CN108101968A - 一种小反刍兽疫疫苗株和野毒株差异性合成肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明“一种小反刍兽疫疫苗株和野毒株差异性合成肽及其应用”涉及小反刍兽疫病毒多肽合成物领域。所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽，其包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段I。所述小反刍野毒株合成肽，其包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的肽段III。本发明提供了两种敏感、特异性好的小反刍H多肽，此多肽可用于鉴别小反刍病毒自然感染动物和疫苗免疫动物血清。本发明多肽主要用于制作鉴别诊断试纸条包被抗原，减少了使用全病毒的危害性，避免病毒扩散。合成肽纯度高，可用于制备特异、敏感、安全、可靠的小反刍兽疫野毒株和疫苗株病毒血清抗体检测试纸条。本发明多肽抗原的优点：分子量小、活性高、抗原稳定，特异性好，制备过程简便、安全可控等优点。

Description

一种小反刍兽疫疫苗株和野毒株差异性合成肽及其应用

技术领域

本发明涉及小反刍兽疫病毒多肽合成物，具体地，涉及一种小反刍兽疫疫苗株和野毒株 差异性合成肽及其应用。

背景技术

小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)，又名小反刍兽伪牛瘟、小反刍兽瘟疫，山 羊瘟疫、传染性脓疱状胃炎、胃肠炎-肺炎综合症等，是由副黏病毒科麻疹病毒属小反刍兽疫 病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种急性接触性传染病。主要感染小反 刍动物(以山羊和绵羊为主)，以突然发热、眼口鼻排分泌物、口炎、腹泻、肺炎和死亡为特 征。OIE将其列为A类疫病。我国规定为一类动物疫病。PPR自1942年首次在西非象牙海 岸的科特迪瓦发现后，一直呈蔓延趋势，目前已经扩展到亚非地区的40多个国家，对全球养 样羊业造成巨大威胁，引起巨大的经济损失和政治影响，因此小反刍兽疫的防控工作受到世 界各国政府的高度重视。

自从2007年我国西藏阿里地区发生小反刍兽疫疫情以来，已经遍布全国29省市，对我国 卫生安全构成了严重威胁。据不完全统计，2007-2014年全球大约有70多个国家向OIE报告 发生PPR疫情或怀疑存在PPRV感染。PPR的存在不但影响经济，还对国际贸易产生不可估 量的损失。为了与世界接轨，并有效保障养羊业稳定健康发展，2015年底，我国农业部制定 了《全国小反刍兽疫消灭计划(2016-2020年)》。

PPRV主要编码6种结构蛋白(核蛋白(N)、磷蛋白(P)、多聚酶大蛋白(L)、基质蛋 白(M)、融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H))和2种非结构蛋白(C和V)。根据N和F基 因的遗传特性，PPRV可分为4个基因系：Ⅰ系、Ⅱ系、Ⅲ系和Ⅳ系。目前我国流行的PPRV 属于Ⅳ系，而疫苗毒株Nigeria75/1属于基因Ⅱ系。有研究表明，H基因在这4个基因谱系 中表现出高度相似的进化关系，故可以用其分析不同毒株的进化关系。如能找到一种能区分 野毒株和疫苗株的抗原或者单抗，就能解决鉴别诊断问题。基于以上原因，我们对基因Ⅳ系 野毒株和疫苗毒株Nigeria75/1的6种主要结构蛋白做了分析，发现不同毒株之间，H(血凝 素蛋白)和F(融合蛋白)蛋白差异最大。其中野毒株和疫苗株H蛋白氨基酸序列差异最大， 两者之间存在抗原差异区。

研究发现，F蛋白具有协助病毒穿过细胞膜将基因组导入宿主靶细胞中的作用，H蛋白则 辅助F蛋白发挥作用，这两种蛋白不仅是小反刍兽疫病毒的主要毒力蛋白，同时也是主要的 保护性抗原。H(Hemagglutinin)也称为附加蛋白(attachment protein)，是PPRV上的一 种糖蛋白，构成病毒粒子表面的一种纤突。H含有609个氨基酸，是6个结构蛋白中最易变 异的蛋白。H蛋白作为病毒和宿主细胞膜结合过程中的受体，具有调节病毒吸附并渗入宿主 细胞的作用，刺激机体产生中和抗体，参与体液保护性免疫，是机体主要的保护性抗原，也 是引起宿主细胞发生病变的主要决定因素。

我国是养羊大国，年养殖量约6亿只。切实做好小反刍兽疫防控工作，事关养羊业持续 健康发展，事关农牧民增收，意义重大。在PPRV防控工作中，诊断、检测是至关重要的环 节。准确可靠的诊断监测、结果判定是制定正确防制措施的依据。在PPR的防控上，我国主 要采取的和疫苗接种为主的政策，使用疫苗为Nigeria75/1弱毒活疫苗，Nigeria75/1弱毒苗虽 具有很强的保护力，由于PPRV只有一个血清型，用传统的方法难以区别野毒感染动物和疫 苗免疫动物，给PPR的防控带来了困难。因此，寻找一种快速、简便的鉴别诊断方法迫在眉 睫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供两种敏感、特异性好的小反刍H多肽，此多肽可用于鉴 别小反刍病毒自然感染动物和疫苗免疫动物血清，为小反刍兽疫的临床诊断、预防和小反刍 兽疫根除计划提供参考依据。

为了达到以上目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第1个方面提供一种小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽，其包括氨基酸序列如 SEQ ID No.1所示的肽段I。

在一些实施例中，所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽，还包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的肽段II。

本发明经实验验证，无论采用SEQ ID No.1所示的肽段I还是SEQ ID No.2所示的肽段II， 或是采用二者的混合物，都能在检测小反刍Nigeria 75/1疫苗株方面使检测的敏感性高达 93.3％-96.7％。

在进一步的实施例中，所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽的氨基酸序列还包括N端 保护氨基酸：C。

本发明的第2个方面提供所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽在鉴定小反刍兽疫病毒疫 苗株免疫动物方面的应用。

本发明的第3个方面提供一种小反刍野毒株合成肽，其包括氨基酸序列如SEQ IDNo.3 所示的肽段III。

在一些实施例中，所述小反刍野毒株合成肽还包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的肽 段IV。

本发明经实验验证，无论采用SEQ ID No.3所示的肽段III还是SEQ ID No.4所示的肽段 IV，或是采用二者的混合物，都能在检测小反刍野毒株方面使检测敏感性高达87％-91.3％。

在进一步的实施例中，所述小反刍野毒株合成肽的氨基酸序列还包括N端保护氨基酸：C。

本发明的第4个方面提供所述小反刍野毒株合成肽在鉴定野生毒株感染动物方面的应用。

本发明的第5个方面提供一种用于鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物和野生毒株感染 动物的试剂，其特征在于，包括所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽，和/或，所述的小 反刍野毒株合成肽。

在进一步的实施例中，所述试剂还包括用于促进来自所述小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动 物的样品、所述野生毒株感染动物的样品分别与所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽、小反 刍野毒株合成肽发生免疫结合的试剂。

在更进一步的实施例中，所述试剂还包括可促进所述免疫结合的结合物显色的试剂。

在进一步优选的实施例中，所述试剂还包括免疫检测领域的常规试剂。

本发明的第6个方面提供一种用于鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物和野生毒株感染 动物的侧向层析系统，其特征在于，包括至少1条检测线；所述检测线上设置有所述的小反 刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽，或，所述的小反刍野毒株合成肽。

在具体的实施例中，所述侧向层析系统包括2条检测线；所述2条检测线上分别设置有 所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽、和所述的小反刍野毒株合成肽。

在进一步的实施例中，所述侧向层析系统还包括质控线；所述质控线按层析方向位于所 述检测线的下游；所述质控线上包被有免疫检测领域常规抗原。优选地，所述免疫检测领域 常规抗原为羊抗兔IgG。

在更进一步的实施例中，所述侧向层析系统还包括样本区；所述样本区按层析方向位于 所述检测线的上游，用于接收来自小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物和野生毒株感染动物。

在一些实施例中，所述检测线、质控线和样本区均设置在层析膜上；所述层析膜优选硝 酸纤维素膜。

在更具体的实施例中，所述侧向层析系统还包括位于所述质控线下游的吸水区，用于吸 收反应废液。

在优选的实施例中，所述检测线和质控线所在区域为检测区；所述检测区内或检测区域 上游还设置有可随液体移动并可在检测线和/或质控线上使所述小反刍Nigeria75/1疫苗株合 成肽、所述小反刍野毒株合成肽、和/或免疫检测领域常规抗原捕捉到靶标物质后形成的复合 物显色的显色试剂。

具体地，所述靶标物质指，小反刍Nigeria 75/1疫苗株在动物体内免疫应答产生的抗体， 和/或小反刍野毒株在动物体内免疫应答产生的抗体。

本发明的第7个方面提供一种用于鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物和野生毒株感染 动物的胶体金试纸条，其特征在于，包括所述的侧向层析系统。

在一些实施例中，所述胶体金试纸条还包括设置在样本区与检测区之间的金标垫；所述 金标垫上设置有显色试剂。

在另一些实施例中，所述胶体金试纸条还包括支撑物，用于支撑所述侧向层析系统；所 述层析膜设置在所述支撑物上。所述支撑物优选PVC板。

在具体的实施例中，小反刍野毒株合成肽在检测线上的设置浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml， 小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽在另一检测线上的设置浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml，鼠抗兔 IgG在质控线上的设置浓度为0.25mg/ml～0.5mg/ml。

本发明以Nigeria 75/1疫苗株H蛋白氨基酸序列为基础，分析其与国内流行野毒株H蛋 白序列比对，找出疫苗株和野毒株差异部分，送合成，并将多肽分别偶联在BSA和KLH大 分子载体上。

小反刍兽疫病毒H合成肽在制备上用于鉴别检测小反刍自然感染动物和疫苗免疫动物中 的应用。

1.利用DNAMAN和DNAstar生物软件对小反刍兽疫病毒野毒株(基因型Ⅳ析)和疫苗株Nigeria75/1(基因型Ⅱ系)H蛋白氨基酸序列进行分析比较。选出1对多肽。

2.将步骤1设计的序列送上海强耀生物公司进行合成，并偶连到BSA(BovineSerum Albumin，牛血清白蛋白)大分子载体上。

3.用所述步骤2的多肽作包被抗原制备二联血清检测胶体金试纸条，包括，地板、样品 垫、金标垫、含有检测线T1、检测线T2和质控线C的检测垫和吸水垫。

4.本发明的小反刍兽疫H多肽抗原可用于鉴别诊断自然感染动物和疫苗接种动物，具有 特异性好、敏感性强等优点。

如果能找到能区分野毒株和疫苗株的抗原差异位点，制备胶体金试纸条，将是一种简便、 快速、灵敏的检测方法，特别适合基地现场临床检测。

H基因系统进化表明四个集群谱系有高度相似性，H基因可以用来分析不同分离株的进 化关系。故，基于H基因的不同分离株的进化关系在流行病学上有一定的指导意义。而H蛋 白的进一步分子生物学分析将为我们更好的了解病毒分子进化和宿主特异性机制，这将在控 制和根除PPR方面具有很大的意义。

故，本研究从小反刍野毒株Ⅳ系和疫苗毒株Ⅱ系H蛋白序列分析中找到几处抗原不同区 域，并对其进行了研究，发现有有两处可以区分小反刍疫苗感染动物血清和野毒感染动物血 清，为制备鉴别诊断试纸条奠定了基础。

本发明通过小反刍兽疫疫苗株和野生毒株的H氨基酸序列分析，选出8种短肽(疫苗株 和野生毒株各4种)，将其分别耦联到BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)和KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin，血蓝蛋白)载体上，通过ELISA法进行鉴定，筛出2种耦联在 KLH上的合成肽，能识别疫苗免疫动物和自然感染动物血清，且无交叉反应。为制备鉴别小 反刍兽疫疫苗株和野生毒株的试剂盒奠定了基础。

本发明涉及小反刍兽疫病毒疫苗株和野生毒株的H合成肽及其应用。本发明通过小反刍 兽疫疫苗株和野生毒株的H氨基酸序列分析，选出8种短肽(疫苗株和野生毒株各4种)， 将其分别耦联到BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)和KLH(Keyhole LimpetHemocyanin，血蓝蛋白)载体上，通过ELISA法进行鉴定，筛出2种耦联在KLH上的合成肽， 能识别疫苗免疫动物和自然感染动物血清，且无交叉反应。为制备鉴别小反刍兽疫疫苗株和野生毒株的试剂盒奠定了基础。

本发明小反刍兽疫病毒H多肽抗原，可用于鉴别小反刍兽疫病毒自然感染动物和疫苗免 疫动物。本发明多肽主要用于制作鉴别诊断试纸条包被抗原，减少了使用全病毒的危害性， 避免病毒扩散。合成肽纯度高，可用于制备特异、敏感、安全、可靠的小反刍兽疫野毒株和 疫苗株病毒血清抗体检测试纸条。

附图说明

图1为试纸条组装示意图；其中1-检测线；2-质控线；3-样本区；4-吸水区；5-NC膜；6-PVC板；7-金标垫。

图2为试纸条检测的判定标准。

图3为试纸条交叉反应的检测。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施 方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发 明的保护范围之内。

生物材料的来源

下述实施例中用到的疫苗和血清：Nigeria75/1小反刍兽疫病毒疫苗，购自新疆天康畜 牧生物技术股份有限公司。小反刍兽疫野毒感染阳性血清由本单位收集并保存(感染养殖场 提供)。牛瘟病毒感染阳性血清为本实验室保存。小反刍兽疫阴性血清为本实验室保存。

第1组实施例、本发明的疫苗株合成肽

本组实施例提供一种小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽。本组所有的实施例都具备如下共 同特征：所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段I。

在进一步的实施例中，所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽还包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的肽段II。

在本组进一步的实施例中，所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽的氨基酸序列还包括N 端保护氨基酸：C；本领域公知，当合成肽段偶联BSA时，需要在肽段N端添加“C(半胱氨 酸)”。

在另一些实施例中，所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽的氨基酸序列为SEQID No.2。

而在另一些具体的实施例中，所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

在一些优选的实施例中，所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别所示肽段的混合物。

第2组实施例、本发明疫苗株合成肽的用途

本组实施例提供第1组实施例任一所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽在鉴定小反刍 兽疫病毒疫苗株免疫动物方面的应用。

第3组实施例、本发明的野毒株合成肽

本组实施例提供一种小反刍野毒株合成肽。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所 述小反刍野毒株合成肽包括：氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的肽段III。

在进一步的实施例中，所述小反刍野毒株合成肽还包括：氨基酸序列还包括SEQID No.4 所示的肽段IV。

在一些实施例中，所述小反刍野毒株合成肽的氨基酸序列还包括N端保护氨基酸：C；本 领域公知，当合成肽段偶联BSA时，需要在肽段N端添加“C(半胱氨酸)”。

在一些具体的实施例中，所述小反刍野毒株合成肽的氨基酸序列为SEQ ID No.4。

而在另一些具体的实施例中，所述小反刍野毒株合成肽的氨基酸序列为SEQ IDNo.3。

在一些优选的实施例中，所述小反刍野毒株合成肽为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别所 示肽段的混合物。

第4组实施例、本发明野毒株合成肽的用途

本组实施例提供第3组实施例任一所述的小反刍野毒株合成肽在鉴定野生毒株感染动物 方面的应用。

第5组实施例、本发明的鉴别试剂

本组实施例提供一种用于鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物和野生毒株感染动物的试 剂，其特征在于，包括第1组实施例任一所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽，和/或第3 组实施例任一所述的小反刍野毒株合成肽。

在进一步的实施例中，所述试剂还包括用于促进来自所述小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动 物的样品、所述野生毒株感染动物的样品分别与所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽、小反 刍野毒株合成肽发生免疫结合的试剂。

在更进一步的实施例中，所述试剂还包括可促进所述免疫结合的结合物显色的试剂。

在一些实施例中，所述试剂还包括免疫检测领域的常规试剂。

第6组实施例、本发明的侧向层析系统

本组实施例提供一种用于鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物和野生毒株感染动物的侧 向层析系统。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述侧向层析系统包括至少1条检测 线；所述检测线上设置有第1组实施例任一所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽，或第2 组实施例任一所述的小反刍野毒株合成肽。

在本组一些实施例中，所述侧向层析系统包括2条检测线；所述2条检测线上分别设置 有第1组实施例任一所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽、和第3组实施例任一所述的小 反刍野毒株合成肽。

在另一些实施例中，所述侧向层析系统还包括质控线；所述质控线按层析方向位于所述 检测线的下游；所述质控线上包被有免疫检测领域常规抗原。优选地，所述免疫检测领域常 规抗原为羊抗兔IgG。

在进一步的实施例中，所述侧向层析系统还包括样本区；所述样本区按层析方向位于所 述检测线的上游，用于接收来自小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物和野生毒株感染动物。

在具体的实施例中，所述检测线、质控线和样本区均设置在层析膜上。所述层析膜优选 硝酸纤维素膜。当然还可以采用本领域常见的其它层析膜，例如，尼龙膜、PVDF膜、醋酸 纤维素膜等等，本领域技术人员可根据实际操作中的具体需求，结合考虑产品成本，对各类 常规层析膜类型进行常规选择。

在更具体的实施例中，所述侧向层析系统还包括位于所述质控线下游的吸水区，用于吸 收反应废液。

在优选的实施例中，所述检测线和质控线所在区域为检测区；所述检测区内或检测区域 上游还设置有可随液体移动并可在检测线和/或质控线上使所述小反刍Nigeria75/1疫苗株合 成肽、所述小反刍野毒株合成肽、和/或免疫检测领域常规抗原捕捉到靶标物质后形成的复合 物显色的显色试剂。

具体地，所述靶标物质指，小反刍Nigeria 75/1疫苗株在动物体内免疫应答产生的抗体， 和/或小反刍野毒株在动物体内免疫应答产生的抗体。

第7组实施例、本发明的胶体金试纸条

本组实施例提供一种用于鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物和野生毒株感染动物的胶 体金试纸条，其特征在于，包括第6组实施例任一所述的侧向层析系统。

在进一步的实施例中，所述胶体金试纸条还包括设置在样本区与检测区之间的金标垫； 所述金标垫上设置有显色试剂。

在更进一步的实施例中，所述胶体金试纸条还包括支撑物，用于支撑所述侧向层析系统； 所述层析膜设置在所述支撑物上。所述支撑物优选PVC板。

在具体的实施例中，小反刍野毒株合成肽在检测线上的设置浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml， 小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽在另一检测线上的设置浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml，鼠抗兔 IgG在质控线上的设置浓度为0.25mg/ml～0.5mg/ml。

实验例、本发明的具体实验操作及效果验证

2.小反刍兽疫H多肽选择和制备：利用DNAstar生物软件分析小反刍野毒株(基因Ⅳ系) 和疫苗毒株Nigeria75/1的H蛋白氨基酸序列，设计两条短肽，在合成肽的氨基端添加半胱 氨酸，通过马来酰亚胺法定向偶联至BSA，所述肽段序列为：

A：肽段I：SDTGKPSTSPG(SEQ ID No.1)

肽段II：TDPTVEKLYLSSHRGIIKDN(SEQ ID No.2)

B：肽段III：SDARDPSTDLG(SEQ ID No.3)

肽段IV：SDLMVEKLYLSSHRGIIKDD(SEQ ID No.4)

3.鉴别诊断试纸条的制备，按以下几步完成：

3.1含有检测线T1、T2和质控线C的硝酸纤维素膜的制备

1)包被抗原：将合成肽A用PBS溶解至终浓度1mg/ml，即为疫苗毒检测线抗原，合成肽 B用PBS溶解至终浓度1mg/ml，即为野毒检测线抗原。对照线抗原为羊抗兔IgG的IgG(Sigma 公司产品)。

2)包被

在硝酸纤维素膜Millipore180上分别包被两条检测线(T1线和T2线)和一条质控线(C 线)；T1线包被A抗原(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示肽段任选其一，或者，两种肽段按 体积比1:1混合)，用于检测疫苗株；T2线包被B抗原(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示肽段任选其一，或者，两种肽段按体积比1:1混合)，用于检测野毒株；C线包被羊抗兔IgG的IgG(Sigma公司产品)，作为质控线；将其置于37℃温箱，烘干2h，室温封存备用。

3.2金标垫的制备

1)胶体金溶液

利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液：取0.01％氯金酸水溶液200ml在微波炉中加 热至沸，准确加入1％柠檬酸三钠水溶液2ml混匀，金黄色的氯金酸水溶液在1分钟内变为紫 红色，继续煮沸6分钟取出室温冷却后置4℃保存，如此制备的金溶胶在530±5nm处有最大 吸收峰。烧制好的胶体金眼观为紫红色，透明、澄清；用分光光度计测定其最大吸收峰为 530nm，吸光度值为0.954。透过电镜观察烧制的胶体金大小均匀一致，散在分布；测量100 个胶体金颗粒大小，计算其平均值为40nm，变异系数9.6％。

2)金标二抗(金标兔抗山羊IgG的IgG)

步骤如下：

(1)量取适量上述1)制备的胶体金溶液倒入锥形瓶中，锡纸封口，在搅拌器上 适量速度搅拌；

(2)用K₂CO2溶液调节胶体金溶液的pH值至8.0-8.5；

(3)将浓度为2mg/ml的兔抗山羊IgG的IgG溶液，通过最适标记量(每ml已调 节好pH值得胶体金溶液中加入8ug蛋白)计算出胶体金标记所需的兔抗山 羊IgG的IgG，逐滴加入到锥形瓶中，继续搅拌30min；

(4)加入10％的PEG10000至终浓度为0.05％，继续搅拌15min，将金标结合物2000rpm离心30min，取上清12000rpm离心30min，沉淀用金标物保存溶液 溶解浓缩至到原体积的1/20。最后用0.45μm微孔滤膜过滤，得到胶体金标记 兔抗山羊IgG的IgG溶液，4℃保存备用。

3)金标垫的制备

将上述2)制备的胶体金标记得到的兔抗山羊IgG的IgG溶液均匀地滴加到玻璃纤维素 膜Ahlstrom8964上，37℃烤箱放置2h，锡纸包裹后干燥器内保存备用，得到金标垫(包被 有金标蛋白的金标垫)

3.3最佳反应膜抗原浓度的确定

将合成的PPRV野毒株多肽B和疫苗株多肽A分别稀释成4个浓度：1.5mg/ml 1.0mg/ml、 0.5mg/ml、0.25mg/ml，用喷膜机喷在硝酸纤维素膜(NC膜)的检测线(T1线和T2线)处；再将羊抗兔IgG稀释成3个浓度：1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml，用喷膜机喷在相应处。两 两组合后与确定好浓度的免疫胶体金制备的金标垫组装制成试纸条小样，检测PPRV山羊阳性血清和GIBICO山羊阴性血清，选择PPRV山羊阳性血清检测时T线最清晰、C线信号背景最 干净，而检测GIBICO山羊阴性血清T线和C线信号背景干净的组合作为最佳反应膜浓度。结 果显示最终选择T1线PPRV野毒株多肽最适浓度范围为0.5mg/ml～1.0mg/ml，T2线PPRV疫 苗毒多肽最适合浓度范围为0.5mg/ml～1.0mg/ml，C线上鼠抗兔IgG的IgG最佳浓度范围为0.25mg/ml～0.5mg/ml。

3.4胶体金试纸条的组装

将制备好的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫按顺序接续粘贴在预先裁好的粘性背板上 (图1)。再用切条机切成0.4cm宽的长条，装入试纸条专用盒内。

3.5胶体金试纸条的检测方法

取20倍稀释的血清样品100ul滴加于上述3.3制备的胶体金试纸条的样品垫上，10min 后判定结果。

根据T1线、T2线C线的显色情况判断是否感染小反刍病毒疫苗株或小反刍病毒野毒株。

结果判定见图2：A：T1、T2和C线均显色，说明小反刍疫苗株和野毒株抗体均为阳性(这个结果表示两种抗体在样品中同时存在,可能是动物先进行疫苗免疫后被小反刍病毒野 毒株感染的情况)；B：T1和C线显色，说明小反刍疫苗株抗体阳性；C：T2和C线显色，说 明野毒株抗体阳性；D：只有C线显色，T1和T2不显色，小反刍抗体阴性；E：T1显色，C 线不显色；F：T1和T2同时显色，C线不显色；G：T2显色，C线不显色；如C线不显色， T1和T2是否显色，判定检测失败，需要重新检测。

4.试纸条的性能评价

4.1特异性

用制备的胶体金试纸条分别检测小反刍疫苗免疫血清、小反刍野毒感染血清、小反刍病 毒阴性血清、犬瘟热阳性血清、牛瘟阳性血清、蓝舌病阳性血清、口蹄疫阳性血清、羊痘阳 性血清等各1份，观察是否有交叉反应。

结果(图3)显示，小反刍疫苗免疫血清在T1检测线有反应(A)，小反刍野毒感染血清 在T2检测线(B)有反应外，小反刍病毒阴性血清(C)、犬瘟热阳性血清(D)、牛瘟阳性血清(E)、蓝舌病阳性血清(F)、口蹄疫阳性血清(G)和羊痘阳性血清(H)等均没有阳性反应。 说明本试纸条特异性很好，没有交叉反应。

4.2敏感性

用此试纸条对背景清楚的小反刍兽疫阳性血清(自然感染血清23分，疫苗免疫血清30 份，小反刍阴性血清20份，均由本公司制备和保存)。计算试纸条敏感性。

临床样品检测结果显示，用第1组实施例和/或第2组实施例任一所述的小反刍多肽抗原 制备的试纸条检测23份小反刍野毒阳性血清有20份为T2检测线阳性，敏感性87.0％-90％， 3份与T1检测线发生非特异反应；疫苗免疫30份血清中有28份血清在T1检测线呈阳性， 敏感性为93.3％-95％，4份与T2检测线有反应；20份阴性血清在T1和T2检测线均为阴性。 具体见表1。

表1鉴别诊断试剂盒试验结果

以上试验说明合成的小反刍野毒株和疫苗株多肽具有良好的反应原性，能够与小反刍阳 性血清反应，且能很好的鉴别自然感染动物血清和临床免疫血清。为制备临床用于鉴别诊断 小反刍病毒自然感染和人工免疫动物的快速诊断试剂奠定了基础。

本发明多肽抗原的优点：分子量小、活性高、抗原稳定，特异性好，制备过程简便、安 全可控等优点。通过软件分析和试验证明该两种多肽能很好的鉴别自然感染动物和疫苗免疫 动物血清。

Claims (10)

1.一种小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽，其包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段I。

2.根据权利要求1所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽，还包括氨基酸序列如SEQID No.2所示的肽段II。

3.根据权利要求1或2所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽，其氨基酸序列还包括N端保护氨基酸：C。

4.权利要求1-3任一所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽在鉴定小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物方面的应用。

5.一种小反刍野毒株合成肽，其包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的肽段III。

6.根据权利要求5所述的小反刍野毒株合成肽，还包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的肽段IV。

7.根据权利要求5或6所述的小反刍野毒株合成肽，其氨基酸序列还包括N端保护氨基酸：C。

8.权利要求6-9任一所述的小反刍野毒株合成肽在鉴定野生毒株感染动物方面的应用。

9.一种用于鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物和野生毒株感染动物的试剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽和/或权利要求5-7任一所述的小反刍野毒株合成肽。

10.根据权利要求9所述的试剂，其特征在于，还包括用于促进来自所述小反刍兽疫病毒疫苗株免疫动物的样品、所述野生毒株感染动物的样品分别与所述小反刍Nigeria 75/1疫苗株合成肽、小反刍野毒株合成肽发生免疫结合的试剂。