CN104614522A - 幽门螺杆菌抗体检测试剂盒、检测方法和应用 - Google Patents

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CN104614522A CN201510069230.8A CN201510069230A CN104614522A CN 104614522 A CN104614522 A CN 104614522A CN 201510069230 A CN201510069230 A CN 201510069230A CN 104614522 A CN104614522 A CN 104614522A
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Abstract

本发明公开一种幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，包括有如下组分：直接包被或间接连接幽门螺杆菌抗原的磁性微球溶液；和直接包被或间接连接抗人IgG抗体的标记示踪物溶液；和/或直接包被或间接连接抗人IgM抗体的标记示踪物溶液；和/或直接包被或间接连接抗人IgA抗体的标记示踪物溶液；和/或直接包被或间接连接金黄色葡萄球菌A蛋白的标记示踪物溶液。本发明还公开了相应的幽门螺杆菌抗体检测方法及其应用。本发明可检测幽门螺杆菌IgG抗体、幽门螺杆菌IgM、幽门螺杆菌IgA及幽门螺杆菌总抗体多种抗体，更好地适用幽门螺杆菌感染者的复杂情况，且可在无需对样本进行预稀释的情况下，准确检测幽门螺杆菌抗体。

Description

幽门螺杆菌抗体检测试剂盒、检测方法和应用
技术领域
本发明涉及化学发光免疫检测技术，尤其涉及一种幽门螺杆菌抗体化学发光免疫检测试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
1982年，澳大利亚学者马歇尔观察到胃黏膜中有一种与慢性胃病发病有关的细菌。1989年，Goodwin等人将其命名为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)，得到学术界的承认。1994年，世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为人类I致癌原。幽门螺杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，长2.5～4.0μm、宽0.5～1.0μm，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形；在固体培养基上生长时，除典型的形态外，有时可出现杆状或圆球状。幽门螺杆菌是微需氧菌，环境氧要求5～8％，在大气或绝对厌氧环境下不能生长。
幽门螺杆菌是引起口臭的最直接病菌之一，由于幽门螺杆菌可以在牙菌斑中生存，在口腔内发生感染后，会直接产生有臭味的碳化物，引起口臭。幽门螺杆菌感染的患者多会出现餐后嗳气、恶心、腹胀、腹部不适的胃肠疾病症状，而且这些症状随时都会出现，但是有些患者没有明显的症状，只有到医院做相对的检查才能发现。随着病情的严重，会逐渐破坏胃肠道壁，引发癌变的发生，感染幽门螺旋杆菌后，可能使患胃癌的危险增加2.7至12倍。而且，感染幽门螺杆菌患者一般都患有胃病，发生胃病的患者，多数与幽门螺杆菌有一定的关系。幽门螺杆菌症状一般感染者在检查中显示阳性，一般不会有什么症状，病毒在患者体内长期的破坏、寄生、繁殖，随着病情的发展，幽门螺杆菌会使菌群失调，引起其他一系列的症状。
我国是幽门螺旋杆菌感染高发国家之一，作为慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等主要病因，治疗消化性溃疡、预防胃癌的一个可行措施就是预防并根除幽门螺旋杆菌感染。由于早期胃癌患者大约80％没有症状，少数患者即使有一些症状也是些非特异性表现，比如：食欲不振、早饱、腹部不适等，极易被当作消化性溃疡或其他胃肠道疾病而忽视。
现有技术中，已发展了涉及细菌学、病理学、血清学、同位素示踪、分子生物学等多种学科的多种检测HP感染的方法，主要包括：细菌的直接检查、尿素酶检查/尿素呼气试验、ELISA、CLIA等免疫学检测及聚合酶链反应等方法。
细菌的直接检查
是指通过胃镜检查钳取胃粘膜(多为胃窦粘膜)作直接涂片、染色，组织切片染色及细菌培养来检测幽门螺旋杆菌。其中胃粘膜细菌培养是诊断幽门螺旋杆菌最可靠的方法，可作为验证其他诊断性试验的“金标准”，同时又能进行药敏试验，指导临床选用药物。但这种方法取样、检查过程繁琐，无法自动化。
尿素酶检查
因为幽门螺旋杆菌是人胃内唯一能够产生大量尿素酶的细菌，故可通过检测尿素酶来诊断幽门螺旋杆菌感染。尿素酶分解胃内尿素生成氨和二氧化碳，使尿素浓度降低、氨浓度升高。基于此原理已发展了多种检测方法：①胃活检组织尿素酶试验；②呼吸试验；③胃液尿素或尿素氮测定；④15N-尿素试验。这种方法简单方便，但不利于自动化处理。
聚合酶链反应技术
正常胃粘膜很少检出幽门螺旋杆菌(0～6％)，慢性胃炎患者幽门螺旋杆菌的检出率很高，约50％～80％，慢性活动性胃炎患者幽门螺旋杆菌检出率则更高，达90％以上。但这种方法分子诊断成本较高。
唾液法测定幽门螺杆菌
只需要收集4滴唾液即可检测，没有任何毒副作用。该方法适合各年龄段人群的检测，特别是老人、孕妇和儿童。针对口腔幽门螺杆菌的敏感性96％，特异性97-100％。若配合胃部幽门螺杆菌检测，行共同诊断和治疗，可根除人体幽门螺杆菌。
尿素呼气试验
由于HP具有较强的内源性尿素酶，能分解胃内及核素标记的尿素，产生CO2和NH3，CO2被吸收后经肺呼出，因此只需分析呼气中的14C或13C即可诊断HP是否存在。
尿素呼气试验的原理是HP在体内产生尿素酶，用13C或14C标记的尿素由受试者服下后，即分解产生带同位素标记的二氧化碳，收集呼气标本，用液体闪烁计数器或用气体核素质谱仪检测标记的二氧化碳，灵敏度极高，可定量，患者无创伤无痛苦，方法简单快速，对检测HP是否根治十分可靠。敏感性95％，特异性95％-100％。
免疫学检测
目前已有多种免疫学检测方法，通过测定血清中的幽门螺旋杆菌抗体来检测幽门螺旋杆菌感染，包括补体结合试验、凝集试验、被动血凝测定、免疫印迹技术和酶联合吸附测定(ELISA)等。这种方法试剂成本低、操作简单，但灵敏度低，只适用于定性和半定量诊断。
目前市面上有索林公司提供粪便样本中的幽门螺旋杆菌抗原检验，和其他多为测定血清IgG，IgA抗体的试剂盒。血清抗体可反映机体对幽门螺旋杆菌的免疫应答能力，检测抗体十分必要。但是，由于幽门螺旋杆菌感染后数周血中才会出现特异抗体，且细菌根除后血中抗体可维持6个月以上。因此幽门螺旋杆菌不能肯定患者有活动性感染，阴性不能排除初期的感染，故该项检查只能用于流行病学的筛查。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，提供一种幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，该试剂盒可检测幽门螺杆菌IgG抗体、幽门螺杆菌IgM、幽门螺杆菌IgA及幽门螺杆菌总抗体多种抗体，更好地适用幽门螺杆菌感染者的复杂情况。
本发明进一步所解决的技术问题是，提供一种幽门螺杆菌抗体化学发光免疫检测方法，该方法可在无需对样本进行预稀释的情况下，准确地检测出幽门螺杆菌抗体，大大提高检测灵敏度和检测结果准确性、简化检测流程、加快检测速度。
本发明进一步所解决的技术问题是，提供一种幽门螺杆菌抗体检测试剂盒在化学发光免疫分析仪中的应用，该应用可在无需对样本进行预稀释的情况下，准确地检测出幽门螺杆菌抗体，大大提高检测灵敏度和检测结果准确性、简化检测流程、加快检测速度且作规范，避免人为引入误差，可实现自动化检测。
为了解决上述技术问题，本发明公开了以下方案：
一种幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，包括有封装于盒体内的检测试剂盒，包括如下组分：
直接包被或间接连接幽门螺杆菌抗原的磁性微球溶液；和
直接包被或间接连接抗人IgG抗体的标记示踪物溶液；和/或
直接包被或间接连接抗人IgM抗体的标记示踪物溶液；和/或
直接包被或间接连接抗人IgA抗体的标记示踪物溶液；和/或
直接包被或间接连接金黄色葡萄球菌A蛋白的标记示踪物溶液。
优选地，所述直接包被或间接连接幽门螺杆菌抗原的磁性微球溶液为：
包被有幽门螺杆菌抗原的磁性微球溶液；或为：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的磁性微球溶液，标记幽门螺杆菌抗原的异硫氰酸荧光素溶液；或为：
包被有链霉亲和素的磁性微球溶液，生物素标记的幽门螺杆菌抗原溶液。
优选地，所述直接包被或间接连接抗人IgG抗体的标记示踪物溶液为：
包被有抗人IgG抗体的标记示踪物溶液；或为：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物溶液，标记抗人IgG抗体的异硫氰酸荧光素溶液；或为：
包被有链霉亲和素的标记示踪物溶液，生物素标记的抗人IgG抗体溶液。
优选地，所述直接包被或间接连接抗人IgM抗体的标记示踪物溶液为：
包被有抗人IgM抗体的标记示踪物溶液；或为：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物溶液，标记抗人IgM抗体的异硫氰酸荧光素溶液；或为：
包被有链霉亲和素的标记示踪物溶液，生物素标记的抗人IgM抗体溶液。
优选地，所述直接包被或间接连接抗人IgA抗体的标记示踪物溶液为：
包被有抗人IgA抗体的标记示踪物溶液；或为：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物溶液，标记抗人IgA抗体的异硫氰酸荧光素溶液；或为：
包被有链霉亲和素的标记示踪物溶液，生物素标记的抗人IgA抗体溶液。
优选地，所述直接包被或间接连接金黄色葡萄球菌A蛋白的标记示踪物溶液为：
包被有金黄色葡萄球菌A蛋白的标记示踪物溶液；或为：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物溶液，标记金黄色葡萄球菌A蛋白的异硫氰酸荧光素溶液；或为：
包被有链霉亲和素的标记示踪物溶液，生物素标记的金黄色葡萄球菌A蛋白溶液。优选地，所述幽门螺杆菌抗原和磁性微球之间与各抗人抗体/金黄色葡萄球菌A蛋白和标记示踪物之间不采用相同的化合物间接连接。
优选地，所述标记示踪物包括有发光标记物，所述发光标记物为金钢烷、异鲁米诺及其衍生物、鲁米诺及其衍生物和吖啶酯中的任意一种。
优选地，所述标记示踪物还包括有化学发光催化剂，所述化学发光催化剂为碱性磷酸酶或过氧化物酶。相应地，本发明还公开了一种幽门螺杆菌抗体检测方法，包括以下步骤：
反应步骤：将待测样本与直接包被或间接连接幽门螺杆菌抗原的磁性微球溶液混匀后，25-40℃温育5-20分钟后，加入直接包被或间接连接抗人IgA抗体/抗人IgG抗体/抗人IgM抗体/金黄色葡萄球菌A蛋白的标记示踪物，25-40℃温育5-20分钟后，清洗，得到反应产物；
检测步骤：外加磁场将所述反应产物沉淀，去除上清液，清洗后，加入化学发光激发物，检测发出的相对光强度，通过计算得到待测样本中的幽门螺杆菌IgA/IgG/IgM/总抗体浓度。
相应地，本发明还公开了上述幽门螺杆菌抗体检测试剂盒在化学发光免疫分析仪上的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的实施例通过直接对样本中的抗体进行检测，并提供可选择地检测多种抗体的方案，从而实现了在无需对样本进行预稀释的情况下，准确地检测出幽门螺杆菌抗体，大大了提高检测灵敏度和检测结果准确性、简化了检测流程、加快了检测速度。
具体实施方式
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第一实施例，本实施例用于测定H.pylori IgG，主要包括以下组分：
包被有HP抗原的磁性微球溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记抗人IgG抗体的标记示踪物溶液
抗人IgG抗体浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
含HP IgG的低点校准品，其中HP IgG浓度：5-20EIU
含HP IgG的高点校准品，其中HP IgG浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第二实施例，本实施例用于测定H.pylori IgG，主要包括以下组分：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体(以下简称为“抗FITC抗体”)的磁性微球溶液
抗FITC抗体浓度：10-200μg/l
磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记抗人IgG抗体的标记示踪物溶液
抗人IgG抗体浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
标记HP抗原的异硫氰酸荧光素(以下简称为“FITC”)溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l         FITC浓度：0.1-1mg/l
含HP IgG的低点校准品，其中HP IgG浓度：5-20EIU
含HP IgG的高点校准品，其中HP IgG浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第三实施例，本实施例用于测定H.pylori IgG，主要包括以下组分：
包被有链霉亲和素(SA)的磁性微球溶液
SA浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记抗人IgG抗体的标记示踪物溶液
抗人IgG抗体浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
生物素(Biotin)标记的HP抗原溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l    Biotin浓度：0.1-1mg/l
含HP IgG的低点校准品，其中HP IgG浓度：5-20EIU
含HP IgG的高点校准品，其中HP IgG浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第四实施例，本实施例用于测定H.pylori IgM，主要包括以下组分：
包被有HP抗原的磁性微球溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记抗人IgM抗体的标记示踪物溶液
抗人IgM抗体浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
含HP IgM的低点校准品，其中HP IgM浓度：5-20EIU
含HP IgM的高点校准品，其中HP IgM浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第五实施例，本实施例用于测定H.pylori IgM，主要包括以下组分：
包被有抗FITC抗体的磁性微球溶液
抗FITC抗体浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记抗人IgM抗体的标记示踪物溶液
抗人IgM抗体浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
标记HP抗原的FITC溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l         FITC浓度：0.1-1mg/l
含HP IgM的低点校准品，其中HP IgM浓度：5-20EIU
含HP IgM的高点校准品，其中HP IgM浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第六实施例，本实施例用于测定H.pylori IgM，主要包括以下组分：
包被有SA的磁性微球溶液
SA浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记抗人IgM抗体的标记示踪物溶液
抗人IgM抗体浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
Biotin标记的HP抗原溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l    Biotin浓度：0.1-1mg/l
含HP IgM的低点校准品，其中HP IgM浓度：5-20EIU
含HP IgM的高点校准品，其中HP IgM浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第七实施例，本实施例用于测定H.pylori IgA，主要包括以下组分：
包被有HP抗原的磁性微球溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记抗人IgA抗体的标记示踪物溶液
抗人IgA抗体浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
含HP IgA的低点校准品，其中HP IgA浓度：5-20EIU
含HP IgA的高点校准品，其中HP IgA浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第八实施例，本实施例用于测定H.pylori IgA，主要包括以下组分：
包被有抗FITC抗体的磁性微球溶液
抗FITC抗体浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记抗人IgA抗体的标记示踪物溶液
抗人IgA抗体浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
标记HP抗原的FITC溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l         FITC浓度：0.1-1mg/l
含HP IgA的低点校准品，其中HP IgA浓度：5-20EIU
含HP IgA的高点校准品，其中HP IgA浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第九实施例，本实施例用于测定H.pylori IgA，主要包括以下组分：
包被有SA的磁性微球溶液
SA浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记抗人IgA抗体的标记示踪物溶液
抗人IgA抗体浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
Biotin标记的HP抗原溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l    Biotin浓度：0.1-1mg/l
含HP IgA的低点校准品，其中HP IgA浓度：5-20EIU
含HP IgA的高点校准品，其中HP IgA浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第十实施例，本实施例用于测定H.pylori总抗体，主要包括以下组分：
包被有HP抗原的磁性微球溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记SPA的标记示踪物溶液
SPA浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
含HP总抗体的低点校准品，其中HP总抗体浓度：5-20EIU
含HP总抗体的高点校准品，其中HP总抗体浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第十一实施例，本实施例用于测定H.pylori总抗体，主要包括以下组分：
包被有抗FITC抗体的磁性微球溶液
抗FITC抗体浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记SPA的标记示踪物溶液
SPA浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
标记HP抗原的FITC溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l    FITC浓度：0.1-1mg/l
含HP总抗体的低点校准品，其中HP总抗体浓度：5-20EIU
含HP总抗体的高点校准品，其中HP总抗体浓度：40-80EIU。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌检测试剂盒的第十二实施例，本实施例用于测定H.pylori总抗体，主要包括以下组分：
包被有SA的磁性微球溶液
SA浓度：10-200μg/l    磁性微球浓度：0.1-5mg/ml
标记SPA的标记示踪物溶液
SPA浓度：10-200μg/l    标记示踪物浓度：0.1-1mg/l
Biotin标记的HP抗原溶液
HP抗原浓度：10-200μg/l    Biotin浓度：0.1-1mg/l
含HP总抗体的低点校准品，其中HP总抗体浓度：5-20EIU
含HP总抗体的高点校准品，其中HP总抗体浓度：40-80EIU。
以上各实施例中，所述试剂盒可具体包括有若干与组分一一对应的单元格，每个单元格内独立封装有一种组分，以供加样过程中，通过加样针在需要的单元格中分别取样。
进一步地，标记示踪物与抗人IgG/IgM/IgA抗体/SPA之间也可采用直接包被或间接连接的方式。
更进一步地，上述各种间接连接的方式还可互换，例如包被有抗FITC抗体的磁性微球溶液，标记HP抗原的FITC溶液也可以是包被有FITC的磁性微球溶液，标记HP抗原的抗FITC抗体溶液；包被有SA的磁性微球溶液，Biotin标记的HP抗原溶液也可以是包被有Biotin的磁性微球溶液，SA标记的HP抗原溶液等。为了防止不同试剂之间的化学物质产生干扰作用考虑，磁性微球与HP抗原之间的间接连接化合物与标记示踪物与抗人IgG/IgM/IgA抗体/SPA之间的间接连接化合物不能同时相同，如：不能同时采用FITC进行连接等。
所述抗FITC抗体既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，优选为羊抗FITC多克隆抗体。所述标记示踪物主要包括有发光标记物，如金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯等。并可优选N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
所述发光标记物是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，该化合物能够经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM)。
进一步地，所述标记示踪物还包括有化学发光催化剂，所述化学发光催化剂为碱性磷酸酶或过氧化物酶。所述化学发光催化剂与氧化物等配合使用，构成氧化系统。所述氧化系统包括H2O2-微过氧化物酶、H2O2-过氧化氢酶、H2O2-乳过氧化物酶、H2O2-次氯血红素、H2O2-氯化血红素、次氯酸盐-CoCl2、过硫酸盐、过氧化钾、高碘酸钠、H2O2-K3Fe(CN)6、黄嘌呤-次黄嘌呤氧化酶、叔丁醇钾中的任意至少一种。
上述标记示踪物使用时，配合相应的化学发光底物即可发光被定量检测，所述化学发光底物包括NaOH和H2O2，还包括金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物中的至少一种，优选N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
更进一步地，上述各试剂中均可含有牛血清蛋白(BSA)和防腐剂，BSA浓度为0.01-0.5g/ml，防腐剂可为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或两种以上混合物。
在上述各实施例中，磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。或者，为达到更加效果，可以是将纳米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特别限制，可根据需要进行选择。
更进一步地，所述磁性微球可以是Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并具有0.1-5μm的粒径，并且，所述磁性微球还通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团，，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2等。
前述实施例所描述的试剂盒和检测方法可在化学发光免疫分析仪中应用。与现有技术中在酶免平台检测幽门螺杆菌相比，化学发光免疫检测平台中应用检测，其操作更规范、结果更准确、检测速度更快。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌化学发光免疫检测方法的第一实施例，用于测定H.pylori G，本实施例实现一次H.pylori G测定流程主要包括以下步骤：
取5-50μl样本、校准品加样至反应杯中；
加入直接包被或间接连接HP抗原的磁性微球溶液混匀后，25-40℃温育5-20分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
再加入直接包被或间接连接抗人IgG抗体的标记示踪物10-200μl后，25-40℃温育5-20分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
加入底物后检测光强度；
通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出样本的H.pylori IgG浓度。
具体实现时，所述直接包被或间接连接HP抗原的磁性微球溶液可以是：
缓冲液10-200μl、包被HP抗原的磁性微球溶液10-50μl；或者
标记HP抗原的荧光素标记物10-200μl、抗FITC抗体的磁性微球溶液10-50μl混匀；或者
Biotin标记的HP抗原溶液10-200μl、包被SA的磁性微球溶液10-50μl混匀。
所述直接包被或间接连接SPA的标记示踪物溶液可以是：
标记抗人IgG抗体的标记示踪物溶液10-50μl；或者
标记抗人IgG抗体的FITC溶液10-200μl、抗FITC抗体的标记示踪物溶液10-50μl混匀；或者
Biotin标记的抗人IgG抗体溶液10-200μl、SA标记的标记示踪物溶液10-50μl混匀。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌化学发光免疫检测方法的第二实施例，用于测定H.pylori M，本实施例实现一次H.pylori M测定流程主要包括以下步骤：
取5-50μl样本、校准品加样至反应杯中；
加入直接包被或间接连接HP抗原的磁性微球溶液混匀后，25-40℃温育5-20分钟
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
再加入直接包被或间接连接抗人IgM抗体的标记示踪物10-200μl；
25-40℃温育5-20分钟后，自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
加入底物后检测光强度；
通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出样本的H.pylori IgM浓度。
具体实现时，所述直接包被或间接连接HP抗原的磁性微球溶液可以是：
缓冲液10-200μl、包被HP抗原的磁性微球溶液10-50μl；或者
标记HP抗原的FITC溶液10-200μl、抗FITC抗体的磁性微球溶液10-50μl混匀；或者
Biotin标记的HP抗原溶液10-200μl、包被SA的磁性微球溶液10-50μl混匀。
所述直接包被或间接连接SPA的标记示踪物溶液可以是：
标记抗人IgM抗体的标记示踪物溶液10-50μl；或者
标记抗人IgM抗体的FITC溶液10-200μl、抗FITC抗体的标记示踪物溶液10-50μl混匀；或者
Biotin标记的抗人IgM抗体溶液10-200μl、SA标记的标记示踪物溶液10-50μl混匀。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌化学发光免疫检测方法的第三实施例，用于测定H.pylori A，本实施例实现一次H.pylori A测定流程主要包括以下步骤：
取5-50μl样本、校准品加样至反应杯中；
加入直接包被或间接连接HP抗原的磁性微球溶液混匀后，25-40℃温育5-20分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
再加入直接包被或间接连接抗人IgA抗体的标记示踪物10-200μl后，25-40℃温育5-20分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
加入底物后检测光强度；
通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出样本的H.pylori IgA浓度。
具体实现时，所述直接包被或间接连接HP抗原的磁性微球溶液可以是：
缓冲液10-200μl、包被HP抗原的磁性微球溶液10-50μl；或者
加入标记HP抗原的荧光素标记物10-200μl、抗FITC抗体的磁性微球溶液10-50μl混匀；或者
Biotin标记的HP抗原溶液10-200μl、包被SA的磁性微球溶液10-50μl。
所述直接包被或间接连接SPA的标记示踪物溶液可以是：
标记抗人IgA抗体的标记示踪物溶液10-50μl；或者
标记抗人IgA抗体的FITC溶液10-200μl、抗FITC抗体的标记示踪物溶液10-50μl混匀；或者
Biotin标记的抗人IgA抗体溶液10-200μl、SA标记的标记示踪物溶液10-50μl混匀。
下面详细描述本发明提供的幽门螺杆菌化学发光免疫检测方法的第四实施例，用于测定H.pylori总抗体，本实施例实现一次H.pylori总抗体测定流程主要包括以下步骤：
取5-50μl样本、校准品加样至反应杯中；
加入直接包被或间接连接HP抗原的磁性微球溶液混匀后，25-40℃温育5-20分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
再加入直接包被或间接连接SPA的标记示踪物10-200μl后，25-40℃温育5-20分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
加入底物后检测光强度；
通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出样本的H.pylori总抗体浓度。
具体实现时，所述直接包被或间接连接HP抗原的磁性微球溶液可以是：
缓冲液10-200μl、包被HP抗原的磁性微球溶液10-50μl；或者
加入标记HP抗原的荧光素标记物10-200μl、抗FITC抗体的磁性微球溶液10-50μl混匀；或者
Biotin标记的HP抗原溶液10-200μl、包被SA的磁性微球溶液10-50μl。
所述直接包被或间接连接SPA的标记示踪物溶液可以是：
标记SPA的标记示踪物溶液10-50μl；或者
标记SPA的FITC溶液10-200μl、抗FITC抗体的标记示踪物溶液10-50μl混匀；或者
Biotin标记的SPA溶液10-200μl、SA标记的标记示踪物溶液10-50μl混匀。
上述各实施例中，所述底物可包括NaOH和H2O2，还可包括金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物中的至少一种，并可优选ABEI。
前述实施例所描述的试剂盒和检测方法可在化学发光免疫分析仪中应用。与现有技术中在酶免平台检测幽门螺杆菌相比，化学发光免疫检测平台中应用检测，其操作更规范、结果更准确、检测速度更快。
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的幽门螺杆菌检测试剂盒的具体组成、检测方法及其功效，详细说明如下。
主要原材料来源
对照试剂：西门子IMMULIE 2000H.pylori IgG。
幽门螺杆菌抗原：购自芬兰BIOHIT公司。
抗人IgG抗体、抗人IgM抗体、抗人IgA抗体、金黄色葡萄球菌A蛋白：均购自Medix公司。
磁性微球：深圳新产业生物医学股份有限公司生产的四氧化三铁磁性微球，浓度为0.6-1.2mg/ml，80％粒径分布为1-5μm，磁化强度为4000高斯时沉淀时间为10-15秒，BSA为30mg时蛋白吸附浓度为0.8mg-1.2mg。
磁性微球、ABEI：为深圳新产业生物医学股份有限公司生产。
FITC:自上海纪宁实业有限公司。
Biotin、SA：均购自深圳菲鹏生物有限公司。
HP各项抗体校准品：来源于人血清提取物。
样本采集：可以为空白管血清、分离胶管血清、促凝剂管血清、EDTA血浆、肝素血浆中的任意一种。
实施例1
一种测定H.pylori IgG的检测试剂盒，包括如下组分：
包被HP抗原的磁性微球溶液
HP抗原浓度：50μg/l    磁性微球浓度：1.2mg/ml
标记抗人IgG抗体的ABEI溶液
抗人IgG抗体浓度：50μg/l    ABEI浓度：0.5mg/l
含HP IgG的低点校准品，其中HP IgG浓度：10.573EIU
含HP IgG的高点校准品，其中HP IgG浓度：68.766EIU。
具体实现时，上述各组分中均可含有BSA和防腐剂，BSA的浓度为0.05g/ml，防腐剂使用叠氮钠，浓度为0.02g/ml。
一种H.pylori IgG的检测方法，包括如下步骤：
将样本、校准品加样至反应杯中；
加入缓冲液100μl、包被HP抗原的磁性微球溶液20μl混匀后，37℃温育10分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
再加入标记抗人IgG抗体的标记示踪物100μl后，37℃温育10分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
加入底物后检测光强度；
通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出样本的H.pylori IgG浓度。
实施例2
一种测定H.pylori IgM的检测试剂盒，包括如下组分：
包被HP抗原的磁性微球溶液
HP抗原浓度：50μg/l    磁性微球浓度：1.2mg/ml
标记抗人IgM抗体的ABEI溶液
抗人IgM抗体浓度：50μg/l    ABEI浓度：0.5mg/l
含HP IgM的低点校准品，其中HP IgM浓度：10.573EIU
含HP IgM的高点校准品，其中HP IgM浓度：68.766EIU。
具体实现时，上述各组分中均可含有BSA和防腐剂，BSA的浓度为0.05g/ml，防腐剂使用叠氮钠，浓度为0.02g/ml。
一种H.pylori IgM的检测方法，包括如下步骤：
将样本、校准品加样至反应杯中；
加入缓冲液100μl、包被HP抗原的磁性微球溶液20μl混匀后，37℃温育10分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
再加入标记抗人IgM抗体的标记示踪物100μl后，37℃温育10分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
加入底物后检测光强度；
通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出样本的H.pylori IgM浓度。
实施例3
一种测定H.pylori IgA的检测试剂盒，包括如下组分：
包被HP抗原的磁性微球溶液
HP抗原浓度：50μg/l    磁性微球浓度：1.2mg/ml
标记抗人IgA抗体的ABEI溶液
抗人IgA抗体浓度：50μg/l    ABEI浓度：0.5mg/l
含HP IgA的低点校准品，其中HP IgA浓度：10.573EIU
含HP IgA的高点校准品，其中HP IgA浓度：68.766EIU。
具体实现时，上述各组分中均可含有BSA和防腐剂，BSA的浓度为0.05g/ml，防腐剂使用叠氮钠，浓度为0.02g/ml。
一种H.pylori IgA的检测方法，包括如下步骤：
将样本、校准品加样至反应杯中；
加入缓冲液100μl、包被HP抗原的磁性微球溶液20μl混匀后，37℃温育10分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液
再加入标记抗人IgA抗体的标记示踪物100μl后，37℃温育10分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
加入底物后检测光强度；
通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出样本的H.pylori IgA浓度。
实施例4
一种测定H.pylori总抗体的检测试剂盒，包括如下组分：
包被HP抗原的磁性微球溶液；
HP抗原浓度：50μg/l    磁性微球浓度：1.2mg/ml
标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)的ABEI溶液；
SPA浓度：50μg/l    ABEI浓度：0.5mg/l
含HP总抗体的低点校准品，其中HP总抗体浓度：10.573EIU
含HP总抗体的高点校准品，其中HP总抗体浓度：68.766EIU。
具体实现时，上述各组分中均可含有BSA和防腐剂，BSA的浓度为0.05g/ml，防腐剂使用叠氮钠，浓度为0.02g/ml。
一种H.pylori总抗体的检测方法，包括如下步骤：
将样本、校准品加样至反应杯中；
加入缓冲液100μl、包被HP抗原的磁性微球溶液20μl混匀后，37℃温育10分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗后，抽走废液；
再加入标记SPA的标记示踪物100μl后，37℃温育10分钟；
自动灌注系统缓冲液进行清洗并抽走废液；
加入底物后检测光强度；
通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出样本的H.pylori总抗体浓度。
对比例1
一种测定H.pylori IgG的检测试剂盒和IGF-1化学发光免疫检测方法，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：
在检测方法中，先对样本进行1:20预稀释处理后，再进行检测。
从医院选取已通过其他临床确诊分别为HP阳性和HP阴性的成人体检样本各100例，分别使用上述实施例1-4、对比例1、及西门子IMMULIE 2000H.pyloriIgG检测试剂盒作为对照例1对此200例样本进行检测，结果如下表1所示。
表1、临床确诊成人样本与各抗体检测结果对比表
另外，选取35例临床诊断为儿童HP初次感染的样本，分别使用上述实施例1-2及使用西门子IMMULIE 2000H.pylori IgG检测试剂作为对照例2，对其进行检测，结果如下表2所示。
表2、HP急性感染患者各项抗体检测对比表
其中，对照例1-2中H.pylori IgG参考范围：阴性：<0.9U/ml，灰区：0.9-1.1U/ml，阳性：>1.1U/ml。
实施例1-4中各抗体参考范围：阴性<25EIU，灰区：25-30EIU，阳性：>30EIU。
结果分析：
由表1中对照例1与实施例1结果对比可见，实施例1的H.pylori IgG阴阳符合率均高于对照例1，试剂灵敏度大大提高；
由表1中实施1-4结果对比可见，成人体检标本中H.pylori IgG检出特异性及灵敏度相比其他抗体较高，H.pylori IgM特异性最低，可能由于HP主要感染仍为慢性感染，IgG水平起伏不大，但IgM水平一般维持在较低水平。
由表1可见，实施例1-4阴性符合率均为100％，但HP总抗体的阳性检出率最高。因此，选择检测HP总抗体作为初筛项目，若HP总抗体为阳性则建议复查其他各项抗体水平，若HP总抗体均为阴性则无需检查其他各项抗体，可减少体检人群中HP初筛的检测成本。
由表2中对照例2与实施例1-2在儿童初次感染时结果可见，H.pylori IgM在儿童HP初次感染后的检出率要明显高于IgG抗体。因此，可推荐H.pylori IgM作为儿童HP感染的诊断指标。
由对照例1、实施例1及对比例1的结果对比可见，预稀释过程因存在结果需要乘以稀释倍数，可存在阴性样本检查出现假阳的风险，故取消预稀释将对样本的检测准确度大大提高。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
通过直接检测样本中的抗体，大大提高了检测结果的准确性；
在幽门螺杆菌IgG抗体的基础上，增加了幽门螺杆菌IgM、幽门螺杆菌IgA及幽门螺杆菌总抗体多种抗体检测的方法和试剂盒组成，更好地适用幽门螺杆菌感染者的复杂情况；
无需对样本进行预稀释，计算结果更为准确、阴阳符合率更高；
在固相载体直接包被抗原的基础上，还提出了间接连接抗原的方式，更加灵活多样；
同时提供了标记示踪物直接包被/间接连接抗人抗体的方式，进一步增加了检测试剂的灵活多样性；
减少温育时间，大大加快了HP抗体检测的时间；
在化学发光免疫检测平台上检测，进一步提高了准确性、加快了检测时间；
提高了抗原包被效价。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：
直接包被或间接连接幽门螺杆菌抗原的磁性微球溶液；和
直接包被或间接连接抗人IgG抗体的标记示踪物溶液；和/或
直接包被或间接连接抗人IgM抗体的标记示踪物溶液；和/或
直接包被或间接连接抗人IgA抗体的标记示踪物溶液；和/或
直接包被或间接连接金黄色葡萄球菌A蛋白的标记示踪物溶液。
2.如权利要求1所述的幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述直接包被或间接连接幽门螺杆菌抗原的磁性微球溶液为：
包被有幽门螺杆菌抗原的磁性微球溶液；或为：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的磁性微球溶液，标记幽门螺杆菌抗原的异硫氰酸荧光素溶液；或为：
包被有链霉亲和素的磁性微球溶液，生物素标记的幽门螺杆菌抗原溶液。
3.如权利要求1所述的幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述直接包被或间接连接抗人IgG抗体的标记示踪物溶液为：
包被有抗人IgG抗体的标记示踪物溶液；或为：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物溶液，标记抗人IgG抗体的异硫氰酸荧光素溶液；或为：
包被有链霉亲和素的标记示踪物溶液，生物素标记的抗人IgG抗体溶液。
4.如权利要求1所述的幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述直接包被或间接连接抗人IgM抗体的标记示踪物溶液为：
包被有抗人IgM抗体的标记示踪物溶液；或为：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物溶液，标记抗人IgM抗体的异硫氰酸荧光素溶液；或为：
包被有链霉亲和素的标记示踪物溶液，生物素标记的抗人IgM抗体溶液。
5.如权利要求1所述的幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述直接包被或间接连接抗人IgA抗体的标记示踪物溶液为：
包被有抗人IgA抗体的标记示踪物溶液；或为：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物溶液，标记抗人IgA抗体的异硫氰酸荧光素溶液；或为：
包被有链霉亲和素的标记示踪物溶液，生物素标记的抗人IgA抗体溶液。
6.如权利要求1所述的幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述直接包被或间接连接金黄色葡萄球菌A蛋白的标记示踪物溶液为：
包被有金黄色葡萄球菌A蛋白的标记示踪物溶液；或为：
包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物溶液，标记金黄色葡萄球菌A蛋白的异硫氰酸荧光素溶液；或为：
包被有链霉亲和素的标记示踪物溶液，生物素标记的金黄色葡萄球菌A蛋白溶液。
7.如权利要求1-6中任一项所述的幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述HP抗原和磁性微球之间与各抗人抗体/金黄色葡萄球菌A蛋白和标记示踪物之间不采用相同的化合物间接连接。
8.如权利要求1-6所述的幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物包括有发光标记物，所述发光标记物为金刚烷、异鲁米诺及其衍生物、鲁米诺及其衍生物和吖啶酯中的任意一种。
9.如权利要求1-6所述的幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物还包括有化学发光催化剂，所述化学发光催化剂为碱性磷酸酶或过氧化物酶。
10.一种幽门螺杆菌抗体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
反应步骤：将待测样本与直接包被或间接连接HP抗原的磁性微球溶液混匀后，25-40℃温育5-20分钟，后加入直接包被或间接连接抗人IgA抗体/抗人IgG抗体/抗人IgM抗体/金黄色葡萄球菌A蛋白的标记示踪物，25-40℃温育5-20分钟，后清洗，得到反应产物；
检测步骤：外加磁场将所述反应产物沉淀，去除上清液，清洗后，加入化学发光激发物，检测发出的相对光强度，通过计算得到待测样本中的幽门螺杆菌IgA/IgG/IgM/总抗体浓度。
11.权利要求1-9中任一项所述的幽门螺杆菌抗体检测试剂盒在化学发光分析仪中的应用。
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