TWI308959B

TWI308959B -

Info

Publication number: TWI308959B
Application number: TW95116830A
Authority: TW
Inventors: Jenn Han Chen; Ying-Mei Shiung; Chiou-Rung Chen; Tung Sheng Shih
Original assignee: Inst Of Occupational Safety And Health Council Of Labor Affairs Executive Yuan
Priority date: 2006-05-12
Filing date: 2006-05-12
Publication date: 2009-04-21
Also published as: TW200742854A

Description

1308959 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種結合疱療病毒抗原以及蛋白質晶片技術，用以大量且快速篩選疱疹病毒感染的方法，可應用於食品衛生或醫療從業人員之健康篩選。【先前技術】人類的單純性泡療病毒(Herpes simplex virus)(HSV)可分為2型，第一型（HSV-I)常引起腰部以上感染，尤其眼及口腔部位的感染，第二型（HSV-II)則常引起腰部以下感染，尤其生殖器感染。HSV-I感染可經由唾液、食具、或其他方式接觸傳染，大部份的人在孩童時期可能就已被感染，如孩童的齦口炎，意即病人的嘴與齒齦長了庖疹囊而後破裂、潰瘍、常發燒，但在幾天後就會痊癒。另外也常造成年輕人的扁桃腺炎。此外，HSV-I於成年人的口腔外黏膜與皮膚交界處產生一群囊泡即唇泡疹，會感到疼痛但病發後幾天就自然痊癒消失。經研究發現，HSV-I在初次感染後，病毒會穿過皮膚沿著神經躲到神經節内，巧妙的躲避人體免疫系統的攻擊，並且一輩子都生活在裡面；之後可能因某種誘因如壓力大、焦慮、疲倦，甚至在月經週期時可能誘使它再度發作同樣的病狀。 HSV-II貝多引起生殖器癌療，為一傳染性高、易反覆發作的疾病。最近幾年發現，台灣成年人口中，第二型單純疱疹病毒帶原率約為12%，第一型單純疱疹病毒（HSV-1 ) 帶原率則達85%，而第一、二型單純疱疹病毒交互感染機率提高，也造成生殖器癌殄感染人口數增加。其中有八成第二型單純疱疹病毒帶原者，即使終生無自覺症狀，平均一年也有22天的時間具傳染性；加上生殖器疱疹的復發性 1308959 高，平均復發次數為一年4〜5次，也有病患一年復發次數高達16次以上，使得生殖器疱疹儼然已成為公共衛生的隱憂。因此醫學界積極努力研究HSV-I以及HSV-II之快速診斷方法以協助醫師進行治療。傳統上偵測體内血清中疱疹病毒抗體的方法主要有三種，一為免疫螢光染色法（immunofluorescentassay) ’二為 ELISA (enzyme-linked immune absorbent assay)，三為西方墨點分析法（Western blot analysis)。免疫螢光染色法需先將受病毒感染的細胞固定在玻片上，然後再將受測者血清滴上進行螢光染色。此法之缺點有（一）、材料準備上不易：需利用活病毒感染細胞，所以對傳染病高的病毒，如SARS 病毒’準備上相當麻煩；（二）、高背景值：由於血清中之抗體種類相當複雜，很容易會造成高背景螢光，造成判讀上的困擾’尤其是當受測者同時罹患自體免疫疾病時，血清中之自體抗體（autoantibody)更可能會造成與感染細胞之非特異性結合而造成誤判。:ELIS A是目前較常用的方法，所使用的抗原可以是感染細胞之萃取物或是重組蛋白，配合儀器之判讀及標準曲線之建立，可進行定量分析，包其缺點是靈敏度並不高。西方墨點分析法是個靈敏度高的偵侧法，尤其配合化學冷光的偵測法，但製備上較為麻煩，需先進行電泳及轉潰的步驟，意即將感染細胞萃取蛋白以垂直，泳法分離，然後再將電泳膠上的蛋白質轉潰到硝化纖維膜上，才能完成測試材料之準備。以上三種方法的乒同問題在於所需準備之之抗原材料量相當多，且無法做至: 方便及多人次的篩選偵測。因此，本發明利用蛋白質晶片技術結合疮療病毒抗原來達到大量且快速_選祕病毒絲之目標。 ’、 U08959 【發明内容】料之使用f杬原以及蛋白質晶片技術，以節省抗原姑本於明亚可進行大規模且節省時間的病例篩檢。、以斷方法，；方：另一目的在於提供-種偵測疱疹病毒感毕之檢測該檢體ΐ:檢ΐ與含有疱疹病毒抗原之晶片接觸，與治療。以病毒錢，以進行臨床上的診 -4達本發明提供-種蛋白質晶片，係包含: 基材之夺一t面；及至少一探針，其係鍵結於前述修病毒a述探針係選自祕病#抗原。前述范醣蛋白D i、為醣蛋白、其多胜肽片段或其衍生物，較佳為、其多胜肽片段或其衍生物。 … 學基㊁施：中’前述基材表面進1具有酸基化基基團鍵學基團，其係可使前述探針㈣在一較佳實施例中，前述醣蛋白D或其多胜括以下胺基酸序列：SEQIDNO.:卜SEQIt>N〇又匕

ID NO. : 3 ^ SEQ ID NO. ： 4 ^ SEQ ID NO. ： 5 . SEQ iD N〇EQ 6、SEQ ID NO·: 7或SEQ ID NO. : 8。前述探針係選自下列胺基酸序列之群組：SEQ ID NO. : 1、SEQ ID jy〇 . 2、 SEQ ID NO. : 3、SEQ ID NO. : 4、SEQ ID NO. : 5、SEq ID NO. : 6、SEQ ID NO. : 7、SEQ ID NO. : 8 及其組合。本發明另提供一種偵測疱疹病毒感染之方法，係包含下列步驟：（a)提供一檢體；（b)將前述檢體與前述蛋白$ = 片接觸，（c)取一一級抗體與前述蛋白質晶片接觸；以及(d) 7 1308959 偵測並分析前述蛋白質晶片反應結果以判斷檢體是否有受疮療病毒感染之現象。前述步驟(c)之二級抗體係與檢體尹之抗癌療病毒抗原抗體具有專一性鍵結。在一較佳實施例中，前述步驟(C)之二級抗體係可以放射線測量、酵素呈色、電顯檢視等方法檢偵測。前述二級抗體較佳可進—步包含一螢光標記或顯色基團。顯色基團係匕S生物素（Biotin)、山葵過氧化酶（h〇rse radish peroxidase，HRP)或鹼性碟酸酶（aikaiine phosphatase ， AP)。斤本發明研究利用蛋白質晶片技術結合疱疹病毒抗原來篩選疱疹病毒感染之檢體，不但可以節省所使用之檢體，還I以進仃大量檢體的仙；此外，蛋自質晶片之檢測效率高，作業時間短，極具有發展之潛力。【實施方式】广主月ί利用重組蛋白結合蛋白質晶片技術檢測疱療病毋感¥。疱疹病毒醣蛋白抗原（如醣蛋白D或苴胜肽利用點製機（arrayer) t覆點製在經電腦設定之多玻片上’可同時偵測12至48人次中之對抗祕赫之抗體。樣本一探含具有-表面之基材;及至少更明確而言’本發明之蛋白學鍵結或非化學鍵結之方式結合於It之探針係藉由化探針則鍵^於基材表面所塗佈之實基團、氣胺基團、或活性硫g旨基團等。此^本發明之= 1308959 質晶片之基材包含破蹲（glass ) '石夕晶片（silica )、尼龍 (nylon)、咼分子聚合物（p〇iymer)、金屬或合金組成之群組。 ' 本發明之偵測疱疹病毒感染方法，該方法將檢體與固定有疱療病毒抗原之晶片接觸，以檢測該檢體是否受有疮療病毒感染，以進行臨床上的診斷與治療。當受測之檢體中有疮瘡病毋·感染跡象時’檢體中會有抗龜療病毒之抗體（即一級抗體）’前述一級抗體會與晶片上的疱疹病毒抗原結合，再鲁以二級抗體與一級抗體結合進而以儀器檢測出陽性感染反應。更明確而言’前述步驟(a)中之檢體係包含血清、血聚、唾液、鼻腔陰道等黏膜分泌物及上述檢體之洗液或抹片。製備本發明之蛋白質晶片之方法係可由熟習微陣列 (microarray chip)技術之人士，依照一般微陣列晶片製程之方式製得。以下係提供利用本發明之實施例詳細說明書本發明之技術及特點，然本實施例並非用以限定本發明，任何熟悉 • 此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍内，當可作各種之更動與潤飾。實施例 . 製備本發明之具醣蛋白D抗原的蛋白皙晶η菸其使用實驗方法- 1.將不同之抗原蛋白或胜肽分裝至九十六孔培養盤’之後置入生物晶片點製機（Cartesian MicroSys 5100 arrayer) ’利用點製鋼針沾取萃取物點製於含搭基玻片 9 1308959 (CEL)上，所點製在玻片之位置及過程均由電腦控制，當點製步驟完成後，將玻片置於4°C冰箱中隔夜。 2.偵測步驟： _ a.加入進行阻斷(blocking)作用之PBSM緩衝液（將 - 2%之脫脂奶粉溶於PBS緩衝液）進行阻斷處理1小時。 b.分別以PBST緩衝液（重量百分比為0.025%之 Tween20溶於PBS緩衝液中）及PBS緩衝液清洗（一分鐘、三次），並以1200 RPM離心甩乾。 • c.一級抗體：HSV-1患者血清（稀釋於pBSMT缓衝液(PBS緩衝液、脫脂奶粉及Tween 20))，室溫反應30 分鐘，並重複步驟b清洗。 d. 二級抗體：結合Cy3之抗人類lgG抗體（稀釋於 PBSMT緩衝液(PBS緩衝液、脫脂奶粉及Tween 20))於室溫反應30分鐘，並重複步驟b清洗。 e. 以晶片掃描儀（Ax〇n Genepix 4000B)判讀，掃描後所得之螢光強度可利用掃描儀所附的影像分析軟體予鲁以數據化，進行定量分析。上述相關之反應條件、使用之試劑、缓衝液等可依照實際情況改變，並不受特別限制。 f驗結果參考第一圖，其中（a)為晶片反應後之影像圖；（b)為對應⑻之晶片上探針之配置圖。根據第一圖顯示，患者血清 -中之對抗HSV-1抗體可以專一且敏感地認得Hsv—i感染細胞萃取物，而不會非專—性地接在沒有感染的細胞萃取物 (Hep-2細胞萃取物）。此結果顯示HSV1感染細胞萃取物可以當做抗原點製在坡片上製成蛋白質晶片，且可專〜性

Cs' 10 1308959 的偵測到患者血清中對抗HSV4之IgG抗體。宜座例本董里^蛋白質晶片之製備及其传用實驗步驟一、抗原之取得：

癌疹病毒重組醣蛋白D購自生工有限公司等，胜肽A-H (SEQ ID NO. : 1-8)係為部分醣蛋白d序列由委託合成。 A peptide : SEQ ID NO. 1 : EEGAGDGEHLEGGDGTRDT B peptide : SEQ ID NO. 2 ： CGIVYWMRRRTQKAPKRIRL C peptide : SEQ ID NO. 3 ： TSKGRPLVPTPQHTPLF D peptide : SEQ ID NO. 4 ： LDQLTDPPGVRRVYfflQAGL E peptide : SEQ ID NO_ 5 : CPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGF F peptide : SEQ ID NO. 6 ： STLLPPELSETPNATQPELAPEAPEDSAL G peptide : SEQ ID NO. 7 ： PLAEDVEKDKPNRPVV H peptide: SEQ ID NO. 8 ：

TPTPYNPSTAPAPAPTPTFACCQTPVNGNSPWAPTAPLPGDM 二、蛋白質陣列之製備與偵測： 1. 將各種抗原（人類IgG、：庖療病毒重組蛋白D、胜肽 A-Η中選擇組合、人類流感病毒抗原（N1H1,台灣型）、及牛血清白蛋白（BSA))，以陣列機點製於含醛基塗層玻片上，玻片上之點製位置如第二圖所示（圖中A、B、 A+B係指胜肽A、B及A+B)，且玻片上每一種抗原皆以三重複方式實施’如第三圖（a)之晶片影像圖所示。 2. 待點製完成，於室温靜置於潮濕盒内30分鐘。 11 (S) 1308959 . 3.置入PBSM緩衝液1小時以進行阻斷作用。 4.加入室溫之PBST緩衝液以攪動子攪動清洗3分鐘，之後再以PBS緩衝液浸潤2分鐘’離心1200RPM甩乾約 / 1分鐘。 - 5.加入受單純疮療病毒第一塑感染病患企清（共有77受測者之血清）（内含一級抗體），於室溫反應30分鐘，然後重複進行步驟4之清洗動作。 6·加入二級抗體（結合cy3之抗人類IgG抗體），於室溫反 • 應30分鐘，然後重複進行步驟4之清洗動作。 7.以晶片掃描儀(Axon Genepix 4000B)判讀結果。實驗結杲根據第三圖所示’其中（a)為反應後之蛋白質晶片影像圖（每一抗原係為三重複），（b)為對應（a)中晶片上各點反應後之逢光強度之示意圖，係取三重複平均值所判定之结果。陽性反應控制組（人類血清IgG)顯示本發明之蛋白質晶片對於含有單純疱疹病毒抗體之血清具有陽性反應，且 φ 直至人類企清1gG為12.^g/ml如此低的濃度，本發明之蛋白質螢光強度仍然很高。此外，實驗結果顯示，^性反應控制組(BSA)並未有反應，如此證明本發明之蛋白質晶片^ 有高特異性，而且也不會與其他病毒抗原例如感冒=毒^ 原產生父叉反應。而使用疱療病毒重組醣蛋白D之實驗組， -根據第三圖（b)顯示，完整疱疹病毒重組醣蛋白d 呷八 .St蛋白D之胜肽AAB與檢體中之一級抗體皆可U 應，而完整疱疹病毒重組醣蛋白D其反應欵果更佳。第四圖為由人類血清IgG所得到的螢光強度與濃度之標準曲線圖其中有超過82 % (63檢體/77檢體)的、^超： 12 1308959 Ο二其餘小於MO 2的部分可能是操作誤差，若未來能改成^動化操作，則其^ t更高更穩定。此外，根據榮光強度數值顯不重組HSV-1 gD的效價及靈敏度遠勝於本發明所挑選的各種胜肽。第五圖為77個受測者血清中對抗流感病毒及疱疹病毒抗體相對濃度之對照圖。由實驗結果顯示77個受測者 (含1個臍帶血清）之血清樣本均可測到含有對抗之抗體。除了 2個樣本之外，所有血清中均可測到抗流感病毒 N1H1抗體’所以流感病毒N1H1抗原可當作一良好的内押制組(internal control)。本實驗之BSA為一陰性控制組，所有受測血清均呈BSA陰性反應。目前本實施例所使用之晶片為一片晶片上同時偵測四十位受測者血清，第六圖（&)為晶片實體影像圖’弟六圖（b)晶片上探針格式設計圖，可^ 時檢測四十人之檢體，一方面可節省檢测時間，另一方面亦可節省所需檢體使用量。綜上所述’本發明係利用蛋白質晶片（微陣列）技術，由於其可於基材上同時點上多數個探針’即疱疹病毒抗原且每一點所需之量僅需約1 nL ;此外，該微陣列技術可同時檢測多個檢體’且所需之檢體量只需約5以1，相較於傳統 ELISA技術，多孔盤中每一孔(well)中所需的抗原量（約2〇〇 #L)及檢體量（約200gL)，本發明之技術可達到大量且快速篩選疱疹病毒感染之目標’且由於檢測知高敏感度與保存度而非常適合用於檢體量少之疾病檢測，且因血^得之門檻低而易於推行。 ’ ^ 其他實施態樣 1308959 本發明之實施方法已詳述於前述實施例中，任何熟悉本技術領域之人士皆可依本發明之說明，在不背離本發明之精神與範圍内視需要更動、修飾本發明，因此，其他實施態樣亦包含在本發明之申請專利範圍中。【圖式簡單說明】第一圖（a)係為本發明實施例一之晶片測試結果。第一圖（b)係為本發明實施例一之晶片陣列設計格式。第二圖係為本發明實施例二之晶片陣列設計格式。第三圖（a)係為本發明實施例二之晶片測試實驗結果。第三圖（b)係為本發明實施例二之晶片螢光強度結果。第四圖係為本發明實施例二晶片測試結果之標準曲線。第五圖係為本發明實施例二之受測者血清中對抗流感病毒與疱疹病毒抗體之濃度對照圖。第六圖（a)係為本發明實施例二之晶片實體影像圖。第六圖（b)係為本發明實施例二之晶片上探針格式設計圖，可同時檢測四十人之檢體。【元件符號說明】益 1308959 05P0315.ST25 SEQUENCE LISTING <110>行政院勞工委員會勞工安全衛生硏究所 <120>偵測疱疹病毒感染之生物晶片及其使用方法 <130> 05P0315 <160> 8 <170> Patentln version 3.3

<210> 1 <211> 19 <212〉 PRT <213> Herpes simplex virus <400> 1

Glu Glu Gly Ala Gly Asp Gly Glu His Leu Glu Gly Gly Asp Gly Thr 15 10 15

Arg Asp Thr

<210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400〉 2

Cys Gly lie Val Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gin Lys Ala Pro Lys 15 10 15

Arg lie Arg Leu 20

<210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400> 3

Thr Ser Lys Gly Arg Pro Leu Val Pro Thr Pro Gin His Thr Pro Leu 15 10 15

Phe <210〉 4 <211> 20 <212> PR丁 <213> Herpes simplex virus <400〉 4

Leu Asp Gin Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Tyr His lie 15 10 15

Gin Ala Gly Leu 20

<210> 5 <211> 25 <212> PRT 第1頁 1308959 05P0315.ST25 <213> Herpes simplex virus <400> 5

Cys Pro He Arg Thr Gin Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser 15 10 15

Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe 20 25

<210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400> 6

Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gin 15 10 15

Pro Glu Leu Ala Pro Glu Ala Pro Glu Asp Ser Ala Leu 20 25

<210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400> 7

Pro Leu Ala Glu Asp Val Glu Lys Asp Lys Pro Asn Arg Pro Val Val 15 10 15 <210> 8 <211> 42 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400> 8

Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Tlir 15 10 15

Pro Thr Phe Ala Cys Cys Gin Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp 20 25 30

Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro Gly Asp Met 35 40 第2頁

Claims

1308959 ""· I I Ni ·.»» | P-vfπ修(更)正本十、申請專利範園：一 ———一 1_ -種蛋白質晶片，係包含：一基材，其具有一表面；及 β至^探針，其係鍵結於前述基材之表面；其中前述探針係込自下列胺基酸序列所組成之群組：SEQIDNO. : 1、SEQID NO· . 2、SEQ IE) NO· : 3、SEQ ro NO. : 4、SEQ ID NO.: 5 SEQ id NO. : 6、SEQ ID NO. : 7、SEQ ID NO. : 8 _ 及其組合。 2. 如申轉概圍第i項所述之蛋白質晶片，其中前述探針係夢由化學鍵結或非化學鍵結之方式結合於基材表面。胃 3. 如申请專利範圍第！項所述之蛋白質晶片，其中前述基材表面具有化學基團、酸性化學基團氰胺基團、或活性硫酿基 4. 如申請專利範圍第3項所述之蛋白質晶片，其中前逃探針係鍵結於前雜基化學基團，性化學基團、氰絲團、或活性硫 5. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質晶片，其中前述其中前述基材包含玻璃（glass)、梦晶片⑽⑷、尼龍（nylQn)= 子聚合物（polymer)、金屬或合金組成之群組。刀 6. —種偵測疱療病毒感染之方法，係包含下列步驟： (a) 提供一檢體； (b) 將前述檢體與申請專利範圍第丨項所述之蛋白質曰 1 1308959 片接觸； (C)取二級抗體與前述蛋白質晶片接觸；以及 ; (d)_並分析前述蛋白質晶片反應結果簡斷檢體是否有 . 受疱疹病毒感染之現象。 7‘如申請專利範圍第6項所述之方法，其中前紐血清、血聚、唾液、鼻腔陰道等黏膜分泌物(^= 之洗液或抹片。 8. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中前述步驟⑹之二級抗體係與檢體中之抗疱疹病毒抗原抗體具有專一性鍵結。 9. 如申請專利範圍帛6項所述之方法，其中前述步驟⑷之二級抗體係可以放射線測量、酵素呈色、電顯檢視等方法檢侧。 10·如申睛專利範圍第6項所述之方法，其巾前述步驟⑷之二級抗體可進一步包含一螢光標記或顯色基團。 φ 1丨·如申請專利範圍第10項所述之方法，其中前述之顯色基團係包 3 生物素（biotin)、山 4過氧化酶（horse radish peroxidase) 或驗性磷酸酶（alkalinephosphatase)。