CN101713779A - 一种用亲和素/链亲和素磁性复合微粒对生物分子进行免疫学检测的方法 - Google Patents

一种用亲和素/链亲和素磁性复合微粒对生物分子进行免疫学检测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫分析领域，具体涉及一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒对生物分子进行免疫学检测的方法。该方法以亲和素/链亲和素磁性复合微粒为载体，包被生物素化的抗体或抗原，然后加入待检标本和酶标抗体/酶标抗原/酶标抗抗体，最后加入显色底物，进行检测。生物素与亲和素/链亲和素有着很强的结合能力，可通过标记在磁性复合微粒表面的亲和素/链亲和素将生物素标记的抗原/抗体进行固定化，进而利用该系统对特定的抗体/抗原进行检测，该检测系统具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等优点。

Description

一种用亲和素/链亲和素磁性复合微粒对生物分子进行免疫学检测的方法
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，具体涉及一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒对生物分子进行免疫学检测的方法。
背景技术
生物素-亲合素系统(BAS)，是七十年代后期发展起来的一种生物反应放大系统。原理基于生物素与亲和素之间存在如下特征：(1)二者具有高度的特异的亲和性。生物素为小分子物质；亲和素有卵白素(又称亲和素)和链亲和素。生物素与亲和素/链亲和素之间的亲和性，至少是抗原(Ag)抗体(Ab)间的一万倍以，且不易受外界干扰，复合物稳定。(2)桥联作用。二者均可偶联蛋白质、核、多糖和酶等生物活性物质，同时还能与固相材料结合，通过这些特性可将它们偶联起来。(3)多级放大作用。一个蛋白质(或核酸等)分子上可结合多个生物素分子，而一个亲和素/链亲和素又可结合四个生物素，因而生物素与亲和素/链亲和素具有多级放大作用。因此，生物素-亲和素/链亲和素系统作为现代生物技术领域最有力的工具之一，在免疫学检测、核酸杂交检测、药物筛选等领域得到了广泛的应用。
生物素与亲和素/链亲和素系统有二种基本类型：以游离亲合素为中间物，分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素的BAB法或ABC技术；另一类是直接用标记亲合素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法或LAB。其反应原理如下：
BAB法：
Figure G2009102544381D00011
特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
BA法：
Figure G2009102544381D00012
特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省却了加B-E的步骤
ABC法：
(1)A+B·E→A-B·E----ABC
Figure G2009102544381D00021
特点：将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC
生物素-亲和素/链亲和素既可偶联生物大分子，又可连接标记材料，在放大系统应用中，无论采用酶、荧光素或发光物作为检测示踪剂，均是待测抗原与生物素化抗体反应形成复合物后，再利用生物素与亲合素/链亲和素间的多价放大结合特性，或直接与标有示踪剂的生物素结合(BA、LAB法)，或依次与亲合素/链亲和素、生物素示踪标记物反应连接成聚合物(BAB、ABC法)，最终使待测反应信号被放大，提高检测方法的灵敏度。
磁性复合微粒是20世纪70年代末发展起来并被广泛用于生物医学领域的超顺磁性复合粒子，是由高分子或无机材料与磁性超细粉末(包括磁性金属如Fe、Co、Ni或其金属氧化物等)构成的胶态复合物。在外加磁场作用下，磁性粒子的超顺磁性可保证既能被快速分离，本身又不会被永久磁化。同时，磁性复合微粒具有较高的比表面积，表现出较强的吸附能力。通过物理吸附，或利用修饰在磁性复合微粒表面的活性基团可将酶、抗体、寡核苷酸及核酸等生物活性物质偶联在其表面。在磁性微粒表面固定亲合素/链亲和素的研究和应用也非常活跃，已有亲合素/链亲和素-磁性复合微粒面市。亲合素/链亲和素-磁性复合微粒在免疫学检测中的应用解决了以往存在的检测问题，以目前常见的ELISA检测为例，某些抗体(抗原)的直接包被会损失其大部分生物学活性，并且有的抗体(抗原)不能直接包被在磁性复合微粒表面。但将生物素化抗体(抗原)通过包被在磁性复合微粒的亲合素/链亲和素固定在其表面，可有效地保持其生物学活性。
发明内容
本发明的目的是向免疫学检测领域提供一种以固相载体，即亲和素/链亲和素磁性复合微粒对生物分子进行免疫学检测的方法，该方法通过标记亲和素/链亲和素将其固定，并通过生物素-亲和素/链亲和素系统进行检测；磁性复合微粒与生物素-亲和素/链亲和素系统相结合，进一步提高了检测的灵敏度和特异性。该方法可用于对HBsAg、TP、HCV、HIV等一类大生物分子的检测，也可将其应用于对肿瘤标志物如甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)等的检测，和对雌二醇、雌三醇、T3、T4、人促甲状腺激素等激素类分子的检测。该方法解决了以往检测技术中标记量少，生物分子易变性失活等技术问题。
本发明的技术解决方案是
一种用亲和素/链亲和素磁性复合微粒对生物分子进行免疫学检测的方法，该方法包括以下步骤：
(1)抗体/抗原与亲和素/链亲和素磁性复合微粒的偶联
将生物素化的抗体或者抗原与偶联缓冲液混合，加入亲和素/链亲和素磁性复合微粒中，置于摇床，在4～37℃，100～300rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；用清洗缓冲液清洗后，磁性分离，弃上清；
(2)封闭
加入封闭液，在4～37℃，100～300rpm条件下，于摇床中反应1～2小时，封闭亲和素/链亲和素磁性复合微粒表面未与抗体/抗原结合的空白位点；磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后，悬于保存缓冲液中保存备用；
(3)与待测物结合
待检标本可以是抗原或者抗体。
当待检标本为抗原时，将待检标本与酶标抗体，或者待检标本与酶标抗原加入步骤(2)的产物中，在4～37℃，100～300rpm条件下，于摇床中反应15～30min，使偶联在亲和素/链亲和素磁性复合微粒表面的生物素化的抗体与之反应；
双抗体夹心反应将形成特异性生物素化抗体-抗原-酶标抗体的复合物；
竞争法反应，酶标抗原将与待检抗原竞争与生物素化的抗体结合，形成生物素化抗体-抗原复合物和生物素化抗体-酶标抗原复合物的混合物。待检标本中抗原量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少。因此标本中抗原含量较多的，反应呈色较含量少的为淡。小分子激素，药物等的测定多用此法；
用清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清；
当待检标本为抗体时，将待检标本与酶标抗原，或者待检标本与酶标抗体，或者待检标本与酶标抗抗体结合物加入步骤(2)的产物中，在4～37℃，100～300rpm条件下，于摇床中反应15～30min，使偶联在亲和素/链亲和素磁性复合微粒表面的生物素化的抗原与之反应结合；
双抗原夹心反应将形成特异性生物素化抗原-抗体-酶标抗原复合物；
竞争法反应，标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与生物素化抗原结合，形成生物素化抗原-抗体复合物和生物素化抗原-酶标抗体复合物的混合物。标本中抗体量愈多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色较浅于阴性反应；
间接法反应将形成生物素化抗原-抗体-酶标抗抗体复合物；
用清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清；
(4)检测
向步骤(3)产物中加入显色底物显色或加入化学发光底物进行发光信号检测。
上述步骤(1)偶联缓冲液可以选自pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、pH＝3.0～7.0，0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝9.0～11，0.005M～1M的CBS缓冲液、pH＝7.0～9.0，0.005M～1M的TBS缓冲液或pH＝3.6～5.6，0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，0.005M～1M的TE缓冲液之中的任意一种。
上述步骤(1)清洗缓冲液可以选自0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液或0.5×～10×的PBS缓冲液。
上述步骤(2)封闭液是游离生物素与牛血清白蛋白、小牛血清、脱脂奶粉、乙醇胺或山羊血清中的任一种或多种成分的混合物；该封闭液的质量体积浓度为1～10％。
上述步骤(2)清洗缓冲液可以选自pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液、pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的TBS缓冲液之中的任意一种或者是含0.02～0.2％吐温的上述缓冲液，吐温浓度以0.05％为最佳。
上述步骤(2)保存缓冲液可以选自pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液，pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的TBS缓冲液，pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液之中的任意一种。
上述步骤(3)酶标抗体、酶标抗原、酶标抗抗体结合物是碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记的抗体、抗原、抗抗体结合物。
上述步骤(3)的清洗缓冲液可以选自0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液或0.5×～10×的PBS缓冲液。
上述步骤(4)显色底物可以选自对硝基苯磷酸酯、磷酸4-甲基伞酮、邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、杂环吖嗪之中的任意一种，化学发光底物是鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物，其中1，2-二氧乙烷类衍生物是金刚烷-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-STAR。
上述方法可用于对HBsAg、TP、HCV、HIV这一类大生物分子；甲胎蛋白、前列腺特异性抗原这一类肿瘤标志物；对雌二醇、雌三醇、T3、T4、人促甲状腺激素这一类激素类分子的检测。
本发明的优点
亲和素/链亲和素磁性复合微粒颗粒微小、比表面积大、生物分子等物质在其表面偶联容量大、悬浮稳定性好，生物素与亲和素/链亲和素有着很强的结合能力，容易失去活性的，不易直接与固相载体相偶联的抗体(抗原)分子，均可通过标记在磁性复合微粒表面的亲和素/链亲和素将其固定，通过生物素-亲和素/链亲和素系统进行检测，二者结合使得该检测系统具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等优点。
附图说明
图1为本发明亲和素/链亲和素磁性复合微粒偶联生物素化的抗HBsAg抗体前后的紫外吸收曲线图，其中曲线1是包被生物素化的抗HBsAg抗体前的紫外吸收曲线，曲线2是包被生物素化的抗HBsAg抗体后的紫外吸收曲线。
图2为本发明检测乙肝病毒表面抗原的标准曲线图。
具体实施方式
以下以检测乙肝为例来说明本发明的内容，该实施例并不对本发明的保护范围作限定。
实施例1
(1)生物素化的抗HBsAg抗体与亲和素/链亲和素磁性复合微粒的偶联
将200μl生物素化的抗HBsAg抗体溶解于400μl pH＝7.4Tris-HCl偶联缓冲液中，混匀后加入亲和素/链亲和素磁性复合微粒中，于37℃，180rpm，摇床中反应20min，反应完毕后取出磁性分离，弃上清；加入400μl 1×PBS，磁性分离，弃上清；
(2)封闭
向亲和素/链亲和素磁性复合微粒中加入1ml含5％脱脂奶粉、游离生物素的Tris-HCl缓冲液，于37℃，180rpm，摇床中反应1小时，磁性分离，弃上清。用2ml pH＝7.4，1×PBS清洗缓冲液清洗3次，磁粒悬于1ml pH＝7.4，0.02MTris-HCl保存缓冲液中，4℃备用。
亲和素/链亲和素磁性复合微粒偶联生物素化的抗HBsAg抗体前后的紫外吸收曲线见图1所示。
(3)与待测物结合
将上面制备的偶联有生物素化的抗HBsAg抗体的亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于血清中乙肝病毒表面抗原的检测，操作如下：
(3.1)从4℃冰箱中取出偶联有生物素化的抗HBsAg抗体的亲和素/链亲和素磁性复合微粒，于室温下平衡10分钟；
(3.2)取3个离心管，管1设定为阳性对照样，管2设定为阴性对照样，管3为空白对照样，向上述3个离心管中各加入20μl该磁性复合微粒，再向管1中加入50μl阳性对照血清，向管2中加入50μl阴性对照血清。
(3.3)再向管1和管2中分别加入辣根过氧化物酶标记的抗乙肝病毒表面抗原多克隆抗体50μl，37℃，180rpm，置摇床中反应25min，阳性管中将形成生物素化抗HBsAg抗体-乙肝病毒表面抗原-辣根过氧化物酶标记的抗乙肝病毒表面抗原多克隆抗体的双抗体夹心复合物。
(3.4)取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用添加0.05％吐温20，pH＝7.4，1×PBS的清洗缓冲液清洗5次，磁性分离，弃上清；
(4)检测
分别向3个管加入底物四甲基联苯胺(TMB)显色，2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪测定450/630nm下各孔吸光度值。对血清/浆乙肝病毒表面抗原检测的吸光度值应大于或等于CUTOFF值(CUTOFF值通常是指阴性对照结果均值的2.1倍)；若对照血清为阴性对照血清，则其中不含乙肝表面抗原，因而不会显色，检测时所得的吸光度值就小于CUTOFF值。实际测得的阴性对照值小于0.05，以0.05计；若所测结果大于0.05，则以实际值计。则该系统的CUTOFF值为0.105。该检测方法与商品化ELISA试剂盒做了对比，检测结果如表1、2、3所示：
表1对adr亚型的检测
  亲和素/链亲和素磁性复合微粒  商品化ELISA试剂盒
  阳性对照   OUT  OUT
  0.2ng/ml   0.143  0.05
  0.5ng/ml   0.154  0.091
  1.0ng/ml   0.145  0.187
  阴性对照   0.05  0.05
表2对adw亚型的检测
  亲和素/链亲和素磁性复合微粒  商品化ELISA试剂盒
  阳性对照   OUT   OUT
  0.5ng/ml   0.110   0.037
  1.0ng/ml   0.177   0.091
  2.0ng/ml   0.300   0.204
  阴性对照   0.05   0.05
表3对ay亚型的检测
  亲和素/链亲和素磁性复合微粒  商品化ELISA试剂盒
  阳性对照   OUT   OUT
  0.5ng/ml   0.06   0.026
  1.0ng/ml   0.108   0.074
  2.0ng/ml   0.184   0.146
  阴性对照   0.05   0.05
通过选用卫生部临床检验中心的HBsAg国家参考品对本系统进行灵敏度分析并与商品化ELISA试剂盒进行对比，从结果可知，亲和素/链亲和素磁性复合微粒检测方法阳性吸光度值几乎全部高于商品化ELISA试剂盒的阳性值，阴性吸光度值则与之相当，可以看出其灵敏度要高于后者。
图2是本发明实施例检测乙肝病毒表面抗原，将HBsAg标准品稀释为1100，1000，800，400，80，40，4pg/ml后所做的标准曲线，结果表明在4～1100pg/ml范围内线性关系良好。
若检测生物分子所用方法为双抗原夹心法，则可参考该双抗体夹心法进行。
实施例2：
(1)生物素化HCV抗原与亲和素/链亲和素磁性复合微粒的偶联
将生物素化HCV抗原溶解于400μl pH＝7.4醋酸盐偶联缓冲液中，混匀后加入亲和素/链亲和素磁性复合微粒中，于37℃，180rpm，摇床中反应20min，反应完毕后取出磁性分离，弃上清；加入400μl 1×PBS，磁性分离，弃上清；
(2)封闭
向亲和素/链亲和素磁性复合微粒中加入1ml含5％脱脂奶粉、游离生物素的Tris-HCl缓冲液，于37℃，180rpm，摇床中反应1小时，磁性分离，弃上清。用2ml pH＝7.4，1×PBS清洗缓冲液清洗3次，磁粒悬于1ml pH＝7.4，1×PBS保存缓冲液中，4℃备用。
(3)与待测物结合
将上面制备的偶联有生物素化HCV抗原的亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于血清中丙肝抗体的检测，操作如下：
(3.1)从4℃冰箱中取出偶联有生物素化HCV抗原的亲和素/链亲和素磁性复合微粒，于室温下平衡10分钟；
(3.2)取3个离心管，管1设定为阳性对照样，管2设定为阴性对照样，管3为空白对照样，向上述3个离心管中各加入20μl该磁性复合微粒，并向管1和管2中加入100μl血清稀释液(含有20％山羊血清的1×PBS)，再向管1中加入10μl阳性对照血清，向管2中加入10μl阴性对照血清。
(3.3)再向管1和管2中分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体100μl，37℃，180rpm，置摇床中反应25min。
(3.4)取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用添加0.05％吐温20，pH＝7.4，1×PBS的清洗缓冲液清洗5次，磁性分离，弃上清；
(4)检测
分别向3个管加入底物四甲基联苯胺(TMB)显色，2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪测定450/630nm下各孔吸光度值。
该方法为间接法检测，竞争法检测均可参考上述方法进行。
表4该检测方法进行的批内稳定性实验
Figure G2009102544381D00101
由表4可以看出，阳性阴性血清的OD值对比显著，OD阳/OD阴＝15.6，且阳性血清的相对标准偏差CV值为7.9％，阴性血清OD值相对标准偏差CV为11.9％，检测的重复性较好。

Claims (8)

1.一种用亲和素/链亲和素磁性复合微粒对生物分子进行免疫学检测的方法，该方法包括以下步骤：
(1)抗体/抗原与亲和素/链亲和素磁性复合微粒的偶联
将生物素化的抗体/抗原与偶联缓冲液混合，加入亲和素/链亲和素磁性复合微粒中，置于摇床，在4～37℃，100～300rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；用缓冲液清洗后，磁性分离，弃上清；
(2)封闭
加入封闭液，在4～37℃，100～300rpm条件下，于摇床中反应1～2小时，封闭亲和素/链亲和素磁性复合微粒表面未与抗体或抗原结合的空白位点；磁性分离，弃上清，用缓冲液清洗后，悬于保存缓冲液中备用；
(3)与待测物结合
当待检标本为抗原时，将待检标本，酶标抗体/酶标抗原加入步骤(2)的产物中，在4～37℃，100～300rpm条件下，于摇床中反应15～30min，使偶联在亲和素/链亲和素磁性复合微粒表面的生物素化的抗体与之反应，双抗体夹心反应形成特异性生物素化抗体-抗原-酶标抗体的复合物；竞争法反应形成生物素化抗体-抗原复合物和生物素化抗体-酶标抗原复合物的混合物；用缓冲液清洗，磁性分离，弃上清；
当待检标本为抗体时，将待检标本，酶标抗原/酶标抗体/酶标抗抗体结合物加入步骤(2)的产物中，在4～37℃，100～300rpm条件下，于摇床中反应15～30min，使偶联在亲和素/链亲和素磁性复合微粒表面的生物素化的抗原与之反应结合，双抗原夹心反应形成特异性生物素化抗原-抗体-酶标抗原复合物；竞争法反应形成生物素化抗原-抗体复合物和生物素化抗原-酶标抗体复合物的混合物；间接法反应形成生物素化抗原-抗体-酶标抗抗体复合物；用缓冲液清洗，磁性分离，弃上清；
(4)检测
向步骤(3)产物中加入显色底物显色或加入化学发光底物进行发光信号检测。
2.根据权利要求1所述的用亲和素/链亲和素磁性复合微粒对生物分子进行免疫学检测的方法，其特征在于：所述步骤(1)亲和素/链亲和素磁性复合微粒对生物素标记抗体/抗原的偶联：所述偶联缓冲液是pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、pH＝3.0～7.0，0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝9.0～11，0.005M～1M的CBS缓冲液、pH＝7.0～9.0，0.005M～1M的TBS缓冲液或pH＝3.6～5.6，0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，0.005M～1M的TE缓冲液之中的任一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)偶联缓冲液是pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、pH＝3.0～7.0，0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝9.0～11，0.005M～1M的CBS缓冲液、pH＝7.0～9.0，0.005M～1M的TBS缓冲液或pH＝3.6～5.6，0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，0.005M～1M的TE缓冲液之中的任一种；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(2)封闭液是游离生物素与牛血清白蛋白、小牛血清、脱脂奶粉、乙醇胺或山羊血清中的任一种或多种成分的混合物；所述封闭液的质量体积浓度为1～10％；
步骤(2)清洗缓冲液是pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液、pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的TBS缓冲液之中的任一种或者是含0.02～0.2％吐温的上述缓冲液；
步骤(2)保存缓冲液是pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HC1缓冲液、pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液，pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的TBS缓冲液，pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液之任意一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(3)酶标抗体、酶标抗原、酶标抗抗体结合物是碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记的抗体、抗原、抗抗体结合物；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(4)显色底物是对硝基苯磷酸酯、磷酸4-甲基伞酮、邻苯二胺、四甲基联苯胺或杂环吖嗪，化学发光底物是鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物，其中1，2-二氧乙烷类衍生物是金刚烷-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-STAR。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述吐温浓度为0.05％。
8.根据权利要求1～7任一项权利要求所述的方法，其特征在于：该方法可用于对HBsAg、TP、HCV、HIV这一类大生物分子；甲胎蛋白、前列腺特异性抗原这一类肿瘤标志物和对雌二醇、雌三醇、T3、T4、人促甲状腺激素这一类激素类分子的检测。
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