CN110498843B

CN110498843B - 小反刍兽疫诊断试剂盒

Info

Publication number: CN110498843B
Application number: CN201810480188.2A
Authority: CN
Inventors: 才学鹏; 薛青红; 孙淼; 陈延飞; 陈建; 李岭
Original assignee: Luoyang Zhongke Biochip Technology Co ltd; China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: Luoyang Zhongke Biochip Technology Co ltd; China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2021-01-26
Anticipated expiration: 2038-05-18
Also published as: CN110498843A

Abstract

本发明涉及小反刍兽疫诊断试剂盒。本发明的检测试剂盒包括基底，以及独立地连接于所述基底上的特定多肽或特定多肽组合。

Description

小反刍兽疫诊断试剂盒

技术领域

本发明主要涉及兽用诊断试剂盒及诊断方法。具体而言，本发明涉及用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒。

背景技术

小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)俗称羊瘟，又名小反刍兽假性牛瘟(pseudorinderpest)、肺肠炎(pneumoenteritis)、口炎肺肠炎复合症(stomatitis-pneumoenteritis complex)，是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。

反刍是指进食经过一段时间以后将半消化的食物返回嘴里再次咀嚼。小反刍动物就是有反刍现象的动物，通常是一些草食动物，因为植物的纤维是比较难消化的。反刍动物采食一般比较匆忙，特别是粗饲料，大部分未经充分咀嚼就吞咽进入瘤胃，经过瘤胃浸泡和软化一段时间后，食物经逆呕重新回到口腔，经过再咀嚼，再次混入唾液并再吞咽进入瘤胃的过程。反刍动物的胃多分为四个胃室，分别为瘤胃、网胃、重瓣胃和皱胃。前两个胃室将食物和唾液混合，特别是使用共生细菌将纤维素分解为葡萄糖。反刍动物包括家养牲畜、野牛、水牛、骆驼、骆马、长颈鹿、鹿、叉角羚、羚羊、绵羊和山羊等。

1942年小反刍兽疫首次在象牙海岸发生，其后，非洲的塞内加尔、加纳、多哥、贝宁等有本病报道，尼日利亚的绵羊和山羊中也发生了本病，并造成了重大损失。亚洲的一些国家也报道了本病，根据世界动物卫生组织(OIE)1993年《世界动物卫生》报道，孟加拉国的山羊有本病发生，印度德拉邦和马哈拉施特拉邦的部分地区绵羊中发生了类似牛瘟的疾病，最后确诊为小反刍兽疫，此后，泰米尔拉德邦也有受到感染报道。1993年，以色列第一次报道有小反刍兽疫发生，传染来源不明，为防止本病传播，以色列对其北部地区的绵羊和山羊接种了牛瘟疫苗。1992年，约旦的绵羊和山羊中发现了本病特异性抗体，1993年，有11个农场出现临诊病例，100多只绵羊和山羊死亡。1993年，沙特阿拉伯首次发现133个病例。2007年7月，该疫病首次传入我国西藏地区。

小反刍兽疫病毒属副黏病毒科麻疹病毒属。与牛瘟病毒有相似的物理化学及免疫学特性。病毒呈多形性，通常为粗糙的球形。病毒颗粒较牛瘟病毒大，核衣壳为螺旋中空杆状并有特征性的亚单位，有囊膜。病毒可在胎绵羊肾、胎羊及新生羊的睾丸细胞、Vero细胞上增殖，并产生细胞病变(CPE)，形成合胞体。

本病主要感染山羊、绵羊、美国白尾鹿等小反刍动物，流行于非洲西部、中部和亚洲的部分地区。在疫区，本病为零星发生，当易感动物增加时，即可发生流行。本病主要通过直接接触传染，病畜的分泌物和排泄物是传染源，处于亚临诊型的病羊尤为危险。小反刍兽疫潜伏期为4-5天，最长21天。自然发病仅见于山羊和绵羊。山羊发病严重，绵羊也偶有严重病例发生。一些康复山羊的唇部形成口疮样病变。感染动物临诊症状与牛瘟病牛相似。急性型体温可上升至41℃，并持续3～5天。感染动物烦躁不安，背毛无光，口鼻干燥，食欲减退。流黏液脓性鼻漏，呼出恶臭气体。在发热的前4天，口腔黏膜充血，颊黏膜进行性广泛性损害、导致多涎，随后出现坏死性病灶，开始口腔黏膜出现小的粗糙的红色浅表坏死病灶，以后变成粉红色，感染部位包括下唇、下齿龈等处。严重病例可见坏死病灶波及齿垫、腭、颊部及其乳头、舌头等处。后期出现带血水样腹泻，严重脱水，消瘦，随之体温下降。出现咳嗽、呼吸异常。发病率高达100％，在严重暴发时，死亡率为100％，在轻度发生时，死亡率不超过50％。幼年动物发病严重发病率和死亡都很高，为我国划定的一类疾病。

因本病毒对胃肠道淋巴细胞及上皮细胞具有特殊的亲和力，故能引起特征性病变。一般在感染细胞中出现嗜酸性胞浆包涵体及多核巨细胞。在淋巴组织中，小反刍兽疫病毒可引起淋巴细胞坏死。脾脏、扁桃体、淋巴结细胞被破坏。含嗜酸性胞浆包涵体的多核巨细胞出现，极少有核内包涵体。在消化系统，病毒引起马尔基氏层深部的上皮细胞发生坏死，感染细胞产生核固缩和核破裂，在表皮生发层形成含有嗜酸性胞浆包涵体的多核巨细胞。

目前，尚无有效方法治疗小反刍兽疫，只能采取疫苗接种、疫情发生后扑杀及定期血清监测的方法来进行控制。因此，该病的血清学诊断及疫苗免疫效果的评估与监测显得尤为重要。

世界动物卫生组织推荐采用的小反刍兽疫病毒抗体检测方法主要有病毒中和试验(VNT)和酶联免疫测定(ELISA)。其中，病毒中和试验方法的检测结果准确，是检测小反刍兽疫病毒的金标准，但该方法检测时间长且不适于检测大量样本。与此相对，酶联免疫测定的特异性和敏感性较高、检测时间比病毒中和试验短且适合检测大量样品，因此，被广泛应用于小反刍兽疫病毒抗体的检测。

用于小反刍兽疫病毒抗体检测的酶联免疫测定方法主要包括竞争酶联免疫测定(c-ELISA)、阻断酶联免疫测定(b-ELISA)和间接酶联免疫测定(间接ELISA)。c-ELISA和b-ELISA的特异性和敏感性都比较高，是被临床普遍接受的小反刍兽疫病毒抗体检测方法，例如国际上通用的法国BIRAD实验室的小反刍兽疫诊断试剂盒就采用了c-ELISA方法。但是，c-ELISA和b-ELISA均需使用单克隆抗体，这造成检测成本大幅提高；而且，c-ELISA和b-ELISA的操作繁琐、检测时间长(虽然相对于VNT已经有所缩短)、判据复杂。另一方面，传统的间接ELISA使用源自小反刍兽疫病毒的完整蛋白(例如H蛋白、N蛋白、F蛋白等)或重组蛋白作为包被抗原来检测血清中的抗体，其成本低于c-ELISA和b-ELISA；但是，由于该方法使用完整蛋白作为抗原，容易发生抗体的错误识别和非特异性识别，因此，其特异性和敏感性都不及c-ELISA和b-ELISA。

因此，需要开发出检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的小反刍兽疫诊断试剂盒。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的小反刍兽疫诊断试剂盒，以及能够用于制备该试剂盒的多肽或多肽组合。

基于抗原表位多肽的间接ELISA方法使用抗原表位多肽(20个氨基酸左右的单条多肽通常只包含一个抗原表位)作为包被抗原。发明人发现：该方法的敏感性往往偏低，单条多肽的敏感性一般不会超过50％；而灵敏性高的多肽，假阳性率也高，即特异性低。如果能够通过某种方式同时提高检测的特异性和敏感性，就可以克服传统的间接ELISA的缺点，开发出特异性和敏感性均可媲美c-ELISA和b-ELISA、甚至更高的小反刍兽疫诊断试剂盒。

发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现了下述多肽组合1。当以该下述多肽组合1中的至少任意一条对对象生物来源的生物样本有响应作为指标时，可以以93.0％的敏感性和89.0％的特异性诊断小反刍兽疫，完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。

因此，本发明包括：

1.一种小反刍兽疫诊断试剂盒，其包括基底，以及独立地固定于所述基底上的下述多肽组合1；

多肽组合1

SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多肽，

SEQ ID NO：2所示的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA的多肽，

SEQ ID NO：3所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，

SEQ ID NO：4所示的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS的多肽，

SEQ ID NO：5所示的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL的多肽，

SEQ ID NO：6所示的序列为H37：NEANWVVPSTDVRDLQNKGE的多肽，以及

SEQ ID NO：7所示的序列为N9：VESPGQIQRITDDPDVSIR的多肽。

2.根据项1所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其用于通过检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)，诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。

3.根据项2所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其中，所述对象生物是小反刍动物。

4.根据项2或3所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。

5.根据项2～4中任一项所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。

6.下述多肽组合1在制备小反刍兽疫诊断试剂盒中的用途；

多肽组合1

SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多肽，

SEQ ID NO：2所示的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA的多肽，

SEQ ID NO：3所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，

SEQ ID NO：4所示的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS的多肽，

SEQ ID NO：5所示的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL的多肽，

SEQ ID NO：6所示的序列为H37：NEANWVVPSTDVRDLQNKGE的多肽，以及

SEQ ID NO：7所示的序列为N9：VESPGQIQRITDDPDVSIR的多肽。

7.根据项6所述的用途，其中，所述小反刍兽疫诊断试剂盒用于通过检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)，诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。

8.根据项7所述的用途，其中，所述对象生物小反刍动物。

9.根据项7或8所述的用途，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。

10.根据项7～9中任一项所述的用途，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。

上述多肽及试剂盒可以用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)。通常，生物样本中的小反刍兽疫病毒抗体(IgG)是由于对象生物被小反刍兽疫病毒感染或被小反刍兽疫疫苗免疫而产生的，因此，上述多肽及试剂盒可以用于诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。

发明的具体实施方式

首先，本发明提供下述多肽组合1：

多肽组合1

SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多肽，

SEQ ID NO：2所示的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA的多肽，

SEQ ID NO：3所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，

SEQ ID NO：4所示的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS的多肽，

SEQ ID NO：5所示的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL的多肽，

SEQ ID NO：6所示的序列为H37：NEANWVVPSTDVRDLQNKGE的多肽，以及

SEQ ID NO：7所示的序列为N9：VESPGQIQRITDDPDVSIR的多肽。

与基于抗原表位多肽的间接ELISA方法中，单条多肽的一般不超过50％的敏感性相比，在以该多肽组合1中的至少任意一条对对象生物来源的生物样本有响应作为指标的情况下，可以以93.0％的敏感性和89.0％的特异性诊断小反刍兽疫。

本说明书中，敏感性是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。特异性是指：用“金标准”方法确认的阴性样本中，被其他方法测定为阴性样本的比例。对于小反刍兽疫病毒抗体的检测而言，本技术领域的“金标准”是病毒中和试验(VNT)。

上述多肽组合可以作为检测探针用于制备检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒。通常，生物样本中的小反刍兽疫病毒抗体(IgG)是由于对象生物被小反刍兽疫病毒感染或被小反刍兽疫疫苗免疫而产生的，因此，上述多肽组合及试剂盒可以用于诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。

因此，本发明还提供一种小反刍兽疫诊断试剂盒，其包括基底，以及独立地连接于所述基底上的上述多肽组合1。

在本说明书中，基底通常为固体，可以是一个，也可以是多个，但优选为一个，即全部多肽独立地连接于同一基底上。在本发明中，对基底没有特殊限制，只要是固体或不溶性材料载体即可。多肽与基底的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体材料的连接方法来进行。

在本说明书中，所述对象生物优选为小反刍动物，更优选为山羊或绵羊。

在本说明书中，所述生物样本可以是全血、血浆或血清。

在使用上述试剂盒诊断小反刍兽疫的情况下，当所述多肽组合1中的任意或一条以上多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定该对象生物已被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫(即阳性)；反之，判定该对象生物未被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫(即阴性)。

在本说明书中，“响应”是指：信噪比(SNR)大于或等于2，其中，信噪比＝(多肽点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。

实施例

1.多肽的制备与确认

SEQ ID NO：1～7的多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，

SEQ ID NO：1的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE；

SEQ ID NO：2的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA；

SEQ ID NO：3的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL；

SEQ ID NO：4的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS；

SEQ ID NO：5的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL；

SEQ ID NO：6的序列为H37：NEANWVVPSTDVRDLQNKGE；

SEQ ID NO：7的序列为N9：VESPGQIQRITDDPDVSIR。

2.试剂盒(多肽芯片)1的制备

试剂盒1

多肽芯片是将SEQ ID NO：1～7的多肽的溶液分别点样在固体支撑材料——“0+X”膜(iPDMS膜)上制备而成的(同时点样一个山羊IgG作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点)。“0+X”膜是将带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂加入到聚二甲基硅氧烷材料中，随后以热交联(硅氢键键合)的方式固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构中，得到的一种材料。其制作过程可参见国际公开专利WO2014/044184。

3.用试剂盒进行检测

将多肽芯片置于室温20min，肉眼观察芯片表面，将有缺损的多肽芯片淘汰，同时确定多肽芯片的正确方向，夹于凸槽，按照血清的数量进行芯片的编号，然后在合格的多肽芯片内注满TBST(0.4M Tris-HCl，2.74M NaCl，2％Tween20，pH7.2±0.2)，室温放置2-4min，检查有无漏夜，将漏液的多肽芯片弃去。填补空缺的多肽芯片，操作同上。将检验合格的多肽芯片夹于凸槽上，每8个芯片为一组，用TBST润洗2次，喷壶淋洗，一孔进一孔出，形成流动，最后在纱布上轻轻拍打，再一个一个取盖甩干，但要注意保持多肽芯片表面湿润，备用。

在超净台内将血清稀释50倍(5μl血清样本+245μl血清稀释液)分别做编号，震荡混匀，使芯片编号与血清编号互相一致，在已经润洗的芯片上上样，200μl/孔，避免产生气泡，加入经稀释后的血清200μl，室温，摇床150rpm，孵育30min。

弃液，淋洗4次(方法同上)，甩干，加入二抗(兔抗山羊IgG)，室温，摇床150rpm，孵育30min

弃液，弃盖，淋洗4次，甩干，每8个芯片为一组，加20μl/孔的发光液(Thermo，Prod#37074)，曝光2min。使用GenePix Pro6.0采集数据。

对于每一份血清，分别统计该试剂盒中的每一条多肽是否有响应(即，信噪比(SNR)大于等于2)，并进行判定。

对于上述试剂盒1，当检测到SEQ ID NO：1～7所示的多肽中的任意一条或一条以上有响应时，判定为小反刍兽疫阳性；反之，判定为阴性。

其中，信噪比＝(多肽点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。多肽点信号值是指软件读取的多肽点的化学发光强度值，阴性对照点信号值是指软件读取的阴性对照点的化学发光强度值。

对于755份来自中国各地区的山羊和绵羊血清样本，分别采用上述步骤2中制备的试剂盒(按上述3的步骤)以及病毒中和试验(VNT，按OIE(2010)《小反刍兽疫病毒中和试验》所述方法)进行检测，检测结果如下所示。

表1

敏感性＝371/399*100％＝93.0％

特异性＝317/356＝89.0％

由以上可知，试剂盒1的敏感性为93.0％、特异性为89％(且是采用VNT方法验证，不是采用对照试剂盒方法验证)，足以媲美采用c-ELISA方法或b-ELISA方法的试剂盒。

序列表

<110> 中国兽医药品监察所

洛阳中科生物芯片技术有限公司

<120> 小反刍兽疫诊断试剂盒

<130> PB00106

<141> 2018-04-24

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Ala Glu Ala Leu Phe Arg Leu Gln Ala Met Ala Lys Ile Leu Glu

1 5 10 15

Asp Gln Glu Glu

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Ser Gln Asn Pro Arg Glu Ala Gln Arg Ser Ala Glu Ala Leu Phe

1 5 10 15

Arg Leu Gln Ala

20

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu

1 5 10 15

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu His Gln Ser

1 5 10 15

Leu Met Asn Ser

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Gly Asp Glu Arg Thr Val Arg Gly Thr Gly Pro Arg Gln Ala Gln

1 5 10 15

Val Ser Phe Leu

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asn Glu Ala Asn Trp Val Val Pro Ser Thr Asp Val Arg Asp Leu Gln

1 5 10 15

Asn Lys Gly Glu

20

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Val Glu Ser Pro Gly Gln Ile Gln Arg Ile Thr Asp Asp Pro Asp Val

1 5 10 15

Ser Ile Arg

Claims

多肽组合1

SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多肽，

SEQ ID NO：2所示的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA的多肽，

SEQ ID NO：3所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，

SEQ ID NO：4所示的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS的多肽，

SEQ ID NO：5所示的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL的多肽，

SEQ ID NO：6所示的序列为H37：NEANWVVPSTDVRDLQNKGE的多肽，以及

SEQ ID NO：7所示的序列为N9：VESPGQIQRITDDPDVSIR的多肽。

2.下述多肽组合1在制备小反刍兽疫诊断试剂盒中的用途；

多肽组合1

SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多肽，

SEQ ID NO：2所示的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA的多肽，

SEQ ID NO：3所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，

SEQ ID NO：4所示的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS的多肽，

SEQ ID NO：5所示的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL的多肽，

SEQ ID NO：6所示的序列为H37：NEANWVVPSTDVRDLQNKGE的多肽，以及

SEQ ID NO：7所示的序列为N9：VESPGQIQRITDDPDVSIR的多肽。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述小反刍兽疫诊断试剂盒用于通过检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的IgG抗体，诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。