CN109959789A - 一种狂犬病毒抗体检测试纸及其制备方法与检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种狂犬病毒抗体检测试纸及其制备方法与检测方法，属于抗体检测试纸技术领域，解决现有技术存在假阳性风险和安全隐患的问题。试纸由一端至另一端依次包括：包被狂犬病毒抗原的样品垫、包被抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的金标垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜、以及吸水垫，其彼此相互重叠并贴于背板的上表面；其中，样品垫包被的狂犬病毒抗原为狂犬病毒样颗粒。本发明采用的标记抗原为昆虫细胞表达的狂犬病病毒样颗粒，避免假阳性的发生，而且使用抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体与血液中的中和抗体进行竞争抗原，提高检测的准确性和灵敏度，病毒样颗粒没有核酸成分，消除了采用全病毒作为标记抗原而产生的生物安全隐患。

Description

一种狂犬病毒抗体检测试纸及其制备方法与检测方法
技术领域
本发明涉及抗体检测试纸技术领域，尤其涉及一种狂犬病毒抗体检测试纸及其制备方法与检测方法。
背景技术
目前，国际上通用的抗体检测方法有酶联免疫吸附试验、快速荧光灶抑制试验、中和免疫荧光试验、小鼠中和试验等，均需要较高的试验环境、精密的试验仪器、专业的操作人员等条件，无法方便快速的对狂犬病毒抗体水平进行监测，不利于较大范围的实施。
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，具有使用方便快速，反应能在15-20分钟内完成，便于基层和现场使用，具有成本低、标记物稳定等特点。
目前的狂犬病病毒抗体检测试纸条所采用的标记抗原为狂犬病病毒全病毒，而狂犬疫苗也为全病毒疫苗，由于不可能达到百分百纯化，疫苗中会存在病毒碎片、牛血清和细胞成分，体内产生的抗体包括抗狂犬病病毒5种结构蛋白(M，G，N，P，L)的抗体，抗牛血清抗体和抗细胞成分的抗体，而当使用全病毒作为标记抗原时，也不可避免标记抗原中存在上述病毒碎片、牛血清和细胞碎片等残余成分，因此，使用全病毒标记的狂犬病病毒检测试纸条与血液样本中结合的不一定为中和抗体，存在假阳性的风险。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供一种狂犬病毒抗体检测试纸及其制备方法与检测方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种狂犬病毒抗体检测试纸，由一端至另一端依次包括：包被狂犬病毒抗原的样品垫、包被抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的金标垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜、以及吸水垫，其彼此相互重叠并贴于背板的上表面；
其中，样品垫包被的狂犬病毒抗原为狂犬病毒样颗粒，检测线包被有抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，质控线包被有金黄色葡萄球菌A蛋白，抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体由胶体金标记。
优选地，样品垫包被的狂犬病毒抗原的蛋白浓度为0.5-2.0g/L。
优选地，狂犬病毒样颗粒的基本组装元件包括狂犬病病毒G蛋白和M蛋白。
优选地，狂犬病毒样颗粒是由狂犬病毒CTN-1株糖蛋白经Bac-to-Bac杆状病毒-Sf9昆虫细胞表达系统表达的病毒样颗粒。
优选地，所述金标垫垫包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为50μg/ml。
优选地，检测线包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为1.0-2.0g/L。
优选地，质控线包被的金黄色葡萄球菌A蛋白的蛋白浓度为1.0-2.0g/L。
本发明还提供了上述的狂犬病毒抗体检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
S1、样品垫制备：制备和纯化狂犬病毒抗原，将纯化后的狂犬病毒抗原用内含2％的Tween-20的20mM四硼酸钠溶液稀释成0.5-2.0mg/ml，喷涂于玻璃纤维素膜上，作为样品垫；
S2、金标垫制备：用0.2mol/L K2CO3将25-40nm的胶体金溶液调节pH值为8.4后，将纯化后检验合格的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体按照蛋白浓度为50μg/ml，加入胶体金溶液中并继续搅拌30分钟；加入10％BSA至终浓度为1％，搅拌30分钟，以10000r/min离心30分钟，小心吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的胶体金标记的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，溶于含3％BSA、3％蔗糖、0.2％Tween-20和0.1％NaN3的20mmol/L Tris-HCl溶液，喷涂在玻璃纤维上，作为金标垫；
S3、硝酸纤维素膜包被：检测线包被的为1.0-2.0g/L的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2；质控线包被的为1.0-2.0g/L的SPA，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2；
S4、试纸组装：采用样品单向层析组装方式，在背板上的一端至另一端依次粘贴狂犬病毒抗原包被的样品垫、吸附与狂犬病毒抗原相应的金标单克隆抗体纤维垫简称金标垫、硝酸纤维素膜上含有用纯化的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体溶液包被的检测线和SPA包被的质控线、吸水垫，组装后切条、密封，4-30℃保存。
本发明还提供了上述的狂犬病毒抗体检测试纸的检测方法，包括以下步骤：
将待检全血或血清样本按1:50～1:100v/v稀释，取50～100μL加入样品垫上，室温静置10-20分钟内判定结果，结果判断方法为：
狂犬病病毒抗体阳性：质控线处，出现一条红色条带；肉眼观察检测线处，出现较弱的线甚至不显色；
狂犬病病毒抗体阴性：在检测线和质控线处，各出现一条紫红色条带；肉眼观察检测线越深，说明狂犬病病毒抗体越弱；
无效：仅在检测线显色，而质控线无明显条带出现，视为试纸条检测无效。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的狂犬病毒抗体检测试纸，采用的标记抗原为昆虫细胞表达的狂犬病病毒样颗粒，仅由G蛋白和M蛋白装配而成，同时昆虫细胞培养时采用的为无血清培养基，去除了牛血清的干扰，避免假阳性的发生，而且使用抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体与血液中的中和抗体进行竞争抗原，提高检测的准确性和灵敏度。本发明的检测方法，抗体效价越高，显色越浅，甚至不显色，抗体效价越低，显色越深，更能引起人们重视。此外，病毒样颗粒没有核酸成分，消除了采用全病毒作为标记抗原而产生的生物安全隐患。因此，本发明将对狂犬病病毒免疫监控提供切实有效的检测手段。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的狂犬病毒抗体检测试纸组装图；
图2为本发明提供的狂犬病毒抗体检测试纸俯视图；
图3为本发明实施例1提供的重组杆状病毒PCR鉴定图；
图4为本发明实施例1提供的狂犬病病毒样颗粒间接免疫荧光图；
图5为本发明实施例1提供的狂犬病病毒样颗粒电镜图；
图6为本发明实施例1提供的狂犬病病毒样颗粒SDS-PAGE图；
图7为本发明实施例1提供的狂犬病病毒样颗粒免疫印迹图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。以下实施用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1狂犬病毒样颗粒的制备与鉴定
(1)材料
供体质粒pFastBac1购自Invitrogen公司，菌种E.coli DH10Bac、昆虫细胞Sf9、狂犬病病毒由长春卓谊生物股份有限公司提供。
兔抗RABV MP血清为长春西诺生物科技有限公司自制；Phusion超保真DNA聚合酶和T4DNA连接酶购自NEB公司产品；限制性内切酶、蛋白分子Marker购自Thermo公司；DH5α感受态细胞、DNA分子Marker、BacPAK杆状病毒快速滴度检测试剂盒购自Takara公司；质粒小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒、基因组提取试剂盒均购自Axygen公司；细胞转染试剂CellfectionII Reagent购自Invitrogen公司；胎牛血清为GIBCO公司产品。
(2)方法
(a)病毒基因组的提取
将狂犬病毒CTN-1病毒接种vero细胞，接种2天后收取病毒液，根据Genbank的BABVCTN-1株全基因组序列信息(Accession NO.HQ317918.1)，利用Primer5.0软件设计特异性扩增G和M基因引物，引物序列如表1所示。
表1狂犬病毒CTN-1株糖蛋白基因G和基质蛋白M特异性扩增引物
序列号 引物名称 序列(5’-3’) 酶切位点
SEQ ID 3 CTNG-F CCC<u>GAATTC</u>ATGATTCCTCAAGCTCTGTTGTTTG EcoR I
SEQ ID 4 CTNG-R TT<u>TCTGCAG</u>TTACAGCTTGGTCTCACCTCCG Pst I
SEQ ID 5 CTNM-F CCC<u>CTCGAG</u>ATGAACTTTCTACGCAAGATAGTGA Xho I
SEQ ID 6 CTNM-R CCC<u>GGTACC</u>CTATTCTAGGAGCAGGGAAGAGTC Kpn I
下划线标记为限制性内切酶酶切位点序列。
(b)CTN-1株目的基因的测定
提取RABV CTN-1株病毒RNA，反转录获得cDNA，以此为模板，以CTNG-F、CTNG-R和CTNM-F、CTNM-R为引物，利用超保真DNA聚合酶分别扩增RABV CTN-1株G和M基因，其中G基因序列如SEQ ID NO.1所示，M基因序列如SEQ ID NO.2所示。将目的基因利用Pst I和EcoR I双酶切G基因得到CTNG，Xho I和Kpn I双酶切M基因得到CTNM；载体pFB 1利用Pst I和EcoRI，Xho I和Kpn I分别进行双酶切。分别将目的产物CTNG-PE与pFB1-PE连接，CTNM-XK与pFB-1-XK连接。而后将两种链接产物分别转入到DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序分析，鉴定。
(c)重组杆状病毒表达质粒BpFB1-CTNG和BpFB1-CTNM的构建
将1μl重组质粒加入冰浴融化的DH10Bac感受态细胞，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1mL无抗性LB培养基，37℃震荡培养4h，取菌液80μL涂LB平板(含卡那霉素、庆大霉素、四环素三种抗生素)，37℃培养48h，挑选白斑菌落，加入LB培养基(卡那霉素、庆大霉素、四环素三种抗生素终浓度分别为50μg/mL、7μg/mL、10μg/mL)，37℃200rpm/min摇床培养14h。以碱裂解发提取重组杆粒DNA，分别命名为BpFB1-CTNG和BpFB1-CTNM。提取质粒DNA，进行PCR鉴定，成功扩增出G基因(1575bp)和M基因(609bp)，结果见图3，胶回收目的片段。
(d)重组杆状病毒的拯救与鉴定
转染前，Sf9贴壁细胞置于12孔培养板中，在10％胎牛血清(FBS)TC-100培养基中27℃培养，当细胞密度达到80％以上时用1.5％FBS-TC-100将Sf9细胞传至6孔板，2ml/well(1.0×106cells/well)，室温30min。利用8μl Cellfectin II Reagent放入100μl无血清培养基，混合均匀，室温静置30min；1ug重组杆状病毒表达质粒BpFB1-CTNG和BpFB1-CTNM放入100μl无血清细胞培养基，混合均匀后与转染剂-培养基复合物混合，形成重组杆粒DNA-脂质复合物，加入6孔板培养细胞，27℃培养，3～5h后吸取上清即为P1代重组杆状病毒，命名为rpFB1-CTNG和rpFB1-CTNM。将拯救获得的P1代杆状病毒感染正常生长的Sf9细胞，培养3～4天，取上清，提取DNA，以CTNG-F、CTNG-R和CTNM-F、CTNM-R为引物，进行PCR鉴定。经鉴定，rpFB1-CTNG和rpFB1-CTNM中G基因和M基因序列测定结果均正确。
(e)狂犬病病毒样颗粒的装配
Sf9细胞于无血清SF900II培养基、27℃震荡悬浮培养，3～4天传代一次。调整细胞密度至2.0×106cells/ml，在27℃震荡悬浮培养12h后，将重组杆状病毒rpFB1-CTNG和rpFB1-CTNM以MOI＝3：2比例共感染Sf9细胞，接毒后27℃震荡悬浮培养4～5天后收取细胞上清。
(f)间接免疫荧光
将重组杆状病毒感染Sf9细胞，27℃培养48h后以间接免疫荧光法检测狂犬病病毒样颗粒表达情况，如图4所示，可见大量绿色荧光，表明狂犬病病毒样颗粒大量表达。
(g)狂犬病病毒样颗粒含量测定
收获Sf9细胞培养液混合物即为狂犬病病毒样颗粒，命名为CTNVLP。利用BacPAK杆状病毒快速滴度检测试剂盒测定重组杆状病毒滴度，结果表明，重组杆状病毒感染Sf9细胞后装配形成的狂犬并病毒样颗粒病毒滴度达2.3×108IFU/ml。
(h)狂犬病病毒样颗粒的纯化
采用蔗糖密度梯度离心法，将病毒样颗粒加入含有20％、30％、40％、55％浓度的蔗糖溶液的离心管中，28000rpm，离心90min，抽取40％-55％之间的病毒条带，21000rpm，离心90min去蔗糖，沉淀用STE(1.7532g NaCl，0.05845g EDTA，0.24228g Tris-base，用二馏水定容至200ml，完全溶解后，用HCl调PH至7.5)溶解，用BCA蛋白浓度试剂盒测定CTNVLP浓度为8.46mg/ml。
(i)狂犬病病毒样颗粒的鉴定
A、利用电镜鉴定CTNVLP形态与大小。将CTNVLP滴加至电镜专用通道，10min后用1％磷钨酸染色3min，进行电镜观察，结果见图5，电镜观察可见大小在180～200nm、纤突明显的圆形或椭圆形rabies VLP。
B、Western Bot
将CTNVLP经SDS-PAGE电泳后转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上，用PBS冲洗1次，用含5％脱脂奶粉的PBS溶液封闭PVDF膜2小时；PBS洗涤膜3次，加入PBS 200倍稀释的狂犬病阳性血清国家标准品，于4℃过夜；PBS洗涤膜3次后，加入PBS 10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG，37℃孵育1小时；PBS洗涤3次；加入显色液，条带应在30分钟左右出现，用去离子水洗膜，终止反应，结果见图6和图7，可见GP(A约60kDa)和MP(B约25kDa)目的蛋白条带。
实施例2狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
(1)选取5只6～8周龄雌性BALB/c小鼠，向小鼠注射前述纯化的狂犬病毒G蛋白病毒样颗粒和等量弗氏完全佐剂乳化物，每只皮下多点注射200μl。两周后进行二免，向小鼠注射狂犬病毒G蛋白病毒样颗粒和等量弗氏不完全佐剂乳化物，注射量和方法同首次免疫。二次免疫两周后进行第三次免疫，免疫方法和病毒注射量同二次免疫。三免两周后选取经剪尾采血后血清ELISA效价达到1:10000以上时，去脾细胞与骨髓瘤细胞以6×107个/ml:1×107个/ml＝6:1的比例进行融合；用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞；采用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)进行杂交瘤细胞的筛选；将筛选到的阳性杂交瘤细胞，腹腔接种8～10周龄雌性BALB/c鼠，每只1×106个细胞。接种10日后，用注射器吸取小鼠腹水。
(2)将步骤(1)收集的腹水以2400r/min，离心5分钟，收集上清，均先后加入终浓度为0.2mol/L NaCl和0.025mol/L CaCl2溶液。滤纸过滤后，加入100倍体积灭菌纯化水，于4℃对滤液进行透析8～15小时，期间换水1～2次。再将滤液以22000r/min，离心30分钟，弃上清；将沉淀重悬于含1mol/L NaCl的0.1mol/L Tris-HCl溶液中(pH 8.0)；重复上述透析与离心1次；将沉淀的蛋白浓度调至5～10mg/ml，得到纯化的单克隆抗体。。
实施例3狂犬病毒抗体定量检测试剂盒的制备
(1)样品垫的制备
将实施例1制备的纯化后的狂犬病病毒样颗粒用20mM四硼酸钠溶液稀释成1.0mg/ml，内含2％的Tween-20，喷涂于玻璃纤维素膜上，作为样品垫。
(2)金标垫的制备
用0.2mol/L K2CO3将25nm的胶体金溶液调节pH值为8.4后，将纯化后检验合格的狂犬病病毒样颗粒单克隆抗体按照蛋白浓度为50μg/ml，快速搅拌下将狂犬病病毒样颗粒单克隆抗体加入胶体金溶液中并继续搅拌30分钟；加入10％BSA至终浓度为1％，搅拌30分钟，以10000r/min离心30分钟，小心吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的金标狂犬病病毒样颗粒单克隆抗体结合物。金标单克隆抗体保存液为20mmol/L Tris-HCl溶液，含3％BSA、3％蔗糖、0.2％Tween-20和0.1％NaN3。金标垫最佳干燥方式为-50℃冷冻干燥。
(3)硝酸纤维素膜包被
检测线T包被的为1.0g/L的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2；质控线C包被的为1.5g/L的SPA，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2。
(4)试纸条组装
采用样品单向层析组装方式，在背板1上的检测样品端依次为狂犬病毒糖蛋白病毒样颗粒包被的样品垫2，吸附与狂犬病毒糖蛋白病毒样颗粒相应的金标单克隆抗体纤维垫简称金标垫3，硝酸纤维素膜4上含有用纯化的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体溶液包被的检测线5和SPA包被的质控线6，吸水垫7。按图1顺序进行粘贴、组装，
具体地，所述背板水平地位于试纸条的最下方，所述硝酸纤维素膜贴于背板的上表面中部，所述金标垫和吸水垫分别贴于硝酸纤维素膜的两侧，所述金标垫位于靠近检测线的一侧并将硝酸纤维素膜的边缘覆盖，所述吸水垫位于靠近质控线的一侧并将硝酸纤维素膜的边缘覆盖，所述样品垫位于金标垫的另一侧并将金标垫的边缘覆盖。
组装后切条，如图2所示，密封，4-30℃保存。
实施例4本发明的狂犬病毒抗体检测试纸与荧光抗体病毒中和试验(FAVN)的比较
应用实例3制备的人狂犬病病毒抗体检测试纸，与检测血清中和抗体效价的国际标准方法——荧光抗体病毒中和试验，同时检测犬血清样品50份、犬狂犬病毒抗体阴性血清5份、犬瘟热病毒抗体阳性血清2份、犬细小病毒抗体阳性血清2份、犬腺病毒抗体阳性血清2份和不同稀释度的犬细小病毒抗体阳性参考血清(19.2IU)，检测结果见表2。
表2本发明试纸与FAVN的检测结果比较
本发明的人狂犬病病毒抗体检测试纸，采用的标记抗原为昆虫细胞表达的狂犬病病毒样颗粒，仅由G蛋白和M蛋白装配而成，同时昆虫细胞培养时采用的为无血清培养基，去除了牛血清的干扰，避免假阳性的发生，特异性好，而且病毒样颗粒没有核酸成分，消除了采用全病毒作为标记抗原而产生的生物安全性隐患。同时使用抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体与血液中的中和抗体进行竞争抗原，提高检测的灵敏度，与国际标准方法的检测结果的符合性高度一致，准确度好，而且安全性更高，实用性更好。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
序列表
<110> 长春西诺生物科技有限公司
<120> 一种人狂犬病毒抗体检测试纸及其制备方法与检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1575
<212> DNA
<213> Rabies virus
<400> 1
atgattcctc aagctctgtt gtttgtacct cttctggttt ttccattgtg tttcgggaaa 60
ttccccattt acacgatacc agacaaactc ggcccctgga gtcccatcga tatacatcac 120
ctcagctgtc cgaacaatct ggttgtggag gacgaaggat gtaccaatct gtcaggattc 180
tcatacatgg agcttaaagt aggatatatt tcggccataa aggtgaacgg gttcacttgt 240
acgggtgtgg taacggaagc agaaacctac actaactttg tcggttatgt caccaccacg 300
tttaagagaa agcacttccg accaacaccg gatgcatgca gatcagcata caattggaag 360
atggcaggtg accccagata tgaagagtct ctgcacaatc cctatcctga ttatcattgg 420
ctccggactg taaaaaccac caaagagtct gttgttatca tatctccaag tgtggcagac 480
ttagacccgt acgataaatc acttcattcg agagtttttc ctagaggaaa atgctcagga 540
ataacggtgt cttctgccta ctgctctacc aaccatgatt ataccatctg gatgcctgaa 600
aatcctagac tggggacctc ttgtgatatt ttcaccaaca gcagagggaa gagagcatcc 660
aaagggagca agacctgtgg atttgtggat gagagaggct tgtacaaatc tctaaaagga 720
gcatgcaaac tgaagctgtg tggagttctt ggacttaggc ttatggacgg aacctgggtc 780
gcgattcaga catcaaacga gaccaagtgg tgccctcctg atcaactagt gaatctacat 840
gactttcatt cagatgagat tgaacatctt gttgtggagg agttggttaa gaagagggag 900
gagtgtctag atgcactgga gtccatcatg accaccaagt ccgtgagttt cagacgtctc 960
agtcacttga ggaagcttgt gcctggattt ggaaaagcat acaccatatt caacaagacc 1020
ttaatggagg ctgatgctca ctacaaatcg gtccgaactt ggaatgagat catcccctcg 1080
aaagggtgtt taagagtcgg ggggagatgt catcctcatg tgaacggagt atttttcaat 1140
ggtatcatcc taggccctga cggccatgtc ttaatcccgg aaatgcagtc atccctcctc 1200
cagcagcata tggagttgtt ggaatcctcg gtcatcccct taatgcatcc cttggcagat 1260
ccatcaacgg tttttaaaga tggtgacgag gtggaggatt ttgttgaggt tcaccttcca 1320
gatgtgcata agcaggtctc aggggttgat ctcggtctcc caaactgggg gaaggatgtg 1380
ttgatgggcg caggcgtttt gacggcactg atgttgatga ttttcctaat gacgtgttgc 1440
cgaaggacta atagagcaga atcaatacaa cacagtcttg gagagacagg gaggaaagtg 1500
tcggtgacct cccaaagcgg gagggtcata tcttcatggg agtcatataa aagcggaggt 1560
gagaccaagc tgtaa 1575
<210> 2
<211> 609
<212> DNA
<213> Rabies virus
<400> 2
atgaactttc tacgcaagat agtgaaaaac tgtagggatg aggacaccca gaagcccccc 60
cctgtatcgg ctcctccaga tgatgatgac ttgtggctgc cccctcctga atatgtcccg 120
ctgaaagaac tcacgggcaa gaagaacatg aggaacttct gcatcaatgg tgaggtcaag 180
gtgtgcagtc caaacggcta ttcattcagg atcttacggc atattctaag atcatttgat 240
gagatatatt ctggaaatca cagaatgatt ggattagtca aggtagtcat tgggcttgct 300
ttatcagggg ctccggtccc tgagggcatg aactgggtgt acaaattgag gagaactctt 360
atcttccaat gggctgattc tagaggtccc ctcgaggggg aggagttaga gtactctcaa 420
gagatcacct gggatgacga tactgagttt gtcggattgc agataagagt gagtgcaaga 480
caatgtcata tccagggtag ggtatggtgt atcaacatga attctagaac atgtcaacta 540
tggtctgaca tgtctcttca gacacaaagg tcggaggagg acaaggactc ttccctgctc 600
ctagaatag 609
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Rabies virus
<400> 3
cccgaattca tgattcctca agctctgttg tttg 34
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Rabies virus
<400> 4
tttctgcagt tacagcttgg tctcacctcc g 31
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Rabies virus
<400> 5
cccctcgaga tgaactttct acgcaagata gtga 34
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Rabies virus
<400> 6
cccggtaccc tattctagga gcagggaaga gtc 33

Claims (9)

1.一种狂犬病毒抗体检测试纸，其特征在于，由一端至另一端依次包括：包被狂犬病毒抗原的样品垫、包被抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的金标垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜、以及吸水垫，其彼此相互重叠并贴于背板的上表面；
其中，样品垫包被的狂犬病毒抗原为狂犬病毒样颗粒，检测线包被有抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，质控线包被有金黄色葡萄球菌A蛋白，抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体由胶体金标记。
2.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体检测试纸，其特征在于，狂犬病毒样颗粒的基本组装元件包括狂犬病病毒G蛋白和M蛋白。
3.如权利要求2所述的狂犬病毒抗体检测试纸，其特征在于，狂犬病毒样颗粒是由狂犬病毒CTN-1株糖蛋白经Bac-to-Bac杆状病毒-Sf9昆虫细胞表达系统表达的病毒样颗粒。
4.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体检测试纸，其特征在于，所述金标垫垫包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为50μg/ml。
5.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体检测试纸，其特征在于，检测线包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为1.0-2.0g/L。
6.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体检测试纸，其特征在于，质控线包被的金黄色葡萄球菌A蛋白的蛋白浓度为1.0-2.0g/L。
7.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体检测试纸，其特征在于，样品垫包被的狂犬病毒抗原的蛋白浓度为0.5-2.0g/L。
8.如权利要求1-7任一项所述的狂犬病毒抗体检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、样品垫制备：制备和纯化狂犬病毒抗原，将纯化后的狂犬病毒抗原用内含2％的Tween-20的20mM四硼酸钠溶液稀释成0.5-2.0mg/ml，喷涂于玻璃纤维素膜上，作为样品垫；
S2、金标垫制备：用0.2mol/L K2CO3将25-40nm的胶体金溶液调节pH值为8.4后，将纯化后检验合格的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体按照蛋白浓度为50μg/ml，加入胶体金溶液中并继续搅拌30分钟；加入10％BSA至终浓度为1％，搅拌30分钟，以10000r/min离心30分钟，小心吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的胶体金标记的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，溶于含3％BSA、3％蔗糖、0.2％Tween-20和0.1％NaN3的20mmol/L Tris-HCl溶液，喷涂在玻璃纤维上，作为金标垫；
S3、硝酸纤维素膜包被：检测线包被的为1.0-2.0g/L的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2；质控线包被的为1.0-2.0g/L的SPA，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2；
S4、试纸组装：采用样品单向层析组装方式，在背板上的一端至另一端依次粘贴狂犬病毒抗原包被的样品垫、吸附与狂犬病毒抗原相应的金标单克隆抗体纤维垫简称金标垫、硝酸纤维素膜上含有用纯化的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体溶液包被的检测线和SPA包被的质控线、吸水垫，组装后切条、密封，4-30℃保存。
9.如权利要求1-7任一项所述的狂犬病毒抗体检测试纸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待检全血或血清样本按1:50～1:100v/v稀释，取50～100μL加入样品垫上，室温静置10-20分钟内判定结果，结果判断方法为：
狂犬病病毒抗体阳性：质控线处，出现一条红色条带；肉眼观察检测线处，出现较弱的线甚至不显色；
狂犬病病毒抗体阴性：在检测线和质控线处，各出现一条紫红色条带；肉眼观察检测线越深，说明狂犬病病毒抗体越弱；
无效：仅在检测线显色，而质控线无明显条带出现，视为试纸条检测无效。
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