含前述的单克隆抗体。
在某些较佳实施例中，所述检测试剂盒为一种直接型ELISA检测试剂盒，以本发明的单克隆抗体为一级抗体，并以其他动物抗鼠抗体为二级抗体检测肠病毒71型抗原。
在某些较佳实施例中，所述检测试剂盒为一种直接型ELISA检测试剂盒，以本发明的单克隆抗体标定可侦测物质(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或标记酵素(例如，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP))，以检测肠病毒71型抗原。
在某些较佳实施例中，所述检测试剂盒为一种三明治型ELISA检测试剂盒，以一种动物来源的多克隆抗体为捕捉抗体，本发明的单克隆抗体为侦测抗体，并以另一种动物来源的抗鼠抗体为二级抗体检测肠病毒71型抗原。
在某些较佳实施例中，所述检测试剂盒为一种三明治型ELISA检测试剂盒，以一种动物来源的多克隆抗体为捕捉抗体，以本发明的单克隆抗体标定可侦测物质(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或标记酵素(例如，辣根过氧化物酶(HRP))为侦测抗体检测肠病毒71型抗原。
在某些较佳实施例中，所述检测试剂盒为一种三明治型ELISA检测试剂盒，以本发明的单克隆抗体为捕捉抗体，并以本发明单克隆抗体标定可侦测物质(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或标记酵素(例如，辣根过氧化物酶(HRP))为侦测抗体检测肠病毒71型抗原。
在另一方面，本发明涉及一种活体外检测肠病毒71型是否存在一生物样本中的方法，包含：(a)将所述样本与本发明的单克隆抗体接触；(b)分析所述抗体的结合，以决定肠病毒71型的存在。
在另一方面，本发明涉及一种检测一样本中肠病毒71型病毒含量的方法，包含：(a)将所述样本与本发明的单克隆抗体接触；(b)分析所述抗体的结合，以决定肠病毒71型的含量。
以下实施例将更为具体地描述本发明，这些实施例仅为说明性的，因为对本领域技术人员而言，许多修改及变化将会变得显而易见。本发明的各种具体实施例将在下文中被详细地描述。
实施例一肠病毒71型单克隆抗体的制备及筛选
一、制备具有分泌抗肠病毒71型抗体能力的小鼠淋巴B细胞
将经过管柱纯化的肠病毒71型抗原以甲醛(Sigma公司，美国)进行灭活处理后，以弗氏佐剂(Sigma公司，美国)以腹腔注射(Intraperitoneal injection,ip)免疫六周龄Balb/c雌性小鼠，每二周进行一次免疫及采血，共免疫四次。小鼠经过三次免疫后，先以酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血清中的抗肠病毒71型抗体效价是否达到门槛，确定达到门槛后再进行第四次免疫，免疫三天后进行采血并牺牲小鼠取出其脾脏，以进行细胞融合试验。
二、细胞融合试验
将预备好的小鼠骨髓瘤细胞(Mouse myeloma cell)NS-1细胞以及上述脾脏细胞均匀混合，并以聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)1450(Sigma公司)进行细胞融合后，将融合的细胞置在含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(Hypoxanthine AminopterinThymidine,HAT)的筛选培养基(Sigma公司)中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。十天后，将培养基更换为次黄嘌呤-胸苷(HT)筛选培养基(Sigma公司)，继续培养五天后，以ELISA进行融合瘤初步筛选。
三、以酵素连结免疫吸附分析(ELISA)筛选融合瘤细胞
以纯化的肠病毒71型病毒作为抗原固定在96孔盘上，并在不同孔中分别加入培养后的融合瘤细胞上清液(试验组)、HA筛选培养基(负对照组)，以及以肠病毒71型病毒免疫的小鼠牺牲前采样的血清(正对照组)作为一级抗体，再以标记碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Goat anti mouse IgG-AP，KPL公司，美国)作为二级抗体，并以
Figure GDA0003363161120000081
Microwell受质试剂盒进行呈色，进行ELISA分析，读取波长650nm下的吸光度(OD650)，以OD650读值大在0.8为标准挑选融合瘤细胞，接着进行放大培养及单克隆化试验。
四、融合瘤细胞的放大培养
将上述挑选出的融合瘤细胞移转至含有次黄嘌呤-胸苷(HT)筛选培养基(Sigma公司)的24孔盘内，置在37℃、5％CO2培养箱中培养，并在三天后取细胞上清液，以ELISA及免疫萤光染色法(Immunofluorescence assay,IFA)进行再次筛选。
五、以免疫萤光染色法(IFA)筛选融合瘤细胞
先将接种在96孔盘的非洲绿猴肾细胞(Vero cells)以病毒感染剂量(Multiplicity of infection；MOI)为0.1的肠病毒71型病毒感染24小时后，以80％冰丙酮在4℃下固定细胞，并以50％甘油(Glycerol)保存在-20℃，接着以融合瘤细胞上清液作为一级抗体在37℃培养箱中作用1小时后，再以标记萤光素异硫氰酸酯(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)的兔抗小鼠抗体(Rabbit anti mouse-FITC，Sigma公司)作为二级抗体在37℃培养箱中作用1小时，最后以萤光显微镜进行观察与拍照。
六、以极限稀释法进行融合瘤细胞的单克隆化
将经过ELISA以及IFA挑选后的融合瘤细胞进行稀释并加入96孔盘内，以光学显微镜观察，标记只含有一颗细胞的孔井，培养10天后，取融合瘤细胞上清液再次进行ELISA以及IFA筛选，将再次筛选后的细胞再放大培养，接着以蛋白质印迹法(Western blot)进行最后的筛选。
七、以蛋白质印迹法(Western blot)筛选融合瘤细胞
将肠病毒71型灭活全病毒以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析后，转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上(Millipore公司)，并将PVDF膜以阻隔缓冲液{Blocking buffer，含有5％(v/v)脱脂奶粉的TBST溶液[10mM Tris-HCl,pH 8.0(Sigma公司)、150mM NaCl(Sigma)、0.3％Tween 20(Sigma公司)]}在室温下作用1小时后，加入一级抗体[亦即，肠病毒71型市售抗体MAB979(正对照组)或肠病毒71型融合瘤细胞上清液(实验组)]在室温下作用1小时后，再以标记碱性磷酸酶(AP)的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Goat anti mouse IgG-AP，KPL公司)作为二级抗体，在室温下作用1小时，最后加入受质(PhosphaGLOTM AP Substrate,KPL公司)在室温下避光作用10分钟进行呈色，最后以清水冲洗终止反应。
八、结果
以含有HAT的筛选培养基去除未融合成功的细胞，接着分别以ELISA、IFA及蛋白质印迹法进行筛选，再经由极限稀释(Limiting dilution)将融合瘤细胞单克隆化后，取得4C7-4C3这株单克隆化成功的融合瘤细胞，且经由IFA反覆确认所述融合瘤细胞可以稳定的分泌出特异性辨识肠病毒71型病毒颗粒的抗体(如图1D所示)，且其识别效果优在肠病毒71型市售抗体MAB979(正对照组，如图1B所示)。所述融合瘤细胞寄存在德国微生物与细胞培养研究所莱布尼茨研究所Leibniz Institute DSMZ-German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures，寄存编号DSM ACC3336。
实施例二 肠病毒71型单克隆抗体的特性分析
一、单克隆抗体的抗体亚型分析
以市售小鼠免疫球蛋白亚型分析试剂盒Mouse Ig Isotyping
Figure GDA0003363161120000091
(eBioscience公司)对融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体进行抗体分型，根据制造商提供的使用手册进行试验方法。结果显示，融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体为IgG1型，且轻链为kappa链。
二、单克隆抗体超可变区(variable region)序列分析
首先以市售RNA抽取试剂盒(Viral NA VacEZor Kit,Lab Prep公司)抽取融合瘤4C7-4C3细胞的mRNA，根据制造商提供的使用手册进行mRNA抽取，并将抽取的RNA保存在-80℃备用。接着，以市售的试剂盒将抽取的mRNA反转录为cDNA，以制备融合瘤4C7-4C3细胞的cDNA。再以所述cDNA为模板，以小鼠免疫球蛋白库试剂盒(Mouse Ig library kit，ProgenBiotechnik公司)中的特异性引物进行聚合酶连锁反应(Polymerase chain reaction,PCR)，其中重链可变区(variable heavy chain,VH)的组别中加入重链稳定区引物(C端)及重链可变区引物(N端)，而轻链可变区(variable light chain,VL)的组别则加入轻链稳定区引物(C端)及轻链可变区引物(N端)，完成PCR反应后以2％洋菜胶分析PCR产物，并将有预期DNA片段的PCR产物以市售DNA片段萃取试剂盒(Geneaid Gel/PCR DNA fragmentsextraction kit，Geneaid公司)进行回收与纯化。将纯化后的PCR产物与市售的T&A克隆载体(T&A Cloning vector，Yeasterm Biotech公司)进行接合反应，并将接合后的DNA产物加至大肠杆菌(RR1)胜任细胞中，以热休克(heat shock)进行转型作用，并挑选转型成功的菌株以PCR确认后，进行DNA定序。
定序结果显示，融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体具有如SEQ ID NO:1所示序列的重链可变区(VH)，且重链可变区(VH)中的互补决定区(complementarity-determiningregions,CDRs)CDR1、CDR2、CDR3分别具有如SEQ ID NOs:2,3,4所示的序列。此外，融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体具有如SEQ ID NO:5所示序列的轻链可变区(VL)，且轻链可变区(VL)中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别具有如SEQ ID NOs:6,7,8所示的序列。
三、以蛋白质印迹法(Western blot)分析单克隆抗体所结合的病毒蛋白
将编码肠病毒71型的三段衣壳蛋白(capsid proteins)(VP1、VP2、VP3)的基因分别转入大肠杆菌(BL21Codon)中，进行原核表现后以蛋白质印迹法分析，以融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体作为一级抗体，以标记碱性磷酸酶(AP)的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Goatanti mouse IgG-AP，KPL公司)作为二级抗体，进行西方墨点分析。
西方墨点分析结果如图2所示，融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体可与肠病毒71型衣壳蛋白VP1结合(图2B，第1道)。
四、以免疫荧光染色法(IFA)分析单克隆抗体辨识的肠病毒71型基因型
先将接种在96孔盘的非洲绿猴肾细胞(Vero cells)以病毒感染剂量(MOI)为0.1的各基因型肠病毒71型病毒(基因型分别为B4、B5、C2、C4、C4a、C4b)或科萨奇病毒A16(Coxsackievirus A16,CA16)感染24小时后，以融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体作为一级抗体、以标记萤光素异硫氰酸酯(FITC)的兔抗小鼠抗体(Rabbit anti mouse-FITC，Sigma公司)作为二级抗体，进行免疫荧光染色法(IFA)检测，检测方法如实施例一所述。
结果显示，融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体可以免疫荧光染色法(IFA)辨识到不同基因型的肠病毒71型病毒，且具有高度专一性，不会辨识到与肠病毒71型相似度极高的科萨奇病毒A16(CA16)。
五、以蛋白质印迹法(Western blot)分析单克隆抗体辨识的肠病毒71型基因型
将非洲绿猴肾细胞(Vero cells)分别以各基因型肠病毒71型病毒(基因型分别为B4、B5、C2、C4、C4a、C4b)或科萨奇病毒A16(Coxsackievirus A16,CA16)感染后制备细胞裂解液，测定细胞裂解液的总蛋白质量后，以固定浓度的蛋白质进行蛋白质印迹法分析，以融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体作为一级抗体，以标记碱性磷酸酶(AP)的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Goat anti mouse IgG-AP，KPL公司)作为二级抗体。
西方墨点分析结果如图3所示，融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体可辨识不同基因型(B4、B5、C2、C4、C4a、C4b)的肠病毒71型病毒(图3B，第1～6道)，但不会辨识到与肠病毒71型相似度极高的科萨奇病毒A16(CA16)(图3B，第7道)，显示融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体对肠病毒71型病毒具有专一性。
实施例三肠病毒71型ELISA抗原检测试剂的开发
一、以直接型ELISA检测肠病毒71型抗原
1.以单克隆抗体为一级抗体，以山羊抗鼠抗体为二级抗体检测肠病毒71型抗原
将肠病毒71型标准抗原进行两倍序列稀释后固定在ELISA平板上，先以不同浓度的融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体(试验组)或纯化的兔抗肠病毒71型多克隆抗体(RAPb)(对照组)作为一级抗体，再以市售标记辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Goat anti mouse IgG-HRP，KPL公司)作为二级抗体，最后以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)作为受质进行呈色后，测定波长450nm下的吸亮度(OD450)，并绘制趋势线，取读值落在趋势线且读值大在背景值的抗原浓度为此检验试剂的检测范围。
结果如图4所示，融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体可绘制出决定系数R2为0.99的标准曲线，而兔抗肠病毒71型多克隆抗体(RAPb)(对照组)则无法成功绘制出决定系数R2为0.99的标准曲线(未显示数据)。
2.以单克隆抗体直接接合辣根过氧化物酶(HRP)检测肠病毒71型抗原
先以市售辣根过氧化物酶(HRP)共轭试剂盒(HRP Conjugation Kit，Abcam公司)将辣根过氧化物酶(HRP)接合至融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体，并将接合HRP的单克隆抗体置在4℃下备用。
将肠病毒71型标准抗原进行两倍序列稀释后固定在ELISA平板上，以不同浓度接合HRP的融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体作为一级抗体，并以TMB作为受质进行呈色后，测定波长450nm下的吸亮度(OD450)，并绘制趋势线，取读值落在趋势线且读值大在背景值的抗原浓度为此检验试剂的检测范围。
结果如图5所示，融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体可绘制出决定系数R2为0.99的标准曲线，且相较在前述连接二级抗体的直接ELISA实验中的单克隆抗体，直接接合HRP的融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体的ELISA读值较高，表示后者有较佳的敏感性。
二、以三明治型ELISA检测肠病毒71型抗原
1.以兔源多克隆抗体为捕捉抗体，单克隆抗体为侦测抗体，以山羊抗鼠抗体为二级抗体检测肠病毒71型抗原
将兔抗肠病毒71型多克隆抗体(RAPb)做为捕捉抗体，先加入两倍序列稀释后的肠病毒71型标准抗原，并以不同浓度的融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体作为一级抗体，再以市售标记辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Goat anti mouse IgG-HRP，KPL公司)作为二级抗体，最后以TMB作为受质进行呈色后，测定波长450nm下的吸亮度(OD450)，并绘制趋势线，取读值落在趋势线且读值大在背景值的抗原浓度为此检验试剂的检测范围。
结果如图6所示，融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体可绘制出决定系数R2为0.99的标准曲线。以浓度为125ng/well的融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体为例，所述标准曲线侦测的抗原浓度范围为20ng/ml～5μg/ml(图6)。
2.以兔源多克隆抗体为捕捉抗体，以单克隆抗体接合辣根过氧化物酶(HRP)为侦测抗体检测肠病毒71型抗原
将兔抗肠病毒71型多克隆抗体(RAPb)做为捕捉抗体，先加入两倍序列稀释后的肠病毒71型标准抗原，并以不同浓度接合HRP的融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体作为一级抗体，并以TMB作为受质进行呈色后，测定波长450nm下的吸亮度(OD450)，并绘制趋势线，取读值落在趋势线且读值大在背景值的抗原浓度为此检验试剂的检测范围。
结果如图7所示，接合HRP的融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体可绘制出决定系数R2为0.99的标准曲线，且相较在前述连接二级抗体的三明治型ELISA实验中的单克隆抗体，直接接合HRP的融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体敏感性较高。以浓度为125ng/well的接合HRP的融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体为例，所述标准曲线侦测的抗原浓度范围为2ng/ml～150ng/ml，其所侦测到的抗原浓度最低可至2ng/ml(图7)。
3.以单克隆抗体为捕捉抗体，单克隆抗体接合辣根过氧化物酶(HRP)为侦测抗体检测肠病毒71型抗原
将融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体做为捕捉抗体，先加入两倍序列稀释后的肠病毒71型标准抗原，并以不同浓度接合HRP的融合瘤4C7-4C3分泌的单克隆抗体作为一级抗体，并以TMB作为受质进行呈色后，测定波长450nm下的吸亮度(OD450)，并绘制趋势线，取读值落在趋势线且读值大在背景值的抗原浓度为此检验试剂的检测范围。
结果如图8所示，当捕捉抗体浓度为250ng/well、侦测抗体浓度为125ng/well时，可绘制出决定系数R2为0.99的标准曲线，且所述标准曲线侦测的抗原浓度范围为2ng/ml～78ng/ml。
上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
序列表
<110> 福又达生物科技股份有限公司
<120> 含抗肠病毒71型VP1蛋白单克隆抗体的检测试剂盒
<130> TPF18-01-5835
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro His Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Met Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Tyr Asn
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ile Asp Pro His Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Thr Glu Met Asp Tyr
1 5
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ser Leu Leu Asp
20 25 30
Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln
85 90 95
Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Ser Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Val Ser Lys
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr
1 5

Claims (10)

1.一种结合抗原肠病毒71型VP1蛋白的单克隆抗体，包含由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体为寄存在德国微生物与细胞培养研究所莱布尼茨研究所Leibniz Institute DSMZ-German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures寄存编号DSM ACC3336的融合瘤所分泌的。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体与肠病毒71型结合。
4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体与肠病毒71型的衣壳蛋白VP1结合。
5.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体经过标定。
6.一种融合瘤，为寄存在德国微生物与细胞培养研究所莱布尼茨研究所LeibnizInstitute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures寄存编号DSM ACC3336的融合瘤。
7.一种核酸，包含编码由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的重链可变区多肽的核苷酸序列和编码由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成的轻链可变区多肽的核苷酸序列。
8.一种肠病毒71型的检测试剂盒，包含权利要求1所述的单克隆抗体。
9.一种检测肠病毒71型是否存在于一生物样本中的方法，包含：
(a) 将所述样本与如权利要求1所述的单克隆抗体接触；
(b) 分析所述抗体的结合，以决定肠病毒71型的存在；
所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。
10.一种检测一样本中肠病毒71型病毒含量的方法，包含：
(a) 将所述样本与如权利要求1所述的单克隆抗体接触；
(b) 分析所述抗体的结合，以决定肠病毒71型的含量；
所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。
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