CN106405082A - 猪伪狂犬病病毒检测试纸 - Google Patents

猪伪狂犬病病毒检测试纸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒的检测试纸，该检测试纸硝酸纤维素检测区5包括固定有猪伪狂犬病毒gD蛋白的疫苗毒株检测线7以及固定有金黄色葡萄球菌SPA的质控线8；该检测试纸还包括金标垫4，金标垫4吸附胶体金标记的抗猪IgG的多克隆抗体；当检测样品在迁移过金标垫4以后，其能向硝酸纤维素检测区5迁移并进行检测。本发明的检测试纸检测结果与中和抗体效价、攻毒保护结果一致，可以用来评价猪伪犬病活疫苗免疫效果评价。

Description

猪伪狂犬病病毒检测试纸
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及猪伪狂犬病病毒的检测试纸。
背景技术
猪伪狂犬病(Pseudorabies)又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒I型(Suid herpes virus I)所引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。猪是该病的主要贮存宿主和传染源。猪伪狂犬病病毒可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎；育肥猪感染猪伪狂犬病病毒时表现为呼吸道症状，无并发症时死亡率低；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100％，断奶仔猪发病率约40％，死亡率可达20％。
预防猪伪狂犬病主要通过猪伪狂犬病病毒gE基因缺失弱毒疫苗进行，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)在被免疫的猪血清中不能检测到针对gE蛋白的抗体，这一差异为利用血清进行伪狂犬野生毒株感染和gE基因缺失疫苗免疫接种进行鉴别诊断提供条件。
然而，此种方法必须在实验室中完成，所用时间长，费用高，并且不能鉴别出未免疫、无感染的抗体阴性猪。而临床上病情复杂，疫苗免疫猪、野毒株感染猪、无免疫无感染阴性猪常呈杂居状态，临床上迫切需要提供一种快速、方便、特异性高、灵敏度高、现场可用的检测方法。
此外，现有技术中对于猪伪狂犬病病毒疫苗的免疫效果的检测需要耗时较长的中和效价测定过程，临床上存在简便的、快速的检测猪伪狂犬病病毒活疫苗免疫效果和活疫苗质量检测的迫切需求。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒的检测试纸，其中，所述检测试纸硝酸纤维素检测区5包括固定有猪伪狂犬病毒gD蛋白的疫苗毒株检测线和质控线。
本发明的猪伪狂犬病病毒的检测试纸的gD蛋白对于检测样品中gD抗体的检测结果与中和抗体效价、攻毒保护结果之间保持一致，本发明的检测试纸能用于评价猪伪狂犬病活疫苗的免疫效果；同时还能检测猪伪狂犬病活疫苗质量。
本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒的检测试纸，其中，所述检测试纸硝酸纤维素检测区5包括固定有猪伪狂犬病毒gE蛋白的野毒株检测线、固定有猪伪狂犬病毒gD蛋白的疫苗毒株检测线和质控线。
本发明的猪伪狂犬病病毒的检测试纸能够在临床上鉴别是否为未免疫、无感染的阴性猪；若非阴性猪，鉴别是否为野毒株感染或是疫苗免疫猪；若为疫苗免疫猪，鉴别抗体水平能否抵抗野毒株感染。根据检测结果进行分析，使用本发明的检测试纸检测后，能够帮助判断猪只是否淘汰、隔离及免疫。本发明的检测试纸特异、敏感、快捷、简便，易在生产实践中推广应用。
本发明的另一个目的在于提供所述猪伪狂犬病病毒检测试纸的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供所述检测试纸在检测猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体中的应用。
本发明的另一个目的在于提供所述检测试纸在检测猪伪狂犬病病毒gD蛋白抗体中的应用。
本发明的另一个目的在于提供所述检测试纸在用于非诊断目的的猪伪狂犬病病毒检测中的应用。
附图说明
图1为本发明检测试纸一种实施方式的主视图；
图2为本发明检测试纸一种实施方式的俯视图。
附图标记：
支撑用不吸水PVC底板1、吸水垫2、样品垫3、金标垫4、硝酸纤维素检测区5、固定有猪伪狂犬病毒gE蛋白的野毒株检测线6、固定有猪伪狂犬病毒gD蛋白的疫苗毒株检测线7、固定有金黄色葡萄球菌SPA的质控线8。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒的检测试纸，包括硝酸纤维素检测区5和金标垫4，其中，所述检测试纸硝酸纤维素检测区5包括固定有猪伪狂犬病毒gD蛋白的疫苗毒株检测线7以及固定有金黄色葡萄球菌SPA的质控线8；所述金标垫4吸附胶体金标记的抗猪IgG的多克隆抗体；当检测样品在迁移过所述金标垫4以后，其能向硝酸纤维素检测区5迁移并进行检测。本发明的猪伪狂犬病病毒的检测试纸的gD蛋白对于检测样品中gD抗体水平的检测结果与中和抗体效价、攻毒保护结果之间保持一致，本发明的检测试纸能用于评价猪伪狂犬病活疫苗的免疫效果；同时能检测猪伪狂犬病活疫苗质量。
作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸中，所述检测试纸硝酸纤维素检测区5进一步包括固定有猪伪狂犬病毒gE蛋白的野毒株检测线6。作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸中，所述固定的猪伪狂犬病毒gD蛋白为编码序列SEQ.ID.NO.1的蛋白。作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸中，所述固定的猪伪狂犬病毒gD蛋白为序列SEQ.ID.NO.3编码的蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸中，所述检测试纸还包括样品垫3，用于添加所述检测样品；以及吸水垫2，所述吸水垫2能促进所述检测样品经由样品垫3、金标垫4、硝酸纤维素检测区5向吸水垫2迁移；所述样品垫3、金标垫4与所述吸水垫2分别位于所述硝酸纤维素检测区5的两端。作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸由支撑板1，金标垫4，硝酸纤维素检测区5和吸水垫2构成，金标垫4吸附有胶体金标记兔抗猪IgG多克隆抗体，硝酸纤维素检测区5上印迹有野毒株检测线6、疫苗毒株检测线7和质控线8的硝酸纤维素膜，由样品端至手柄端的排列为野毒株感染检测线6/疫苗毒株感染检测线7/质控线8。
鉴别检测时，当有猪伪狂犬野毒株感染，在硝酸纤维素检测区5显现野毒株检测线6，，疫苗毒株检测线7和质控8三条红色条带；当猪伪狂犬疫苗毒株免疫，在硝酸纤维素检测区5显现疫苗毒株感染检测线7和质控线8二条红色条带；当猪伪狂犬野毒株和疫苗毒株均未感染，硝酸纤维素检测区5只显现质控线8一条红色条带。
作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸中，所述金标垫4上吸附的胶体金标记的抗猪IgG的多克隆抗体包括兔抗猪IgG的多克隆抗体、或羊抗猪IgG的多克隆抗体、或鼠抗猪IgG的多克隆抗体、或马抗猪IgG的多克隆抗体。
作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸中，所述固定的猪伪狂犬病毒gE蛋白为编码序列SEQ.ID.NO.2的蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸中，所述固定的猪伪狂犬病毒gE蛋白为序列SEQ.ID.NO.4编码的蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸中，所述检测线6、7与质控线8在所述硝酸纤维素检测区5上依次按照从由样品垫3向吸水垫2的方向分布。
作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸中，所述检测线6、7与质控线8任何两条检测线之间间隔距离≥3mm。
作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试纸中，所述检测线6、7与质控线8任何两条检测线之间间隔距离≥5mm。
本发明还涉及所述检测试纸在用于非诊断目的的猪伪狂犬病病毒检测中的应用；其中，所述非诊断目的的猪伪狂犬病病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行定性和定量猪伪狂犬病病毒的检测、国际生猪贸易、进出口检疫检验以及猪伪狂犬病活疫苗质量控制方面的应用。
本发明还涉及制备所述猪伪狂犬病病毒的检测试纸的方法，所述方法包括：步骤(1)，表达gD蛋白、gE蛋白，制备金黄色葡萄球菌SPA和兔抗猪IgG多克隆抗体，并使用胶体金标记所述制备的兔抗猪IgG多克隆抗体；步骤(2)，将所述步骤(1)中制备的gD蛋白、gE蛋白、金黄色葡萄球菌SPA，分别固定在硝酸纤维素膜检测区5的野毒株检测线6、疫苗毒株检测线7以及质控线8上，将所述制备的胶体金标记兔抗猪IgG多克隆抗体吸附在金标垫4上；以及步骤(3)，依次设置用于添加所述检测样品的样品垫3、金标垫4、硝酸纤维素膜检测区5以及吸水垫2。
作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病病毒的检测试纸固定在支持物1上。
作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病病毒的检测试纸的方法步骤(2)中，将所述步骤(1)中表达的gD蛋白、gE蛋白和制备的金黄色葡萄球菌SPA分别调节浓度为0.55mg/ml、1.0mg/ml和3.0mg/ml，然后将所述调节浓度的gD蛋白、gE蛋白和金黄色葡萄球菌SPA包被固定于检测线7、6和质控线8上。
作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病病毒的检测试纸的方法中，所述检测线6、7与质控线8任何两条检测线之间间隔距离≥3mm。
作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病病毒的检测试纸的方法中，所述检测线6、7与质控线8任何两条检测线之间间隔距离≥5mm。
本发明还涉及所述检测试纸在检测猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体中的应用。
本发明所述检测试纸在临床上能够检测感染了猪伪狂犬病野毒株后猪体所产生抗gE蛋白抗体，其灵敏度与商业上试剂盒灵敏度相当。
本发明还涉及所述检测试纸在检测猪伪狂犬病病毒gD蛋白抗体中的应用。
本发明的猪伪狂犬病病毒的检测试纸的gD蛋白对于检测样品中gD抗体水平的检测结果与中和抗体效价、攻毒保护结果之间保持一致，能够评价猪伪狂犬病活疫苗的免疫效果，同时可用于检测猪伪狂犬病活疫苗质量。
本发明的检测试纸显示检测结果形象、直观准确。鉴别检测试纸以显示红棕色“│”、“││”和“│││”印迹作为检测的阴性、疫苗毒株感染和野毒株感染阳性标记，即在硝酸纤维素检测区5上显示一条棕红色条带“│”为实验成立，且猪伪狂犬病毒抗体阴性，表示被检测样品无疫苗毒株或强野毒株感染，同时提醒该养殖场需进行猪伪狂犬病疫苗免疫；两条棕红色条带“││”为猪伪狂犬病毒疫苗gD抗体阳性，说明为猪伪狂犬疫苗毒株感染，表示该养殖场猪伪狂犬病疫苗免疫有效，能够有效预防猪伪狂犬病野毒株攻击，近期不需要进行疫苗免疫；三条棕红色条带“│││”为猪伪狂犬病毒gE抗体阳性，表示被检样品为野毒株感染风险，若为种猪需进行淘汰；若为商品猪需及时隔离和进行猪伪狂犬病疫苗紧急免疫接种。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1 PRV gD蛋白的制备
1、病毒DNA的提取和PRV gD基因扩增
在生长良好的PK15细胞上接种PRV HN1201病毒(猪伪狂犬病病毒株为HN1201株(Pseudorabies virus，strain HN1201)，保藏号为CCTCCNO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日)，收获病毒后用TAKARA公司MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取PRV基因组DNA。取1μl基因组DNA作为模板，利用gD特异性引物：
gDSF:5′GTGATGGTGATGGTGATGGTGATGATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGC3′
gDSR:5′CTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG3′
进行PCR扩增，利用TAKARA的高保真酶HS DNA PolymerasewithGC Buffer，扩增条件为：94℃3min；94℃30s，68℃90s，30cycles；72℃5min。PCR产物命名为gD。其核苷酸序列见SEQ.ID.NO.3，推导其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1。
2、重组Bacmid的获取及鉴定
将高保真酶扩增获得的PCR产物gD克隆至pFastBac/HBM-TOPO载体(购自Invitrogen公司，货号A11339)，克隆体系如下：gD PCR产物4μl，Salt solution(盐溶液)1μl，TOPO vector1μl，共6μl。混合均匀，室温孵育5min，转化One ShotR Mach1TMT1R感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板，挑取单克隆鉴定gD基因的插入方向，插入方向正确的质粒送Invitrogen公司测序，鉴定gD序列的正确性。测序正确的质粒命名为pFastBac/HBM-TOPO-gD。
pFastBac/HBM-TOPO-gD质粒转化DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen，货号10361012)，pFastBac/HBM-TOPO-gD和感受态细胞中的穿梭质粒Bacmid进行转座，用Invitrogen的PureLinkHiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提取获得的重组质粒，并用pUCM13Forward/pUCM13Reverse引物鉴定gD的插入，阳性Bacmid命名为Bacmid-gD。
3、转染获得重组杆状病毒
按照Invitrogen公司Bac-to-Bac HBM TOPO Secreted Expression System的说明书提供的方法进行。6孔板每孔铺8×105个sf9细胞，待细胞贴壁后按照Cellfectin Ⅱ转染试剂的说明书进行转染：分别稀释8μl Cellfectin Ⅱ和1μg Bacmid-gD DNA到100ulSF-900 Ⅱ培养基中，Vortex混匀，混合稀释后的DNA与稀释后的Cellfectin Ⅱ(总体积约210μl),混合均匀室温孵育15～30min，滴加到细胞中。转染后72h待出现细胞病变后，收集细胞培养上清，记为P0代重组病毒vBac-gD。P0代重组病毒vBac-gD感染sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-gD用于重组蛋白表达。
4、重组杆状病毒感染High-five细胞获得重组蛋白
将P3代重组杆状病毒vBac-gD接种High-five细胞(购自Invitrogen，货号B85502)。500ml三角瓶中悬浮培养High-five细胞，至细胞密度达到7.0×105cell/ml后，按照1MOI的量接种病毒，感染后72h收取细胞培养上清。利用Millipore的切向流过滤系统将体积浓缩为原来体积的1/10。用1％(体积比)的Triton X-100(购自sigma)灭活杆状病毒，SDS-PAGE光密度法测定蛋白含量为200μg/ml，所制备PRV gD可用于检测试纸疫苗毒株检测线7印迹的印制。
实施例2PRV gE蛋白的制备
1、病毒DNA的提和PRV gE基因扩增
病毒DNA提取参照PRV gD蛋白的制备中1。取1μl基因组DNA作为模板，利用gE特异性引物：
gESF5'-GTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGAGGCCCCG
AGCCTCTCCGCCG-3'；和
gESR5'-CGCCAGCACAAACAGCCGCCCG-3'。
使用HS DNA Polymerase和设计的特异性引物对gE片段进行PCR扩增，PCR反应程序为：98℃2min；进入PCR循环，98℃10s，60℃5s，72℃1min30s，30个循环；72℃10min。PCR产物命名为gE。其核苷酸序列见SEQ.ID.NO.4，推导其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2。
2、重组Bacmid的获取及鉴定
将高保真酶扩增获得的PCR产物gE克隆至pFastBac/HBM-TOPO载体(购自Invitrogen公司，货号A11339)，克隆体系如下：gE PCR产物4μl，Salt solution(盐溶液)1μl，TOPO vector1μl，共6μl。混合均匀，室温孵育5min，转化One ShotR Mach1TMT1R感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板，挑取单克隆鉴定gE基因的插入方向，插入方向正确的质粒送Invitrogen公司测序，鉴定gE序列的正确性。测序正确的质粒命名为pFastBac/HBM-TOPO-gE。
pFastBac/HBM-TOPO-gE质粒转化DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen，货号10361012)，pFastBac/HBM-TOPO-gE和感受态细胞中的穿梭质粒Bacmid进行转座，用Invitrogen的PureLinkHiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提取获得的重组质粒，并用pUCM13Forward/pUCM13Reverse引物鉴定gE的插入，阳性Bacmid命名为Bacmid-gE。
3、转染获得重组杆状病毒
按照Invitrogen公司Bac-to-Bac HBM TOPO Secreted Expression System的说明书提供的方法进行。6孔板每孔铺8×105个sf9细胞，待细胞贴壁后按照Cellfectin Ⅱ转染试剂的说明书进行转染：分别稀释8μl Cellfectin Ⅱ和1μg Bacmid-gD DNA到100ulSF-900 Ⅱ培养基中，Vortex混匀，混合稀释后的DNA与稀释后的Cellfectin Ⅱ(总体积约210μl),混合均匀室温孵育15～30min，一滴滴加到细胞中。转染后72h待出现细胞病变后，收集细胞培养上清，记为P0代重组病毒vBac-gE。P0代重组病毒vBac-gE感染sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-gE用于重组蛋白表达。
4、重组杆状病毒感染High-five细胞获得重组蛋白
将P3代重组杆状病毒vBac-gE接种High-five细胞(购自Invitrogen，货号B85502)。500ml三角瓶中悬浮培养High-five细胞，至细胞密度达到7.0×105cell/ml后，按照1MOI的量接种病毒，感染后72h收取细胞培养上清。采用Ni柱亲和层析纯化蛋白，用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白含量为12mg/ml，所制备PRV gE蛋白可用于检测试纸猪伪狂犬野毒株感染检测线6印迹的印制。
实施例3兔抗猪IgG多克隆抗体制备
1、猪IgG制备
购买SPF仔猪，无菌采血，分离血清，用辛酸-硫酸铵法纯化IgG。取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成20％(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min；3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白；在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml，使成50％(NH4)2SO4溶液，充分混合，静置30min；3000r/min离心20min，弃上清；于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，静置30min；3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2～3次；用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常温水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次，以1％BaCl2检查透析液中的SO4 2-或以纳氏试剂检查NH4 +(取3～4ml透析液，加试剂1～2滴，出现砖红色即认为有NH4 +存在)，直至无SO4 2-或NH4出现为止(也可采用Sephadex G25或电透析除盐)；离心去沉淀(去除杂蛋白)，上清液即为粗提IgG；过DEAE-纤维素层析柱，以0.01mol/L pH7.4PBS(0.03mol/L NaCl)洗脱，收集洗脱液(也可采用SephadexG150或G200柱)；用BCA蛋白质定量试剂盒测定纯化猪IgG的蛋白含量，达到5.1mg/ml以上。
2、兔抗猪IgG多克隆抗体
以纯化的猪IgG与等量弗氏完全佐剂乳化后采用多点注射方式免疫SPF兔子，每隔两周加强免疫，加强免疫2次，加强免疫时用纯化的猪IgG与等量弗氏不全佐剂乳化。
以琼脂扩散试验(AGP)测定免疫血清抗体效价高于1：64时，采集高免兔全血，分离血清，以辛酸-硫酸铵法纯化兔抗猪IgG多克隆抗体方法参考3.1，测定IgG蛋白浓度6.2mg/ml)，所制备兔抗猪IgG多克隆抗体可用于胶体金标记。
实施例4兔抗猪IgG多克隆抗体的胶体金标记
1、将HAuC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸。
2、搅动下准确加入1.0ml的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液。
3、继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色，全过程约2～3min。冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积100ml，置于4℃保存。
4、用0.2mol/LK2CO3调节胶体金溶液的pH至8.2，匀速搅拌30min。
5、将1/10体积的1.0mg/ml兔抗猪IgG多克隆抗体溶液加于胶体金溶液中，匀速搅拌30min，逐滴加入适量的10％BSA，匀速搅拌30min。
6、置于4℃2小时后，4℃2000r/min离心30min，弃去沉淀，上清于10000r/min继续离心30min，弃去上清，沉淀即为胶体金标记的抗体，-20℃保存。
实施例5猪伪狂犬病病毒胶体金检测试纸条的制备
1、硝酸纤维素检测膜的制备
包被将PRV gE蛋白用PB工作液(1L双蒸水溶解5.80g Na2HPO4·12H2O和0.59gNaH2PO4·2H2O)稀释至1mg/ml，用喷膜仪包被于硝酸纤维素膜靠近金标垫4处，作为猪伪狂犬野毒株检测线6；PRV gD蛋白用PB工作液稀释至0.55mg/ml，用喷膜仪包被于6检测线下方，作为猪伪狂犬疫苗毒株检测线7；金黄色葡萄球菌SPA用PB工作液稀释至3.0mg/ml，用喷膜仪包被于7检测线下方，作为质控线8；膜的宽度为18mm，两线间距为5mm，置干燥间干燥。
2、干燥与封装
将包被好的硝酸纤维素膜置于干燥间(温度为20～25℃，湿度低于20％)干燥3小时。将干燥的硝酸纤维素膜贴于塑料底板的中间，用自动斩切机裁成合适大小(长为60mm，宽为4mm)，干燥间密封保存。
3、金标垫的制备
取稀释好的金标单兔抗猪IgG多克隆抗体，均匀加到玻璃纤维滤膜上，干燥间(温度为20～25℃，湿度低于20％)干燥12～16小时。用自动斩切机裁成合适大小(长为70mm，宽为4mm)。常温密封干燥保存。
4、样品垫的制备
将玻璃纤维滤膜用自动斩切机裁成合适大小(长为15mm，宽为4mm)，常温密封干燥保存。
5、吸水垫的制备
将吸水滤纸用自动斩切机裁成合适大小(长为25mm，宽为4mm)，常温密封干燥保存。
6、试纸条的制备
本发明猪伪狂犬病病毒的检测试纸设置参见图1、图2进行，图中，1为支撑板用不吸水PVC底板，2为吸水垫，3为样品垫，4为吸附胶体金标记的兔抗猪IgG多克隆抗体的金标垫，5为采用硝酸纤维素膜制备的检测区，6为用特异识别猪伪狂犬病毒强毒株但不与疫苗毒株反应的gE蛋白在硝酸纤维素膜上印制的猪伪狂犬强毒检测线印迹“|”，7为特异识别猪伪狂犬病毒野毒株以及疫苗毒株反应的gD蛋白在硝酸纤维素膜上印制的猪伪狂犬疫苗毒株检测线印迹“|”，8为金黄色葡萄球菌SPA在硝酸纤维素膜上印制的质控线印迹“|”，在硝酸纤维素检测区5上的强毒检测线印迹、疫苗毒株检测线印迹和质控线印迹组合排列为“|||”。以上组分之间交界处纤维互相交叉渗透。
本发明试纸的检测原理为：将试纸条样品垫3上滴加三蒸水，室温下作用10～15min，只在质控线8线出现一条红线，检测线6、7线不显红色，表明阴性结果成立。鉴别检测猪血清时试纸以显示红棕色“│”、“││”和“│││”印迹作为检测的阴性、疫苗毒株免疫和野毒株感染阳性标记，即在硝酸纤维素检测区5上显示一条棕红色条带“│”为试验成立，表明猪伪狂犬病毒抗体阴性，表示被检测样品无疫苗毒株或强野毒株感染，同时提醒该养殖场猪伪狂犬病毒抗体阴性，有爆发猪伪狂犬病风险，需进行猪伪狂犬病疫苗免疫；两条棕红色条带“││”为猪伪狂犬病毒疫苗gD抗体阳性，表示该养殖场猪伪狂犬病疫苗免疫有效，能够有效预防猪伪狂犬病野毒株攻击；三条棕红色条带“│││”为猪伪狂犬病毒gE抗体阳性，表示被检样品为野毒株感染风险，若为种猪需进行淘汰；若为商品猪需及时隔离和进行猪伪狂犬病疫苗紧急免疫接种。
实施例6猪伪狂犬病病毒胶体金检测试纸条检测结果与攻毒保护相关实验
将21日龄PRV抗体阴性仔猪25头随机分成5组，5头/组。第1组颈部肌肉免疫猪伪狂犬活疫苗，1ml(含106.0TCID50)，第2组颈部肌肉免疫猪伪狂犬活疫苗，1ml(含105.0TCID50)，第3组颈部肌肉免疫猪伪狂犬活疫苗，1ml(含104.0TCID50)，第4组颈部肌肉免疫猪伪狂犬活疫苗，1ml(含103.0TCID50)，第5组不免疫为对照组。免疫后28日采血，用猪伪狂犬病gB抗体检测试剂盒和猪伪狂犬病病毒胶体金检测试纸条检测抗体，参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定中和抗体。免疫28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株106.0TCID50/头，试验结果：猪伪狂犬病gB抗体检测试剂盒、猪伪狂犬病病毒胶体金检测试纸条、中和抗体及攻毒保护之间关系见表1。
攻毒0日、5日、7日、11日、14日采血，用猪伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒和猪伪狂犬病病毒胶体金检测试纸条检测gE抗体。攻毒观察至14日，统计各组疫苗保护情况。试验结果：猪伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒和猪伪狂犬病病毒胶体金检测试纸条gE抗体结果比较见表2。
表1免疫期28天后抗体检测结果及攻毒保护统计
结果显示，猪伪狂犬病病毒胶体金检测试纸检测的阳性率与攻毒保护结果一致性较高，有研究报道猪伪狂犬活疫苗中和抗体效价在1：10以上可对猪伪狂犬野毒株产生保护(Engel M,Wierup M.Eradication of ADV from a Swedish pig herd using gI-/TK-Vaccine[J].VetREC，1997,140(19)493～495.。猪伪狂犬病gB抗体检测试剂盒、猪伪狂犬病病毒胶体金检测试纸、中和抗体及攻毒保护之间存在一致性，研究结果显示本发明的猪伪狂犬病病毒检测试纸可以用来评价猪伪犬病活疫苗免疫效果评价以及猪伪犬病活疫苗质量评价。
表2攻毒后gE抗体检测结果
试验结果显示，鉴别猪伪狂犬病毒检测试纸在攻毒后7日能检测到野毒株，与猪伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒检测结果相近。从检测结果分析猪伪狂犬病病毒检测试纸能特异性区分猪只为疫苗毒株或者野毒株感染。
表1和表2表明，猪伪狂犬病病毒检测试纸能快速、简便评价猪伪狂犬活疫苗免疫后的免疫效果及特异性区分猪只是否感染野毒株，可以用于养殖场对疫苗免疫后评价及种猪PRV净化。
实施例7猪伪狂犬病病毒胶体金检测试纸条应用
某养殖场免疫猪伪狂犬活疫苗28天后采集血清，包括种公猪、种母猪和仔猪。
检测结果及分析结果如表3：
表3检测结果及分析
注：“│”代表gE、gD抗体阴性；“││”代表gE抗体阴性、gD抗体阳性；“│││”代表gE、gD抗体阳性。
将上述仔猪36#、38#、39#、40#、41#、42#、43#、44#进行攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株106.0TCID50/头，攻毒后观察临床症状，结果见表4。
表4仔猪攻毒结果
同时对上述仔猪37#和45#通过PCR进行鉴定，结果显示均为伪狂犬野毒株感染。
上述田间实验结果进一步说明，在临床上本发明的猪伪狂犬病病毒检测试纸检测结果准确，能有效区分疫苗毒株与野毒株感染，准确判定疫苗免疫保护效力，对于疫苗免疫后的效果评价及PRV净化有着重要的作用。
以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修改。因此，不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征，(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制，除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明确地列举出此类限制。

Claims (10)

1.一种猪伪狂犬病病毒的检测试纸，包括硝酸纤维素检测区(5)和金标垫(4)，其中，所述检测试纸硝酸纤维素检测区(5)包括固定有猪伪狂犬病毒gD蛋白的疫苗毒株检测线(7)以及固定有金黄色葡萄球菌SPA的质控线(8)；
所述金标垫(4)吸附胶体金标记的抗猪IgG的多克隆抗体；
当检测样品在迁移过所述金标垫(4)以后，其能向硝酸纤维素检测区(5)迁移并进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测试纸，其中，所述检测试纸硝酸纤维素检测区(5)进一步包括固定有猪伪狂犬病毒gE蛋白的野毒株检测线(6)。
3.根据权利要求1所述的检测试纸，其中，所述固定的猪伪狂犬病毒gD蛋白为编码序列SEQ.ID.NO.1的蛋白。
4.根据权利要求1所述的检测试纸，其中，所述检测试纸还包括样品垫(3)，用于添加所述检测样品；以及
吸水垫(2)，所述吸水垫(2)能促进所述检测样品经由样品垫(3)、金标垫(4)、硝酸纤维素检测区(5)向吸水垫(2)迁移；
所述样品垫(3)、金标垫(4)与所述吸水垫(2)分别位于所述硝酸纤维素检测区(5)的两端。
5.根据权利要求1所述的检测试纸，其中，所述金标垫(4)上吸附的胶体金标记的抗猪IgG的多克隆抗体包括兔抗猪IgG的多克隆抗体、或羊抗猪IgG的多克隆抗体、或鼠抗猪IgG的多克隆抗体、或马抗猪IgG的多克隆抗体。
6.根据权利要求2所述的检测试纸，其中，所述固定的猪伪狂犬病毒gE蛋白为编码序列SEQ.ID.NO.2的蛋白。
7.根据权利要求2所述的检测试纸，其中，所述检测线(6)、(7)与质控线(8)在所述硝酸纤维素检测区(5)上依次按照从由样品垫(3)向吸水垫(2)的方向分布。
8.根据权利要求2所述的检测试纸，其中，所述检测线(6)、(7)与质控线(8)任何两条检测线之间间隔距离≥3mm；优选地，所述检测线(6)、(7)与质控线(8)任何两条检测线之间间隔距离≥5mm。
9.一种制备权利要求1所述猪伪狂犬病病毒的检测试纸的方法，所述方法包括：
步骤(1)，表达gD蛋白、gE蛋白，制备金黄色葡萄球菌SPA和兔抗猪IgG多克隆抗体，并使用胶体金标记所述制备的兔抗猪IgG多克隆抗体；
步骤(2)，将所述步骤(1)中制备的gD蛋白、gE蛋白、金黄色葡萄球菌SPA，分别固定在硝酸纤维素膜检测区(5)的野毒株检测线(6)、疫苗毒株检测线(7)以及质控线(8)上，将所述制备的胶体金标记兔抗猪IgG多克隆抗体吸附在金标垫(4)上；以及
步骤(3)，依次设置用于添加所述检测样品的样品垫(3)、金标垫(4)、硝酸纤维素膜检测区(5)以及吸水垫(2)；
优选地，所述步骤(2)中，将所述步骤(1)中表达的gD蛋白、gE蛋白和制备的金黄色葡萄球菌SPA分别调节浓度为0.55mg/ml、1.0mg/ml和3.0mg/ml，然后将所述调节浓度的gD蛋白、gE蛋白和金黄色葡萄球菌SPA包被固定于检测线7、6和质控线8上；
优选地，所述检测线(6)、(7)与质控线(8)任何两条检测线之间间隔距离≥3mm；优选地，所述检测线(6)、(7)与质控线(8)任何两条检测线之间间隔距离≥5mm。
10.权利要求1～8任一项所述检测试纸在用于非诊断目的的猪伪狂犬病病毒检测中的应用；其中，所述非诊断目的的猪伪狂犬病病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行定性和定量猪伪狂犬病病毒的检测、国际生猪贸易、进出口检疫检验以及猪伪狂犬病活疫苗质量控制方面的应用。
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