CN113804879A

CN113804879A - 幽门螺旋杆菌IgM和IgG抗体联合检测试剂盒

Info

Publication number: CN113804879A
Application number: CN202010541402.8A
Authority: CN
Inventors: 马玉娇
Original assignee: Beijing Kangmei Tianhong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Kangmei Tianhong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2021-12-17

Abstract

本发明公开了一种幽门螺旋杆菌IgM和IgG抗体联合检测试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括胶体金试纸条；所述胶体金试纸条的胶体金垫上包被有胶体金标记的幽门螺旋杆菌抗原；所述胶体金试纸条的检测垫上具有两个T线和一个C线，一个T线上包被抗人IgG单克隆抗体，另一个T线上包被抗人IgM单克隆抗体，C线上包被幽门螺旋杆菌多克隆抗体。IgG抗体，提示既往感染。IgM抗体，提示现症感染。因此，本发明提供的试剂盒可以全面性动态评估幽门螺旋杆菌感染情况。本发明对于幽门螺旋杆菌的防控具有重大的应用推广价值。

Description

幽门螺旋杆菌IgM和IgG抗体联合检测试剂盒

技术领域

本发明属于临床检验领域，涉及一种幽门螺旋杆菌IgM和IgG抗体联合检测试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)，又称为幽门螺旋杆菌，是一种寄生在胃部和十二指肠的革兰氏阴性微量需氧细菌，其感染非常普遍，全球自然人群感染率超过50％。影响幽门螺旋杆菌感染率的因素包括经济状况、居住条件、文化程度、职业及饮水习惯等，普遍来说，发展中国家高于发达国家。目前认为，在自然环境中，人是幽门螺旋杆菌唯一的传染源，传播途径推测为经口感染。

几乎所有的幽门螺旋杆菌感染者在组织学上均存在活动性炎性反应，幽门螺旋杆菌感染为一种感染(传染)性疾病，可导致慢性胃炎、消化性溃疡等，常见症状包括胃上部不适感以及疼痛、胀气、厌食、恶心、呕吐以及深色或焦油色粪便等，其中约70％以上感染者无明显症状。幽门螺旋杆菌是胃炎、消化性溃疡的主要致病因素，并与功能性消化不良、胃黏膜相关性淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的发生密切相关，世界卫生组织国际癌症研究机构已将其列为Ⅰ类致癌因子。根除幽门螺旋杆菌可显著减少胃和十二指肠疾病包括胃癌的发病率，并可在未来减少幽门螺旋杆菌感染的新发病例。

现有技术中，幽门螺旋杆菌检测方法主要有如下几种：尿素呼气实验(UBT)、粪便HP抗原检测(SAT)、快速试验、细菌学培养、组织学检测。

尿素呼气实验在临床上已经应用了接近30年，该方法操作简便、准确性高，直至今日仍是诊断Hp感染最常用的非侵入性试验，并用于Hp流行病学调查和根除治疗的疗效评估。目前，临床常用的13C-UBT和14C-UBT在诊断准确性上并无差异。缺点：为避免假阴性结果的产生，患者需要在试验前2周停用PPI或在试验前4周停用抗菌药物；该方法有一定放射性，部分人群使用受限。

粪便HP抗原检测是另一种对于Hp诊断有着很高敏感性和特异性的非侵入性试验。在一项全球性的Meta分析中，其敏感性和特异性分别为94％和97％，且操作简便，适用于各类患者。缺点：SAT结果的准确性受多种因素，如抗菌药物、氢离子泵抑制剂、N-乙酰半胱氨酸、排便和上消化道出血的影响；样本的保存，如温度、运送时间和临界值的选择也对SAT诊断的准确性有影响；还有一个面临的问题是患者的依从性，这危及了测试的成本效益问题(一个全面的建模分析显示，粪便抗原检测的依从性约为48％，相比之下，尿素呼气试验和血清学检测的依从性为86％)。

快速试验基于Hp的活性，能将检测试剂转化为氨，导致pH值升高，从而使pH监测仪的颜色发生变化。优点：快速脲酶试验具有廉价、快速、简单、高特异性、原料获取方便等优点，是诊断Hp感染颇具实用性的侵入性试验。缺点：不同的商业试剂取得的结果需不同的反应时间，早于推荐时间阅读试验可能导致假阴性结果；活检标本存在细菌密度、H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂、铋剂、抗菌药物、胃酸缺乏和出血，所有这些都增加了假阴性结果的可能性；对试验在儿童Hp检测中的应用的敏感性仍存在争论。

细菌学培养在管理治疗失败、抗菌药物耐药性及敏感性研究中起着重要作用。此外，细菌培养还可以分离Hp，以便进一步分析其表型和基因型特征，从而更好地了解病原体，为临床治疗提供依据。缺点：培养Hp既费时又费力，且Hp是一种非常挑剔的细菌，其培养结果严重依赖于环境。细菌分离的敏感性在实验室之间差别很大，宿主因素如胃炎活性高、细菌负荷低、出血、饮酒、使用H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂(PPI)、抗菌药物等对培养阳性率有不良影响。

组织学检测有助于深入了解胃黏膜状况。有研究报道，消化性溃疡患者不管是否出血，相比细菌培养、血清学和快速尿激酶试验，组织学检查最准确。缺点：影响组织学诊断准确性的因素也很多，如取组织部位、大小和数目，染色方法，是否应用质子泵抑制剂、抗菌药物，以及病理学检测人员的经验等。

发明内容

本发明的目的是提供一种幽门螺旋杆菌IgM和IgG抗体联合检测试剂盒。

本发明提供了一种用于检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体的试剂盒，包括胶体金试纸条和样本稀释液；

所述胶体金试纸条的胶体金垫上包被有胶体金标记的幽门螺旋杆菌抗原；所述胶体金试纸条的检测垫上具有两个T线和一个C线，一个T线上包被抗人IgG单克隆抗体，另一个T线上包被抗人IgM单克隆抗体，C线上包被幽门螺旋杆菌多克隆抗体；

所述样本稀释液的组成如下：含0.5g/100ml PVA、1g/100ml吐温20、0.5g/100ml氯化钠和1g/100ml Proclin-300，余量为缓冲液。

本发明还提供了一种用于检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体的试剂盒，包括胶体金试纸条和样本稀释液；

所述胶体金试纸条包括底板、样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫；沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的幽门螺旋杆菌抗原；所述胶体金试纸条的检测垫上具有两个T线和一个C线，一个T线上包被抗人IgG单克隆抗体，另一个T线上包被抗人IgM单克隆抗体，C线上包被幽门螺旋杆菌多克隆抗体；

本发明还提供了胶体金试纸条和样本稀释液在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体；

本发明还提供了一种用于检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体的胶体金试纸条；

所述胶体金试纸条的胶体金垫上包被有胶体金标记的幽门螺旋杆菌抗原；所述胶体金试纸条的检测垫上具有两个T线和一个C线，一个T线上包被抗人IgG单克隆抗体，另一个T线上包被抗人IgM单克隆抗体，C线上包被幽门螺旋杆菌多克隆抗体。

本发明还提供了一种用于检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体的胶体金试纸条，包括底板、样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫；

沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的幽门螺旋杆菌抗原；所述胶体金试纸条的检测垫上具有两个T线和一个C线，一个T线上包被抗人IgG单克隆抗体，另一个T线上包被抗人IgM单克隆抗体，C线上包被幽门螺旋杆菌多克隆抗体。

本发明还提供了所述胶体金试纸条在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体。

所述幽门螺旋杆菌抗原为如下(a)或(b)：

(a)序列表的序列1所示的蛋白质；

(b)序列表的序列3所示的蛋白质。

以上任一所述PVA的Mw为9000-10000。

以上任一所述缓冲液为pH7.0、20mM PBS缓冲液。

以上任一所述抗人IgG(单克隆抗体)具体可为杭州隆基生物技术有限公司的产品(货号MS00601)。

以上任一所述抗人IgM(单克隆抗体)具体可为杭州隆基生物技术有限公司(货号US00704)的产品。

以上任一所述幽门螺旋杆菌多克隆抗体具体可为杭州贤至生物科技有限公司的产品。

本发明提供的幽门螺旋杆菌IgM和IgG抗体联合检测试剂盒，为基于胶体金技术的定性检测试剂盒。IgG抗体，提示既往感染。IgM抗体，提示现症感染。因此，本发明提供的试剂盒可以全面性动态评估幽门螺旋杆菌感染情况。采用本发明提供的试剂盒检测幽门螺旋杆菌具有如下优点：操作简便、检测迅速、成本低廉、特异性好、灵敏度高、适于普及并可单份检测，更适合于流行病学调查及现场应用。本发明对于幽门螺旋杆菌的防控具有重大的应用推广价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Tris：三(羟甲基)氨基甲烷。BSA：牛血清白蛋白。PVA：聚乙烯醇；Mw为9000-10000，ALDRICH公司，货号360627。

实施例中，呼气试验结果作为金标准，即呼气试验阳性的志愿者的血清作为幽门螺旋杆菌阳性血清，呼气试验阴性的志愿者的血清作为幽门螺旋杆菌阴性血清。呼气试验原理：患者口服尿素[¹³C]胶囊，进入胃部后，如果胃部存在幽门螺旋杆菌，此菌会分泌尿素酶水解尿素，尿素被水解后形成CO₂随血液进入肺部并以气体排出，然后检测患者呼出的气体中有没有¹³C,如果有的话，代表存在幽门螺旋杆菌。呼气试验采用尿素[¹³C]胶囊呼气试验药盒和碳13呼气试验分析仪。呼气试验数值≥4为阳性结果，呼气试验数值<4为阴性结果。

实施例1、幽门螺旋杆菌抗原的制备

1、用SEQ ID No.2中第4-1707位核苷酸所示的DNA分子替换pET30a(+)载体的NdeI和XhoI识别位点间的小片段，保持pET30a(+)载体的其它序列不变，得到重组质粒pET30a-HP。幽门螺旋杆菌抗原基因(简称HP基因)，如SEQ ID No.2所示，编码SEQ ID No.1所示的幽门螺旋杆菌抗原。重组质粒pET30a-HP中形成了融合基因，如SEQ ID No.4所示，编码SEQ IDNo.3所示的融合蛋白。融合蛋白中，第1至569位氨基酸残基组成幽门螺旋杆菌抗原，第572-577位氨基酸残基组成His₆标签。融合蛋白，又称为具有His₆标签的幽门螺旋杆菌抗原(用His₆-HP表示)。融合蛋白的预期分子量约为63kD。

2、将重组质粒pET30a-HP导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pET30a-HP的重组大肠杆菌，命名为大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-HP。

3、将大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-HP接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至0D₆₀₀值＝0.6，然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为1mM，然后37℃、200rpm振荡培养4小时。

4、完成步骤3后，收集菌体沉淀，用pH7.0、50mM的PBS缓冲液充分洗涤，然后重悬于pH7.0、50mM的PBS缓冲液进行超声破碎(超声破碎参数：功率30％，总时间20min，每工作5s停5s)，然后4℃、12000rpm离心10min，收集上清液。

5、取步骤4得到的上清液，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。

6、取步骤5得到的滤液，进行镍柱亲和层析，收集含有目标蛋白的过柱后溶液。目标蛋白即具有His₆标签的幽门螺旋杆菌抗原。

7、取步骤6得到的过柱后溶液，采用3KD孔径的柱式超滤膜和pH7.0、50mM的PBS缓冲液进行脱盐，得到以pH7.0、50mM的PBS缓冲液为溶剂体系的蛋白溶液，将该蛋白溶液命名为His₆-HP溶液。采用Bradford法检测His₆-HP溶液的蛋白浓度，作为His₆-HP的浓度。His₆-HP溶液中，His₆-HP的浓度为2.8mg/ml。

实施例2、试剂盒的制备

一、试剂盒的制备

1、胶体金垫的制备

(1)胶体金的制备

①取1g氯金酸(粉末状)，溶解于100ml超纯水，得到氯金酸溶液。取1g二水合柠檬酸三钠，溶解于100ml超纯水，得到柠檬酸三钠溶液。

②取一个2000ml容量的圆底烧瓶，加入约1000ml超纯水，220V电压加热至沸腾，然后将沸水倒掉。

③取完成步骤②的圆底烧瓶，加入980ml超纯水，220V电压加热，刚刚沸腾时加入10ml步骤①制备的氯金酸溶液，1-2分钟后加入9ml步骤①制备的柠檬酸三钠溶液，观察显色，待显色为透亮的红色时，调整电压至150V加热5分钟，然后用冷流水冲洗圆底烧瓶外壁使其迅速冷却至室温，然后向所述圆底烧瓶中加入超纯水定容至1000ml，得到胶体金。胶体金的粒径为35-40nm。

(2)金标抗原溶液的制备

①取平底锥形瓶，加入100ml胶体金，然后加入2g/100ml K₂CO₃水溶液以调整体系pH至7.0，然后加入实施例1制备的His₆-HP溶液并使His₆-HP在体系中的浓度为10μg/ml，搅拌30分钟，然后加入10g/100ml BSA水溶液并使BSA在体系中的浓度为1g/100ml，搅拌30分钟。

②完成步骤①后，4℃、10000rpm离心10min，弃上清液，然后加入10ml保存液进行复溶，即为金标抗原溶液。以加入量计，金标抗原溶液中的His₆-HP浓度为100μg/ml。

保存液：含20mM Tris、0.2g/100ml酪蛋白、0.1g/100ml氯化钠和0.1g/100ml BSA，余量为水。

金标抗原即胶体金标记的His₆-HP。

(3)胶体金垫的制备

将金标抗原溶液按照12μl/cm的速度均匀喷涂于玻璃纤维素膜的上表面，然后37℃干燥2小时，即为胶体金垫。

2、检测垫的制备

抗人IgG用包被缓冲液稀释至2mg/ml，得到T1溶液。抗人IgM用包被缓冲液稀释至2mg/ml，得到T2溶液。幽门螺旋杆菌多抗用包被缓冲液稀释至1.5mg/ml，得到C溶液。抗人IgG(单克隆抗体)：杭州隆基生物技术有限公司(货号MS00601)。抗人IgM(单克隆抗体)：杭州隆基生物技术有限公司(货号US00704)。幽门螺旋杆菌多抗(幽门螺旋杆菌多克隆抗体)：杭州贤至生物科技有限公司。

包被缓冲液：pH7.4、20mM的PBS缓冲液。

取硝酸纤维素膜，用T1溶液在硝酸纤维素膜的上表面喷一条T1线(T1线线宽为1mm；T1线线长方向，每厘米T1线喷1μL T1溶液)，用T2溶液在硝酸纤维素膜的上表面喷一条T2线(T2线线宽为1mm；T2线线长方向，每厘米T2线喷1μL T2溶液)，用C溶液在硝酸纤维素膜的上表面喷一条C线(C线线宽为1mm；C线线长方向，每厘米C线喷1μL C溶液)。T2线位于T1线和C线中间，T1线、T2线和C均相互平行。T1线和T2线的垂直距离为4mm。T2线和C线的垂直距离为4mm。

然后，37℃干燥2小时，即为检测垫。

3、样品垫的制备

玻璃纤维素膜浸泡于处理液中完全浸润后取出，然后自然晾干(10-12小时)，即为样品垫。

处理液：含0.2g/100ml PVP K-30、5g/100ml蔗糖、5g/100ml海藻糖(α，α)、1g/100ml吐温20，余量为水。PVP K-30：聚乙烯吡咯烷酮K-30。

4、试纸条的制备

试纸条包括卡壳、底板、样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫。沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上(相邻垫之间略重叠)。

沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向。试纸条的宽度为3.8mm。试纸条的总长度为6cm，其中样品垫的长度为1.7cm，胶体金垫的长度为0.8cm，检测垫的长度为2.5cm，吸水垫的长度为1.7cm。C线靠近吸水垫、远离胶体金垫。T1线靠近胶体金垫、远离吸水垫。

卡壳套设于试纸条外，具有检测窗和加样孔。加样孔位于样品垫上方。检测窗用于观察T1线、T2线和C线的显色情况。

吸水垫的材质为吸水纸。

底板仅起支撑作用，常规材质均可，例如PVC。

5、试剂盒的组装

试剂盒包括步骤4制备的试纸条和样本稀释液。

样本稀释液：含0.5g/100ml PVA、1g/100ml吐温20、0.5g/100ml氯化钠和1g/100mlProclin-300，余量为pH7.0、20mM PBS缓冲液。

二、试剂盒的使用方法

水平放置试纸条，在加样孔依次加入10μl供试样本(血清或血浆)和100μl(约2～3滴)样本稀释液，15～20分钟观察结果。

结果判定方法：C线未显色时，不管T1线和/或T2线是否显色，均为结果无效；C线显示为红色且T1线显示为红色且T2线不显色，为幽门螺旋杆菌IgG抗体单阳性；C线显示为红色且T1线不显色且T2线显示为红色，为幽门螺旋杆菌IgM抗体单阳性；C线显示为红色且T1线显示为红色且T2线显示为红色，为幽门螺旋杆菌IgG抗体和幽门螺旋杆菌IgM抗体双阳性；C线显示为红色且T1线不显色且T2线不显色，为幽门螺旋杆菌抗体阴性。幽门螺旋杆菌IgG抗体单阳性或幽门螺旋杆菌IgM抗体单阳性或幽门螺旋杆菌IgG抗体和幽门螺旋杆菌IgM抗体双阳性均属于幽门螺旋杆菌抗体阳性。

三、试剂盒的工作原理

工作原理(捕获法)：如果样本中含有幽门螺旋杆菌IgG抗体，经过胶体金垫时与金标抗原相结合，经过检测垫时T1线上的抗人IgG通过捕获幽门螺旋杆菌IgG抗体间接捕获金标抗原从而显示为红色(阳性结果)；如果样本中含有幽门螺旋杆菌IgM抗体，经过胶体金垫时与金标抗原相结合，经过检测垫时T2线上的抗人IgM通过捕获幽门螺旋杆菌IgM抗体间接捕获金标抗原从而显示为红色(阳性结果)；如果样本中不含有胃幽门螺旋杆菌IgG抗体且不含有幽门螺旋杆菌IgM抗体，经过胶体金垫时无抗体与金标抗原相结合，经过检测垫时T1线上的抗人IgG和T2线上的抗人IgM均无法捕获金标抗原从而不显色(阴性结果)。无论检测样本为何种情况，经过检测垫时C线上的兔抗幽门螺旋杆菌抗体均能捕获金标抗原从而显示为红色。

实施例3、试剂盒的性能检测

一、对比试剂盒的制备(对比抗原)

用对照抗原甲代替实施例1制备的幽门螺旋杆菌抗原，其它同实施例2的步骤一，得到对比试剂盒甲。对照抗原甲：HP重组抗原，货号1101-0015，菲鹏生物股份有限公司。

用对照抗原乙代替实施例1制备的幽门螺旋杆菌抗原，其它同实施例2的步骤一，得到对比试剂盒乙。对照抗原乙：Helicobacter pylori antigens抗原A168，生产商为Calbioreagents，销售商为北京瀚睿赛思生物科技有限公司。

二、平行试验

100份血清，其中50份幽门螺旋杆菌阳性血清，50份幽门螺旋杆菌阴性血清。

分别采用实施例2制备的试剂盒、步骤一制备的对比试剂盒甲和步骤一制备的对比试剂盒乙，按照试剂盒说明书进行平行检测。

结果见表1。对比试剂盒甲的阳性符合率为70％，对比试剂盒乙的阳性符合率为84％，实施例2制备的试剂盒的阳性符合率为98％。

表1

三、对比试剂盒的制备(对比抗体)

用对照IgM抗体代替抗人IgM，其它同实施例2的步骤一，得到对比试剂盒丙。对照IgM抗体：IgM 7408C1-49，北京瀚睿赛思生物科技有限公司。

四、平行试验

取若干幽门螺旋杆菌阳性血清，采用实施例2制备的试剂盒，按照试剂盒说明书操作，筛选出10份幽门螺旋杆菌IgG抗体和幽门螺旋杆菌IgM抗体双阳性血清。取10份幽门螺旋杆菌阴性血清。

分别采用实施例2制备的试剂盒和步骤三制备的对比试剂盒丙，按照试剂盒说明书进行平行检测。

结果见表2。检测效果有显著差异。

表2

实施例4、试剂盒的性能检测

对照稀释液A：含1g/100ml酪蛋白、5g/100ml蔗糖、0.8g/100ml氯化钠和1g/100ml叠氮钠，余量为pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液。

对照稀释液B：含0.5g/100ml牛血清白蛋白、1g/100ml吐温20、0.5g/100ml PVA和1g/100ml Proclin-300，余量为pH7.5、10mM Tris-HCl缓冲液。

对照稀释液C：含0.5g/100ml氯化钠、0.5g/100ml牛血清白蛋白、1g/100ml吐温20和1g/100ml Proclin-300，余量为pH7.0、20mM PBS缓冲液。

对照稀释液D：含2g/100ml PVA、10g/100ml吐温20、0.5g/100ml氯化钠和1g/100mlProclin-300，余量为pH6.5、20mM PBS缓冲液。

用四种对照稀释液代替样本稀释液，其他同实施例2的步骤一，得到四个对照试剂盒。按照与对照稀释液对应的关系，依次命名为对照试剂盒A、对照试剂盒B、对照试剂盒C或对照试剂盒D。

取若干幽门螺旋杆菌阳性血清，采用实施例2制备的试剂盒，按照试剂盒说明书操作，筛选出10份幽门螺旋杆菌IgG抗体单阳性血清、10份幽门螺旋杆菌IgM抗体单阳性血清、10份幽门螺旋杆菌IgG抗体和幽门螺旋杆菌IgM抗体双阳性血清。取10份幽门螺旋杆菌阴性血清。

采用实施例2制备的试剂盒或四个对照试剂盒，按照试剂盒说明书进行平行检测。

结果见表3。样本稀释液的作用主要为抗干扰作用。

表3

实施例5、试剂盒的性能检测

采用实施例2制备的试剂盒与市售同类试剂盒对比评估。

市售同类试剂盒为维润赛润生物技术(深圳)有限公司产品，该公司是德国维润赛润技术有限公司在中国设立的唯一子公司。市售同类试剂盒分别为幽门螺旋杆菌IgM抗体检测试剂盒(产品编号：ESR118M)和幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试剂盒(产品编号：ESR118G)，均为酶联免疫法试剂盒。

取若干人血清样本，分别采用实施例2制备的试剂盒、幽门螺旋杆菌IgM抗体检测试剂盒、幽门螺旋杆菌IgG抗体检测试剂盒按照各自说明书进行操作检测。

幽门螺旋杆菌IgM抗体的检测结果见表4。幽门螺旋杆菌IgG抗体的检测结果见表5。IgG检测结果阳性符合率为98.1％，IgM检测结果阳性符合率为97.8％，整体符合率较好。

表4

表5

实施例6、特异性检测

交叉反应病原体分别为：大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、变形杆菌、弯曲乳杆菌、粪肠球菌。各个交叉反应病原体均为北纳创联生物技术有限公司产品。

取幽门螺旋杆菌阴性血清，加入交叉反应病原体，使其浓度为10⁷CPU/ml，得到供试血清。

取供试血清，采用实施例2制备的试剂盒并按说明书操作。

各个供试血清的检测结果均为幽门螺旋杆菌阴性。

结果表明，实施例2制备的试剂盒对不同类干扰物质无交叉反应。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京康美天鸿生物科技有限公司

<120> 幽门螺旋杆菌IgM和IgG抗体联合检测试剂盒

<130> GNCYX200035

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 569

<212> PRT

<213> Helicobacter pylori

<400> 1

Met Lys Lys Ile Ser Arg Lys Glu Tyr Val Ser Met Tyr Gly Pro Thr

1 5 10 15

Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Ala Glu Val

20 25 30

Glu His Asp Tyr Thr Ile Tyr Gly Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly Gly

35 40 45

Lys Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser Gln Ser Asn Asn Pro Ser Lys Glu

50 55 60

Glu Leu Asp Leu Ile Ile Thr Ser Ala Leu Ile Val Asp Tyr Thr Gly

65 70 75 80

Ile Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly Ile

85 90 95

Gly Lys Gly Gly Asn Lys Asp Met Gln Asp Gly Val Lys Asn Asn Leu

100 105 110

Ser Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val

115 120 125

Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr His Ile His Phe Ile Ser Pro Gln Gln

130 135 140

Ile Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly

145 150 155 160

Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg

165 170 175

Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met Asn

180 185 190

Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala

195 200 205

Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp

210 215 220

Gly Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys

225 230 235 240

Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly

245 250 255

Cys Val Glu Asp Thr Met Ala Ala Ile Ala Gly Arg Thr Met His Thr

260 265 270

Phe His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys

275 280 285

Val Ala Gly Glu His Asn Ile Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr Ile

290 295 300

Pro Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met Val

305 310 315 320

Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp

325 330 335

Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp

340 345 350

Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg

355 360 365

Val Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys

370 375 380

Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn Phe

385 390 395 400

Arg Ile Lys Arg Tyr Leu Ser Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala

405 410 415

His Gly Ile Ser Glu Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Val Ala

420 425 430

Asp Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn Met

435 440 445

Ile Ile Lys Gly Gly Phe Ile Ala Leu Ser Gln Met Gly Asp Ala Asn

450 455 460

Ala Ser Ile Pro Thr Pro Gln Pro Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe Ala

465 470 475 480

His His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Ile Thr Phe Val Ser Gln

485 490 495

Ala Ala Tyr Asp Lys Gly Ile Lys Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg Gln

500 505 510

Val Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asp Met Gln

515 520 525

Phe Asn Asp Thr Thr Ala His Ile Glu Val Asn Pro Glu Thr Tyr His

530 535 540

Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Thr Lys Val

545 550 555 560

Ser Leu Ala Gln Leu Phe Ser Ile Phe

565

<210> 2

<211> 1710

<212> DNA

<213> Helicobacter pylori

<400> 2

atgaaaaaga ttagcagaaa agaatatgtt tctatgtatg gtcctactac aggcgataaa 60

gtgagattgg gcgatacaga tttgatcgct gaagtagaac atgactacac catttatggc 120

gaagagctta aattcggtgg cggtaaaacc ctaagagaag gcatgagcca atctaacaac 180

cccagcaaag aagaactgga tctaatcatc actagcgctt tgatcgtgga ttacaccggc 240

atttataaag cggatattgg tattaaagat ggcaaaatcg ctggcattgg taaaggcggt 300

aacaaagaca tgcaagatgg tgttaaaaac aatcttagcg tgggtcctgc tactgaagcc 360

ttagccggtg aaggtttgat cgtaactgct ggtggtattg acacacacat ccacttcatt 420

tcaccccaac aaatccctac agcttttgca agcggtgtaa caacgatgat tggtggcgga 480

actggccctg ctgatggcac taacgcaacc actatcactc caggcagaag aaatttaaaa 540

tggatgctca gagcagctga agaatattcc atgaacttag gtttcttagc taaaggtaac 600

gcttctaatg atgcgagctt agccgatcaa attgaagccg gtgcgattgg ctttaaaatc 660

cacgaagact ggggaacaac tccttctgca atcaatcatg cgttagatgt tgcggacaaa 720

tacgatgtgc aagtcgctat ccacacagac actttgaatg aagccggttg tgtagaagac 780

actatggcag ccattgccgg acgcactatg cacactttcc acactgaagg cgctggcggc 840

ggacacgctc ctgatattat taaagtggcc ggtgaacaca acattctgcc cgcttccact 900

aaccccacta tccctttcac tgtgaataca gaagcagaac acatggacat gcttatggtg 960

tgccaccact tggataaaag cattaaagaa gatgttcagt tcgctgactc aaggatccgc 1020

cctcaaacca ttgcggctga agacactttg catgacatgg ggattttctc aatcactagt 1080

tctgactctc aagctatggg tcgtgtgggc gaagttatca ccagaacttg gcaaacagct 1140

gacaaaaaca aaaaagaatt tggccgcttg aaagaagaaa aaggcgataa cgacaacttc 1200

aggatcaaac gctacttgtc taaatacacc attaacccag cgatcgctca tgggattagc 1260

gagtatgtag gttctgtaga agtgggcaaa gtggctgact tggtattgtg gagtccagca 1320

ttctttggcg tgaaacccaa catgatcatc aaaggcgggt tcattgcgtt aagtcaaatg 1380

ggcgatgcga acgcttctat ccctacccca caaccagttt attacagaga aatgttcgct 1440

catcatggta aagccaaata cgatgcaaac atcacttttg tgtctcaagc ggcttatgac 1500

aaaggcatta aagaagaatt agggcttgaa agacaagtat taccggtaaa aaattgcaga 1560

aacatcacta aaaaggacat gcaattcaac gacactactg ctcacattga agtcaatcct 1620

gaaacttacc atgtgttcgt ggatggcaaa gaagtaactt ctaaaccagc cactaaagtg 1680

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<210> 3

<211> 577

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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Met Lys Lys Ile Ser Arg Lys Glu Tyr Val Ser Met Tyr Gly Pro Thr

1 5 10 15

Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Ala Glu Val

20 25 30

Glu His Asp Tyr Thr Ile Tyr Gly Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly Gly

35 40 45

Lys Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser Gln Ser Asn Asn Pro Ser Lys Glu

50 55 60

Glu Leu Asp Leu Ile Ile Thr Ser Ala Leu Ile Val Asp Tyr Thr Gly

65 70 75 80

Ile Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly Ile

85 90 95

Gly Lys Gly Gly Asn Lys Asp Met Gln Asp Gly Val Lys Asn Asn Leu

100 105 110

Ser Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val

115 120 125

Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr His Ile His Phe Ile Ser Pro Gln Gln

130 135 140

Ile Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly

145 150 155 160

Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg

165 170 175

Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met Asn

180 185 190

Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala

195 200 205

Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp

210 215 220

Gly Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys

225 230 235 240

Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly

245 250 255

Cys Val Glu Asp Thr Met Ala Ala Ile Ala Gly Arg Thr Met His Thr

260 265 270

Phe His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys

275 280 285

Val Ala Gly Glu His Asn Ile Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr Ile

290 295 300

Pro Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met Val

305 310 315 320

Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp

325 330 335

Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp

340 345 350

Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg

355 360 365

Val Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys

370 375 380

Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn Phe

385 390 395 400

Arg Ile Lys Arg Tyr Leu Ser Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala

405 410 415

His Gly Ile Ser Glu Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Val Ala

420 425 430

Asp Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn Met

435 440 445

Ile Ile Lys Gly Gly Phe Ile Ala Leu Ser Gln Met Gly Asp Ala Asn

450 455 460

Ala Ser Ile Pro Thr Pro Gln Pro Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe Ala

465 470 475 480

His His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Ile Thr Phe Val Ser Gln

485 490 495

Ala Ala Tyr Asp Lys Gly Ile Lys Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg Gln

500 505 510

Val Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asp Met Gln

515 520 525

Phe Asn Asp Thr Thr Ala His Ile Glu Val Asn Pro Glu Thr Tyr His

530 535 540

Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Thr Lys Val

545 550 555 560

Ser Leu Ala Gln Leu Phe Ser Ile Phe Leu Glu His His His His His

565 570 575

His

<210> 4

<211> 1734

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atgaaaaaga ttagcagaaa agaatatgtt tctatgtatg gtcctactac aggcgataaa 60

gtgagattgg gcgatacaga tttgatcgct gaagtagaac atgactacac catttatggc 120

gaagagctta aattcggtgg cggtaaaacc ctaagagaag gcatgagcca atctaacaac 180

cccagcaaag aagaactgga tctaatcatc actagcgctt tgatcgtgga ttacaccggc 240

atttataaag cggatattgg tattaaagat ggcaaaatcg ctggcattgg taaaggcggt 300

aacaaagaca tgcaagatgg tgttaaaaac aatcttagcg tgggtcctgc tactgaagcc 360

ttagccggtg aaggtttgat cgtaactgct ggtggtattg acacacacat ccacttcatt 420

tcaccccaac aaatccctac agcttttgca agcggtgtaa caacgatgat tggtggcgga 480

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tggatgctca gagcagctga agaatattcc atgaacttag gtttcttagc taaaggtaac 600

gcttctaatg atgcgagctt agccgatcaa attgaagccg gtgcgattgg ctttaaaatc 660

cacgaagact ggggaacaac tccttctgca atcaatcatg cgttagatgt tgcggacaaa 720

tacgatgtgc aagtcgctat ccacacagac actttgaatg aagccggttg tgtagaagac 780

actatggcag ccattgccgg acgcactatg cacactttcc acactgaagg cgctggcggc 840

ggacacgctc ctgatattat taaagtggcc ggtgaacaca acattctgcc cgcttccact 900

aaccccacta tccctttcac tgtgaataca gaagcagaac acatggacat gcttatggtg 960

tgccaccact tggataaaag cattaaagaa gatgttcagt tcgctgactc aaggatccgc 1020

cctcaaacca ttgcggctga agacactttg catgacatgg ggattttctc aatcactagt 1080

tctgactctc aagctatggg tcgtgtgggc gaagttatca ccagaacttg gcaaacagct 1140

gacaaaaaca aaaaagaatt tggccgcttg aaagaagaaa aaggcgataa cgacaacttc 1200

aggatcaaac gctacttgtc taaatacacc attaacccag cgatcgctca tgggattagc 1260

gagtatgtag gttctgtaga agtgggcaaa gtggctgact tggtattgtg gagtccagca 1320

ttctttggcg tgaaacccaa catgatcatc aaaggcgggt tcattgcgtt aagtcaaatg 1380

ggcgatgcga acgcttctat ccctacccca caaccagttt attacagaga aatgttcgct 1440

catcatggta aagccaaata cgatgcaaac atcacttttg tgtctcaagc ggcttatgac 1500

aaaggcatta aagaagaatt agggcttgaa agacaagtat taccggtaaa aaattgcaga 1560

aacatcacta aaaaggacat gcaattcaac gacactactg ctcacattga agtcaatcct 1620

gaaacttacc atgtgttcgt ggatggcaaa gaagtaactt ctaaaccagc cactaaagtg 1680

agcttggcac aactctttag cattttcctc gagcaccacc accaccacca ctga 1734

Claims

1.一种用于检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体的试剂盒，包括胶体金试纸条和样本稀释液；

2.一种用于检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体的试剂盒，包括胶体金试纸条和样本稀释液；

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：

所述幽门螺旋杆菌抗原为如下(a)或(b)：

(a)序列表的序列1所示的蛋白质；

(b)序列表的序列3所示的蛋白质。

4.胶体金试纸条和样本稀释液在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体；

5.胶体金试纸条和样本稀释液在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体；

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：

所述幽门螺旋杆菌抗原为如下(a)或(b)：

(a)序列表的序列1所示的蛋白质；

(b)序列表的序列3所示的蛋白质。

7.一种用于检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体的胶体金试纸条；

8.一种用于检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体的胶体金试纸条，包括底板、样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫；

9.如权利要求7或8所述的胶体金试纸条，其特征在于：

所述幽门螺旋杆菌抗原为如下(a)或(b)：

(a)序列表的序列1所示的蛋白质；

(b)序列表的序列3所示的蛋白质。

10.权利要求7或8或9所述胶体金试纸条在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测血液样本中是否存在幽门螺旋杆菌抗体。