CN113583118B - 用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心ELISA检测试剂盒，所述单链抗体的序列如SEQ ID No:1所示。所述嵌合抗体包括所述的单链抗体和鸭IgG恒定区Fc段基因。所述双夹心ELISA检测试剂盒包括包被有捕获抗体的酶标板、检测抗体和酶标抗体；其中，所述捕获抗体为如上所述的嵌合抗体；所述检测抗体为鼠抗番鸭呼肠孤病毒多克隆抗体；所述酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG。本发明通过提供一种特异性识别番鸭呼肠孤病毒的抗体，并在此基础上通过鸭IgG恒定区Fc段基因进行修饰，降低排斥作用，提高重组后的嵌合抗体对于抗原的针对性识别，提高对番鸭呼肠孤病毒识别的敏感性。

Description

用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心 ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的特异性检测领域，具体地，涉及用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心ELISA检测试剂盒。

背景技术

番鸭“白点病”，因病死鸭肝脏和脾脏出现突出表面的坏死点而得名，是危害养鸭业的主要疾病之一，其病原是番鸭呼肠孤病毒(MDRV)，一年四季可经饮水、胚蛋、肌肉、滴鼻和爪垫注射等途径感染番鸭、半番鸭和麻鸭，45日龄以内(主要为2周龄以内)最易感。雏鸭感染后，机体细胞免疫和体液免疫功能下降，引发免疫抑制，进而继发其他疾病，呈现高达85％的发病率和接近55％的死亡率，即使耐过也往往变成僵鸭，给养鸭业造成了重大经济损失。因此，如何控制MDRV感染是养鸭业亟待解决的问题。

进行快速有效的诊断与监测是控制本病的前提。目前报道的检测MDRV感染的方法有病毒分离法、血清学方法和分子生物学法，但还没有确实可行的商品化诊断试剂，临床诊断多以经验判断为主。因此，探索快速、敏感、特异、低廉、简便、适于大规模诊断并监测MDRV感染的新技术，对于系统掌握第一手MDRV流行病学数据显得尤为重要。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于针对现有技术中MDRV的检测方法存在的弊端，从而提供一种能够特异性检测MDRV感染，敏感度高，且适合大规模商品化进行诊断的用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心ELISA检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体，所述单链抗体的序列如SEQ ID No:1所示。

优选地，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。

本发明还提供了一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的嵌合抗体，所述嵌合抗体包括如上述所述的单链抗体和鸭IgG恒定区Fc段基因。

优选地，所述鸭IgG恒定区Fc段基因采用序列如SEQ ID No:2和SEQ IDNo:3的引物对提取获得。

本发明还提供了一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的双夹心ELISA检测试剂盒，所述双夹心ELISA检测试剂盒包括包被有捕获抗体的酶标板、检测抗体和酶标抗体；其中，

所述捕获抗体为如上述所述的嵌合抗体；

所述检测抗体为鼠抗番鸭呼肠孤病毒多克隆抗体；

所述酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG。

优选地，所述捕获抗体的包被浓度为3-6μg/mL。

优选地，所述双夹心ELISA检测试剂盒还包括封闭剂和显色剂。

优选地，所述封闭剂选自浓度为1％的明胶，且封闭温度为37℃，封闭时间为3-18h；

所述显色剂选自TMB显色液，显色时间为5-25min。

优选地，所述鼠抗番鸭呼肠孤病毒多克隆抗体为采用番鸭呼肠孤病毒中的σC蛋白免疫小鼠产生的多克隆抗体。

通过上述技术方案，本发明通过提供一种特异性识别番鸭呼肠孤病毒的单链抗体，并在此基础上通过鸭IgG恒定区Fc段基因进行修饰，降低排斥作用，提高重组后的嵌合抗体对于抗原的针对性识别，提高对番鸭呼肠孤病毒识别的敏感性。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是实施例1中的pUC57-ScFv采用BamHI/HindIII双酶切后的鉴定图；

图2是实施例2中的鸭IgG恒定区Fc段基因的扩增产物的糖凝胶电泳图；

图3是实施例3中的pGEMT-ScFv-Fc采用NcoI/SphI双酶切后的鉴定图；

图4是实施例3中的pFBD-ScFv-Fc采用NcoI/SphI双酶切后的鉴定图；

图5是实施例3中的重组Bacmid和未发生转座的DH10Bac中的杆粒的扩增产物的糖凝胶电泳图；

图6是实施例3中的经过培养后的未转染的Sf9细胞；

图7是实施例3中的经过培养后的转染Sf9细胞；

图8是实施例3中的P2代病毒的扩增产物的糖凝胶电泳图；

图9是实施例3中的P2代病毒按照3pfu/cell的剂量感染Sf9细胞后的重组病毒表达ScFv-Fc的SDS-PAGE分析图；

图10是实施例3中的P2代病毒按照3pfu/cell的剂量感染Sf9细胞后的重组病毒表达ScFv-Fc的Western blot鉴定图；

图11是实施例3中的纯化后的嵌合抗体的SDS-PAGE分析图；

图12是检测例5中的编号为1-6的样品的扩增产物的糖凝胶电泳图；

图13是检测例5中的编号为7-22的样品的扩增产物的糖凝胶电泳图；

图14是检测例5中的编号为23-30的样品的扩增产物的糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

具体地，本发明提供了一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体，其序列如SEQID No:1所示。

实施例1、单链抗体的制备：

1、根据MDRVσC基因序列，分析筛选了5个免疫原性高的疏水性区域的氨基酸多肽(分别编号为Seq5-1、Seq5-2、Seq5-3、Seq5-4、Seq5-5)，序列见表1。

表1

多肽编号	AA位点	AA序列
			Seq5-1	1～23	MSGTPAPPGYSVPSCSPGSRGLT
Seq5-2	194-210	LIDPTYDTALLTPSPAF
			Seq5-3	222～238	DDASTKESFSLSTTGSF
Seq5-4	246～256	AWIPVAPETKN
			Seq5-5	36～55	PVSRSDVEDLSRRLSSLQSS

2、将上述五个氨基酸多肽分别与KLH(血蓝蛋白)偶联后免疫小鼠，经三次免疫后收集小鼠的血清，以对应的氨基酸多肽为包被原，HRP标记的羊抗鼠IgG(直接购自江苏康为世纪生物科技有限公司的常规市售HRP标记的羊抗鼠IgG)为二抗，间接ELISA法测定免疫鼠血清效价(包被浓度为10μg/mL，血清稀释后每孔的用量为100μL，TMB显色液，显色时间为15min)，每组效价结果见表2(n＝3)，收集效价较高组的血清备作多克隆抗体。

表2

3、选择血清效价较高的免疫鼠脾脏按常规杂交瘤技术融合，再以10μg/mL的重组σC蛋白(参照《中国动物传染病学报》中2020年28期P91-94“番鸭源呼肠孤病毒σC基因的表达与分析”中记载的方式制备)为包被原，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，间接ELISA法筛选特异性杂交瘤细胞株(得到编号分别为JN1#、JN2#、JN3#和JN4#的杂交瘤细胞株)，检测结果见表3。其中，通过表3可以看出，编号为JN3#的杂交瘤细胞株具有较高的免疫结合特性。

表3

细胞株编号	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	空白对照
							JN1#	0.328	0.283	0.221	0.185	0.130	0.090
JN2#	0.231	0.241	0.247	0.244	0.188	0.085
							JN3#	0.749	0.668	0.521	0.453	0.341	0.088
JN4#	0.223	0.239	0.223	0.188	0.147	0.080

4、提取上述得到的编号为JN3#的杂交瘤细胞株的总RNA，RT-PCR法分别扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并分别克隆至T载体后进行序列测定；根据测序结果确定特异性VH和VL序列。选取(Gly4Ser)3序列为Linker，获得序列如SEQ ID No：1所示的VH-Linker-VL取向的单链抗体，记为ScFv。其中，在后续使用过程中，这里的单链抗体可以直接根据SEQ ID No：1记载的碱基序列合成即可。进一步地，将上述合成后的单链抗体置于pUC57载体中上后，对得到的pUC57-ScFv采用BamHI/HindIII双酶切后的鉴定图如图1所示，其中，泳道1来自BamHI/HindIII双酶切后的pUC57-ScFv，泳道M为分子量标记。

实施例2、鸭IgG恒定区Fc段基因的提取：

采用序列如SEQ ID No:2和SEQ ID No:3的引物对基于Trizol法提取鸭脾脏总RNA，RT-PCR法获取鸭IgG恒定区Fc段基因，对扩增后得到的鸭IgG恒定区Fc段基因(记为IgG-Fc)进行鉴定，电泳结果如图2所示，其中，泳道1来自鸭IgG恒定区Fc段基因，泳道M为分子量标记。

实施例3、嵌合抗体的制备：

1、借助重组DNA技术将ScFv和IgG-Fc分步克隆至pGEMT载体上以构建形成重组质粒，记为pGEMT-ScFv-Fc，将得到的重组质粒采用NcoI/SphI双酶切后的鉴定图如图3所示，其中，泳道1来自NcoI/SphI双酶切后pGEMT-ScFv-Fc，泳道M为分子量标记；将ScFv和IgG-Fc克隆至pFastBacDual载体上以构建形成穿梭载体，记为pFBD-ScFv-Fc，将得到的穿梭载体采用NcoI/SphI双酶切后的鉴定图如图4所示，其中，泳道pFBD-ScFv-Fc来自NcoI/SphI双酶切后的pFBD-ScFv-Fc，泳道marker为分子量标记。

2、将pFBD-ScFv-Fc采用氯化钙法转化DH10Bac感受态细胞后，将转化后的感受态细胞进行培养，待长出单菌落后，挑取出单菌进行扩增后提取获得重组杆粒，记为重组Bacmid；以pUC/M13通用引物对(序列如SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示)对重组Bacmid和未发生转座的DH10Bac中的杆粒进行PCR鉴定，电泳结果如图5所示(其中，重组Bacmid DNA参照专利名为“质粒DNA大规模纯化工艺”中改良的碱裂解法提取)，其中，泳道未重组来自未发生转座的DH10Bac中的杆粒，泳道重组Bacmid来自重组杆粒，泳道marker为分子量标记。其中，重组Bacmid有预期4.56kb的片段，而未发生转座的DH10Bac中的杆粒的PCR扩增产物为2.56kb。

3、将重组Bacmid DNA与转染试剂脂质体按照一定比例混匀后转染状态良好的Sf9(昆虫)细胞，28℃培养72h后(其中，在经过培养后，未转染的Sf9细胞如图6所示，经过转染后的Sf9细胞如图7所示，通过图7可见经过转染后的Sf9细胞在培养后生长速度明显减慢、形态发生明显变化、大量细胞病变脱落)，收集转染后的Sf9细胞与上清液，反复冻融后离心，弃沉淀，最终得到的上清液即为P1代病毒，空斑实验测定P1代病毒滴度。将P1代重组毒按照0.1pfu/cell的剂量感染Sf9细胞，72h后收集细胞与上清液，反复冻融后离心，弃沉淀取上清液，最终获得滴度较高的P2代病毒。

4、提取P2代病毒基因组DNA，采用序列如SEQ ID No:2和SEQ ID No:3的引物对对其进行PCR法鉴定，结果如图8所示，其中，泳道Sf9来自未转染的普通Sf9细胞，泳道病毒感染后来自经P1代病毒感染后含有P2代病毒的Sf9细胞，泳道marker为分子量标记。通过图8可以看出，P1代病毒感染后Sf9细胞的上清(即含有P2代病毒的Sf9细胞)可以扩增出预期1.29kb左右的条带，而无感染对照组(即普通的Sf9细胞)无条带。

5、将P2代病毒按照1pfu/cell、3pfu/cell、5pfu/cell和10pfu/cell的剂量分别感染对数生长期的Sf9细胞，收集48h、72h和96h的上清液和细胞，采用SDS-PAGE结合Westernbloting法分析P2代病毒表达的目的蛋白(ScFv-Fc，即嵌合抗体)的表达情况，其中3pfu/cell感染剂量组在不同时间的结果如图9所示：在约75kD处有预期ScFv-Fc大小的重组蛋白，主要在上清中，重组蛋白能被Anti-His单抗识别(如图10所示)。

6、将3pfu/cell剂量感染的Sf9细胞培养72h后收获上清液与细胞，而后经过超声破碎后离心取上清液，经His镍柱纯化，得到纯化后的嵌合抗体。纯化后的嵌合抗体的SDS-PAGE分析如图11所示，其中，泳道BSA来自牛血清蛋白，泳道Sf9来自Sf9细胞，纯化ScFv-Fc来自纯化后的嵌合抗体，泳道marker为分子量标记。通过图11可以看出，纯化后的嵌合抗体的纯度在95％以上。

实施例4、基于嵌合抗体的双夹心ELISA检测方法：

以嵌合抗体作为捕获抗体(起始浓度10μg/ml，倍比稀释至0.3125μg/ml)，常规方法包被、封闭，再依次加入足够量已知MDRV作为被检抗原，1:20-1:1280的σC Seq5抗血清(属于鼠抗番鸭呼肠孤病毒多克隆抗体，具体为采用σC蛋白免疫小鼠产生的多克隆抗体，而非番鸭呼肠孤全病毒免疫产生的多克隆抗体)为检测抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG为酶标抗体，TMD显色，同时设PBS为空白对照(n＝3)。确定双夹心ELISA检测MDRV时的最佳条件为：嵌合抗体的包被浓度为5μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜；采用浓度为1％明胶，于37℃条件下封闭2h。

一种具体的检测方法：向包被有嵌合抗体的酶标板上加入待测样品，于37℃孵育1h；加入1:160稀释的鼠抗σC Seq5多克隆抗体，37℃孵育1h；加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h；TMB底物显色，室温避光显色20min，酶标仪检测OD450nm。【即(检测组-阴性组)/阴性组的比值大于等于2.1时判断为阳性】

检测例1、基于嵌合抗体的番鸭呼肠孤病毒的特异性鉴定：

分别以纯化的番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭H9N2低致病性禽流感病毒(H9N2)和1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)包被ELISA板，10μg/ml的嵌合抗体作为一抗，市售HRP标记的Anti-His抗体为二抗，进行重组蛋白的特异性鉴定，间接ELISA检测结果如表4所示。通过表4可以看出，本发明得到的嵌合抗体能与MDRV发生特异性结合，而无法识别其他病毒，具有特异性。

表4

病毒类型	MDRV	MDPV	DTMUV	H9N2	DHAV-1	空白对照
							OD450	2.378	0.102	0.093	0.096	0.074	0.068

检测例2、双夹心ELISA检测方法的敏感性测试：

将MDRV细胞培养物(TCID₅₀为10⁵/0.1mL)分别进行10倍稀释，采用实施例4中的双夹心ELISA方法对MDRV的最低检出量，每孔100μL(n＝3)，结果如表5所示。通过表5可以看出，在病毒稀释10^-5时，检测结果依然是阳性，即所建立方法对MDRV的最低检出量为1TCID₅₀，具有较高的敏感性。

表5

检测例3、双夹心ELISA检测方法的特异性测试：

采用实施例4中的双夹心ELISA检测方法分别检测MDRV、MDPV、DTMUV、H9N2和DHAV-1的细胞培养物，同时设细胞对照(n＝3)，结果见表6。通过表6可以看出，建立的方法只能检测出MDRV为阳性，并不能检测出其他病毒。表明所建立的方法具有较强的特异性。

表6

样品

MDRV

MDPV

DTMUV

H9N2

DHAV-1

Sf9

PBS

结果

+

-

-

-

-

-

-

检测例4、模拟临床样品的检测：

将MDRV病毒液按每只10LD50剂量饮水感染20只7日龄非免雏番鸭，3d后分别采集泄殖腔拭子、脾脏、肝脏的混样，按照100μL/g加人PBS，反复冻融后留上清。用建立的双夹心ELISA法检测上清中病毒(n＝3)，设置病毒阳性对照、未感染病毒的阴性对照以及空白对照，结果如表7。通过表7可以看出，本发明的方法能够检测出临床感染样品，脾脏和泄殖腔的检测结果具有一致性。

表7

样品

泄殖腔拭子

脾脏

肝脏

阳性毒

阴性

PBS

OD450

0.635

0.805

0.872

0.690

0.021

0.019

结果

+

+

+

+

-

-

检测例5、临床样品的检测：

用建立的方法对江苏、安徽、浙江、山东一些鸭场送检的30例疑似呼肠孤感染的病、死鸭的泄殖腔样品，仅检出1例，结果汇总如表8。同时，对上述送检样品采用现有技术中已经建立的番鸭呼肠孤RT-PCR方法以及新型呼肠孤RT-PCR方法进行检测，结果如图12-图14所示(其中，泳道1-30分别一一对应来自编号为1-30的样品，泳道+来自番鸭呼肠孤病毒阳性对照样本，泳道M为分子量标记)，可以看出编号为6的样品为番鸭呼肠孤病毒感染，同时，还有13个样品在泳道中出现的条带所含有的DNA片段的长度为200bp和250bp，为新型呼肠孤病毒感染。通过上述验证结果可以看出，采用本发明的双夹心ELISA检测方法检测的结果与采用RT-PCR方法检测结果一致，进一步证明建立ELISA检测方法可以特异性检出番鸭呼肠孤病毒，且检测准确性高。

表8

本发明提供了一种特异性识别MDRV的嵌合抗体，基于该嵌合抗体建立了可检测临床MDRV感染的双夹心ELISA方法，该方法敏感性高、特异性强，为临床番鸭呼肠孤病毒的流行数据掌握奠定了技术基础。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 江苏农牧科技职业学院

<120> 用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心ELISA检测试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgta ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctactaca tacactggct gaagcaaagc 120

cctgtaaaga gccttgagtg gatcggacgt attaattctt acaatggtgc tactacctac 180

aaccagaatt tcaaggacaa ggccagcttg actgtagata agtcctccag cacagcctac 240

atggacctcc acagcctgac atctgaggac tctgcagtct tttactgtgc aagggagggg 300

tatggtctgt cctactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagg aggaggaggc 360

tctggaggag gagggagtgg aggcggggga agcgatgttt tgctgaccca aactccactc 420

tccctgcctg tcagtcttgg agatcaagcc tccatctctt gtagatctag tcagaacatt 480

gtacatagta atggaaacac ctatttagaa tggtacctgc agaaaccagg ccagtctcca 540

aagctcctga tcaacaaagt ttccaaccga ttttctgggg tcccagacag gttcagtggc 600

agtggatcag ggacagattt cacactcaag atcagcagag tggaggctga ggatctggga 660

gtttattact gctttcaagg ttcacatgtt ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 720

gagctgaaa 729

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccggcagcc ccacggcgcc ctccgt 26

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctatttaccg ggggtcttct gga 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccagtcacg acgttgtaaa acg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcggataac aatttcacac agg 23

Claims (8)

1.一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的编码核酸的序列如SEQ ID No:1所示。

2.一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的嵌合抗体，其特征在于，所述嵌合抗体包括如权利要求1所述的单链抗体和鸭IgG恒定区Fc段。

3.根据权利要求2所述的用于检测番鸭呼肠孤病毒的嵌合抗体，其特征在于，所述鸭IgG恒定区Fc段采用序列如SEQ ID No:2和SEQ ID No:3的引物对提取获得。

4.一种用于检测番鸭呼肠孤病毒的双夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述双夹心ELISA检测试剂盒包括包被有捕获抗体的酶标板、检测抗体和酶标抗体；其中，

所述捕获抗体为如权利要求2或3所述的嵌合抗体；

所述检测抗体为鼠抗番鸭呼肠孤病毒多克隆抗体；

所述酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG。

5.根据权利要求4所述的双夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体的包被浓度为3-6μg/mL。

6.根据权利要求4或5所述的双夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述双夹心ELISA检测试剂盒还包括封闭剂和显色剂。

7.根据权利要求6所述的双夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述封闭剂选自浓度为1%的明胶，且封闭温度为37℃，封闭时间为1-18h；所述显色剂选自TMB显色液，显色时间为5-25min。

8.根据权利要求4所述的双夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述鼠抗番鸭呼肠孤病毒多克隆抗体为采用番鸭呼肠孤病毒中的σC蛋白免疫小鼠产生的多克隆抗体。

Images