CN112213493A - 可用于区分疫苗免疫和自然感染的小反刍兽疫检测试剂盒 - Google Patents
可用于区分疫苗免疫和自然感染的小反刍兽疫检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒。本发明的检测试剂盒包括固相载体以及独立地连接于所述固相载体上的特定多肽组合。所述试剂盒被采用以用于区分受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物和受到小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物，或者用于从受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物群体中区分出受到小反刍兽疫疫苗免疫后又受到小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物。
Description
技术领域
本发明主要涉及兽用检测试剂盒。具体而言，该试剂盒可用于区分对象生物中的小反刍兽疫疫苗免疫和小反刍兽疫自然感染。
背景技术
小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)俗称羊瘟，又名小反刍兽假性牛瘟(pseudorinderpest)、肺肠炎(pneumoenteritis)、口炎肺肠炎复合症(stomatitis-pneumoenteritis complex)，是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。
1942年本病首次在象牙海岸发生，其后，非洲的塞内加尔、加纳、多哥、贝宁等有本病报道，尼日利亚的绵羊和山羊中也发生了本病，并造成了重大损失。亚洲的一些国家也报道了本病，根据世界动物卫生组织(OIE)1993年《世界动物卫生》报道，孟加拉国的山羊有本病发生，印度德拉邦和马哈拉施特拉邦的部分地区绵羊中发生了类似牛瘟的疾病，最后确诊为小反刍兽疫，此后，泰米尔拉德邦也有受到感染报道。1993年，以色列第一次报道有小反刍兽疫发生，传染来源不明，为防止本病传播，以色列对其北部地区的绵羊和山羊接种了牛瘟疫苗。1992年，约旦的绵羊和山羊中发现了本病特异性抗体，1993年，有11个农场出现临诊病例，100多只绵羊和山羊死亡。1993年，沙特阿拉伯首次发现133个病例。2007年7月，该疫病首次传入我国西藏地区。
小反刍兽疫病毒属副黏病毒科麻疹病毒属。与牛瘟病毒有相似的物理化学及免疫学特性。病毒呈多形性，通常为粗糙的球形。病毒颗粒较牛瘟病毒大，核衣壳为螺旋中空杆状并有特征性的亚单位，有囊膜。病毒可在胎绵羊肾、胎羊及新生羊的睾丸细胞、Vero细胞上增殖，并产生细胞病变(CPE)，形成合胞体。
小反刍兽疫主要感染山羊、绵羊、美国白尾鹿等小反刍动物，发病动物死亡率高，为我国划定的一类动物疫病。
目前，尚无有效方法治疗小反刍兽疫，只能采取疫苗接种、疫情发生后扑杀及定期血清监测的方法来进行控制。因此，该病的血清学诊断及疫苗免疫效果的评估与监测显得尤为重要。
世界动物卫生组织推荐采用的小反刍兽疫病毒抗体检测方法主要有病毒中和试验(VNT)和酶联免疫测定(ELISA)。其中，病毒中和试验方法的检测结果准确，是检测小反刍兽疫病毒的金标准，但该方法检测时间长且不适于检测大量样本。与此相对，酶联免疫测定的特异性和敏感性较高、检测时间比病毒中和试验短且适合检测大量样品，因此，被广泛应用于小反刍兽疫病毒抗体的检测。
但是，疫苗免疫并非百分之百成功，会出现免疫失败、动物接受免疫后又发生自然感染现象。这些免疫后又被感染的动物可能成为动物群体中的传染源，增加动物群体性发病的风险。因此，尽快识别出这些免疫后又被感染的动物并将其扑杀是十分重要的。
另一方面，小反刍兽疫疫苗为减毒活疫苗，现有的小反刍兽疫病毒抗体检测方法无论是病毒中和试验(VNT)还是酶联免疫测定(ELISA)，都不能区分疫苗免疫和自然感染。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够用于区分小反刍兽疫疫苗免疫和小反刍兽疫病毒自然感染的检测试剂盒。
发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现通过将下述多肽组合1中的至少一条多肽(即一条、两条、三条、四条或全部多肽)是否对对象生物来源的生物样本有响应作为指标，能够区分对象生物是被小反刍兽疫疫苗免疫还是被小反刍兽疫病毒自然感染。从而，完成了本发明。
因此，本发明包括：
1.一种多肽组合，其包括：
a.SEQ ID NO：1所示的多肽(N50)，以及
b.SEQ ID NO：2所示的多肽(N49)，以及
c.SEQ ID NO：3所示的多肽(N47)或SEQ ID NO：4所示的多肽(N46)。
2.根据项1所述的多肽组合，其中，所述多肽组合还包括：
d.SEQ ID NO：5所示的多肽(F10)。
在此，各序列为：
SEQ ID NO：1：SAEALFRLQAMAKILEDQEE。
SEQ ID NO：2：SSQNPREAQRSAEALFRLQA。
SEQ ID NO：3：GETPGPLLPEIMQEDELSRE。
SEQ ID NO：4：TKRTRSGKPRGETPGPLLPE。
SEQ ID NO：5：TKNVRPIQTLTPGRRTRRFV。
3.根据项1或2所述的多肽组合在制备小反刍兽疫检测试剂盒中的用途。
4.根据项3所述的用途，其中所述试剂盒被采用以用于区分受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物和受到小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物，或者用于从受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物群体中区分出受到小反刍兽疫疫苗免疫后又受到小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物。
在此，具体的区分方法是，以所述多肽组合中是否至少有一条多肽(即一条、两条、三条、四条或全部多肽)对来源于对象生物的生物样本有响应作为指标。出现上述响应则说明存在自然感染。
“响应”是指R值大于或等于0.3，其中，R＝SNR1/SNR0，SNR1测得的生物样本的SNR值，SNR0是测得的阳性标准品的SNR值。
5.根据项3所述的用途，其中，所述对象生物是小反刍动物。
6.根据项3所述的用途，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
7.根据项3所述的用途，其中，所述试剂盒的固相载体上连接有来自于小反刍兽疫病毒的蛋白。
8.一种小反刍兽疫检测试剂盒，其固相载体上连接有根据项1或2所述的多肽组合。
在此，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料的载体即可。多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。
9.根据项8所述的试剂盒，其固相载体上还连接有来自于小反刍兽疫病毒的蛋白。
10.根据项9所述的试剂盒，其中，所述来自于小反刍兽疫病毒的蛋白是N蛋白、F蛋白和/或H蛋白。
在此，N蛋白是指小反刍兽疫病毒的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)，H蛋白是指小反刍兽疫病毒的血凝素蛋白(Haemagglutinin protein)，F蛋白是指小反刍兽疫病毒的融合蛋白(Fusion protein)。
11.根据项8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒被采用以用于区分受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物和受到小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物，或者用于从受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物群体中区分出受到小反刍兽疫疫苗免疫后又受到小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物。
12.根据项8所述的试剂盒，其中，所述对象生物是小反刍动物。
13.根据项8所述的试剂盒，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
在此，所述生物样本可以是对象生物的全血、血浆或血清。
即使在用小反刍兽疫疫苗为减毒活疫苗对动物群体中的对象生物进行免疫的情况下，使用本发明的小反刍兽疫检测试剂盒也能够区分疫苗免疫和自然感染。简单地讲，本发明能够取得这样的技术效果的原因是被疫苗免疫或自然感染时，对象生物产生的结合上述多肽的抗体存在一个在一段时间内产生又逐渐消失的过程。
具体实施方式
首先，本发明提供一种小反刍兽疫检测试剂盒，其包括固相载体，以及独立地连接于所述固相载体上的多肽组合。
所述多肽组合是
a.SEQ ID NO：1所示的多肽(N50)，
b.SEQ ID NO：2所示的多肽(N49)，以及
c.SEQ ID NO：3所示的多肽(N47)。
或者是
a.SEQ ID NO：1所示的多肽(N50)，
b.SEQ ID NO：2示的多肽(N49)，
c.SEQ ID NO：3所示的多肽(N47)，和
d.SEQ ID NO：5所示的多肽(F10)。
或者是
a.SEQ ID NO：1所示的多肽(N50)，
b.SEQ ID NO：2示的多肽(N49)，和
c.SEQ ID NO：4所示的多肽(N46)。
或者是
a.SEQ ID NO：1所示的多肽(N50)，
b.SEQ ID NO：2示的多肽(N49)，
c.SEQ ID NO：4所示的多肽(N46)，和
d.SEQ ID NO：5所示的多肽(F10)。
在本说明书中，固体载体可以是一个，也可以是多个，但优选为一个，即全部多肽独立地连接于同一固体载体上。在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料的载体即可。多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。
对于用小反刍兽疫疫苗(例如减毒活疫苗)免疫接种60天后的对象生物，如果采用病毒中和试验(VNT)和/或酶联免疫测定(ELISA)检测到其来源的生物样本为小反刍兽疫病毒抗体阳性，则可以确定该对象生物来源的生物样本中存在抗小反刍兽疫病毒的抗体，但无法判断该抗体是因疫苗免疫产生还是因病毒自然感染产生。即，现有的VNT和/或ELISA检测方法均不能从接受过小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物群体中区分出接受免疫后又被病毒自然感染的对象生物。
但是，对于上述VNT和/或ELISA检测阳性的生物样本，如果以所述多肽组合1中是否至少有一条多肽(即一条、两条、三条、四条或全部多肽)对来源于对象生物的生物样本有响应作为指标，则能够区分上述对象生物是被小反刍兽疫疫苗免疫还是被小反刍兽疫病毒自然感染。具体而言，当所述多肽组合中的任意一条或多条多肽对上述对象生物来源的生物样本有响应时，判定为该对象生物被小反刍兽疫病毒自然感染；反之，当所述多肽组合1中没有任何一条多肽对上述对象生物来源的生物样本有响应时，判定为该对象生物小反刍兽疫疫苗免疫、未被小反刍兽疫病毒自然感染。
因此，本发明还提供所述多肽组合在制备用于区分小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物和小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒中的用途。或者，本发明还提供所述多肽组合在制备试剂盒中的用途，该检测试剂盒用于从受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物群体中区分出受到小反刍兽疫疫苗免疫后又被小反刍兽疫病毒自然感染。
在本说明书中的上下文中，所述对象生物优选为小反刍动物，更优选为山羊或绵羊。
在本说明书中，所述生物样本可以是对象生物的全血、血浆或血清。
在本说明书中，信噪比(SNR)＝(多肽点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。
在本说明书中，“响应”是指R值大于或等于0.3，其中，R＝SNR1/SNR0，SNR1测得的生物样本的SNR值，SNR0是测得的阳性标准品的SNR值。所述阳性标准品例如可以是小反刍兽疫疫苗免疫后14～28天采集的对象生物来源的生物样本。
实施例1.多肽的制备与确认
SEQ ID NO：1～5的多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，
SEQ ID NO.1：SAEALFRLQAMAKILEDQEE。
SEQ ID NO.2：SSQNPREAQRSAEALFRLQA。
SEQ ID NO.3：GETPGPLLPEIMQEDELSRE。
SEQ ID NO.4：TKRTRSGKPRGETPGPLLPE。
SEQ ID NO.5：TKNVRPIQTLTPGRRTRRFV。
实施例2.试剂盒(检测芯片)1～3的制备
试剂盒1
采用常规方法在常规的ELISA用固相载体上点样上述SEQ ID NO：1～3所示的多肽的溶液，另外点样一个山羊IgG作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点，制备了检测芯片。所述检测芯片上还点样了重组表达的小反刍兽疫病毒N蛋白、F蛋白和H蛋白，用于确定样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体。所述试剂盒还包括小反刍兽疫疫苗免疫后14～28天采集的山羊血清样本，作为阳性标准品。
试剂盒2
除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1、2、4所示的多肽的溶液外，按照与上述试剂盒1相同的制备方法制备了检测芯片，即为试剂盒2。
试剂盒3
除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1、2、3、5所示的多肽的溶液外，按与上述试剂盒1相同的制备方法制备检测芯片，即为试剂盒3。
试剂盒4
除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1、2、4、5所示的多肽的溶液外，按与上述试剂盒1相同的制备方法制备检测芯片，即为试剂盒4。
实施例3.用试剂盒进行检测
检验步骤
(1)用纯化水将20×浓缩清洗液(TBST：0.4M Tris-HCl，2.74M NaCl，2％Tween20，pH7.2±0.2)按1:20进行稀释，得到清洗液。为使检测芯片表面完全浸润，用移液枪将约200μL清洗液加到检测芯片表面，并浸泡检测芯片一定时间。
(2)用样本稀释液(0.05MPBS，1％BSA，0.2％PVP，0.5％Tween20，pH7.2±0.2)将待测血清样本按照1:50稀释。所述待测血清样本是在小反刍兽疫疫苗(减毒活疫苗)免疫60天后采集的山羊血清样本(VNT和/或ELISA检测阳性)、以及所述阳性标准品。
(3)对于弃去了清洗液的检测芯片，在表面完全湿润的状态下，吸取200μL稀释后的血清样本加入到检测芯片上。
(4)在恒温摇床中以150转/分钟将检测芯片孵育30分钟，温度为室温。
(5)弃去血清样本，用清洗液清洗检测芯片的表面。
(6)清洗后，在检测芯片上加入200μL的酶标抗体溶液(兔抗山羊IgG-HRP，Sigma，A5420)，在恒温摇床中以150转/分钟将检测芯片孵育30分钟，温度为室温。
(7)弃去酶标抗体溶液，用清洗液将检测芯片表面清洗干净。
(8)清洗完成后，在检测芯片表面上均匀铺展20μL的发光底物液(Thermo，Prod#37074)。
(9)将用凝胶成像仪对检测芯片进行化学发光成像，并判定结果。
(10)结果判定：对于每一份血清，分别统计该试剂盒中的每一条多肽是否有响应(即R值是否大于等于0.3)，并进行判定。即，
对于上述试剂盒1，当检测到SEQ ID NO：1和/或2和/或3所示的多肽有响应时，判定为被小反刍兽疫病毒自然感染；反之，判定为未被小反刍兽疫病毒自然感染。
对于上述试剂盒2，当检测到SEQ ID NO：1和/或2和/或4所示的多肽有响应时，判定为被小反刍兽疫病毒自然感染；反之，判定为未被小反刍兽疫病毒自然感染。
对于上述试剂盒3，当检测到SEQ ID NO：1和/或2和/或3和/或5所示的多肽有响应时，判定为被小反刍兽疫病毒自然感染；反之，判定为未被小反刍兽疫病毒自然感染。
对于上述试剂盒4，当检测到SEQ ID NO：1和/或2和/或4和/或5所示的多肽有响应时，判定为被小反刍兽疫病毒自然感染；反之，判定为未被小反刍兽疫病毒自然感染。
对于从小反刍兽疫疫苗免疫接种60天后的山羊和绵羊采集的128份血清样本，采用上述试剂盒1、试剂盒2、试剂盒3或试剂盒4分别进行检测。检测结果均表明其中的两只山羊已被小反刍兽疫病毒自然感染。将这两只山羊扑杀并进行临床检验，检验结果证明其确已罹患小反刍兽疫。
尽管以上对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
序列表
<110> 中国兽医药品监察所
苏州工业园区强东医药科技有限公司
<120> 可用于区分疫苗免疫和自然感染的小反刍兽疫检测试剂盒
<130> PC00437
<141> 2019-05-31
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Ser Ala Glu Ala Leu Phe Arg Leu Gln Ala Met Ala Lys Ile Leu Glu
1 5 10 15
Asp Gln Glu Glu
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ser Ser Gln Asn Pro Arg Glu Ala Gln Arg Ser Ala Glu Ala Leu Phe
1 5 10 15
Arg Leu Gln Ala
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gly Glu Thr Pro Gly Pro Leu Leu Pro Glu Ile Met Gln Glu Asp Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Glu
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Thr Lys Arg Thr Arg Ser Gly Lys Pro Arg Gly Glu Thr Pro Gly Pro
1 5 10 15
Leu Leu Pro Glu
20
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Thr Lys Asn Val Arg Pro Ile Gln Thr Leu Thr Pro Gly Arg Arg Thr
1 5 10 15
Arg Arg Phe Val
20
Claims (10)
1.一种多肽组合，其包括：
SEQ ID NO：1所示的多肽(N50)，以及
SEQ ID NO：2所示的多肽(N49)，以及
SEQ ID NO：3所示的多肽(N47)或SEQ ID NO：4所示的多肽(N46)。
2.根据权利要求1所述的多肽组合，其中，所述多肽组合还包括：
d.SEQ ID NO：5所示的多肽(F10)。
3.根据权利要求1或2所述的多肽组合在制备小反刍兽疫检测试剂盒中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述试剂盒被采用以用于区分受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物和受到小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物，或者用于从受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物群体中区分出受到小反刍兽疫疫苗免疫后又受到小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物。
5.根据权利要求3所述的用途，其中，所述对象生物是小反刍动物。
6.根据权利要求3所述的用途，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
7.一种小反刍兽疫检测试剂盒，其固相载体上连接有根据权利要求1或2所述的多肽组合。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒被采用以用于区分受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物和受到小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物，或者用于从受到小反刍兽疫疫苗免疫的对象生物群体中区分出受到小反刍兽疫疫苗免疫后又受到小反刍兽疫病毒自然感染的对象生物。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述对象生物是小反刍动物。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
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